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抗蝰蛇蛇毒凍干血清及制備方法

文檔序號(hào):1182715閱讀:516來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):抗蝰蛇蛇毒凍干血清及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制品,特別涉及抗蛇毒血清及制備工藝。

背景技術(shù)
蝰蛇(Vipera russelli siamensi)屬蝰科蝰亞科,是以血液循環(huán)毒素為主的劇毒蛇類(lèi)。我國(guó)蝰蛇主要分布于廣西、廣東、福建和臺(tái)灣。蝰蛇晝夜活動(dòng),蟠蜷成團(tuán),行動(dòng)較遲緩,蛇性?xún)疵?。蝰蛇毒主要含血循毒,有毒成分以凝血毒素為主,還有溶血毒素、纖維蛋白溶解毒素、抗凝血成分、血小板積聚變性成分、出血毒素等。人被咬傷后發(fā)病急、癥狀重,傷口腫痛,出血、引起血管內(nèi)廣泛凝血DIC危險(xiǎn)癥狀,患者可因溶血而致貧血及黃疸、腎功能衰竭,甚至肺出血及腦出血;蝰蛇毒素還可損害心肌,造成中毒性心肌炎和心肌功能衰竭。蝰蛇咬傷致死率約為30%。相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中,發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?005100303946“抗蝰蛇血清及其制備方法”提供了由園斑蝰蛇毒免疫馬獲得免疫血漿,經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑,每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD50以上,相當(dāng)于4mg干毒,臨床試驗(yàn)有效率為98.5%,治愈率達(dá)91%。即使以2010年版“中國(guó)藥典”抗蛇毒血清F(ab′)2片段純度僅要求不低于60%。但是,園斑蝰蛇是蝰科蛇類(lèi)亞種,不同亞種間抗原特異性差異較大,單一蛇毒免疫血漿生產(chǎn)的F(ab′)2只能與相應(yīng)抗原決定簇特異性結(jié)合,加之蝰蛇一次排毒量大,毒性強(qiáng),因而其局限是明顯的;而濃縮原液以氯仿為溶劑且含量較大(1.4-0.6%)以及明礬絮凝沉淀蛋白都對(duì)人體存在潛在損傷;另一方面,不僅血清水解鹽析獲得的成品純度低(F(ab′)2≥60%)導(dǎo)致抗體效價(jià)較低,而且,由于抗血清含有較多大分子量IgG和激活補(bǔ)體的Fc片段,成為臨床發(fā)生抗血清過(guò)敏反應(yīng)除個(gè)體差異外最主要的因素,因此,若要較徹底地去除這些導(dǎo)致過(guò)敏成分在制備中只利用鹽析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的首先是提供一種高效價(jià)的、特異性中和蝰蛇毒的抗蝰蛇蛇毒血清,其次是提供一種利用疏水層析純化鹽析后的F(ab′)2,可獲得高純度的F(ab′)2制品,降低產(chǎn)品過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率的精制抗蝰蛇毒血清方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下方式達(dá)到 (一)作為成品的抗蝰蛇蛇毒凍干血清 該抗蛇毒血清F(ab′)2片段純度大于85%,分子量為97000~110000Da。該抗蛇毒血清F(a b′)2凍干品與蝰蛇毒質(zhì)量比為15∶1(mg∶mg)時(shí)能特異性中和小鼠的蝰蛇毒。
該抗蛇毒血清免疫擴(kuò)散測(cè)定抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒比例在8∶1以下時(shí)出現(xiàn)清晰的免疫沉淀線。
(二)一種制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法 制備工藝依次包括如下步驟 (1)將至少兩個(gè)產(chǎn)地不同亞種采集的蝰蛇毒混合作為免疫原免疫馬得到具有特異性IgG血漿; (2)取以上免疫血漿,用硫酸銨分步鹽析獲得IgG組分; (3)用無(wú)菌水補(bǔ)I gG溶液體積,調(diào)pH值,加入胃蛋白酶水解IgG離心收集上清液即取得F(ab′)2粗品; (4)將以上F(ab′)2粗品用3mo l/L的硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)后到100-110ms/cm后上預(yù)先用1.2mol·L-1硫酸銨+50mmol·-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱,用該緩沖液淋洗1-3倍柱床體積后,用注射用水線性梯度(0%→100%,3倍柱床體積)洗脫,收集洗脫1峰,脫鹽過(guò)濾凍干。
所述抗蛇毒血清Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析結(jié)果經(jīng)活性和純度檢測(cè),活性集中在洗脫1峰上,F(xiàn)(ab′)2SDS-PAGE純度大于85%;小分子雜蛋白質(zhì)集中在小分子雜蛋白集中在穿透峰、洗脫2、洗脫3峰上。分離圖譜如圖1所示。
所述步驟(2)中是使硫酸銨終濃度為50%,待硫酸銨完全溶解后離心,取沉淀,以無(wú)菌水溶解后,加入硫酸銨,使硫酸銨的終濃度為33%,待硫酸銨完全溶解后離心,取沉淀,加入適量無(wú)菌水溶解,透析后離心,上清液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾上層析柱進(jìn)行純化。
所述步驟(3)中是將以上IgG溶液用無(wú)菌水補(bǔ)體積至原血漿體積的一半,按每100mL加入0.2mL甲苯,以6mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至3.5,按每1000mL加入0.1g胃蛋白酶,置31℃水浴4~6hr,然后以5mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH值至5.2,置57℃保持30min,待溫度降至45℃以下后離心,上清為F(ab′)2粗品。
所述步驟(4)將其收集活性峰產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25柱或8000-10000Da超濾膜超濾脫鹽后0.22μm膜過(guò)濾除菌凍干,獲得F(ab′)2凍干品。
本發(fā)明經(jīng)I gG提取、酶解及疏水柱純化,F(xiàn)(ab′)2片段純度達(dá)85%以上,純度超過(guò)目前國(guó)家藥典60%的要求。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明注入體內(nèi)的I gG和Fc片段量減少甚多,且效價(jià)高,能夠在保證療效的同時(shí)較大幅度地降低不良反應(yīng)發(fā)生率。



圖1為Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析結(jié)果。圖中1.穿透峰、2.洗脫1峰、3.洗脫2峰、4.洗脫3峰。
圖2為疏水柱純化后各峰SDS-PAGE圖。圖中1.穿透峰、2.洗脫1峰、3.洗脫2峰、4.洗脫3峰、5.標(biāo)準(zhǔn)MK。SDS-PAGE電泳膠板用Bio-Rad Gel doc EQ凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行圖像采集后,使用Quantity One 4.4凝膠分析軟件測(cè)定。
以下結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明,但本發(fā)明保護(hù)范圍包括但不限于以下實(shí)施例。

具體實(shí)施例方式 2~3個(gè)蝰蛇亞種毒凍干品購(gòu)自中國(guó)南方不同產(chǎn)地。
混合以上產(chǎn)地不同蝰蛇亞種毒凍干品,檢測(cè)LD50作為免疫原;免疫用馬為2010年《中國(guó)藥典》三部相關(guān)規(guī)定檢疫合格的昆明矮種馬;實(shí)驗(yàn)用鼠為昆明種小白鼠,SPF級(jí),體重18-20g;胃蛋白酶經(jīng)類(lèi)A物質(zhì)檢驗(yàn)合格,比活1∶3000。
(一)馬匹免疫及免疫血漿采集 馬匹免疫前先用濃縮破傷風(fēng)類(lèi)毒素進(jìn)行2次前期免疫,將蝰蛇蛇毒用甲醛漸進(jìn)法脫毒后,加油佐劑(蛇毒濃度為0.2mg/ml)。免疫分為基礎(chǔ)免疫與超免疫,基礎(chǔ)免疫是按每匹馬0.5ml的量注射兩針,中間間隔3周,基礎(chǔ)免疫完成后測(cè)免疫馬的血漿效價(jià),有明顯抗體應(yīng)答反應(yīng)的馬匹再進(jìn)行超免疫,超免疫劑量從1ml直至7ml,劑量由小到大,免疫間隔為2周,注射部位為背部?jī)蓚?cè)肌肉。
試血及采血(1)試血效價(jià)按1ml血漿與不同稀釋度的蛇毒溶液等體積混合于37℃放置45min后接種昆明種小白鼠,腹腔注射,每個(gè)稀釋度注射4只,雌雄各半,記錄72h小鼠死亡情況,以能保護(hù)小鼠全部存活的一組作為其試血效價(jià)。試血效價(jià)達(dá)到1mL血漿能中和1mg蝰蛇毒;(2)I gG抗體滴度測(cè)定以包被液稀釋濃度為1%的蝰蛇蛇毒(1∶20)包被酶標(biāo)板,每孔100μl,置4℃過(guò)夜,洗板3次,將原血漿以酶聯(lián)免疫法稀釋液按1mg/ml溶解,進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5……稀釋后加入酶標(biāo)板中,并以健康馬血清稀釋相同倍數(shù)作為陰性對(duì)照,37℃結(jié)合2小時(shí)后,洗板3次,再加入酶標(biāo)記二抗(兔抗馬HRP),37℃結(jié)合2小時(shí),洗板后加入底物液,顯色30~45分鐘后加入2mol·L-1H2SO4中止反應(yīng),置自動(dòng)酶標(biāo)分析儀測(cè)定OD492值,以S/N≥2.1(S樣本光密度,N陰性對(duì)照光密度)作為陽(yáng)性。原血漿ELI SA結(jié)果稀釋至10-5mg/ml時(shí)仍然為陽(yáng)性。
以上兩項(xiàng)都合格時(shí)時(shí)即可開(kāi)始采血,離心分離血漿,保存于-20℃,累積幾次血漿后,混合并制備。
(二)IgG的制備 取免疫馬血漿,加入硫酸銨,使硫酸銨終濃度為50%,待硫酸銨全部溶解后,離心,取沉淀,以無(wú)菌水溶解后,加入硫酸銨,使硫酸銨終濃度為33%,完全溶解后離心,取沉淀,加入無(wú)菌水溶解,然后透析、離心,上清即為IgG。制備結(jié)果經(jīng)薄層掃描分析,提純的IgG電泳純度為85%(如圖1)。
(三)F(ab′)2的粗提及純化 制備的IgG用無(wú)菌水補(bǔ)體積到原血漿體積的一半,按0.2%的量加入甲苯,以6mol·L-1HCl調(diào)pH至3.5,每1000ml加入0.1克胃酶,置31℃水浴5小時(shí),然后以5MNaOH調(diào)pH至5.2,置57℃,30分鐘,待溫度降至45℃以下,離心,上清即為F(ab′)2粗提品。得到的F(ab′)2純度在64.2%(如圖2)。
F(ab′)2的純化F(ab′)2粗提品用3mol/L的硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)后到100-110ms/cm后上預(yù)先用1.2mol·-1硫酸銨+50mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱,用該緩沖液淋洗1-3倍柱床體積后,用注射用水線性梯度(0%→100%,3倍柱床體積)洗脫,收集洗脫1峰,過(guò)濾凍干。分離圖譜如圖1所示。
如圖2SDS-PAGE圖顯示經(jīng)Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析柱純化的F(ab′)2條帶純度為95.6%。
通過(guò)以上步驟,如果F(ab′)2純度低于85%,則進(jìn)一步將F(ab′)2粗提品經(jīng)0.45μm膜濾后再以相同條件上Pheny1-Sepharose(low-sub)FF柱層析柱進(jìn)行純化,可提高F(ab′)2純度。
完成上述工藝后,為進(jìn)一步去除細(xì)菌、小分子量雜蛋白和無(wú)機(jī)鹽,將收集的活性峰產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽或8000-10000Kda超濾膜超濾脫鹽后0.22μm膜過(guò)濾除菌再凍干以獲得F(ab′)2凍干品。
(四)抗蝰蛇蛇毒免疫血清F(ab′)2效價(jià)測(cè)定及中和能力測(cè)定 (1)免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果純化后的F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒在8∶1時(shí)出現(xiàn)免疫沉淀線。
(2)抗蝰蛇毒血清成品小鼠中和法測(cè)定抗體效價(jià)采用Blliss簡(jiǎn)化機(jī)率單位法測(cè)得蝰蛇蛇毒LD50為1.75μg/g。小鼠體外中和實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射蝰蛇毒量均為2LD50,以硼酸鹽緩沖溶液溶解抗血清與蛇毒,抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蛇毒按質(zhì)量比1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1……混合搖勻后置37℃結(jié)合45min后注射小鼠,每個(gè)稀釋度注射6只,雌雄各半,腹腔注射,每只0.4ml;同法測(cè)定抗蝮蛇毒血清中和蝰蛇毒的效價(jià);對(duì)照組為硼酸鹽緩沖液與2LD50蝰蛇毒作用,觀察72h并記錄小鼠死亡情況。結(jié)果精制的抗蝰蛇毒F(ab′)2凍干品與蛇毒的中和比例為15∶1(mg∶mg)時(shí),可保護(hù)小鼠100%存活,而抗蝮蛇毒血清70∶1中和蝰蛇毒的仍無(wú)法保護(hù)小鼠, 表1抗蝰蛇毒血清小鼠體外中和試驗(yàn)
(五)成品制備 稱(chēng)取16.83g精制抗蝰蛇毒血清凍干品,用305ml注射用水復(fù)溶,經(jīng)0.22um膜過(guò)濾后分裝,10ml/瓶,凍干。
最后制備的凍干抗蝰蛇毒血清成品經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)每瓶能有效中和蝰蛇平均一次排毒量37.4mg,可以及時(shí)救助蝰蛇毒蛇傷患者。
(六)抗蝰蛇蛇毒免疫血清F(ab′)2其它檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定 按照2010年版《中國(guó)藥典》抗蛇毒血清成品的其它項(xiàng)目按藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2. 表2抗蝰蛇毒血清其它相關(guān)項(xiàng)目檢驗(yàn)結(jié)果


權(quán)利要求
1.抗蝰蛇蛇毒凍干血清,其特征是該抗蛇毒血清F(ab′)2片段純度85%以上,分子量為97000~110000Da,該抗蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒質(zhì)量比為15∶1(mg∶mg)時(shí)能特異性中和小鼠的蝰蛇毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蝰蛇蛇毒凍干血清,其特征是該抗蛇毒血清免疫擴(kuò)散測(cè)定抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒比例在8∶1以下時(shí)出現(xiàn)清晰的免疫沉淀線。
3.一種如權(quán)利要求1-3所述的制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法,依次包括如下步驟
(1)將至少兩個(gè)產(chǎn)地不同亞種采集的蝰蛇毒混合作為免疫原免疫馬得到特異性IgG血漿;
(2)取以上免疫血漿,用硫酸銨分步鹽析獲得IgG組分;
(3)用無(wú)菌水補(bǔ)IgG溶液體積,調(diào)pH值,加入胃蛋白酶水解IgG離心收集上清液即取得F(ab′)2粗品;
(4)將以上F(ab′)2粗品用3mol/L的硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)后到100-110ms/cm后上預(yù)先用1.2mol·L-1硫酸銨+50mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱,用該緩沖液淋洗1-3倍柱床體積后,用注射用水線性梯度(0%→100%,3倍柱床體積)洗脫,收集洗脫1峰,脫鹽過(guò)濾凍干。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法,其特征是該抗蛇毒血清Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析結(jié)果經(jīng)活性和純度檢測(cè),活性集中在洗脫1峰上,F(xiàn)(ab′)2SDS-PAGE純度大于85%;小分子雜蛋白質(zhì)集中在小分子雜蛋白集中在穿透峰、洗脫2、洗脫3峰上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法,其特征是在步驟(2)中使硫酸銨終濃度為50%,待硫酸銨完全溶解后離心,取沉淀,以無(wú)菌水溶解后,加入硫酸銨,使硫酸銨的終濃度為33%,待硫酸銨完全溶解后離心,取沉淀,加入適量無(wú)菌水溶解,透析后離心,上清液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾上層析柱進(jìn)行純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法,其特征是在步驟(3)中將以上IgG溶液用無(wú)菌水補(bǔ)體積至原血漿體積的一半,按每100mL加入0.2mL甲苯,以6mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至3.5,按每1000mL加入0.1g胃蛋白酶,置31℃水浴4~6hr,然后以5mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH值至5.2,置57℃保持30min,待溫度降至45℃以下后離心,上清為F(ab′)2粗品。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清,其特征是將步驟(4)將收集活性峰產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25柱或8000-10000Da超濾膜超濾脫鹽后0.22μm膜過(guò)濾除菌凍干,獲得F(ab′)2凍干品。
全文摘要
抗蝰蛇蛇毒凍干血清及制備方法,屬于生物醫(yī)藥制品,特別涉及抗蛇毒血清及制備工藝。本發(fā)明抗蛇毒血清與蝰蛇毒質(zhì)量比15∶1能特異性中和注射小鼠蝰蛇毒;免疫擴(kuò)散測(cè)定抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒比例8∶1出現(xiàn)免疫沉淀線;其它檢測(cè)項(xiàng)符合2010年《中國(guó)藥典》蛇毒抗血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析結(jié)果檢測(cè)活性集中在洗脫1峰,小分子雜蛋白集中在穿透峰、洗脫2、洗脫3峰。本發(fā)明工藝以蝰蛇毒免疫馬獲得免疫血漿,經(jīng)鹽析制備IgG,再酶解、疏水柱純化后得到F(ab′)2活性片段。本發(fā)明特異性強(qiáng)、效價(jià)高,抗血清F(ab′)2凍干品純度高于85%。
文檔編號(hào)A61K35/16GK101816789SQ201010141970
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者范泉水, 鄭穎, 邱薇, 張富強(qiáng), 葉鋒平, 周衛(wèi)國(guó), 張志曉 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心軍事醫(yī)學(xué)研究所
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