專利名稱：白穎苔草在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白穎苔草在制備抗呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白穎苔草，莎草科、苔草屬，拉丁文Car ex rigescens (Franch. )V. Krecz. (C. stenophyllaffahlb. var. rigescens Franch.)，又名小羊胡子草，在我國分布于遼寧、華 北、山東、河南、西北等地，常見于草地、山坡和河邊，為多年生植物，形態(tài)特征具細長匍匐 根狀莖，稈高5 40厘米，基部有黑褐色纖維狀分裂的舊葉鞘。葉片短于稈，寬1 3毫米， 扁平。穗狀花序卵形或矩圓形，小穗5 8個，密集生于稈端；小穗卵形或?qū)捖研?，長5 8 毫米，頂部少數(shù)雄花，其他都為雌花。苞片鱗片狀，果囊卵形或橢圓形，與鱗片近等長，兩面 具多數(shù)脈，基部圓，略具海綿狀組織，邊緣無翅，頂端急縮為短喙，喙口具2小齒，小堅果寬 橢圓形。現(xiàn)在多用作公園、風景區(qū)、庭園觀賞草坪或適當踐踏的休息草坪，是高速公路、鐵路 兩旁等地優(yōu)良的地被植物。白穎苔草作為藥用植物，在《本草綱目》、《中藥志》、《中華人民共和國藥典》(2005 版)均無記載，《中華本草》記載歸經(jīng)三焦、脾、胃、腎，味甘、苦、澀，性平，具有清熱利尿通淋 作用，主治乳糜尿。但目前尚未見白穎苔草或白穎苔草提取物具有抗病毒活性的資料報道。Flu A屬于正粘科病毒，在人類和其它生物每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系 統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴重呼吸系統(tǒng)感染，甚者引起肺炎、腦炎甚至死亡；HCMV、HSV-l、HSV-2屬于皰疹科病毒，HCMV引起免疫底下人群的嚴重感染，宮內(nèi)感 染造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和畸形，新生兒黃疸、肝炎、肺炎等，同時也是人類動脈粥樣硬化的 重要病原之一 ；HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹，同時也是引起腦炎、肝炎、全 身嚴重感染甚至宮內(nèi)感染的重要病原；RSV主要引起呼吸系統(tǒng)感染，在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎，是 人類上呼吸道感染的重要病原之一。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了白穎苔草在制藥中的新用途白穎苔草在制備抗HSV-1的藥物中的應(yīng)用。白穎苔草在制備抗HSV-2的藥物中的應(yīng)用。白穎苔草在制備抗HCMV的藥物中的應(yīng)用。白穎苔草在制備抗Flu A的藥物中的應(yīng)用。白穎苔草在制備抗RSV的藥物中的應(yīng)用。所述白穎苔草的應(yīng)用具體為先將白穎苔草進行前處理，然后將前處理得到的提 取物用于制備抗病毒的藥物，如可將提取物與醫(yī)學上可接受的輔料一起制成膠囊劑、片劑、 顆粒劑、口服液制劑等，將提取物進一步純化也可以制成注射制劑。
所述前處理為以下六種方式之一①白穎苔草鮮榨汁取白穎苔草，物理方法榨汁，得到提取物。②白穎苔草水提取物取白穎苔草，加雙蒸水煮開，過濾獲煮汁，即為水提取物。③白穎苔草丙酮提取物取白穎苔草，經(jīng)水/丙酮提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得膏狀物，即為 丙酮提取物，將其溶于細胞維持液中備用于試驗。④白穎苔草醇提取物取白穎苔草，經(jīng)水/甲醇(或乙醇)提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得膏狀 物，即為醇提取物，將其溶于細胞維持液中備用于試驗。⑤白穎苔草乙酸乙酯提取物將丙酮提取物用石油醚、氯仿萃、乙酸乙酯分部抽 提，即為乙酸乙酯提取物，將其溶于細胞維持液中備用于試驗。⑥白穎苔草硅膠柱分離組分將⑤中的乙酸乙酯提取物用硅膠柱分離，用氯仿/ 甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇的6 4、5 5、4 6洗脫組分即為柱分離組分，將其溶于 細胞維持液中備用于試驗。經(jīng)實驗證明，白穎苔草上述不同提取物對HSV-1、HSV-2、HCMV、RSV和flu A均有 顯著的抑制作用a.白穎苔草鮮榨汁抑制HSV 1、HSV 2、RSV在HEK293細胞出現(xiàn)CPE效應(yīng) (CytopathicEffect, CPE)，IC50 分別為之-11.96、〗-10.56.和 2,.50，TI 分別為 895. 78,522. 76 和 274. 37 ；抑制 HCMVAD169 在 HEL 發(fā)生 CPE，IC50 為 2-10.47，TI 為 512 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE, IC50 為 2_7.58，TI 為 73. 52。b.白穎苔草水提取物抑制HSV 1、HSV 2、RSV在HEK293發(fā)生CPE，IC50分別為 2-4.50^-4.46.禾口 2-3-76，TI 分別為 6. 45 和 6. 92 和 2. 20 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 發(fā)生 CPE，IC50 為 2-5.38，TI 為 12. 91 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE，IC50 為 2-4.39，TI 為 6. 36。c.白穎苔草丙酮提取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293發(fā)生CPE，IC50分別 為 2i5i、2i60 和 2i94，TI 分別為 247. 28,130. 60 禾口 166. 57 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 發(fā)生 CPE, IC50 為 2-8.61，TI 為 73. 01 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE, IC50 為 2-7.88，TI 為 42. 52。d.白穎苔草醇提取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293發(fā)生CPE，IC50分別為 2-9.94、2-8.63禾日 2-8.54，ti 分別為 176. 07、71.01和66. 72 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL，IC5Q 為 2-8'38， TI 為 64. 89 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE, IC50 為 2"854, TI 為 70. 52。e.白穎苔草乙酸乙酯提取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293發(fā)生CPE，IC50 分別為 2-11.44、2-10.09 禾口 2-9.54，TI 分別為 451. 93、177. 29 和 121. 09 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 發(fā) 生 CPE，IC50 為 2-10.40，TI 為 213. 78 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE, IC50 為 54 ；TI 為 60. 55。f.白穎苔草硅膠柱分離組分抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293發(fā)生CPE，IC50 分別為 2_9_52、2_9_54 和 2_9'56，TI 分別為> 367. 09、> 372. 22 和>> 377. 41 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 發(fā)生 CPE, IC50 為 2-9.27，TI 為> 308. 69 ；抑制 Flu A 在 MDCK 發(fā)生 CPE, IC50 為 2"4'40, TI 為> 10. 56。為便于觀察與比較，上述內(nèi)容詳見表1。表1白穎苔草抑毒試驗結(jié)果(IC5(1/TI)
4 從上表可以看出，白穎苔草各提取物對多種病毒有顯著的抑制作用，這提示白穎 苔草不僅利尿通淋、治療乳糜尿(中華本草記載)，而且在治療多種病毒感染性疾病領(lǐng)域存 在潛在的應(yīng)用價值，對皰疹科病毒(HSV-1、HSV-2、HCMV)感染性疾病的治療意義尤為重大。 本發(fā)明為白穎苔草臨床用于治療病毒感染性疾病提供實驗依據(jù)，對研制抗HSV-l、HSV-2、 HCMV、RSV和Flu A病毒的藥物提供了一定的指導意義，具有重要的參考價值。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。


圖1為HSV-1病毒對照HEK293細胞出現(xiàn)完全CPE示意圖(200X)；圖2為HSV-2病毒對照HEK293細胞出現(xiàn)完全CPE示意圖；(200X)；圖3為HCMV病毒對照HEL細胞出現(xiàn)CPE示意圖；(200X)；圖4為RSV病毒對照HEK293細胞出現(xiàn)90%以上CPE示意圖(200X)；圖5為Flu-A病毒對照MDCK出現(xiàn)90%以上CPE示意圖(200 X)；圖6為受到保護的HEK293細胞示意圖(200 X)；圖7為受到保護的HEL細胞示意圖(200X)。圖8為受到保護的MDCK細胞示意圖(200 X)；
具體實施例方式實施例白穎苔草提取物對病毒的作用研究(1)制備白穎苔草提取物取白穎苔草分別采用物理方法榨汁(新鮮草榨汁)、水煮、水/丙酮提取、水/乙醇 提取分別獲取鮮榨汁①、水提取物②、丙酮提取物③和醇提取物④，將③或④用石油醚、氯 仿、乙酸乙酯分部抽提，取乙酸乙酯萃取部分即為⑤，將⑤用硅膠柱分離，用氯仿/甲醇梯 度洗脫，收集氯仿/甲醇的6 4、5 5、4 6洗脫組分為⑥。將上述提取物分別溶于細胞維持液(含2%新生牛血清的MEM，GIBIC0公司產(chǎn)品)中備用。(2)細胞株與病毒株人胚腎細胞(HEK293，為HSV 1、HSV 2、RSV病毒敏感細胞)購自美國Clontech公 司；人胚肺細胞P12(HEL P12，HCMV敏感株)，由山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所微生物 學研究室贈送；狗腎細胞(MDCK，流感病毒敏感細胞)引自中國CDC病毒病研究所；單純皰 疹病毒1型(HSV-l)Sm44株、單純皰疹病毒2型(HSV-1) 333株、呼吸道合胞病毒(RSV)Long 株、流感病毒甲型(Flu A) 1995. All :32094地方株和柯薩基病毒3型(Cox_B3)Nancy株引 自中國CDC病毒病研究所，人巨細胞病毒AD169株(HCMV AD169)，引自中國生物制品鑒定所疫 苗三室。(3)細胞毒性測定參照文獻汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ；24(1) 25 27的方法，將各樣品以2倍比做 系列稀釋(2—1 一5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK、HEL和HEK293上，每孔 100 u L，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設(shè)微孔板D的1 6孔為細胞對照，7 12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波 長測定0D值，將實驗組與細胞對照組0D值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算 藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD5Q)。(4)抑毒試驗參照文獻汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用 的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ；24(1) :25 27的方法，將樣品按稀釋順序橫向接 種于96板孔中的單層細胞上，每孔100 u L，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加 含有100個TCID5(1的病毒100 u L作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物 對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1 12作為細胞對照。共6個樣品和6個病毒試 驗組，6 個樣品均包括 RSV-HEK293、HSV 1_HEK293、HSV 2_HEK293、Flu A_MDCK、HCMV_HEL 和 Cox B3-HEK293體外感染模型，37°C、5% C02培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出 現(xiàn)90 %以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去 除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench 方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC5(I)，最終將TD5(i和IC5(I相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。(5)結(jié)果①樣品TD5Q的測定對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。榨汁、水 提取物、丙酮提取、醇提取物和乙酸乙酯萃取物的105(|在1 0(分別為2-1_38、2-1_72、2-2_47、2-2_48 和 2_2』6 ；在 HEL 分別為 2-L47、2-L69、2-2_42、2-2_36 和 2_2'66，在 HEK293 分別為 2-L53、2-L81、2_2_56、 2_2 4和2_2 62，而硅膠柱分離成分在各細胞的最大稀釋度(1 2)均未測得細胞毒性，即TD5(i < 2—1，詳見表2、表3和表4。表2白穎苔草榨汁、水提取物和丙酮提取物細胞毒性試驗結(jié)果
表3白穎苔草醇提取物、乙酸乙酯提取物和硅膠柱層析成分細胞毒性試驗結(jié)果 由表2和表3可得表4 表4白穎苔草各提取物細胞毒性試驗結(jié)果(TD5Q) ②抑毒實驗對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV 1、HSV 2、 HCMVAD169、RSV、F1u A、Cox B3 病毒對照組分別在第 3d、3d、10d、2d、4d、2d 出現(xiàn) 90% 以上的 CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細胞融合(HSV 1致多個細胞融和成大泡， 而HSV 2致融合為小泡)、變圓、脫落為主要特征(如圖1、2所示)；HCMV AD169在HEL出現(xiàn) 的CPE則以細胞腫脹、脹圓、最終脫落為特征(如圖3所示)；RSV在HEK293CPE以折光性增 強、變圓、脫落、破碎為主要特征(如圖4所示)；Flu A在MDCK CPE以折光性增強、壞死、破 碎為主要特征(如圖5所示)；柯薩基病毒在HEK293則以細胞折光性增強、變圓、破碎和脫 落為主。而抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE a鮮榨汁試驗組HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀 釋度之前、HCMV AD169-HEL組在9孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前、 FluA-MDCK組細胞在第6稀釋度之前、細胞完全被保護(如圖6、7、8所示，細胞致密貼壁生 長)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小逐漸加重?？滤_基B3-HEK293所有試驗孔全部出 現(xiàn) CPE ；b水提取物HSV 1-HEK293在第3稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第3稀釋度之 前、HCMV AD169-HEL組在4孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第2稀釋度之前、Flu A-MDCK 組細胞在第3稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小逐漸加重。 柯薩基B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE ；c丙酮提取物HSV 1-HEK293在第9稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第8稀釋度之 前、HCMV AD169-HEL組在7孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第8稀釋度之前、Flu A-MDCK 組細胞在第6稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小逐漸加重。 柯薩基B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE ；d醇提取物HSV 1-HEK293在第8稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第7稀釋度之 前、HCMV AD169-HEL組在7孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第7稀釋度之前、Flu A-MDCK 組細胞在第6稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小逐漸加重。 柯薩基B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE ；e乙酸乙酯萃取物HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9 稀釋度之前、HCMV AD169-HEL組在9孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第8稀釋度之前、 FluA-MDCK組細胞在第7稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小 逐漸加重?？滤_基B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE ；f硅膠柱分離組分HSV 1-HEK293在第8稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第7 稀釋度之前、HCMV AD169-HEL組在6孔之前、RSV-HEK293試驗組細胞在第8稀釋度之前、
8FluA-MDCK組細胞在第3稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減小 逐漸加重?？滤_基B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE ；將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組 A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5Q，IC50與TD5Q相比獲得TI a鮮榨汁試驗組抑制HSV 1、HSV 2、RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50分別為 2-H.96^2-io.56.和 2iM，Ti 分別為 895. 78、522. 7 和 274. 37 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2-10.47，TI 為 512 ；抑制 Flu A 在 MDCK 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2_7.58, TI 為 73. 52。 CoxB3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草榨汁對Cox B3無抑制作用。b水提取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50分別為2"4'50, 2-4.46 和 2-3.76，TI 分別為 6. 45,6. 92 和 2. 20 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2-5.38，TI 為 12. 91 ；抑制 P1U A 在 MDCK 細胞發(fā)生 CPE, IC50 為 39, TI 為 6. 36。CoxB3_HEK293 所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草水提取物對Cox B3無抑制作用。c丙酮提取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC5(1分別為 2-10.51^2-9.60 和 2-9_94，分別為 247. 28,130. 60 和 166. 57 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2-861，TI 為 73. 01 ；抑制 Flu A 在 MDCK 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2-7.88，TI 為 42. 52。 CoxB3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草丙酮提取物對Cox B3無抑制作用。d醇提取物抑制HSV UHSV 2、RSV在HEK293 細胞發(fā)生CPE，IC5(1 分別為 2-9_94、2_8_63 和 2-8.54，TI 分別為 176. 07,71. 01 和 66. 72 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2-s.38，TI 為 64. 89 ；抑制 F1U A在MDCK 細胞發(fā)生 CPE, IC50 為 2-854，TI 為 70. 52。CoxB3_HEK293 所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草醇提取物對Cox B3無抑制作用。e乙酸乙酯萃取物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50分別為 2-iL44、2-ia09 禾口 2-9_54，ti 為 451. 93>177. 29 和 121. 09 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細胞發(fā)生 CPE， IC50 為 2-10.40，TI 為 213. 78 ；抑制 Flu A 在 MDCK 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2"8'54, TI 為 60. 55。 CoxB3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草乙酸乙酯萃取物對Cox B3無抑制作 用。f硅膠柱分離物抑制HSV 1、HSV 2和RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50分別為 2-9.52、2-9.54 和 2-956 ;TI 分別為> 367. 09、> 372. 22 禾口，> 377. 41 ；抑制 HCMV AD169 在 HEL 細 胞的發(fā)生 CPE，IC50 為 2_9.27，TI 為> 308. 69 ；抑制 Flu A 在 MDCK 細胞發(fā)生 CPE，IC50 為 2_4.40， TI為10. 56。Cox B3-HEK293所有試驗孔全部出現(xiàn)CPE，表明白穎苔草硅膠柱提取物對Cox B3無抑制作用。以上結(jié)果詳見表5、表6和表7。表5白穎苔草榨汁、7k提取物和丙酮提取物抑毒試驗結(jié)果 表6白穎苔草醇提取物、乙酸乙酯提取物和硅膠柱層析成分抑毒試驗結(jié)果 由表5和表可得表7:表7白穎苔草各提取物抑毒試驗結(jié)果(IC5(I/TI) 從以上實驗結(jié)果可以看出，白穎苔草具有顯著的抗皰疹科病毒(包括 HSV-1HEV-2HCMV)、抗副粘科病毒RSV和抗正粘科病毒flu_A的作用，但對腸道病毒cox_B 病毒無效。
權(quán)利要求
白穎苔草在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了白穎苔草在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用經(jīng)實驗證明，白穎苔草對HSV-1、HSV-2、HCMV、RSV和flu A均有顯著的抑制作用，這提示白穎苔草在治療多種病毒感染性疾病領(lǐng)域存在潛在的應(yīng)用價值，對皰疹科病毒(HSV-1、HSV-2、HCMV)感染性疾病的治療意義尤為重大。本發(fā)明為白穎苔草臨床用于治療病毒感染性疾病提供實驗依據(jù)，對研制抗HSV-1、HSV-2、HCMV、RSV和Flu A病毒的藥物提供了一定的指導意義，具有重要的參考價值。
文檔編號A61P31/14GK101850043SQ20101019681
公開日2010年10月6日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者高川 申請人:高川