專利名稱：九里香葉總黃酮在制備預(yù)防與治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對糖尿病腎病具有預(yù)防與治療作用的中藥有效部位，提供的是一種植 物提取物的新的醫(yī)藥用途，即九里香葉總黃酮在制備預(yù)防與治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng) 用，屬于中醫(yī)中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的進(jìn)步，人民生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，2型糖尿病的發(fā)病 率正在逐年迅速增長，并且發(fā)病呈低齡化發(fā)展趨勢，嚴(yán)重地影響了人們的健康水平。約有 40%的糖尿病患者并發(fā)糖尿病腎病(diabetic η印hropathy，DN)，越來越多的糖尿病腎病 患者最終將進(jìn)入致死率最高的終末期腎病(End Stage Renal disease, ESRD)階段。根據(jù) 中華腎臟病協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在我國DN是終末期腎病的第二大病因，而在西方國家， DN早已成為終末期腎病發(fā)病的首要因素。糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之 一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。如何預(yù)防和改善DN的發(fā)生發(fā)展，提高糖尿病患 者的生活質(zhì)量，早已經(jīng)成為科研工作者們研究的熱點(diǎn)。近些年隨著DN發(fā)病率的增高，對其發(fā)病機(jī)制的研究也取得了較大的進(jìn)展。一般認(rèn) 為主要由血流動(dòng)力學(xué)改變、生化代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞生長因子異常增多和遺傳因 素等多種原因相互影響共同導(dǎo)致DN的發(fā)生。九里香[Murraya paniculate (L. ) Jack]為蕓香科九里香屬植物，又名千里 香，主要產(chǎn)自我國云南、貴州、湖南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地。到目前為止從九里香 [Murrayapaniculata(L.) Jack]葉中分得的黃酮類化合物有 3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八 甲氧基黃酮(3，5，6，7，8，3'，4'，5' -octamethoxyflavone) >3,5,6,7,3'，4'，5'—七 甲氧基黃酮(3，5，6，7，3' ,4' ,5' _h印tamethoxyflavone)(江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典， 上冊，上海人民出版社，1977 :44-45) ;5，7，8，3' ,4' ,5' _六甲氧基黃酮(5，7，8，3 ‘， 4'，5' -hexamethoxyf lavone) ,3,5,7,8,3 ‘，4'，5'-七甲氧基黃酮(3，5，7，8，3 ‘， 4'，5' -h印tamethoxyflavone)(植物學(xué)報(bào) 1984，26(2) :184-186) ;5，7，3'，4'，5'-五 甲氧基黃酮(5，7，3'，4'，5' -pentamethoxyflavone)(化學(xué)學(xué)報(bào) 1984，42，1308-1311)以 及5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3‘，4'，5'-六 甲氧基黃酮、7-羥基_5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3'-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮 (中國專利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應(yīng)用》，申請?zhí)?00710147357. 2)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的是一種植物提取物的新的醫(yī)藥用途，即九里香葉總黃酮在制備預(yù)防 與治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。所述九里香葉總黃酮其特征在于其中至少含有5，7，3 ‘， 4'-四甲氧基黃酮、5，7，3' ,4' ,5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3' ,4'-五甲氧基黃酮、5， 6,7,3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基_5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。而且其中5，7，3' ,4'-四甲氧基黃酮、5，7，3' ,4' ,5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3‘， 4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3' ,4' ,5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3‘ ,4'-三甲氧基 黃酮的含量之和大于50%，或者5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧 基黃酮的含量之和大于50%。本發(fā)明所述的藥物可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等口 服劑型，也可以是注射劑等非口服劑型。另外本發(fā)明所述的九里香葉總黃酮可以與其他藥 物包括化學(xué)藥、中藥以及天然藥物組成復(fù)方藥物用于糖尿病的治療。我們的前期研究證明，九里香葉總黃酮對實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病具有治療作用，但有 關(guān)九里香葉總黃酮對2型糖尿病腎病的預(yù)防與治療作用尚未見研究報(bào)道。本發(fā)明通過高糖高脂飲食伴小劑量鏈脲佐菌素建立大鼠實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病腎病 (T2DN)模型，觀察了九里香葉總黃酮對大鼠的血糖、血脂代謝、自由基氧化損傷、炎性因子 和腎功能等方面的影響。結(jié)果表明，灌胃給予九里香葉總黃酮35、70mg/kg 13周，可明顯改 善糖尿病大鼠的腎臟功能和結(jié)構(gòu)損傷，糾正T2DN大鼠的血糖、血脂代謝紊亂，對抗自由基 的氧化損傷及炎性因子的異常增加，證明九里香葉總黃酮對2型糖尿病腎病具有明顯預(yù)防 與治療作用。


圖INormal組腎小球HE染色照片(X 400倍)圖2Model組腎小球HE染色照片(X 400倍)圖3TFMP 70mg/kg組腎小球HE染色照片(X 400倍)
圖4TFMP 30mg/kg組腎小球HE染色照片(X 400倍)圖5Captopril組腎小球HE染色照片(X400倍)圖6C+T組腎小球HE染色照片(X 400倍)圖7Normal組腎小球PAS染色照片(X 400倍)圖8Model組腎小球PAS染色照片(X 400倍)圖9TFMP 70mg/kg組腎小球PAS染色照片(X 400倍)圖10TFMP 35mg/kg組腎小球PAS染色照片(X 400倍)圖IlCaptopril組腎小球PAS染色照片(X400倍)圖12C+T組腎小球PAS染色照片(X 400倍)圖13Normal組腎小球免疫組化TGF- β ！表達(dá)照片(X 400倍)
圖14Model組腎小球免疫組化TGF- β工表達(dá)照片(X 400倍)圖15TFMP 70mg/kg組腎小球免疫組化TGF- β ！表達(dá)照片(X 400倍)圖16TFMP 35mg/kg組腎小球免疫組化TGF- β ！表達(dá)照片(X 400倍)圖17Captopril組腎小球免疫組化TGF-β i表達(dá)照片(X400倍)圖18C+T組腎小球免疫組化TGF- β ！表達(dá)照片(X 400倍)圖19Normal組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X 400倍)圖20Model組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X 400倍)圖21TFMP 70mg/kg組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X 400倍)圖22TFMP 35mg/kg組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X 400倍)圖23Captopril組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X400倍)
圖24C+T組腎小球免疫組化CTGF表達(dá)照片(X 400倍)圖25Normal組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖26Model組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖27TFMP 70mg/kg組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖28TFMP 35mg/kg組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖29Captopril組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖30C+T組腎小球電鏡照片(X 15000倍)圖31Normal組胰島HE染色照片(X 400倍)圖32Model組胰島HE染色照片(X 400倍圖33TFMP 70mg/kg組胰島HE染色照片(X 400倍
圖34TFMP 35mg/kg組胰島HE染色照片(X 400倍圖35Captopril組胰島HE染色照片(X400倍圖36C+T組胰島HE染色照片(X 400倍
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1九里香葉總黃酮的制備取九里香葉10公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分 別為6、6、6倍，回流時(shí)間分別為60、45、30分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加 水稀釋，過AB-8大孔吸附樹脂吸附，水洗至中性，85%乙醇洗脫至薄層層析檢測不到5，7， 3'，4'-四甲氧基黃酮為止，洗脫液減壓回收乙醇，得九里香葉提取物。取此九里香葉提 取物進(jìn)行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集黃酮部 分，回收溶劑，得九里香葉總黃酮296克。經(jīng)HPLC檢測，其中5，7，3' ,4' _四甲氧基黃酮 以及5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮含量之和大于65%。實(shí)施例2取九里香葉總黃酮100克，加淀粉適量，制粒，裝入膠囊，制成1000粒，得九里香葉 總黃酮膠囊。實(shí)施例3取九里香葉總黃酮100克，加預(yù)膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉適量，制粒，壓片，制成 1000粒，得九里香葉總黃酮片。實(shí)施例4取九里香葉總黃酮100克，加吐溫80適量，加10升加熱溶解，高溫滅菌，分裝成 1000瓶，得九里香葉總黃酮口服液。實(shí)施例5取九里香葉總黃酮10克，加入IOOOml丙二醇和IOOOml注射用水，攪拌溶解，過 濾，滅菌，罐裝，每支2ml，得九里香葉總黃酮注射液。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例九里香葉總黃酮對大鼠實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病腎病的預(yù)防與治療作用實(shí)驗(yàn)研究本實(shí)驗(yàn)所用英文縮寫詞如下。英文縮寫詞表
九里香葉總黃酮(TFMP)按照實(shí)施例1之方法制備
卡托普利(Captopril)上海普康藥業(yè)有限公司批號=081003
鏈脲佐菌素(STZ)美國Signa化學(xué)公司批號087kl403
膽固醇北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司批號96L104100
丙硫氧嘧啶上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司批號=090103
膽酸鈉美國Signa化學(xué)公司批號028K0012
TC測試盒北京北化康泰臨床試劑有限公司批號20091023
HDL-c測試盒北京北化康泰臨床試劑有限公司批號20091027
LDL-c測試盒北京北化康泰臨床試劑有限公司批號20090909
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TG測試盒 SOD測試盒 MDA測試盒 GSH-Px測試盒
北京北化康泰臨床試劑有限公司 南京建成生物研究所 南京建成生物研究所 南京建成生物研究所
糖化血紅蛋白(GSP)測試盒南京建成生物研究所 血、尿肌酐測定試劑盒 南京建成生物研究所 考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒南京建成生物研究所 血尿素氮(BUN)測試盒 南京建成生物研究所 尿蛋白定量試劑南京建成生物研究所
碘I125 IL-6放射免疫分析藥北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司
ιπτ.
(以下將九里香葉總黃酮簡稱為TFMP)。 2. 1.3實(shí)驗(yàn)儀器 血糖儀
號號號號號號號號號@ 批批批批批批 批批批
20090925 20091210 20091210 20091210 20091204 20091204 20091217 20091204 20091204 20091225
DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) LDZ5-2型普通離心機(jī) DR-HW-I電熱恒溫水溫箱 7202Β型可見分光光度計(jì) QL-901 Vortex 混懸器 FJ-2003/018 I125免疫測量儀
優(yōu)克糖
寧波新芝科器研究所 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠 尤尼柯(上海)儀器有限公司 海門市其林貝爾儀器制造 國營二六廠2. 2實(shí)驗(yàn)方法2. 2.1藥物配制高糖高脂飲食配方蔗糖20%，豬油10%，雞蛋10%，膽酸鈉0. 1%，膽固醇1%， 丙硫氧嘧啶0. 2%，正常大鼠飼料。高糖高脂飲食的制備將大鼠飼料、蔗糖、豬油、雞蛋、膽酸鈉、膽固醇及丙硫氧嘧 啶按上述配方比例加熱水充分混勻后，手制成團(tuán)。鏈脲佐菌素(STZ) -20度以下保存。臨用時(shí)以0. lmol/L, PH4. 2檸檬酸-檸檬酸 鈉緩沖液配制成的鏈脲佐菌素溶液。將九里香葉總黃酮用0. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成0. 35%和0. 7%的溶 液。卡托普利用研缽磨碎，用0.5%的CMC-Na配成0. 的溶液。將含0.7%九里香葉總黃 酮CMC-Na溶液和0.2%卡托普利CMC-Na溶液按50 50混合得到0. 1 %卡托普利+0. 35 % 九里香葉總黃酮CMC-Na溶液(C+T組)。2. 2. 2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓敖o藥方法將180只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后隨機(jī)分為正常組(20只)和模型組(160 只)。正常組大鼠每日正常飲食，模型組大鼠每天給予高糖高脂飲食，8周后，正常組和模型 組隨機(jī)各取12只大鼠尾靜脈取血檢測血清TC、TG和FFA的含量。待確證模型組大鼠FFA 明顯升高產(chǎn)生胰島素抵抗后，各組動(dòng)物禁食不禁水12h，模型組舌下注射STZ(30mg/kg)，正 常組舌下注射等體積的上述緩沖液。給予STZ 2周后大鼠尾靜脈取血用血糖儀檢測空腹血 糖。將空腹血糖值> 11. lmmol/L的大鼠列入2型糖尿病腎病動(dòng)物。成模后的2型糖尿病
7
Normal 組 Model 組
九里香葉總黃酮70mg/kg組 九里香葉總黃酮35mg/kg組 Captopril 組 C+T 組
腎病大鼠改為隔日給予一次高糖高脂飲食。 將成模的2型糖尿病大鼠按血糖和體重隨機(jī)分為5組，即=Model組、九里香葉總 黃酮70mg/kg組、九里香葉總黃酮35mg/kg組、Captopril組及0. 卡托普利+0. 35%九 里香葉總黃酮(C+T組)，每組20只。另選10只正常組大鼠作為Normal組。具體的給藥方 案為
灌胃 0. 5% CMC-Na 10mL/kg 灌胃 0. 5% CMC-Na 10mL/kg 灌胃九里香葉總黃酮70mg/kg 灌胃九里香葉總黃酮35mg/kg 灌胃卡托普利10mg/kg
灌胃卡托普利10mg/kg+九里香總黃酮35mg/kg 各組動(dòng)物每日按照上述方案灌胃(ig)給藥，連續(xù)13周。每周記錄體重，每三周尾 靜脈取血，用血糖儀測定空腹血糖值1次。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天將大鼠放入代謝籠內(nèi)，禁食不 禁水，收集24h尿液。測定空腹血糖，ig給藥Ih后，腹腔注射10%水合氯醛30mg/kg麻醉， 腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)和放免指標(biāo)的測定。采集各鼠腎臟、胰腺， 進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。2. 3觀察指標(biāo)及標(biāo)本采集2.3. 1 —般指標(biāo)的觀察監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠的一般狀態(tài)、血糖、體重、攝食及攝水量等變化，并記錄 各組大鼠每日的攝食、攝水量。2. 3. 2尿蛋白的測定于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天收集各組大鼠24h尿樣，留尿期間禁食，不禁水，將大鼠放入洗 凈的金屬代謝籠內(nèi)，記錄尿量后取5ml，700rpm離心5min，去除沉渣，分裝于Eppendorf管 中，-80°C冰箱保存。用試劑盒檢測尿蛋白濃度，尿蛋白濃度乘以24h尿量既為尿蛋白排泄率。2. 3. 3血清生化指標(biāo)的測定大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛30mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈采血，注入干凈的試管內(nèi) 4°C,2000rpm離心lOmin，分離血清后分裝于Eppendorf管中，_80°C冰箱保存，用分光光度 計(jì)測定血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白 膽固醇(LDL-c)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)的含量，用放射免疫法測定血清白細(xì)胞介素 6(IL-6)含量。2. 3. 4形態(tài)學(xué)觀察大鼠腹主動(dòng)脈采血處死后，分別取胰腺及兩側(cè)腎臟去除包膜后立刻用生理鹽水清 洗，用濾紙吸干，左側(cè)腎臟稱重并計(jì)算腎重/體重。光鏡標(biāo)本左側(cè)腎臟稱重后縱向?qū)Π肫书_，立即置入10%福爾馬林溶液中固定， 進(jìn)行HE、PAS及免疫組化染色。觀察大鼠系膜細(xì)胞增生及PAS陽性物質(zhì)表達(dá)情況。用免疫 組化方法檢測大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子UTGF-^)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)情 況。胰腺進(jìn)行HE染色，觀察胰島及細(xì)胞的改變情況。電鏡標(biāo)本取大鼠左側(cè)腎臟另一半皮質(zhì)約1平方毫米大小的組織1 2塊，放入緩沖液內(nèi)固定。用透射電鏡觀察腎臟基底膜，系膜基質(zhì)，系膜細(xì)胞，上皮細(xì)胞足突的變化。2. 3. 5抗氧化指標(biāo)的測定組織勻漿制備剪取大鼠右側(cè)腎臟皮質(zhì)部分，在冰生理鹽水中反復(fù)漂洗，除去血 液，濾紙拭干，稱重。按1 9濃度(W V = Ig 9ml)加入生理鹽水。在4°C環(huán)境下， 用DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)制備組織勻漿。3500r/min離心15min后吸取上清液分裝于 Eppendorf管中，_80°C冰箱保存。大鼠腎臟組織勻漿制備完成后，用試劑盒檢測腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。2. 4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)量資料用〒土 s表示，計(jì)量資料進(jìn)行組間t 檢驗(yàn)，P < 0. 05為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2. 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 5. 1高糖高脂飲食對大鼠血脂的影響與正常組比較，模型組大鼠連續(xù)給予高糖高脂飲食8周后出現(xiàn)明顯血脂代謝紊 亂TC、TG及FFA含量均顯著增高(P < 0. 01)。說明模型組大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，有類似臨 床2型糖尿病病人的特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 1。Tab. 1. Effect of highly fatted food on serum lipid in normal rats(χ 士s,n = 12)
GroupTC(mmol/L)TG(mmol/L)FFA(mmolZL)
Normal1.52 士 0.220.20 士 0.072504.27士639.06Model3.83±0.67##0.58±0.21##3564.88±800.54 m##P < 0. 01 vs normal2. 5. 2—般狀態(tài)觀察Model組大鼠舌下靜脈注射STZ 2周后，一般狀態(tài)表現(xiàn)為活動(dòng)減少；多飲，平均飲 水量是Normal組的三倍；多尿，墊料明顯潮濕，每日需更換2 3次；體重逐漸下降；精神 萎靡，毛色灰暗、粗糙。與Model組比較，TFMP 70、35mg/kg組，Captopril組及C+T組大鼠 的飲水量、尿量增多，體重下降及精神狀態(tài)等均有所改善。2. 5. 3TFMP對T2DN大鼠血糖的影響與Normal組比較，Model組大鼠第0、3、6、9、13周血糖值均顯著升高(P < 0. 01)。 與Model組比較，TFMP 70、35mg/kg劑量組和C+T組于藥后第3周血糖值均顯著降低(P < 0. 05或P < 0. 01)，并持續(xù)到13周末；Captopril組血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 2。Tab. 2. Effect of TFMP on blood glucose in T2DN rats ( χ ±s) flP < 0. 05，##P < 0. 01 vs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs model
2. 5. 4TFMP 對 T2DN 大鼠 GSP 的影響 與Normal組比較，Model組的糖化血紅蛋白(GSP)含量顯著升高(P < 0. 01)。與 Model組比較，TFMP70、35mg/kg劑量組的GSP含量顯著降低(P < 0. 05)，Captopril組及 C+T組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 3。 Tab. 3. Effect of TFMP on GSP in T2DN rats(x ±s) P < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs model 2. 5. 5TFMP 對 T2DN 大鼠 TG、TC、LDL-c 及 HDL_c 水平的影響 與Nornal組比較，Model組TG、TC及LDL_c含量值均顯著升高，HDL_c含量顯著 降低(P < 0. 05 或 P < 0. 01)。與 Model 組比較，TFMP 70mg/kg 組的 TG、TC 及 LDL-c 含量 值顯著降低，HDL-c含量顯著升高(P < 0. 05) ；TFMP 35mg/kg組LDL-c含量值顯著降低， HDL-c含量顯著升高(P < 0. 05)，TC和TG含量值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05) ；Captopril組 TG、TC、LDL-c, HDL-c含量值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05) ；C+T組TC和TG含量值顯著降低(P < 0. 05或P < 0. 01)，LDL-c、HDL-c含量值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見 Tab. 4。Tab. 4. Effect of TFMP on content of lipid in T2DN rats ( χ ±s) flP < 0. 05，##P < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs model
2. 5. 6TFMP 對 T2DN 大鼠腎臟組織 SOD、MDA, GSH-Px 的影響與Normal 組比較，Model 組 SOD、GSH-Px 活性顯著降低(P < 0. 05 或 P < 0. 01)， MDA含量顯著增加(P < 0. 01)。與Model組比較，TFMP 70mg/kg劑量組SOD、GSH-Px活性 顯著提高(P < 0. 05或P < 0. 01)，MDA含量顯著降低(P < 0.01) ；TFMP 35mg/kg劑量組 S0D、MDA及GSH-Px值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05) ；Captopril組S0D、GSH_Px活性顯著升高 (P < 0. 05)，MDA 含量顯著降低(P < 0. 05) ；C+T 組 SOD,GSH-Px 活性顯著增高(P < 0. 01)， MDA含量顯著降低(P < 0. 01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 5。Tab. 5. Effect of TFMP on SOD、MDA、GSH—Px in T2DN rats ( χ ±s) flP < 0. 05，flflP < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs model2. 5. 7TFMP對T2DN大鼠血清IL-6的影響與Normal組比較，Model組大鼠血清IL-6含量顯著升高(P < 0. 01)。與Model組 比較，TFMP70mg/kg劑量組、Captopril及C+T組IL-6含量值均顯著下降(P < 0. 05) ；TFMP 35mg/kg劑量組IL-6含量值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 6。Tab. 6. Effect of TFMP on content of IL-6 in T2DN rats(x ±s) ##P < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05vs model2. 5. 8TFMP對T2DN腎重/體重的影響與Normal組比較，Model組腎重/體重(KW/BW)顯著增大(P < 0. 01)。與Model 組比較，TFMP 70、35mg/kg劑量組、Captopril組和C+T組KW/BW顯著減小(P < 0. 05)。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見Tab. 7。Tab. 7. Effect of TFMP on KW/BW in T2DN rats(^ 士s)
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2. 5. 9TFMP對T2DN大鼠尿蛋白及蛋白排泄率的影響
與Normal組比較，Model組尿蛋白排泄率(UAER)和尿蛋白(UAlb)濃度值均顯著 升高(P <0.01)。與 Model 組比較，TFMP 70、35mg/kg 劑量組、Captopril 組及 C+T 組 UAER 和UAlb濃度值顯著降低(P < 0. 05或P < 0. 01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 8。Tab. 8. Effect of TFMP on UAER and content of UAlb and in T2DN rats( χ 士s) ##P < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs model2. 5. 10TFMP 對 T2DN 大鼠 BUN、Scr 和 CCr 的影響與Normal組比較，Model組大鼠血清BUN、SCr含量顯著增高(P < 0. 05或P < 0. 01)，內(nèi)生肌酐清除率(CCr)顯著降低(P < 0. 05)。與Model組比較，TFMP 70、35mg/kg 劑量組、Captopril組及C+T組大鼠血清BUN和Scr含量顯著下降(P < 0. 05或P < 0. 01)，CCr顯著升高(P < 0. 05或P < 0. 01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab. 9。Tab. 9. Effect of TMPF on BUN、Scr and CCr in T2DN rats ( χ +s) flP < 0. 05，##P < 0. Olvs normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs model2.5.11形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察2. 5. 11. 1 腎臟 HE、PAS 染色觀察Normal組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小球基底膜和毛細(xì)血管襻開放良好，腎 小球囊無滲出，系膜基質(zhì)無增生，間質(zhì)偶見炎細(xì)胞浸潤，未見明顯腎小球硬化的病理改變。 Model組腎小球系膜區(qū)PAS陽性物質(zhì)增多，呈不均勻紅染，可見腎小球毛細(xì)血管叢明顯縮 小，大部分毛細(xì)血管袢皺縮塌陷，腎小球體積下降，球囊腔擴(kuò)張，系膜區(qū)荒廢明顯，間質(zhì)炎細(xì) 胞浸潤，部分?jǐn)U張小管內(nèi)可見蛋白樣管型，周圍腎小管出現(xiàn)透明樣變性及空泡變。TFMP 35、 70mg/kg劑量組、Captopril組及C+T組均有輕微病變出現(xiàn)，腎小球形態(tài)基本正常，大部分 毛細(xì)血管開放良好，偶見腎小管透明變性、局部間質(zhì)炎性細(xì)胞侵潤，與Model組比較，各組 系膜區(qū)PAS陽性物質(zhì)明顯減少，腎臟病變均明顯減輕(圖1 12)。2.5.11.2腎臟TGF- β ！和CTGF免疫組化觀察TGF-^1和CTGF在腎小球血管內(nèi)皮、系膜細(xì)胞及腎小管上皮部分間質(zhì)細(xì)胞都有所 表達(dá)，陽性顆粒主要位于胞漿中，呈棕黃色。Normal組腎小球及血管內(nèi)皮細(xì)胞上有少量 TGF-^1和CTGF表達(dá)，著色淺，含量較少。Model組腎小球TGF-^和CTGF表達(dá)明顯增 加，含量增多，染色較深，明顯強(qiáng)于Normal組。與Model組比較，TFMP 35、70mg/kg劑量組、 Captopril組及C+T組的腎小球TGF-i^和CTGF表達(dá)均明顯減輕，顏色較淺。(圖13 24)。2. 5. 11.3腎臟透射電鏡下觀察Normal組腎小球?yàn)V過膜三層結(jié)構(gòu)清晰，可見內(nèi)皮細(xì)胞孔，基底膜薄厚均勻，足突 呈梳齒狀分布。Model組基膜呈不規(guī)則階段性增厚，足突細(xì)胞廣泛融合，濾過膜結(jié)構(gòu)模 糊。TFMP35、70mg/kg劑量組、Captopril組、C+T組，濾過膜三層結(jié)構(gòu)基本清晰，仍有部分基 底膜輕度增厚，足突細(xì)胞呈梳齒狀輕度微絨毛化，偶見足突細(xì)胞輕度融合，但病變明顯輕于Model 組。(圖 25 30)。2. 5. 11. 4胰島HE染色觀察Normal組胰島數(shù)目較多，體積較大，呈圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)狀。胰島內(nèi)細(xì)胞豐 富，排列整齊，核多為圓形。Model組胰島數(shù)目稀少，體積萎縮，邊界不清。胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù) 目減少、排列不規(guī)則，胰島細(xì)胞核大小、形態(tài)不規(guī)則。殘存的胰島細(xì)胞顯現(xiàn)明顯空泡變性。 TFMP35、70mg/kg劑量組及C+T組偶見胰島細(xì)胞空泡變性，胰島邊界不清，但胰島體積及胰 島細(xì)胞形態(tài)基本正常，病變與Model組比較均明顯減輕。與Model組比較Captopril組胰 島病變改善不明顯。(圖31 36)。
權(quán)利要求
九里香葉總黃酮在制備預(yù)防與治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中至少含有5，7，3',4'-四甲 氧基黃酮、5，7，3' ,4' ,5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3' ,4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3‘， 4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基_5，3' ,4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。
3.權(quán)利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3',4'-四甲氧基黃 酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3 ‘，4'， 5'-六甲氧基黃酮、7-羥基_5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%。
4.權(quán)利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3',4' _四甲氧基黃酮 和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。
5.九里香葉總黃酮與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療糖尿病腎病的復(fù)方藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了九里香葉總黃酮的一種新的醫(yī)藥用途，即從九里香葉中獲得的5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮和5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮的含量之和大于50％的九里香葉總黃酮對糖尿病腎病具有顯著的預(yù)防與治療作用。
文檔編號A61P3/10GK101897786SQ20101018975
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者于曉風(fēng), 李緒文, 桂明玉, 睢大員, 金永日 申請人:長春瑞德醫(yī)藥科技有限公司