專利名稱：間隙連接蛋白及其編碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間隙連接蛋白及其編碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物 中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的高發(fā)病率和高致死率疾病。傳統(tǒng)腫瘤治療都是針 對所有的腫瘤細胞，而且認為腫瘤細胞具有功能同質(zhì)性。近年來，隨著腫瘤干細胞(Tumour stem cells,TSC)相繼在不同的腫瘤組織中分離成功，有力的證明了腫瘤干細胞的存在，為 深入探討腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及評價預(yù)后等提供了新的理論依據(jù)，也為腫瘤治療帶來了新的 思路。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細胞具有功能異質(zhì)性，在腫瘤細胞群體中，只有腫瘤干細 胞亞群才有自我更新、多向分化及成瘤能力，是腫瘤發(fā)生、進展和復發(fā)的根源。只有殺滅腫 瘤干細胞，才能達到根治腫瘤的目的。因此，腫瘤治療的關(guān)鍵應(yīng)是針對腫瘤干細胞的治療。間隙連接(gap junction, GJ)是細胞間連接方式的一種，由間隙連接蛋白 (connexin, Cx)構(gòu)成。相鄰細胞間通過間隙連接介導的間隙連接通訊(gap junction intercelluar communication,GJIC)進行信息、能量和物質(zhì)的交換，對細胞的新陳代謝、內(nèi) 環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起重要的調(diào)控作用。在間隙連接蛋白家族中，間隙連接蛋 白43(Cx43)表達最為廣泛，對于保持正常的間隙連接通訊功能至關(guān)重要。大量研究表明，間隙連接通訊功能缺陷與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫 瘤形成過程中，間隙連接通訊功能的抑制或缺失使前腫瘤細胞或轉(zhuǎn)化細胞與周圍正常細胞 之間的信息傳遞受阻，失去周圍正常細胞的調(diào)控而獲得自主性生長，進而發(fā)展成腫瘤細胞。 腫瘤細胞之間同型間隙連接通訊被破壞在導致腫瘤細胞異質(zhì)性增加的同時可導致細胞之 間解離，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移能力與間隙連接通訊呈負相關(guān)。而間隙連接通訊功能缺陷 與間隙連接蛋白的表達降低或消失密切相關(guān)。許多腫瘤細胞如膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、 前列腺癌細胞等均顯示相應(yīng)的間隙連接蛋白表達降低或缺失。應(yīng)用間隙連接蛋白基因轉(zhuǎn) 染腫瘤細胞，可見間隙連接蛋白表達升高，間隙連接通訊功能恢復，腫瘤生長和轉(zhuǎn)化表型抑 制。因此，間隙連接蛋白及其基因是良好的抗腫瘤藥物靶標。但是，上述研究結(jié)果均是以腫 瘤細胞為研究對象，而腫瘤干細胞中，間隙連接通訊的功能狀態(tài)、間隙連接蛋白的表達情況 以及其同腫瘤干細胞特殊的生物學特性之間的關(guān)系尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供間隙連接蛋白及其編 碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用。為達到此目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了間隙連接蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細 胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用。進一步，所述腫瘤干細胞為膠質(zhì)瘤干細胞；
進一步，所述藥物包括間隙連接蛋白和藥學上可接受的載體；進一步，所述間隙連接蛋白為間隙連接蛋白43。在本發(fā)明的第二方面，提供了間隙連接蛋白編碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性 表型的藥物中的應(yīng)用。進一步，所述腫瘤干細胞為膠質(zhì)瘤干細胞；進一步，所述藥物包括間隙連接蛋白編碼基因重組表達載體和藥學上可接受的載 體；進一步，所述間隙連接蛋白編碼基因為間隙連接蛋白43的編碼基因GJAl ；進一步，所述間隙連接蛋白編碼基因重組表達載體為GJAl基因重組腺病毒，所述 GJAl基因重組腺病毒是將人GJA7基因表達盒插入El區(qū)缺失的復制缺陷型腺病毒載體的 El區(qū)缺失位置而得到；進一步，所述人GJAl基因表達盒包括啟動子、人GJAl基因cDNA和終止子，所述啟 動子為CMV，所述終止子為PloyA。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明考察了腫瘤干細胞中間隙連接通訊的功能狀態(tài)、 間隙連接蛋白的表達情況以及其同腫瘤干細胞特殊的生物學特性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示， 同分化腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞中存在間隙連接通訊障礙，細胞間未見明顯間隙連接樣 結(jié)構(gòu)，多種間隙連接蛋白表達下調(diào)，尤其是間隙連接蛋白43 ；間隙連接蛋白43的表達下調(diào)， 與其編碼基因GJAl啟動子甲基化以及microRNA的表達相關(guān)；恢復間隙連接蛋白43在腫 瘤干細胞中的表達，能夠顯著降低腫瘤干細胞的自我更新和成瘤能力，同時明顯降低腫瘤 干細胞的侵襲能力，這與間隙連接通訊功能的部分恢復、E-鈣粘素(E-Cadherin)表達上調(diào) 以及SDF-1/CXCR4下游信號通路(AKT和ERK1/2)失活有關(guān)。因此，間隙連接蛋白及其編碼 基因可用于制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域具有良好的潛在應(yīng)用前
旦
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為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1顯示了 6例人原代惡性膠質(zhì)瘤標本Pl P6的切片HE染色結(jié)果；其中P1為 男性，45歲，右側(cè)額葉，星形細胞瘤，II級；P2為女性，37歲，左側(cè)顳葉，星形細胞瘤，II級； P3為男性，45歲，右側(cè)額葉，多形性膠質(zhì)母細胞瘤，IV級；P4為男性，55歲，左側(cè)額葉和顳 葉，多形性膠質(zhì)母細胞瘤，IV級；P5為男性，55歲，右側(cè)額葉，多形性膠質(zhì)母細胞瘤，IV級； P6為男性，60歲，左側(cè)頂葉和顳葉，多形性膠質(zhì)母細胞瘤，IV級。圖2顯示了腫瘤干細胞及其分化細胞形態(tài)的顯微鑒定結(jié)果；其中A I為不同來 源的腫瘤干細胞球A來源于惡性膠質(zhì)瘤U87細胞系，B來源于乳腺癌MCF-7細胞系，C來源 于結(jié)腸癌HCT116細胞系，D I來源于Pl P6 J 0為不同來源的腫瘤干細胞球的分化 細胞J來源于U87，K來源于MCF-7，L來源于HCTl 16，M 0來源于Pl P3，箭頭所指處 為腫瘤干細胞球；光學顯微鏡放大倍數(shù)為200倍。圖3顯示了腫瘤干細胞標志物的免疫熒光染色鑒定結(jié)果；其中A為來源于U87的 腫瘤干細胞球鑒定巢蛋白(nestin)，紅色熒光，標尺為20 μ m ;B D為來源于Pl P3的腫瘤干細胞球鑒定nestin，紅色熒光，標尺依次為50、30和70 μ m ；E為來源于U87的腫瘤干 細胞球鑒定⑶133，紅色熒光，標尺為75 μ m ;F H為來源于Pl P3的腫瘤干細胞球鑒定 ⑶133，紅色熒光，標尺依次為50、25和50μπι;Ι為來源于U87的腫瘤干細胞球鑒定八聚體 結(jié)合蛋白_4 (0ct4)，綠色熒光，標尺為100 μ m ； J為來源于U87的腫瘤干細胞球鑒定⑶44s， 紅色熒光，標尺為25 μ m ;K為來源于MCF-7的腫瘤干細胞球鑒定⑶44s，紅色熒光，標尺為 25 μ m ;L為來源于HCTl 16的腫瘤干細胞球鑒定⑶133，紅色熒光，標尺為50 μ m ；細胞核為 藍色熒光。圖4顯示了腫瘤干細胞分化標志物的免疫熒光染色鑒定結(jié)果；其中A E為 來源于U87的腫瘤干細胞球的分化細胞:A鑒定膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，紅色熒光，標 尺為75 μ m;B鑒定髓鞘堿性蛋白(MBP)，紅色熒光，標尺為75ym;C鑒定β-微管蛋白 III ( β -tubulin III)，綠色熒光，標尺為75 μ m ;D鑒定nestin,紅色熒光，標尺為10 μ m ； E鑒定⑶133，紅色熒光，標尺為25 μ m ;F J為來源于Pl的腫瘤干細胞球的分化細胞F 和G鑒定GFAP，綠色熒光，F(xiàn)標尺為500 μ m, G標尺為75 μ m ;H鑒定MBP，綠色熒光，標尺為 50 μ m ;1鑒定β -tubulinlll，綠色熒光，標尺為50 μ m J鑒定nestin，綠色熒光，標尺為 75 μ m ；細胞核為藍色熒光；箭頭所指處為腫瘤干細胞球。圖5顯示了腫瘤干細胞成瘤能力鑒定結(jié)果；其中A為皮下接種IX IO5個來源于 U87的腫瘤干細胞8周，B為原位接種IX IO4個來源于U87的腫瘤干細胞6周，C為原位接 種5X IO3來源于P3的腫瘤干細胞6周；箭頭所指處為腫瘤。圖6顯示了腫瘤干細胞的熒光漂白恢復實驗結(jié)果；各組數(shù)據(jù)之間進行單因素方 差分析和 t 檢驗:a :F = 30. 24，P = O. 000 < 0. 01 ；b :P = 0. 005 < 0. 01 ；c :P = 0. 013 < 0. 05 ；d :P = 0. 889 > 0. 05 ；e :t = -2. 805，P = O. 038 < 0. 05 ；f :t = -4. 514，P = 0. 010 < 0. 05 ；g :t = -4. 930，P = O. 003 < 0. 01 ；h :t = _1· 414，P = O. 207 > 0. 05。圖7顯示了腫瘤干細胞間隙連接樣結(jié)構(gòu)的顯微檢測結(jié)果；其中A為來源于U87的 腫瘤干細胞球的掃描電子顯微圖，標尺為1(^!11出為來源于現(xiàn)7的腫瘤干細胞球的透射電 子顯微圖，標尺為10(^!11;(為來源于現(xiàn)7的腫瘤干細胞球的分化細胞的透射電子顯微圖， 標尺為200 μ m;方框區(qū)為細胞連接區(qū)，箭頭所指處為間隙連接樣結(jié)構(gòu)。圖8顯示了腫瘤細胞干細胞中間隙連接蛋白基因表達的RT-PCR檢測結(jié)果；其中 1泳道為來源于U87的貼壁未成球腫瘤細胞，2泳道為來源于U87的腫瘤干細胞球。圖9顯示了腫瘤干細胞中間隙連接蛋白基因表達的實時定量RT-PCR檢測結(jié)果。圖10顯示了腫瘤干細胞中間隙連接蛋白43表達的Western-blot檢測結(jié)果；其 中1泳道為來源于U87的貼壁未成球腫瘤細胞，2泳道為來源于U87的腫瘤干細胞球。圖11顯示了腫瘤干細胞中間隙連接蛋白43表達的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；其中 無陰影曲線為來源于U87的腫瘤干細胞球，有陰影曲線為陰性對照。圖12顯示了腫瘤干細胞中間隙連接蛋白43表達的免疫熒光染色檢測結(jié)果；其中 A F為不同來源的腫瘤干細胞球，A來源于U87，B D來源于Pl P3，E來源于MCF_7，F(xiàn) 來源于HCT116 ；G和I L為不同來源的貼壁未成球腫瘤細胞，G來源于U87，I來源于P2， J來源于P3，K來源于MCF-7，L來源于HCTl 16 ；H為來源于U87的腫瘤干細胞球的分化細 胞；A和C的標尺為100 μ m，B禾口 D的標尺為50 μ m，E L的標尺為25 μ m。圖13顯示了腫瘤干細胞中干細胞標志物與間隙連接蛋白43的免疫熒光雙重染色
5檢測結(jié)果；其中一所指處為干細胞標志物，綠色熒光；>所指處為間隙連接蛋白43，紅色 熒光，細胞核為藍色熒光。圖14顯示了腫瘤干細胞中干細胞標志物與間隙連接蛋白43的免疫組織化學雙重 染色檢測結(jié)果；其中間隙連接蛋白43為深紅色顆粒，干細胞標志物
為深棕色顆粒(箭頭所指處和圓圈內(nèi))；光學顯微鏡放大倍數(shù) 為200倍。圖15顯示了腫瘤干細胞中GJAl基因啟動子甲基化水平的檢測結(jié)果；其中A為高 頻聲波處理染色質(zhì)結(jié)果，其中M泳道為DNA分子量標準，+為經(jīng)高頻聲波處理，-為未經(jīng)高頻 聲波處理，1泳道為來源于U87的貼壁未成球腫瘤細胞，2泳道為來源于U87的腫瘤干細胞 球的分化細胞，3泳道為來源于U87的腫瘤干細胞球；B為實時定量PCR擴增GJAl基因啟動 子區(qū)域1和區(qū)域2的示意圖；C和D分別為GJAl基因啟動子區(qū)域1和區(qū)域2的擴增結(jié)果， 其中1為來源于U87的貼壁未成球腫瘤細胞，2為來源于U87的腫瘤干細胞球的分化細胞， 3為來源于U87的腫瘤干細胞球。圖16顯示了腫瘤干細胞中以GJAl基因轉(zhuǎn)錄本為靶點的microRNA表達情況；其 中1為來源于U87的腫瘤干細胞球，2為來源于U87的貼壁未成球腫瘤細胞。圖17顯示了 GJAl基因重組腺病毒的滴度測定結(jié)果；其中A為陰性對照，B為GJAl 基因重組腺病毒Ad-Cx43，C為GFP基因?qū)φ障俨《続d-GFP ；光學顯微鏡放大倍數(shù)為100倍。圖18顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞形態(tài)的顯微檢測結(jié)果；其 中，A為熒光顯微鏡鑒定結(jié)果，B為倒置相差顯微鏡鑒定結(jié)果。圖19顯示了 GJAl基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；其中深色 部分為陰性對照，淺色部分為GJAl基因重組腺病毒Ad-Cx43。圖20顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞中GJAl基因表達的實時定 量RT-PCR檢測結(jié)果。圖21顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞中間隙連接蛋白43表達的 免疫熒光染色檢測結(jié)果。圖22顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞的熒光漂白恢復實驗結(jié)果； 各組數(shù)據(jù)之間進行單因素方差分析a :t = -2. 350，P = 0. 05 ；b :t = -1. 276，P = O. 249。圖23顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，第1代腫瘤干細胞球生長情況檢測結(jié) 果；各組數(shù)據(jù)之間進行單因素方差分析a =F = 61. 82，P = 0. 000 < 0. 01 ；b =P = 0. 934 > 0. 05 ；c :P = 0. 000 < 0. 01 ；d :P = 0. 000 < 0. 01。圖24顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞的分化生長曲線。圖25顯示了皮下接種GJAl基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的腫瘤干細胞后，裸鼠的腫瘤生 長曲線。圖26顯示了皮下接種GJAl基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的腫瘤干細胞后，裸鼠的腫瘤組 織切片HE染色結(jié)果；光學顯微鏡放大倍數(shù)為200倍。圖27顯示了原位接種GJAl基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染的腫瘤干細胞后，裸鼠的腫瘤生 長情況和腫瘤組織切片HE染色結(jié)果；其中箭頭所指處為腫瘤，光學顯微鏡放大倍數(shù)為200 倍；右下角小圖為裸鼠腦組織。圖28顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，U87細胞分化標志物GFAP和干細胞標
6志物⑶133的實時定量RT-PCR檢測結(jié)果。圖29顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞的侵襲能力檢測結(jié)果[以 胎牛血清(FBS)為招引物]；各組數(shù)據(jù)之間進行單因素方差分析a =F = 22. 480,P = 0. 000
<0. 01 ；b :P = 0. 975 > 0. 05 ；c :P = 0. 000 < 0. 01 ；d :P = 0. 009 < 0. 01。圖30顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞的侵襲能力檢測結(jié)果[以 基質(zhì)細胞衍生因子1 α (SDF-1 α )為招引物]；各組數(shù)據(jù)之間進行單因素方差分析a =F = 16. 860，P = O. 000 < 0. 01 ；b :P = 0. 783 > 0. 05 ；c :P = 0. 004 < 0. 01 ；d :P = 0. 016
<0. 05。圖31顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞中E-Cadherin表達的 Western-blot 檢測結(jié)果。圖32顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒后，腫瘤干細胞中E-Cadherin表達的免疫 熒光染色檢測結(jié)果；其中Ad-Cx43轉(zhuǎn)染組的標尺為10 μ m, Ad-GFP轉(zhuǎn)染組的標尺為50 μ m。圖33顯示了轉(zhuǎn)染GJAl基因重組腺病毒的腫瘤干細胞接受SDF-I α刺激后，磷酸 化AKT和ERK1/2表達的Western-blot檢測結(jié)果。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中的主要試劑堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自Upstate公司， 表皮細胞生長因子(EGF)和胰島素(insulin)購自Sigma公司，自血病抑制因子(LIF) 購自Chemicon公司，B27添加劑購自Gibco公司；小鼠抗人nestin單克隆抗體、兔抗人 MBP多克隆抗體、小鼠抗人β-tubulin III單克隆抗體、小鼠抗人Sox2單克隆抗體和小 鼠抗人01 igo2單克隆抗體購自Chemicon公司，小鼠抗人CD133單克隆抗體購自Abcam公 司，兔抗人0ct4多克隆抗體購自BioVision公司，小鼠抗人⑶44s單克隆抗體購自Neo Markers公司，兔抗人GFAP多克隆抗體購自Dako公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊 抗兔IgG、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記山羊抗兔IgG和Cy3標記山羊抗鼠IgG購 自Molecular Probes公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Sigma公司，基質(zhì)膠 購自 Sigma 公司；試劑盒TaRaKa RNAPCR kit 3. 0 和 SYBR PrimeScript PCR kit 購自 TaRaKa公司，增強型化學發(fā)光試劑盒購自ECI公司，EnVision兩步法免疫組化試劑盒購自 Dako 公司，Adenovirus titer immunoassay Kit 購自 Cell Biolabs 公司，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)購自 Dojindo 公司。優(yōu)選實施例中的主要儀器KYKY-EM3200型掃描電子顯微鏡購自北京中科科儀技 術(shù)發(fā)展有限責任公司，JEM-2000EX型透射電子顯微鏡購自日立公司，AlphaEase FC凝膠 圖像分析軟件購自Alpha Innotech公司，Coulter Epics XL型流式細胞儀購自Beckman Coulter公司，MiRCURY 微陣列系統(tǒng)購自Exiqon公司，μ Quant型酶標儀購自Bio-TEK公司。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實 驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或 按照制造廠商所建議的條件。一、腫瘤干細胞的分離與鑒定
1、腫瘤干細胞的分離分別從人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87、乳腺癌細胞系MCF-7、結(jié)腸癌細胞系HCT116以及 6例人原代惡性膠質(zhì)瘤標本Pl P6(如圖1所示)中分離腫瘤干細胞。從U87、MCF-7或HCT116中分離腫瘤干細胞在24孔培養(yǎng)板中，將U87、MCF-7或 HCTl 16細胞以2X IO4/孔的密度接種于500 μ 1含有體積分數(shù)為10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基 中，在溫度為37°C、C02體積分數(shù)為5%和飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接種后12 18小時，加 入500 μ 1無血清干細胞培養(yǎng)基，之后每隔24小時半量更換新鮮無血清干細胞培養(yǎng)基1次； 5日后，更換為完全無血清干細胞培養(yǎng)基；約1周后，待懸浮生長的腫瘤干細胞球增大至每 球含200個細胞時，收集細胞球，吹打成單細胞懸液，再接種于無血清干細胞培養(yǎng)基中進行 傳代。從Pl Ρ6中分離腫瘤干細胞將Pl Ρ6剪成約1 X 1 X Imm大小的碎塊，接種 于0. 5ml FBS中，在溫度為37°C、C02體積分數(shù)為5%和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，接種4小時 后，加入3ml含有體積分數(shù)為10 %的FBS的DMEM培養(yǎng)基，待單層細胞出現(xiàn)后，用質(zhì)量分數(shù)為 0. 25%的胰酶溶液消化，吹打成單細胞懸液，再接種于無血清干細胞培養(yǎng)基中，約1 2周 后，待懸浮生長的腫瘤干細胞球增大至每球含100個細胞時，收集細胞球，吹打成單細胞懸 液，再接種于無血清干細胞培養(yǎng)基中進行傳代。上述無血清干細胞培養(yǎng)基的組成如下DMEM/F12培養(yǎng)基，其中含有濃度為20ng/ ml的bFGF、濃度為20ng/ml的EGF、濃度為10ng/ml的LIF、濃度為4U/L的胰島素和1 XB27。2、腫瘤干細胞的鑒定(1)腫瘤干細胞及其分化細胞的形態(tài)鑒定分別將U87、MCF_7、HCT116和Pl P6細胞接種于無血清干細胞培養(yǎng)基后，絕大多 數(shù)細胞呈懸浮狀態(tài)，極少數(shù)細胞貼壁分化，24 48小時后培養(yǎng)基中開始出現(xiàn)懸浮生長的腫 瘤干細胞球，初始細胞球較小，由4 16個細胞組成，細胞呈圓形，大小一致，折光性強，立 體飽滿，此后懸浮于培養(yǎng)基中的細胞球逐漸增多，體積逐漸增大，形態(tài)更加規(guī)則(如圖2A I所示)。傳代后，腫瘤干細胞球的生長過程及細胞形態(tài)與第一代保持一致。分別將來源于U87、MCF_7、HCT116和Pl P3的腫瘤干細胞球用含有質(zhì)量分數(shù)為 10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基誘導分化，6小時后球體貼壁，有少數(shù)細胞從球體遷出，24小時后 球體變扁，遷出的細胞明顯增多，3 5天后大量細胞從球體遷出，緊密圍繞在球體周圍，分 化成為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞樣細胞，細胞核大小不一，異質(zhì)性明顯(如圖2J O所示)。(2)腫瘤干細胞及其分化細胞的標志物鑒定采用免疫熒光染色鑒定腫瘤干細胞及其分化細胞的標記物mestin、⑶133、0ct4 和CD44s(干細胞標記物)，GFAP(星形膠質(zhì)細胞標記物)，MBP(少突膠質(zhì)細胞標記物)， β -tubulinIII (神經(jīng)元標記物)。分別將來源于U87、MCF-7、HCTl 16和Pl P3的腫瘤干細胞球用PBS漂洗后，用 質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液于室溫下固定20分鐘制備細胞爬片，或用冷丙酮于4°C固 定20分鐘制備冰凍切片，加入一抗小鼠抗人nestin單克隆抗體、小鼠抗人CD133單克隆 抗體、兔抗人0ct4多克隆抗體或小鼠抗人CD44s單克隆抗體，4°C孵育過夜，用PBS漂洗后， 再加入相應(yīng)的二抗FITC(綠色熒光)標記山羊抗兔IgG、TRITC(紅色熒光)標記山羊抗兔 IgG或Cy3 (紅色熒光)標記山羊抗鼠IgG，37°C孵育1小時，用PBS漂洗后，再用DAPI (藍色熒光)標記細胞核，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖3所示，可見來源于U87的腫 瘤干細胞球nestin、CD133、0ct4和CD44s表達呈陽性，來源于MCF-7和HCTl 16的腫瘤干細 胞球⑶44s表達呈陽性；來源于Pl P3的腫瘤干細胞球nestin和⑶133表達呈陽性。分別將來源于U87和Pl的腫瘤干細胞球用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的FBS的DMEM培 養(yǎng)基誘導分化2周，用PBS漂洗后，用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液于室溫下固定20分鐘 制備細胞爬片，或用冷丙酮于4°C固定20分鐘制備冰凍切片，加入一抗兔抗人GFAP多克 隆抗體、兔抗人MBP多克隆抗體、小鼠抗人β-tubulin III單克隆抗體、小鼠抗人nestin單 克隆抗體或小鼠抗人CD133單克隆抗體，4°C孵育過夜，用PBS漂洗后，再加入相應(yīng)的二抗 FITC(綠色熒光)標記山羊抗兔IgG、TRITC(紅色熒光)標記山羊抗兔IgG或Cy3 (紅色熒 光)標記山羊抗鼠IgG，37°C孵育1小時，用PBS漂洗后，再用DAPI (藍色熒光)標記細胞 核，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖4所示，可見來源于U87和Pl的腫瘤干細胞球的 分化細胞DFAP、MBP和β-tubulin III表達呈陽性，同時還有散在的細胞nestin和⑶133 表達呈陽性，提示來源于U87和Pl的腫瘤干細胞具有多向分化潛能，同時，在含血清培養(yǎng)基 中，仍有少量細胞保持其干細胞狀態(tài)。(3)腫瘤干細胞的成瘤能力鑒定取4周齡雌性裸鼠，于皮下或原位接種來源于U87或P3的腫瘤干細胞，接種6 8周后，取腫瘤組織，用含有質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛的飽和蔗糖溶液固定，8 μ m切片，HE 染色，置光學顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖5所示，可見由來源于U87和P3的腫瘤干細胞形成的 腫瘤具備人多形性膠質(zhì)母細胞瘤的病理學特征①壞死；②病理性核分裂相；③血管豐富， 密度高；④多形性；⑤蟹爪樣侵襲，腫瘤邊界不清。二、腫瘤干細胞中間隙連接通訊的功能狀態(tài)及間隙連接蛋白的表達情況1、腫瘤干細胞存在間隙連接通訊障礙采用熒光漂白恢復(Fluorescence Recovery after Photobleaching，F(xiàn)RAP)實驗 評估腫瘤干細胞間的間隙連接通訊情況。分別將來源于U87、MCF-7、HCTl 16和P2 P3的腫瘤細胞(腫瘤干細胞球、貼壁 未成球腫瘤細胞、腫瘤干細胞球的分化細胞)接種于蓋玻片上，用含有濃度為1.25mmol/l 的CaCl2和濃度為0. 5mmol/l的MgCl2的Hank’ s液漂洗細胞3次，用濃度為10 μ g/ml的 5 (6)-羧基熒光素二乙酸鹽[5(6)-CFDA]于37°C孵育15分鐘，再用含有濃度為1. 25mmol/l 的CaCl2和濃度為0. 5mmol/l的MgCl2的Hank’ s液漂洗細胞3次，在激光共聚焦顯微鏡下 選擇至少與3個以上細胞相鄰的腫瘤細胞作為實驗?zāi)[瘤細胞，同時選擇與其它細胞不相鄰 的腫瘤細胞作為對照，將實驗?zāi)[瘤細胞以激光漂白至初始熒光強度的50 90%，記錄4分 鐘內(nèi)胞內(nèi)熒光強度的恢復情況，按下述公式計算恢復率恢復率％=(恢復后熒光強度-漂 白后熒光強度)/(漂白前熒光強度-漂白后熒光強度)X 100，實驗?zāi)[瘤細胞漂白前后和恢 復后的熒光強度用對照腫瘤細胞進行校正。結(jié)果如圖6和表1所示，除了來源于HCT116的 腫瘤干細胞外，來源于U87、MCF-7和P2 P3的腫瘤干細胞的恢復率均明顯低于相應(yīng)的貼 壁未成球腫瘤細胞或腫瘤干細胞球的分化細胞，提示腫瘤干細胞間的間隙連接通訊明顯降 低。表1不同來源的腫瘤細胞的熒光漂白恢復率(又±SD%)
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權(quán)利要求
間隙連接蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隙連接蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤干細胞為膠質(zhì) 瘤干細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隙連接蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述藥物包括間隙連接 蛋白和藥學上可接受的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的間隙連接蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述 間隙連接蛋白為間隙連接蛋白43。
5.間隙連接蛋白編碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的間隙連接蛋白編碼基因的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤干細 胞為膠質(zhì)瘤干細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的間隙連接蛋白編碼基因的應(yīng)用，其特征在于所述藥物包括 間隙連接蛋白編碼基因重組表達載體和藥學上可接受的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一權(quán)利要求所述的間隙連接蛋白編碼基因的應(yīng)用，其特征在 于所述間隙連接蛋白編碼基因為間隙連接蛋白43的編碼基因GJA1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的間隙連接蛋白編碼基因的應(yīng)用，其特征在于所述間隙連接 蛋白編碼基因重組表達載體為GJAl基因重組腺病毒，所述GJAl基因重組腺病毒是將人 GJAl基因表達盒插入El區(qū)缺失的復制缺陷型腺病毒載體的El區(qū)缺失位置而得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的間隙連接蛋白編碼基因的應(yīng)用，其特征在于所述人GJAl 基因表達盒包括啟動子、人GJAl基因cDNA和終止子，所述啟動子為CMV，所述終止子為 PloyA0
全文摘要
本發(fā)明公開了間隙連接蛋白及其編碼基因在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明考察了腫瘤干細胞中間隙連接通訊的功能狀態(tài)、間隙連接蛋白的表達情況以及其同腫瘤干細胞特殊生物學特性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，同分化腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞中存在間隙連接通訊障礙，細胞間未見明顯間隙連接樣結(jié)構(gòu)，多種間隙連接蛋白表達下調(diào)，尤其是間隙連接蛋白43(Cx43)；Cx43的表達下調(diào)與其編碼基因GJA1啟動子甲基化以及microRNA的表達相關(guān)；恢復Cx43在腫瘤干細胞中的表達，能夠顯著降低腫瘤干細胞的自我更新能力、成瘤能力和侵襲能力，這與間隙連接通訊功能的部分恢復、E-鈣粘素表達上調(diào)以及SDF-1/CXCR4下游信號通路(AKT和ERK1/2)失活有關(guān)；提示間隙連接蛋白及其編碼基因可用于制備逆轉(zhuǎn)腫瘤干細胞惡性表型的藥物。
文檔編號A61K48/00GK101966332SQ20101050806
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者余時滄, 卞修武, 姜建勇, 平軼芳, 王清良, 肖華亮 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院