專利名稱：Cntf(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活物在治療肥胖癥上的用途的制作方法
CNTF (睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體激活物在治療肥胖癥上的
用途本發(fā)明的主題是激活CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體的分子-例如hCNTF(人 CNTF)或hCNTF的突變體-作為有效成分在制備適于治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病之藥物 組合物上的用途。術(shù)語hCNTF突變體意指理論上可以從hCNTF經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代衍 生的氨基酸序列。在工業(yè)國家中影響成年人口 30%的肥胖癥，是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，因?yàn)樗?與II型糖尿病、高血壓、血脂過多和增加的死亡率有關(guān)。肥胖癥是陽性能量平衡的結(jié)果，即 熱量攝入與能量消耗提高的比例的結(jié)果。由于在故意的和非故意的改變后恢復(fù)脂肪群的機(jī) 制的操作，治療一般是不成功的(1)。脂郁積(lipostasis)理論提出體脂肪貯存的多少由 反饋環(huán)調(diào)節(jié)，所說的反饋環(huán)由脂細(xì)胞來源的循環(huán)分子構(gòu)成，這些分子作用于下丘腦降低食 欲并增加能量消耗(2)。最近鑒定的16-千道爾頓血漿蛋白質(zhì)1印tin滿足許多從這樣的脂郁積激素預(yù)期 的標(biāo)準(zhǔn)(3)。在嚙齒類和人類中，它在脂肪組織中表達(dá)，并且其血漿水平與體重指數(shù)密切相 關(guān)G)。在肥胖(ob/ob)突變小鼠中缺乏1印tin導(dǎo)致體脂肪大量增加，這可以由全身施用 重組蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)(5，6，7)。然而，人肥胖癥似乎不是由于1印tin缺損的表達(dá)，因?yàn)橄鄬?duì)于瘦 人而言，在胖人中顯示增加的1印tin信使核糖核酸和血漿蛋白質(zhì)水平0)。這樣，胖人可 能對(duì)1印tin的脂郁積作用不靈敏，有可能是因?yàn)樵?印tin轉(zhuǎn)運(yùn)水平，Ieptin受體活性，或 后-受體性信號(hào)機(jī)制上有缺陷(8)。這樣，在這一特殊領(lǐng)域中需要一些在對(duì)1印tin具有抵抗力的人群中能夠治療肥 胖癥的新藥劑。L印tin抗性是糖尿病(db/db)小鼠突變體的特征，該突變體表達(dá)缺乏大多數(shù)胞質(zhì) 內(nèi)結(jié)構(gòu)域的Ieptin受體的截短的形式(9)。更密切類似人肥胖癥的動(dòng)物模型是由飼喂高脂 肪食物產(chǎn)生的小鼠(DI0小鼠)的模型。類似于人肥胖癥患者，DIO小鼠具有提高的1印tin 的血漿水平(4)，說明它們對(duì)激素的體重減輕作用比較不靈敏。本發(fā)明提供了生物活性的抗肥胖劑，其可以逆轉(zhuǎn)肥胖，以及與此相聯(lián)系的血糖過 多和血胰島素增多。因此，本發(fā)明的主題是激活CNTF受體的物質(zhì)在制備適于治療肥胖癥和與其相關(guān) 的疾病之藥物上的用途。這些物質(zhì)可以是hCNTF(人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；SEQ ID NO=D自身 或者其突變體(參見例如SEQ IDNO :2-28)。采用hCNTF突變體(Serl66Asp/Glnl67His)， 已經(jīng)獲得了良好的結(jié)果，該突變體在159位到178位，具有下列氨基酸序列(如所附序列表 中 SEQ ID N0:5 所示):Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp Hi s Trp Thr Val Arg Ser IleHis Asp Leu Arg Phe[為簡(jiǎn)便起見，這一 hCNTF突變體在下文也將稱為DH-CNTF]。為 簡(jiǎn)便起見，在所附序列表中，僅標(biāo)明了突變體SEQID NO 2-22的159-位到178位的部分。本發(fā)明的另一個(gè)主題是編碼hCNTF或其突變體的DNA在制備用于治療肥胖癥和與 其相關(guān)的疾病的組合物上的用途。本發(fā)明也具有作為其主題的用于治療肥胖癥和減輕體重的藥物，該藥物含有作為至少一種有效成分的hCNTF或其突變體，并且含有藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的 載體指對(duì)患者不危險(xiǎn)，不降解或不使有效成分失活或者不干擾有效成分的作用的載體。優(yōu) 選的載體是生理鹽溶液，但是也可以施用其它藥學(xué)上可接受的載體，并且易于由本領(lǐng)域技 術(shù)人員所確定。在已顯示出好的結(jié)果的實(shí)施方案中，hCNTF或其突變體可以用于與1印tin 組合在這種情況下，野生型或突變型CNTF/1印tin的比率可以在1 500-1 5，優(yōu)選地 在1 100-1 25的范圍內(nèi)選擇。hCNTF或hCNTF變體可以以約1_10，000 μ g/kg體重范圍內(nèi)的劑量施用給需要治療 的患者。優(yōu)選的劑量在10和1000 μ g/kg體重之間。成年人典型的日劑量在1和IOOmg之 間。按照本發(fā)明的有效成分的必需量可以以每日一次用藥或全天多次用藥來施用。治療方 案可以需要延長(zhǎng)期的施用。所施用的劑量大小須由醫(yī)生確定，并且取決于一些因素，如疾病 的性質(zhì)與特性，患者的年齡和健康狀況，患者對(duì)藥物自身的耐受性。在特定的實(shí)施方案中，為了獲得快速體重的顯著的降低(5-10% )(使用適當(dāng)?shù)纳?食和/或體育鍛煉可以持續(xù)保持這種狀態(tài))，可以借助短期(1-2周)每日施用hCNTF或其 突變體來治療肥胖患者?；钚缘鞍踪|(zhì)分子可以配制來供腸胃外，鼻，支氣管或眼施用。按照本發(fā)明的藥物組 合物優(yōu)選地是借助注射腸胃外施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸胃外施用是皮下或肌內(nèi)施用。 其它施用的有效方法是施用靜脈內(nèi)注射劑，緩釋腸胃外制劑，吸入霧劑，或栓劑。在緩釋制 劑中，主要溶劑可以是含水或非水類型的。此外，載體可以含有保持或改變制劑的PH值，粘 度，澄清度，顏色，無菌性，穩(wěn)定性，分解速度或氣味的其它藥理學(xué)上可接受的賦形劑。同樣， 載體也可以含有改變或保持有效成分的穩(wěn)定性，分解速度，釋放，或吸收的其它藥理學(xué)上可 接受的賦形劑。這些賦形劑是通常用來配制供腸胃外施用的藥劑(單劑形式和多劑形式) 的物質(zhì)。如上所提及的，按照本發(fā)明的制劑的優(yōu)選的腸胃外施用形式是皮下或肌內(nèi)。最優(yōu) 選的腸胃外施用形式是皮下。為了獲得有效成分的所需日劑量，采取單次或重復(fù)皮下或肌 內(nèi)注射是可能的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，有效成分的劑量在10和IOOOyg/ kg/天之間。為了治療肥胖癥，周期性地施用有效成分可能是合乎需要的。周期性地施用可 以采取每月，每-兩周，每周，每日或每小時(shí)施用一次的形式。施用所需的頻率對(duì)基于標(biāo)準(zhǔn) 的觀測(cè)技術(shù)治療患者的醫(yī)生而言是顯而易見的?？紤]按照本發(fā)明的藥物制劑的口服也是可能的。在這種情況下，所施用的有效成 分優(yōu)選地是膠囊化的?？梢阅z囊化的有效成分可以用或不用通常用于制備固體藥劑的載體 配制。優(yōu)選地，當(dāng)生物利用度被最大化，同時(shí)前-系統(tǒng)降解被最小化時(shí)，膠囊以使得制劑的 活性部分在胃腸道中釋放的方式制備。所說的制劑也可以包含以有利于有效成分的吸收為 目的的其它賦形劑。使用稀釋劑，調(diào)味劑，低熔點(diǎn)蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，膠囊分解劑和 結(jié)合劑也是可能的。特定的劑量按照患者的近似體重計(jì)算，而不依賴于施用方法。確定適當(dāng)?shù)闹委焺?量所需的計(jì)算的其它工作由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行，他們可以獲得這些結(jié)果而不 需要過度的實(shí)驗(yàn)，尤其是在本文所提供的試驗(yàn)和用藥信息的教導(dǎo)下。按照本發(fā)明，對(duì)肥胖患者施用治療有效量的有效成分。如上所提及的，所需的劑量 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定而無須過度的實(shí)驗(yàn)?！爸委熡行Я?可以被定義為足以引起足夠的體重減輕并且導(dǎo)致代謝參數(shù)(如肥胖患者的血液葡萄糖水平)后續(xù)正常化的有效成分的量。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)給出了本發(fā)明的一般性描述。借助于下列實(shí)施例，參照特定的實(shí) 施方案，以下給出更詳細(xì)的說明，目的是為了更好地理解本發(fā)明的目的，特征，優(yōu)點(diǎn)和操作 方法。然而，無意于將本發(fā)明的范圍限定在此范圍內(nèi)。附圖描述圖IhCNTF和1印tin在遺傳性肥胖小鼠(ob/ob和db/db)和患飲食誘導(dǎo)的肥胖癥 (DIO)的小鼠中對(duì)體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。在第0天開始， 小鼠每日接受腹膜內(nèi)注射的載體或蛋白質(zhì)(數(shù)量以yg/只小鼠表示)。體重以在-2天的 原始體重的百分?jǐn)?shù)表示，并表示為平均值士s. e.m(對(duì)ob/ob和db/db η = 3，對(duì)DIO小鼠η =5)。每一組載體處理的動(dòng)物的基線重量(克)為ob/ob，49. 3士0. 3 ;db/db，39. 1 士2. 5 ； DI0,42. 6士0. 8。由重復(fù)測(cè)量ANOVA確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對(duì)于所有組，處理的作用，時(shí)間以 及時(shí)間X處理的P-值分別是P < 0. 05，P < 0. 0001和P < 0. 01。圖2在DIO小鼠中，單獨(dú)施用或組合施用hCNTF (2 μ g/只小鼠)和1印tin (100 μ g/ 只小鼠)對(duì)體重減輕的作用。小鼠每日接受腹膜內(nèi)注射的所示的藥劑。圖3在肥胖對(duì)瘦小小鼠中，DH-CNTF對(duì)體重和食物攝取的作用的持續(xù)時(shí)間。以5 只一組圈養(yǎng)的C57BL/KS db/db小鼠(圓圈)或年齡和性別搭配的C57BL/KS+/+小鼠(方 塊)，接受每日腹膜內(nèi)注射載體(空心符號(hào))或IOyg DH-CNTF (實(shí)心符號(hào))，共25天。從 第26天起，所有小鼠用載體處理。食物攝取是每組所消耗的克數(shù)除以5。圖4DH-CNTF處理肥胖小鼠對(duì)尸體組成的影響。小鼠每日腹膜內(nèi)注射載體或IOyg DH-CNTF處理10天。結(jié)果為平均值士 s. e. m. (n = 5)。*Ρ < 0. 05 ；料P < 0. 01 (對(duì)載體， 由t-檢驗(yàn))。圖51印tin和hCNTF在神經(jīng)元細(xì)胞系中對(duì)STAT因子活化的影響。人OB-Rb的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染的GT-1-7和SN-56細(xì)胞在存在或不存在指示細(xì)胞因子(lOOng/ml)下培養(yǎng)10 分鐘。細(xì)胞STAT因子的活化由電遷移率變換測(cè)定法測(cè)定。箭頭指結(jié)合的STAT3同二聚體， STATl :STAT3雜二聚物，以及STATI同二聚體遷移的位置。圖6由原位雜交測(cè)定的1印tin (OB-Rb)和CNTF(CNTF受體-([CNTFRa和LIFR) 的受體亞單位在小鼠下丘腦中的表達(dá)。A，弓狀核；P，副室核。(X100)圖7 1印tin和hCNTF在小鼠下丘腦中對(duì)tis-11表達(dá)的影響。接受腹膜內(nèi)注射載 體，1印tin (100 μ g)或DH-hCNTF(10 μ g)的三只ob/ob小鼠組在1小時(shí)后經(jīng)頸部脫位宰殺。 采用對(duì)鼠tis-11特異性的35S-標(biāo)記的CRNA探針，在載體或蛋白質(zhì)處理的小鼠的冰凍冠腦 切片上完成原位雜交。實(shí)施例IhCNTF和其突變體DH-CNTF的抗肥胖作用蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如以前的描述(11)在大腸桿菌BL21中產(chǎn)生重組人類CNTF和 DH-CNTF0按照Memmer等的方法(12)利用合成寡脫氧核糖核酸經(jīng)PCR裝配人1印tin的 DNA編碼序列，并且亞克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒pRSET-5d(13)。利用與hCNTF相同的方案產(chǎn)生 人1印tin。為了除去細(xì)菌酯多糖，經(jīng)反相HPLC(Il)純化所有的蛋白質(zhì)。當(dāng)用鱟屬阿米巴樣 細(xì)胞測(cè)定(西格瑪)時(shí)，純化的制劑含有不到5毫微克內(nèi)毒素/mg蛋白質(zhì)。
動(dòng)物研究。采用雄性10-11周齡C57BL/6J ob/ob和C57BL/KSdb/db小鼠，以及19 周齡AKR/J小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所說AKR/J小鼠通過從12周開始進(jìn)食高脂肪食物(14)表現(xiàn)出 肥胖。除了以其它方式注明的外，在12小時(shí)光照-黑暗循環(huán)(7:30時(shí)開始光照，19:30時(shí)停 止)下，將動(dòng)物在單個(gè)籠子中圈養(yǎng)，隨時(shí)可得到水和標(biāo)準(zhǔn)的或高脂肪的(AKR小鼠)嚙齒動(dòng) 物食物。在開始用載體或細(xì)胞因子治療(0天)之前，對(duì)它們習(xí)慣性地每日(9:00)腹膜內(nèi) 注射載體(0. 9%鹽水，0. 2mg/ml無內(nèi)毒素牛血清清蛋白)兩天。注射后稱量動(dòng)物，通過記 錄在食物盤子中余下的食物的量確定食物攝取量。MM人睫神經(jīng)營養(yǎng)因子(hCNTF),其突變體DH-CNTF(IO) [ (Serl66Asp/Glnl67His) hCNTF]；對(duì)CNTF α -受體具有40-倍高的親和性的hCNTF的突變體)和人1印tin在遺傳性 肥胖小鼠以及飲食誘導(dǎo)的肥胖癥的小鼠(DIO)中試驗(yàn)生物學(xué)活性。這些肥胖癥和糖尿病模 型在本領(lǐng)域一般被接受為肥胖病態(tài)的指示。在這些模型中顯示抗肥胖作用的藥劑在其它哺 乳動(dòng)物(特別是人)中將顯示類似的作用。如在以下將更清楚地看到的，本發(fā)明的化合物在以上所論及的所有生物學(xué)試驗(yàn)中 是活性的，并且也發(fā)現(xiàn)它們是抗肥胖劑。此外，它們?cè)谀孓D(zhuǎn)與肥胖癥相聯(lián)系的血糖過多與血 胰島素增多中是活性的。因此認(rèn)為這些化合物在人糖尿病的血糖過多的治療中也將有用。依據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果(6-8，15)，發(fā)現(xiàn)對(duì)不表達(dá)功能性1印tin的突變ob/ob小 鼠全身性施用1印tin逆轉(zhuǎn)與1印tin缺損有關(guān)的肥胖以及飲食過多。對(duì)ob/ob小鼠每日 腹膜內(nèi)施用hCNTF (在2和50 μ g/只小鼠之間；相對(duì)于40-1000 μ g/kg體重)也產(chǎn)生體 重的逐步和劑量依賴性降低，并且產(chǎn)生食物攝取的迅速降低(

圖1)。在實(shí)驗(yàn)的最高劑量 (50 μ g ； 1000 μ g/kg)時(shí)，hCNTF在7天之后引起體重降低16% (與載體處理的對(duì)照中5% 增加相比)，并引起食物攝取的5-倍降低。這些作用在大小上與IOOyg(2000 μ g/kg)劑 量的1印tin的作用是可比較的(在體重和食物攝取上分別為13%和95%降低；t-檢驗(yàn)P < 0. 0001)。在劑量低于hCNTF的約5倍時(shí)，hCNTF變體DH-CNTF在體重和食物攝取上產(chǎn)生 類似的降低。這一結(jié)果與具有降低的受體相互作用(數(shù)據(jù)未顯示出)的hCNTF變體的活性 缺乏(11) 一起表明，hCNTF的抗肥胖作用是由特異性CNTF受體的活化介導(dǎo)的。db/db突變小鼠對(duì)1印tin不產(chǎn)生反應(yīng)(6-8，15)，這是因?yàn)榫幋a1印tin受體OB-R 的基因的突變，其導(dǎo)致產(chǎn)生具有截短的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的受體剪接變體(9，29)。相反以 hCNTF治療db/db小鼠引起劑量和時(shí)間依賴性重量喪失和食物攝取抑制(圖1)。超激動(dòng)劑 DH-CNTF在約hCNTF 1/5劑量時(shí)，引發(fā)可比較的作用。在ob/ob和db/db小鼠中獲得的結(jié)果 顯示不是通過刺激1印tin釋放或通過直接激活1印tin受體起作用。經(jīng)進(jìn)食高脂肪食物患有肥胖癥的AKR小鼠(DI0小鼠)以前已報(bào)道對(duì)1印tin的 重量和食欲降低作用不如ob/ob小鼠敏感(7)。這一發(fā)現(xiàn)以及在DIO小鼠中的1印tin血 漿水平高于瘦弱小鼠中的觀察結(jié)果，導(dǎo)致提出這樣一種觀點(diǎn)食物誘導(dǎo)的肥胖與Ieptin抗 性相關(guān)(4，17)。如圖1所示，用人1印tin (100 μ g，2500 μ g/kg)處理DIO小鼠5天引起體 重(7士 <0.05，對(duì)載體)和食物攝取(27士2%;p < 0.05)中等程度的降低。相反， hCNTF(50 μ g，1250 μ g/kg)和 DH-CNTF(10 μ g，250 μ g/kg)引起體重(分別為 19士 禾口 對(duì)士1% ；ρ < 0. 0001)和食物攝取(分別為76士4% ；和73士7% ；ρ < 0. 0005)上更強(qiáng)烈 的降低。在db/db和DIO小鼠兩者中hCNTF可以逆轉(zhuǎn)肥胖的發(fā)現(xiàn)對(duì)治療人肥胖癥具有重要意義，這種肥胖癥已被認(rèn)為與1印tin的抗性相關(guān)(4，18，19)?？梢钥吹剑逝中∈竺咳战邮芨鼓?nèi)施用hCNTF或突變DH-CNTF，劑量從2到 50 μ g，相當(dāng)于50到1000 μ g/kg體重。在最高劑量時(shí)，在治療5天后，化合物引起體重10% 以上的降低。因此，為誘導(dǎo)體重快速降低(5-10% )對(duì)患有肥胖癥的患者施用在1000 μ g/ kg以下的hCNTF或DH-CNTF，優(yōu)選的劑量是約100 μ g/kg。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案的這一 形式中，每天施用hCNTF或DH-CNTF —次，連續(xù)處理幾天，直到獲得所需的體重減輕。實(shí)施例2在DIO小鼠中1印tin與hCNTF協(xié)作增加抗肥胖作用對(duì)肥胖DIO小鼠每日腹膜內(nèi)注射1印tin(IOOyg ；相當(dāng)于2500 μ g/kg)以及小劑 量的Qyg相當(dāng)于50μ g/kg)的hCNTF。兩種藥劑本身均不產(chǎn)生明顯的體重減輕。這一處 理具有產(chǎn)生強(qiáng)的，協(xié)同的體重減輕的作用(圖2)。這一結(jié)果證明，小劑量的hCNTF可以用于 在與1印tin抗性相關(guān)的肥胖模型中給出明顯增加的1印tin作用。實(shí)施例3DH-CNTF的抗肥胖作用的持續(xù)時(shí)間和特異性^^行為研究。通過記錄在3小時(shí)的黑暗的循環(huán)期間小鼠跨過其籠子中央的次數(shù)測(cè)定 運(yùn)動(dòng)活性(21: OOhr-M: OOhr)。采用0到3級(jí)分類(0，沒有活性；1，弱；2，正常；3，超活)，通 過在籠子中的集中觀察(在30分鐘光照循環(huán)期間各在1分鐘內(nèi)觀察5次)估價(jià)Grooming 行為。采用具有作為新味道的0. 糖精的兩瓶樣品完成對(duì)調(diào)節(jié)的味道厭惡測(cè)定。身體組成。將屠體勻漿，并將2-克等分試樣凍干，然后在90°C下烘干直到重量恒 定。然后以乙醚/乙醇OO l，v/v)提取脂肪01)。從脫水和脂肪提取后的重量差異分 別計(jì)算水和脂肪質(zhì)量，瘦肉質(zhì)量定義為剩下的屠體量。MM以前報(bào)道hCNTF在正常的小鼠中引起瞬時(shí)的體重減輕和食物攝取降低(22)，此 后，還沒有研究其對(duì)肥胖動(dòng)物的作用。因此確定它對(duì)肥胖小鼠的作用是否敏感是重要的。 如圖3所示，DH-hCNTF產(chǎn)品在肥胖小鼠中產(chǎn)生延長(zhǎng)的作用。以DH-CNTF 25-天處理db/db 小鼠導(dǎo)致體重逐漸和穩(wěn)步地減輕，至第8天達(dá)到相應(yīng)于年齡和性別相對(duì)的野生型小鼠的水 平。平行地，DH-CNTF引起食物攝取約50%的降低，在整個(gè)處理期間均保持。在用hCNTF處 理17天的ob/ob小鼠中獲得了類似的結(jié)果(未顯示數(shù)據(jù))。相反，在種系匹配的野生型小 鼠中，DH-CNTF僅引起瞬時(shí)作用。這樣，在瘦弱小鼠中DH-CNTF迅速降低食物攝取和體重改 變比率，但是這些作用在大約5和10天的處理后分別減弱(圖3)。在肥胖和瘦弱動(dòng)物之間所觀察到的區(qū)別的一種可能的解釋是hCNTF，類似于 1印tin (5，6)，有效地耗盡脂肪組織群體，以便其作用的程度和期限依賴于脂肪沉積的大 小。事實(shí)上，與載體處理的對(duì)照相比，DH-CNTF在ob/ob和db/db小鼠中特異性地降低身體 脂肪的百分比，而增加身體的水和瘦肉(圖4)。由DH-CNTF誘導(dǎo)的絕對(duì)重量損失可以通過 體脂肪的有效損失(伴隨著水質(zhì)量的小量減輕(參見圖4中的絕對(duì)重量))計(jì)量。在ob/ ob小鼠中Ieptin產(chǎn)生類似的作用(5，6)。這樣，在肥胖小鼠中，hCNTF引起特異性抗脂肪 作用。相反，已報(bào)道hCNTF在瘦弱小鼠中引起肌肉03)和蛋白質(zhì)04)重量的減輕。對(duì)這 一明顯差異的一種似是而非的解釋是hCNTF的有效的脂肪-消耗作用導(dǎo)致瘦弱動(dòng)物中體脂 肪幾乎全部損失(參見03)和我們未出版的結(jié)果)，這引起作為次要事件的蛋白質(zhì)損失。hCNTF不產(chǎn)生毒性，不舒服或疾病。不可逆毒性由以下發(fā)現(xiàn)排除，在db/db (圖2G，H)和ob/ob小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)兩者中，在中斷蛋白質(zhì)施用后，體重和食物攝取迅速回到 處理前的水平。與載體處理的對(duì)照比較，以DH-CNTFdOy g)處理db/db小鼠3天不明顯 改變運(yùn)動(dòng)活性(活性得分分別為43士6和49士6 ;n = 5)。同樣地，DH-CNTF處理不改變 grooming行為(活性得分對(duì)DH-CNTF和載體處理的分別為1. 2士0. 6和1. 0士0. 4)。此 外，DH-CNTF不引起任何習(xí)慣性行為的形成。蛋白質(zhì)引起對(duì)味道厭惡的可能性采用兩瓶具 有作為新味道的0. 1 %糖精的樣品在DIO小鼠中檢查。類似于1印tin(已報(bào)道其在ob/ ob小鼠(5)中降低水?dāng)z取)，DH-CNTF(IOyg)在調(diào)節(jié)2天后導(dǎo)致DIO小鼠水?dāng)z取的降低 (1. 8士0. 1ml 對(duì)在載體處理的對(duì)照中的 2. 8士0. 2ml ；η = 9 ;P < 0. 001)。然而，DH-CNTF 不引起對(duì)味道的討厭(糖精攝取為總液體的49士2%對(duì)對(duì)照的51 士4%)。這些結(jié)果表明 DH-CNTF的飽食作用不是因?yàn)榧?xì)胞因子誘導(dǎo)的疾病行為。實(shí)施例4hCNTF和DH-CNTF肥胖相關(guān)代謝缺陷的逆轉(zhuǎn)方法小鼠接受每日腹膜內(nèi)注射載體，1eptin (100yg)，hCNTF(50yg)或 DH-CNTFdOy g)。在配對(duì)飼喂實(shí)驗(yàn)和4)中，在前面的24小時(shí)期間，載體處理的小鼠隨 意飼喂或飼喂相同量的由DH-CNTF-處理的小鼠消耗的食物。在最后注射后的24小時(shí)(實(shí) 驗(yàn)1和3)，或在最后注射和移去食物后7小時(shí)(實(shí)驗(yàn)2和4)取血樣。用葡糖氧化酶方法測(cè) 定血清葡萄糖，并且利用大鼠胰島素作為標(biāo)準(zhǔn)，用放射免疫測(cè)定法(Amersham)測(cè)定血清胰 島素。結(jié)果除重量和食欲調(diào)節(jié)作用外，hCNTF和DH-CNTF能夠逆轉(zhuǎn)與ob和db突變相關(guān)的血 糖過多與血胰島素增多。攜帶有在C57BL/6背景上的ob突變的小鼠顯示出強(qiáng)的血胰島素增多(在2_3月 齡時(shí)具有幾乎正常葡萄糖水平)(25)，這可以通過1ept in處理予以糾正(5，6，15)。用 hCNTF或DH-CNTF處理ob/ob小鼠也導(dǎo)致血清胰島素水平的大的降低(表1，實(shí)驗(yàn)1和2)。 在C57BL/KS背景上的db/db突變體以嚴(yán)重的血糖過多為特征(在2-3月齡時(shí)具有幾乎正常 的胰島素水平)(26)。如以前所報(bào)道的(5，6，15)，1印tin不能在db/db小鼠中逆轉(zhuǎn)血糖過 多。相反hCNTF和DH-hCNTF導(dǎo)致添加的和耐久的血清葡萄糖水平兩者上2_3_倍的降低， 而不影響已經(jīng)低水平的胰島素(表1，實(shí)驗(yàn)3和4)。對(duì)細(xì)胞因子-處理的動(dòng)物的食物攝取， DH-CNTF的體重減輕和抗糖尿病作用超過由配對(duì)飼喂ob/ob或db/db小鼠引起的那些(表 1，實(shí)驗(yàn)2和4)。這些結(jié)果顯示hCNTF的作用，類似于1eptin (6，27，28)，不單獨(dú)因?yàn)榻档偷?食物攝取。在肥胖小鼠中1eptin，hCNTF和配對(duì)飼喂對(duì)體重改變和血清胰島素和葡萄糖的影響
權(quán)利要求
1.激活CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)受體的物質(zhì)在制備用于減輕體重之藥物組合物上的 用途，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)是hCNTF(人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)或其突變體。
2.按照權(quán)利要求1的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)是 由SEQ ID NO :23、M、25J6、27J8的序列組成的多肽或是由SEQ ID NO :1的修飾形式組 成的多肽，其中所述SEQ ID NO 1的修飾形式的159位到178位氨基酸被選自SEQ ID NO 2-22的序列替換。
3.按照權(quán)利要求1的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)是 SEQ ID NO 1的修飾形式，其中所述SEQ ID NO 1的修飾形式的159位到178位氨基酸被 SEQ ID NO 5 替換。
4.按照權(quán)利要求1的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述激活CNTF受體的物質(zhì)是 DH-CNTF。
5.按照權(quán)利要求1的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述的藥物組合物適于肥胖癥 的治療。
6.按照權(quán)利要求5的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述的藥物組合物適于治療與 肥胖癥相關(guān)的疾病。
7.按照權(quán)利要求6的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述的與肥胖癥相關(guān)的疾病是 血糖過多或血胰島素增多。
8.按照權(quán)利要求6的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述的與肥胖癥相關(guān)的疾病是 糖尿病。
9.編碼如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所定義的物質(zhì)的DNA分子在制備用于基因治療肥胖癥 的藥物組合物上的用途。
10.按照權(quán)利要求9的DNA分子的用途，其中所述的藥物組合物適于治療與肥胖癥相關(guān) 的疾病。
11.按照權(quán)利要求10的DNA分子的用途，其中所述的與肥胖癥相關(guān)的疾病是血糖過多 或血胰島素增多。
12.按照權(quán)利要求10的DNA分子的用途，其中所述的與肥胖癥相關(guān)的疾病是糖尿病。
13.按照權(quán)利要求1到8之任一項(xiàng)的激活CNTF受體的物質(zhì)的用途，其中所述的藥物組 合物以膠囊的形式制備。
14.一種用于減輕體重的藥物組合物，該組合物包含作為至少一種有效成分的如權(quán)利 要求1-12中任一項(xiàng)所定義的至少一種物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體。
15.按照權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述的有效成分是hCNTF或其突變體。
16.按照權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述的活性成分由SEQIDNO :23、24、25、26、 27、觀的序列組成的多肽或是由SEQ ID NO :1的修飾形式組成的多肽，其中所述SEQ ID NO 1的修飾形式的159位到178位氨基酸被選自SEQ ID NO :2_22的序列替換。
17.按照權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述活性成分是SEQID NO :1的修飾形式， 其中所述SEQ ID NO 1的修飾形式的159位到178位氨基酸被SEQ ID NO 5替換。
18.按照權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述活性成分是DH-CNTF。
19.按照權(quán)利要求14-18之任一的藥物組合物，其中所述的藥物組合物還包含有效成 分Ieptin或類Ieptin分子。
20.按照權(quán)利要求19的藥物組合物，其中hCNTF和/或至少一種其突變體與Ieptin的 比率是 1 500-1 5。
21.按照權(quán)利要求19的藥物組合物，其中hCNTF和/或至少一種其突變體與Ieptin的 比率是 1 100-1 25。
22.按照權(quán)利要求14到21之任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述的藥物組合物還含有藥學(xué) 上可接受的賦形劑。
23.按照權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述的賦形劑有利于有效成分的吸收。
全文摘要
本發(fā)明涉及hCNTF(人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)，其突變體或激活CNTF受體的其它分子在制備用于治療肥胖癥和與其相關(guān)的疾病(例如血糖過多)之藥物上的用途。圖1顯示hCNTF和leptin在遺傳性肥胖小鼠和患飲食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)的小鼠中對(duì)體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102145163SQ201010282598
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者A·德馬提斯, A·迪馬科, D·拉扎羅, G·帕恩薩, G·西里伯特, I·格洛格恩, P·科斯塔, R·勞弗, R·科特斯 申請(qǐng)人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所