專利名稱：通絡(luò)祛痛膏hplc指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜的測定方法，具體地說是用高效液相色譜(HPLC)指紋 圖譜方法來測定通絡(luò)祛痛膏成品的化學成分的方法。
背景技術(shù)：
骨性關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生性疾病可發(fā)生于任何年齡，骨性關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生行疾病的 發(fā)病率隨著年齡的增加而增加，以40歲以上的中老年為多，該病具有發(fā)病率高，病程長，治 療后極易復發(fā)等特點。每年都有很多患者因沒有接受很好的治療而離開人世，令人悲痛。 目前治療的方法有很多，最常見的幾種是藥物治療、物理治療、牽引按摩、手術(shù)治療、中醫(yī)外 貼治療等。內(nèi)服藥物治療對患者的腸胃造成一定傷害，且很難達到病根，因此起效速度慢， 無法根治。手術(shù)治療的危險性大，恢復期慢，容易帶來身體的二次傷害。以上兩種治療不建 議骨性關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生性疾病患者使用，因為考慮到患者大多都是中老年人，這兩種治療 都很高危。像物理治療、牽引按摩根本不能治愈病癥可緩解疼痛，起輔助治療的作用。中醫(yī) 外貼法治療，中醫(yī)認為骨質(zhì)增生與外傷、勞損、瘀血阻絡(luò)、感受風寒濕邪、痰濕內(nèi)阻、肝腎虧 虛等有關(guān)，中醫(yī)膏藥針對病因病癥用藥，藥效可直達病灶，起到標本兼治的功效！同時使用 方便、安全可靠，比較適合中老年患者使用。通絡(luò)祛痛膏正是這一中醫(yī)精華，由當歸、川芎、 紅花、山奈、花椒、肉桂、干姜等具有活血行氣、活血通經(jīng)，祛瘀止痛、祛風散寒功效的藥材組 成，是遵循中藥歸經(jīng)原則，運用藥物互相協(xié)調(diào)為用的效能，組成的多味藥物大組方，共收活 血通絡(luò)，散寒祛濕，消腫止痛之功能，適用于骨性關(guān)節(jié)病見瘀血停滯、寒濕阻絡(luò)之證。對于治療關(guān)節(jié)刺痛或鈍痛，關(guān)節(jié)僵硬，屈伸不利，畏寒肢冷等臨床癥狀，雖然中藥 的單一靶點的作用強度低于西藥，但是其多途徑、多靶點、動態(tài)整體治療、毒副作用小的特 性則遠非西藥所能企及，療效確切的中成藥的綜合治療效果要超過西藥。通絡(luò)祛痛膏目前 的質(zhì)量標準只控制處方中某一味藥中一種成分阿魏酸的含量以及部分藥材中單一成分的 薄層鑒別，難以從整體上反映產(chǎn)品的質(zhì)量或從整體上控制產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，如何從整體上 更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量一直是我公司積極研究的課題。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成 分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋 圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20 世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用HPLC指紋圖譜的方法控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏 葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用時提取物所得物質(zhì)群的整體作 用結(jié)果，對這樣一個整體的質(zhì)量控制，采用的是HPLC指紋圖譜的方法。隨著研究的深入，人 們逐漸認識到，中藥、尤其是復方中藥，其中所含的任一成分都不能代表其整體療效，從現(xiàn) 行的質(zhì)量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量測定結(jié)合的 方式已是發(fā)展的趨勢。通絡(luò)祛痛膏臨床上用于腰部、膝部骨性關(guān)節(jié)炎屬瘀血停滯、寒濕阻絡(luò)證，證見關(guān) 節(jié)刺痛或鈍痛，關(guān)節(jié)僵硬，屈伸不利，畏寒肢冷。其治療效果已經(jīng)得到多年臨床的驗證，而是否能夠保證藥物的質(zhì)量以及通絡(luò)祛痛膏的質(zhì)量，是決定通絡(luò)祛痛膏療效的基礎(chǔ)。要控制通 絡(luò)祛痛膏的功效，只針對其一、二個化學成分進行表征可控制時不夠的，必須對它的物質(zhì)群 整體予以控制。指紋圖譜作為中藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已經(jīng)成為國際共識。目 前如何能夠從整體上、從更宏觀的角度對通絡(luò)祛痛膏制劑進行質(zhì)量控制的宏觀質(zhì)量控制方 法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種 通絡(luò)祛痛膏指紋圖譜的測定方法，通過此方法，可控制 通絡(luò)祛痛膏的質(zhì)量。本發(fā)明可以通過下述步驟實施(a)供試品溶液的制備取通絡(luò)祛痛膏適量，加入甲醇，與水一定比例的甲醇、乙 醇，與水一定比例的乙醇中的至少一種溶劑提取，置具塞三角瓶中，回流提取或超聲提取， 過濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A 為磷酸水溶液或冰醋酸水溶液或磷酸水溶液加三乙胺或冰醋酸水溶液加三乙胺或水，流動 相B為乙腈；檢測波長220 300nm ；(C)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指 紋圖譜。優(yōu)選的本發(fā)明可以通過下述步驟實施，所述步驟(a)中所述的加50% 100%的 甲醇溶液或50% 100%的乙醇溶液。進一步優(yōu)選的本發(fā)明可以通過下述步驟實施所述步驟(a)中加50% 100%的 甲醇溶液或50% 100%的乙醇溶液20 100ml，超聲提取或回流提取，用0. 2um或0. 45um 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用；所述步驟(b)中色譜條件進樣量5 40ul ；檢測波長為250 280nm ；柱溫20
40 "C。更進一步優(yōu)選的本發(fā)明可以通過下述步驟實施所述步驟(a)中供試品溶液的制 備取樣品適量，加75% 100%的甲醇溶液或75% 100%的乙醇溶液30 50ml，超聲 提取0. 5 3h或回流提取0. 5 3h，溶液用0. 2um或0. 45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供 試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗 脫，流動相A為0. 1 的磷酸水溶液或為0. 1 冰醋酸水溶液或為0. 1 的磷 酸水溶液加0. 1 的三乙胺或為0. 1 的冰醋酸水溶液加0. 1 的三乙胺，流 動相B為乙腈或甲醇；梯度洗脫程序A相(％) 70 0 70 B相(％) 30 100 30， 梯度時間0 105min。流速1. Oml/min，進樣量10 20ul ；檢測波長為250 280nm ；柱溫 20 40"C。再更進一步優(yōu)選的本發(fā)明可以通過下述步驟實施所述步驟(a)中供試品溶液的 制備取樣品適量，加甲醇溶液或75%的乙醇溶液30ml，超聲提取2h或回流提取2h，溶液 用0. 45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為0. 1 1 %的磷酸水溶液或為0. 1 1 %冰醋酸水溶液，流動相B為乙腈；梯 度洗脫程序0分鐘 時，流動相A為60 %，流動相B為40 % ；30分鐘時，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；35分鐘時，流動相A為30 %，流動相B為70 % ；
70分鐘時，流動相A為0%，流動相B為100% ；70. 01分鐘時，流動相A為60 %，流動相B為40 % ；90分鐘，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；流速1. Oml/min，進樣量10 20ul ；檢測波長為250nm和280nm ；柱溫28 32°C。(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指 紋圖譜。最佳的本發(fā)明中可以通過下述步驟實施所述步驟(a)中供試品溶液的制備取 樣品片1片，加75%乙醇溶液30ml，回流提取2h，補足失重，放置室溫，溶液用0. 45um濾膜 濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵 合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為0. 1的磷酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程 序O分鐘時，流動相A為60 %，流動相B為40 % ；40分鐘時，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；45分鐘時，流動相A為30 %，流動相B為70 % ；
75分鐘時，流動相A為O%，流動相B為100% ；75. Ol分鐘時，流動相A為60%，流動相B為40% ；105分鐘，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；流速1. Oml/min,進樣量IOul ；檢測波長為250nm和280nm ；柱溫30°C。本發(fā)明中，選用100%甲醇、75%乙醇、75%甲醇和100%乙醇作為提取溶劑超聲 提取所獲得的通絡(luò)祛痛膏指紋圖譜整體效果優(yōu)于水、50%甲醇、50%乙醇的提取效果；優(yōu)選 100%的甲醇和75%乙醇30ml作為提取溶劑超聲均有較好的提取效果；進一步優(yōu)選75%乙 醇30ml回流提取所得指紋圖譜的整體效果較好；再進一步優(yōu)選75%乙醇30ml回流提取2h 所得指紋圖譜的整體效果最佳。按照本發(fā)明的方法測定的是通絡(luò)祛痛膏16批次的樣品的指紋圖譜，按照上述方 法測定的指紋圖譜中，16批次樣品的指紋圖譜與標準圖譜指紋比較其相似度均大于0. 9， 通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm的標準指紋圖譜和混合對照圖譜的比對以及相似度 結(jié)果，所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖1、圖2和圖3所示；通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋 圖譜280nm的標準指紋圖譜和混合對照圖譜的比對和16批次樣品的指紋圖譜和相似度結(jié) 果，所述圖譜的圖形如說明書附圖中的圖4、圖5和圖6所示。本發(fā)明對通絡(luò)祛痛膏的半成品膠漿進行了測定，9批次的膠漿的指紋圖譜與其標 準指紋圖譜比較其相似度均大于0.9，所述圖譜的圖形如說明書中附圖中的圖7、圖8、圖9、 圖10和圖11所示。本發(fā)明通過測定通絡(luò)祛痛膏半成品膠漿和成品的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，膠漿和成品的吸收峰數(shù)量基本一致。因膠漿是制劑過程中最后的半成品，所以膠漿和成品的吸收峰數(shù)量和 峰位基本一致，說明半成品和成品之間是有前后秉承關(guān)系的。說明采用測定通絡(luò)祛痛膏指 紋圖譜作為通絡(luò)祛痛膏 質(zhì)量鑒別的控制標準比單獨以阿魏酸或其中某一成分作為質(zhì)量標 準更能夠客觀的反映產(chǎn)品的內(nèi)在成分的有無與其含量，以全面控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明的優(yōu)點如下(1)以通絡(luò)祛痛膏成品建立的HPLC指紋圖譜，代表著通絡(luò)祛痛膏成品中大部分的 化學成分，能有效地表征通絡(luò)祛痛膏成品的質(zhì)量。從而實現(xiàn)對通絡(luò)祛痛膏最大可能的化學 成分進行檢測，有利于對成品質(zhì)量的全面監(jiān)控。(2)以通絡(luò)祛痛膏成品指紋圖譜圖形作為一個整體看待，注重各個構(gòu)成指紋特征 峰的前后順序和相應(yīng)量的變化，注重整體面貌特征，既避免了因只測定一、二個化學成分而 判定通絡(luò)祛痛膏制劑整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標而人為處理的可能性。本發(fā) 明為更全面、準確評價通絡(luò)祛痛膏的質(zhì)量提供了新的對照標準，將更加保證通絡(luò)祛痛膏的 質(zhì)量及其臨床的療效。(3)本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好，適用于通絡(luò)祛痛膏成品 的整體質(zhì)量控制。(4)本發(fā)明建立的指紋圖譜能夠表達該產(chǎn)品的特征(包括8個已知成分)，具有較 好的專屬性。本發(fā)明提供了一種通絡(luò)祛痛膏成品的檢測方法，本發(fā)明是通過大量實驗所得的切 實可行的方法，具有重復性。在本發(fā)明中利用高效液相，在相同測定條件下所獲得的通絡(luò)祛 痛膏成品的指紋圖譜、通絡(luò)祛痛膏半成品膠漿的指紋圖譜重合性好，測定重復性好，可以利 用通絡(luò)祛痛膏指紋圖譜的標準指紋圖譜來控制半成品膠漿的質(zhì)量，達到更科學的控制制劑 質(zhì)量的目的。


下面給出通絡(luò)祛痛膏成品、通絡(luò)祛痛膏半成品的指紋圖譜，已在進一步說明本發(fā) 明，但不對不發(fā)明限制。圖1通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm下的標準指紋圖譜和混合對照比對的 圖譜圖2通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm下16批次樣品指紋圖譜和標準指紋圖 譜的比對圖3通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm下16批次樣品指紋圖譜和標準指紋圖 譜的相似度結(jié)果圖4通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜280nm下的標準指紋圖譜和混合對照比對的 圖譜圖5通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜280nm下16批次樣品指紋圖譜和標準指紋圖 譜的比對圖6通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜280nm下16批次樣品指紋圖譜和標準指紋圖 譜的相似度結(jié)果圖7通絡(luò)祛痛膏HPLC指紋圖譜半成品膠漿和成品制劑在250nm下各自的標準指紋圖 譜的比對圖8通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm下半成品膠漿9批次樣品指紋圖譜和 標準指紋圖譜圖9通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm下半成品膠漿9批次樣品指紋圖譜和 標準指紋圖譜的相似度結(jié)果圖10通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜280nm下半成品膠漿9批次樣品指紋圖譜和 標準指紋圖譜圖11通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜280nm下半成品膠漿9批次樣品指紋圖譜和 標準指紋圖譜相似度結(jié)果
具體實施例方式下面列舉實施例進一步詳細說明本發(fā)明，該實施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明 沒有限制。實施例一1、供試品溶液的制備取樣品適量，分別采用100%甲醇溶液、乙醇、75%乙醇溶 液作為提取溶劑，超聲提取0. 5h，溶液用0. 45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。2、HPLC分析條件Kromasil 100_5C18 分析柱(4. 6匪X 250匪，5um)；流動相A 為 0. 2%磷酸水溶液， B相為甲醇，流速1. Oml/min ；檢測波長220 300nm ；柱溫30°C，進樣15ul。梯度洗脫程序如下表
權(quán)利要求
1.一種通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征包括如下步驟(a)供試品溶液的制備取通絡(luò)祛痛膏適量，加入甲醇，與水一定比例的甲醇、乙醇，與 水一定比例的乙醇中的至少一種溶劑提取，置具塞三角瓶中，回流提取或超聲提取，過濾 膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為磷 酸水溶液或冰醋酸水溶液或磷酸水溶液加三乙胺或冰醋酸水溶液加三乙胺或水，流動相B 為乙腈或甲醇；檢測波長220 300nm ；(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖■i並 曰O
2.如權(quán)利要求1所述的通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的測定方法，其特征在于所 述步驟(a)中供試品溶液的制備取樣品適量，加50% 100%的甲醇溶液或50% 100% 的乙醇溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(a)中供試品溶液的制備取樣品適量，加50% 100%的甲醇溶液或 50% 100%的乙醇溶液20 100ml，超聲提取或回流提取，用0. 2 0. 45um濾膜濾過，取 續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件進樣量5 40ul ；檢測波長為250 280nm ；柱溫20 40 "C。
4.如權(quán)利要求1所述的通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(a)中供試品溶液的制備取樣品適量，加75% 100%的甲醇溶液或 75 % 100 %的乙醇溶液30 50ml，超聲提取0. 5 汕或回流提取0. 5 汕，溶液用0. 2 0. 45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流 動相A為0. 1 1 %的磷酸水溶液或為0. 1 1 %冰醋酸水溶液或為0. 1 1 %的磷酸水溶 液加0. 1 的三乙胺或為0. 1 的冰醋酸水溶液加0. 1 的三乙胺，流動相B 為乙腈或甲醇；梯度洗脫程序A相(％) 70 0 70 B相(％) 30 100 30，梯度時 間0 105min。流速1. Oml/min，進樣量10 20ul ；檢測波長為250 ^Onm ；柱溫20 40 V。
5.如權(quán)利要求1所述的通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(a)中供試品溶液的制備取樣品適量，加100%甲醇溶液或75%的乙醇溶液 30ml，超聲提取池或回流提取池，溶液用0. 45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流 動相A為0. 1 1 %的磷酸水溶液或為0. 1 1 %冰醋酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗 脫程序0分鐘時，流動相A為60 %，流動相B為40 % ； 40分鐘時，流動相A為40 %，流動相B為60 % ； 45分鐘時，流動相A為30 %，流動相B為70 % ； 75分鐘時，流動相λ為0%，流動相B為100% ； 75. Ol分鐘時，流動相A為60%，流動相B為40% ；105分鐘，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；流速1. Oml/min,進樣量10 30ul ；檢測波長為250nm和280nm ；柱溫28 32°C。 (c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
6.如權(quán)利要求1所述的通絡(luò)祛痛膏成品貼片的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟(a)中供試品溶液的制備取膠漿Ig或樣品片1片，加75%乙醇溶液30ml，回流提取池，補足失重，放置室溫，溶液用0.45um濾膜濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。所述步驟(b)中色譜條件所述步驟(b)中色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅 膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為0. 1的磷酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序 O分鐘時，流動相A為60 %，流動相B為40 % ； 40分鐘時，流動相A為40 %，流動相B為60 % ； 45分鐘時，流動相A為30 %，流動相B為70 % ； 75分鐘時，流動相λ為0%，流動相B為100% ； 75. Ol分鐘時，流動相A為60%，流動相B為40% ； 105分鐘，流動相A為40 %，流動相B為60 % ；流速1. Oml/min,進樣量IOul ；檢測波長為250nm和^Onm ；柱溫30°C。
7.如權(quán)利要求1所述所得通絡(luò)祛痛膏指紋圖譜，其特征在與所得的HPLC指紋圖譜，其 特征在于所述通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm的標準指紋圖譜的共有峰以及標準指紋圖 譜和混合對照圖譜的比對和16批次樣品的指紋圖譜的相似度結(jié)果，所述圖譜的圖形如說 明書附圖中的圖1、圖2和圖3所示；所述通絡(luò)祛痛膏制劑HPLC指紋圖譜250nm的標準指 紋圖譜的共有峰以及標準指紋圖譜和混合對照圖譜的比對和16批次樣品的指紋圖譜的相 似度結(jié)果，所述圖譜的圖形如說明書附圖中圖4、圖5和圖6所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及通絡(luò)祛痛膏HPLC指紋圖譜的測定方法，并通過大量實驗建立通絡(luò)祛痛膏成品藥膏指紋圖譜建立的方法及其標準HPLC指紋圖譜。首先制備通絡(luò)祛痛膏成品貼片的供試品溶液，將樣品置于具塞三角瓶中，用75％的甲醇溶液進行水浴回流，過0.45μm濾膜，進樣量10μl；采用梯度洗脫，流動相A為0.1％磷酸水溶液或冰醋酸水溶液，流動相B為乙腈溶液，流速為1.0ml/min，檢測波長250nm和280nm，柱溫30℃；照高效液相色譜法測定，得到通絡(luò)祛痛膏的指紋圖譜。此種方法測定的指紋圖譜重復性高，可作為測定通絡(luò)祛痛膏中化學組分的方法，也可作為鑒定通絡(luò)祛痛膏質(zhì)量控制方法。
文檔編號A61P19/02GK102049028SQ20101054704
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者張軍兵, 武惠斌, 熊維政, 王巖, 申桂芬, 聶紅梅 申請人:北京羚銳偉業(yè)科技有限公司, 河南羚銳制藥股份有限公司北京藥物研究院