專利名稱：從丁香中提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種藥物制備方法，具體地說是一種從丁香中提取殺滅丙型肝炎病毒 藥物的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，難以治愈。丙型肝炎是由人體感染丙 型肝炎病毒引起的疾病。由于丙型肝炎病毒復(fù)制能力極強(qiáng)，病毒表面有一層堅硬外殼，一般 的藥物難以滲透進(jìn)病毒體內(nèi)，所以病毒難以殺滅，丙型肝炎也就難以治愈?，F(xiàn)有技術(shù)是用抗 病毒西藥治療，但是由于丙型肝炎病毒構(gòu)造的特殊性，只能使患者短時期減輕癥狀，無法根 治疾病。所以發(fā)明一種從植物中提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法，生產(chǎn)對人體無副作用， 能夠有效殺滅丙型肝炎病毒的藥物是一個重要的任務(wù)。丁香等可食性植物是大眾日常生活中喜愛的香辛料調(diào)味品。長期以來被認(rèn)為有抗 病防病作用。近年來國內(nèi)外研究證實(shí)香辛料對一些細(xì)菌、真菌具有一定的抑菌或殺菌活性。 但是對于從丁香能夠殺滅丙型肝炎病毒則沒有見報道；對于用什么方法提取丁香中含有的 殺滅丙型肝炎病毒物質(zhì)沒有見報道。經(jīng)檢索國內(nèi)外專利文獻(xiàn)，查閱國內(nèi)外公開出版物均未 見有從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法的報道。本發(fā)明利用安全、經(jīng)濟(jì)和便捷的丁 香來提取殺滅丙型肝炎病毒的藥物，對于治療丙型肝炎具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法，步驟如下(1) 丁香醇提殺滅丙型肝炎病毒藥物a.準(zhǔn)確稱取丁香20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95%乙醇浸泡2h ；b.用索氏提取器對上述樣品80°C熱回流4h ；c.將上述溶液過濾；過濾后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20重量份；d.將濃縮后的溶液過濾除菌，用DMEM培養(yǎng)液稀釋；(2) 丁香水提殺滅丙型肝炎病毒藥物a.準(zhǔn)確稱取丁香20重量份，粉碎至100目，加入120重量份的純水浸泡2h ；b.用索氏提取器對上述樣品80°C熱回流4h ；c.將上述溶液過濾；過濾后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20重量份；d.將濃縮后的溶液過濾除菌，用DMEM培養(yǎng)液稀釋。丁香為丁香植物的種子。DMEM培養(yǎng)液為富含氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基。本發(fā)明的要點(diǎn)是將丁香粉碎，經(jīng)95%乙醇浸泡、80°C熱回流、過濾、濃縮、除菌、 用DMEM培養(yǎng)液稀釋制成。臨床使用時根據(jù)需要配制成不同濃度藥物。
丁香取植物丁香的種子。DMEM培養(yǎng)液是一種富含氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是氨基酸和維生素含 量高；含有糖酵解途徑中的重要物質(zhì)——丙酮酸；含有微量的鐵離子。本發(fā)明利用國際上最新的能高效產(chǎn)生有體外感染活性的HCV病毒顆粒(HCVcc)的 Huh-7. 5. 1細(xì)胞模型為平臺，IFA實(shí)驗結(jié)果表明各種丁香提取液對HCVcc殺滅作用的效果 為丁香醇提液>丁香水提液。阻斷實(shí)驗顯示細(xì)胞經(jīng)過提取液處理后均不能阻止HCVcc的感 染。丁香水提液在20mg/ml濃度時能抑制細(xì)胞內(nèi)HCV增殖，在低濃度時無效。丁香醇提液 在低濃度下則有明顯的抑制效果。表明丁香抗病毒成分多以醇溶形式存在。三種濃度丁香 醇提液作用于細(xì)胞后，經(jīng)熒光定量PCR檢測顯示細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平顯著下降，顯示丁香液 能有效抑制病毒RNA的復(fù)制且呈劑量依賴，證實(shí)丁香提取液抑制HCV增殖是通過影響病毒 復(fù)制環(huán)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的。表明丁香抗HCV活性強(qiáng)。我們利用HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型Huh-7. 5. 1細(xì)胞為平臺，采用免疫熒光染色 法(Immunofluorescence assay, I FA)禾口焚光定量 PCR(fluorescentquantitative PCR, FQ-PCR)等技術(shù)，以丁香提取液為研究對象，在國內(nèi)首次提取抗丙型肝炎病毒的活性藥物。本發(fā)明的具體實(shí)施如下；將Huh-7. 5. 1細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37°C、5% C02 (CO2)飽 和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加100μ g/ml的鏈霉素和100U/ml的青霉素。此 細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)3天后，用0. 25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。HCVcc滴度為每毫升 培養(yǎng)上清IO5感染單位，保存于-80°C冰箱備用。香辛料提取液的制備丁香購自藥房。取丁香40g，分成兩份，每份20g，粉碎后一份用120ml 95%乙醇(約IlOg)浸泡、 另一份用120ml純水浸泡2h。隨后用索氏提取器對2份樣品分別進(jìn)行80°C熱回流4h，再過 濾，將每份樣品液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20ml，此為提取原液即Iml提取液含Ig原材料的 提取物(濃度為lg/ml)。在細(xì)胞室內(nèi)將4份提取原液進(jìn)行過濾除菌后，分別用DMEM培養(yǎng)液 進(jìn)行 1 10、1 50,1 IOOU 200,1 1000 稀釋，得到濃度分別為 100mg/ml、20mg/ ml、10mg/ml、5mg/ml、lmg/ml的提取液，以下簡稱為丁香醇提液、丁香水提液。丁香提取液處理HCVcc具有直接殺滅效果。雖不能阻斷Huh-7. 5. 1細(xì)胞感染 HCVcc，但能抑制感染細(xì)胞內(nèi)病毒的增殖，其機(jī)制是影響病毒RNA的合成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、原料便宜，成本低。2、方法簡單，提取方便。3、對丙型肝炎病毒有直接殺滅效果。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 提取液對Huh-7. 5. 1細(xì)胞毒性測定用胰酶消化Huh-7. 5. 1細(xì)胞，按2X IO4/孔的密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)6h，待細(xì)胞貼壁后，在每孔中分別加入不同濃度的各類提取液10 μ 1，37°C培養(yǎng)過夜，在每孔中加入10μ1 CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h。同時設(shè)立陰性對照，未加提 取液的細(xì)胞孔，加CCK-8、空白對照。用酶標(biāo)儀測定各孔450nm吸光度值OD值。實(shí)施例2 丁香提取液抗病毒活性為篩選丁香提取液有無抗HCV活性及其作用的強(qiáng)弱，以及發(fā)揮抗病毒作用的途 徑，設(shè)計以下三組平行實(shí)驗第一組殺滅病毒四類提取液均取3個濃度20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml各10μ 1首先和10 μ 1 HCVcc 等量混合，37°C作用4h后，再接種到96孔板內(nèi)，其中Hoh "7. 5. 1細(xì)胞密度為3 X IO4/孔。 培養(yǎng)72h后，進(jìn)行IFA實(shí)驗，檢測細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白表達(dá)。以HCVcc直接感染的一個孔為陽性 對照、以未加提取液、病毒的一個孔為陰性對照。第二組阻斷病毒感染將10 μ 1不同濃度提取液首先加到含有Huh-7. 5. 1細(xì)胞的96孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜， 棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每孔添加100 μ 1培養(yǎng)液后再加10 μ 1 HCVcc進(jìn)行病毒感染，同 時設(shè)立陽性、陰性對照。培養(yǎng)72h后進(jìn)行IFA檢測。第三組抑制病毒增殖將10 μ 1 HCVcc感染96孔板內(nèi)的Huh_7. 5. 1細(xì)胞，培養(yǎng)6h，棄培養(yǎng)液，用PBS洗 滌3次，每孔添加100 μ 1培養(yǎng)液后再加10 μ 1不同濃度提取液，同時設(shè)立陽性、陰性對照， 培養(yǎng)72h后進(jìn)行IFA檢測。實(shí)施例3 IFA檢測將96孔板中的培養(yǎng)上清吸掉，每孔加入100μ 1甲醇，置-20°C固定 20min，PBS 洗滌(3minX3 次)。每孔加入 0. 1 % TritonX-100 (用 PBS 配制)100 μ 1，室溫 透化30min，PBS洗滌3min/次X 3次。每孔加入含3% BSA的PBS 100 μ 1封閉液，室溫封 閉1小時。吸掉封閉液，每孔加入丙型肝炎患者血清50 μ 1，用封閉液做1 50稀釋的血 清，作為第一抗體，室溫孵育2h，PBS洗滌IOmin/次X 3次。每孔加入熒光素FITC標(biāo)記的 抗人IgG，作為第二抗體，避光孵育1小時，PBS洗滌3minX3次。用熒光顯微鏡觀察并拍 照。實(shí)施例4 FQ-PCR檢測細(xì)胞總RNA的提取和純化將100 μ 1 HCVcc感染6孔板內(nèi)的 Huh-7. 5. 1細(xì)胞，培養(yǎng)6h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每孔添加2ml培養(yǎng)液后，分別加入 濃度為lmg/ml、5mg/ml、20mg/ml的丁香液(醇提)，培養(yǎng)72后分別收集消化后的細(xì)胞，以 3000rpm離心5min去上清。使用RNArose Reagent,按其操作步驟提取總RNA，用DEPC水溶 解，再用酚·氯仿抽提法純化RNA，再用DEPC水溶解總RNA并測定濃度。RNA的逆轉(zhuǎn)錄純化后的總RNAl μ g，隨機(jī)引物(0. 5 μ g/ml) 1 μ 1，DEPC處理水補(bǔ)足 至11 μ 1,混勻，于65°C水浴5min，立即冰浴2min，然后加入5XM-MLV buffer 5μ 1，IOMm dNTP 1. 5 μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μ 1，DEPC水補(bǔ)足至25 μ 1，混勻，于37°C水浴Ih以合成 cDNA模板。FQ-PCR 檢測cDNA 模板 2 μ 1，2X SYBR GreenI 10 μ 1，HCV 特異的正向引物和反 向引物(10 μ Μ)各0. 2 μ 1，雙蒸水7.6 μ 1，混合后在Smart Cycler定量PCR儀上按以下程序擴(kuò)增95°C預(yù)變性Imin ；94°C變性5s，60°C退火20s，72°C延伸10s，在延伸步驟末采集熒 光信號，共35個循環(huán)；融解曲線分析72°C 95°C，0. 1°C /秒。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量 HCV檢測的標(biāo)準(zhǔn)品是含有全長HCV cDNA的質(zhì)粒pGEM_J4 (濃度梯度為7 X IO3 IO8拷貝/ μ 1)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗組樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對照計算檢測樣品的濃度。再換算 成每 1 μ g 細(xì)胞總 RNA 中的 HCV 基因組當(dāng)量(genome equivalents per μ gtotal RNA，GE/ μ gRNA)。實(shí)施例5 提取液對Huh-7. 5. 1細(xì)胞的毒性按〔(實(shí)驗孔OD值-空白對照孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白對照孔OD 值)〕X 100%來計算細(xì)胞存活率，表明除100mg/ml濃度的丁香液(醇提)孔存活率較低外 (42% )，其他各孔的細(xì)胞存活率都大于84%，顯示各類提取液對Huh-7. 5. 1細(xì)胞基本無毒 性作用。因此在后續(xù)的抗病毒活性研究中，各類提取液均選擇20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml等 三個濃度。實(shí)施例6 提取液對HCVcc的直接殺滅效果第一組IFA實(shí)驗結(jié)果顯示，丁香液(醇提)三個濃度孔在熒光顯微鏡下均未見產(chǎn) 生綠色熒光的陽性細(xì)胞。丁香液(水提)三個孔陽性細(xì)胞數(shù)最多，鏡下計數(shù)分別達(dá)到6%、 10%,22%o蒜液20mg/ml孔為陰性，5mg/ml、lmg/ml兩孔陽性細(xì)胞分別為5%,8%0姜液 20mg/ml孔為陰性，5mg/ml、lmg/ml兩孔陽性細(xì)胞分別為1%>3%0與陽性對照孔相比(陽 性細(xì)胞約60% )，提取液對HCVcc殺滅的效果為丁香液(醇提)>丁香液(水提)。表1四類提取液對Huh-7. 5. 1細(xì)胞的毒性測定(0D值/45(1)
權(quán)利要求
一種從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法，步驟如下(1)丁香醇提殺滅丙型肝炎病毒藥物a.準(zhǔn)確稱取丁香20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95％乙醇浸泡2h；b.用索氏提取器對上述樣品80℃熱回流4h；c.將上述溶液過濾；過濾后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20重量份；d.將濃縮后的溶液過濾除菌，用DMEM培養(yǎng)液稀釋；(2)丁香水提殺滅丙型肝炎病毒藥物a準(zhǔn)確稱取丁香20重量份，粉碎至100目，加入120重量份的純水浸泡2h；b.用索氏提取器對上述樣品80℃熱回流4h；c將上述溶液過濾；過濾后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20重量份；d將濃縮后的溶液過濾除菌，用DMEM培養(yǎng)液稀釋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法，其特征在于丁 香為丁香植物的種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法，其特征在于 DMEM培養(yǎng)液為氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種藥物制備方法，具體地說是一種從丁香提取殺滅丙型肝炎病毒藥物的方法。準(zhǔn)確稱取丁香20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95％乙醇120克浸泡2h；用索氏提取器對上述樣品進(jìn)行80℃熱回流4h；將上述溶液過濾；過濾后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20重量份；將濃縮后的溶液過濾除菌，用DMEM培養(yǎng)液稀釋。本發(fā)明丁香醇提殺滅丙型肝炎病毒藥物為優(yōu)選藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是原料便宜，成本低；方法簡單，提取方便；對丙型肝炎病毒有直接殺滅效果。
文檔編號A61K36/61GK101953894SQ20101026679
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者姚傳鳳, 楊宇 申請人:姚傳鳳