專利名稱：抗生育重組質(zhì)粒、基因疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗生育基因疫苗，更具體地說，本發(fā)明涉及一種含有大鼠細(xì)胞色素P450家族26超家族A多肽1 (Cyp26al)的抗生育基因疫苗、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
鼠及其它小型有害哺乳動物，每年對全球的農(nóng)林牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。在澳大利亞東南地區(qū)谷物產(chǎn)糧區(qū)的家鼠(Mus domesticus)鼠害，平均每年損失2106噸糧食。80年代，我國農(nóng)牧林業(yè)鼠害普遍大發(fā)生，每年農(nóng)牧區(qū)發(fā)生鼠害的面積高達(dá)數(shù)千萬公頃，減少糧食 100多億公斤，牧草損失數(shù)百億公斤，直接經(jīng)濟損失上百億元。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全球所生產(chǎn)的糧食有10%被鼠糟踏。每年，鼠及其它小型有害哺乳動物不僅對全球的農(nóng)林牧業(yè)產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失，還傳播出血熱、鼠疫等對人類身體健康甚至生命造成嚴(yán)重威脅的疾病。 目前常用的滅鼠藥劑殺傷力雖強但殘毒極大，嚴(yán)重污染環(huán)境。此外，鼠類的繁殖力極強，即使一次滅鼠率達(dá)95%，所剩的5%也能在一至兩年內(nèi)恢復(fù)到原有水平，使得人類要不斷提高鼠藥毒性，年復(fù)一年地投藥，形成“滅-長-滅”的惡性循環(huán)，造成大面積的殘毒污染。因此，既能長期有效地控制鼠害，又能維持生態(tài)平衡，降低環(huán)境污染，成為人類在鼠害控制研究過程中追求的目標(biāo)。隨著基因重組技術(shù)及基因載體傳遞系統(tǒng)的迅速發(fā)展，90年代初基因免疫技術(shù)問世。技術(shù)的核心是將編碼抗原的核酸序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中構(gòu)建基因疫苗，然后直接接種到動物機體中，重組的基因疫苗可以利用宿主體內(nèi)的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘導(dǎo)宿主機體對該外源蛋白產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，從而達(dá)到免疫目的。許多動物模型和人體實驗已證明核基因疫苗既可激活體液免疫，又能激活細(xì)胞免疫，基因疫苗與傳統(tǒng)滅活疫苗、減毒疫苗相比具有免疫效果好、安全性較高、持久性、同種異株的交叉免疫保護作用、制備簡便、成本低廉、便于貯藏和運輸?shù)仍S多全新的潛在優(yōu)勢。近十年來，基因疫苗在防治疾病、控制動物繁殖等許多方面的基礎(chǔ)研究有重大突破。核酸疫苗的開發(fā)和應(yīng)用的研究引起了世界各國的高度重視，許多企業(yè)相繼投入巨資使之產(chǎn)品化。Cyp26al(retinoic acid hydroxylase)又稱 P450RA1，是細(xì)胞色素 P450 (CYP)家族成員，即細(xì)胞色素P450家族26超家族A多肽1，盡管CYP26與細(xì)胞色素P450家族的成員具有相似的結(jié)構(gòu)，但它與細(xì)胞色素P450家族的任何成員都不具有同源性，因此被認(rèn)為是細(xì)胞色素P450的基因家族的一個新成員。White等1996年首次從斑馬魚中克隆得到該細(xì)胞色素P450家族的新成員P450RA1，其cDNA最初被稱作CYP26，后被命名Cyp26al。之后，研究人員相繼從人、小鼠和雞的肝臟等器官組織中克隆到Cyp26al。RNA印跡分析表明，Cyp26al mRNA在肝臟、十二指腸、結(jié)腸、胎盤和腦部有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Cyp26al能將視黃酸(RA)選擇性的轉(zhuǎn)化為RA的極性代謝物(4-0H-，18-0H-,4-oxo-RA)。RA是維生素A的主要活性代謝物，能氧化維生素A轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘?-氧視黃醇，Cyp26al通過調(diào)節(jié)RA水平進(jìn)而控制類維生素A信號。有報道指出，類維生素A信號在胚胎發(fā)育中起了重要作用。給動物喂飼缺乏維生素A的飼料，胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，胚胎接受過多的類維生素A信號亦會破壞胚胎的正常發(fā)育。還有資料報道，小鼠妊娠期間過多的攝取RA可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良，畸形的類型和程度與劑量相關(guān)，而且Cyp26al功能缺失能引起小鼠胚胎死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人采用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)，篩選大鼠植入前后子宮差異表達(dá)基因，通過RT-PCR和Northern blotting實驗證實Cyp26al基因胚胎植入前后為差異表達(dá)基因。 用RACE方法首次克隆了 SD大鼠子宮Cyp26al基因的cDNA全長，并登錄GenBank (登錄號 DQ317305)。該基因與真核表達(dá)載體構(gòu)建出基因疫苗后免疫雌性小鼠，顯示Cyp26al基因疫苗具有明顯的抗生育作用。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種用于哺乳動物抗生育基因疫苗的重組質(zhì)粒及包括該重組質(zhì)粒的基因疫苗。本發(fā)明的另一個目的在于，提供上述重組質(zhì)粒及基因疫苗的制備方法及用途。本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于哺乳動物抗生育基因疫苗的重組質(zhì)粒，其由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表達(dá)載體組成，真核表達(dá)載體優(yōu)選為PCR 3. 1。優(yōu)選地，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自Spreqne-Dawley大鼠子宮，其堿基序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 1所示。另一方面，本發(fā)明提供了包含上述重組質(zhì)粒的菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌感受態(tài)DH5a菌株。本發(fā)明還提供了包含上述重組質(zhì)粒的細(xì)胞，優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自人宮頸癌 (HeLa)細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明提供一種哺乳動物抗生育的基因疫苗，其中包含上述的重組質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述基因疫苗還包含佐劑；更優(yōu)選地，所述佐劑選自百分比濃度為0. 25%的普魯卡因，每次注射佐劑用量與基因疫苗用量的體積質(zhì)量配比為2(V/ μ ) 1(1/^0，具體優(yōu)選佐劑用量與基因疫苗用量分別為10(^1和5(^8。還一方面，本發(fā)明提供一種制備上述重組質(zhì)粒的方法，該方法采用如SEQ ID NO. 2 和SEQ ID而.3所示的堿基序列作為引物克隆所述07 26&1基因的(^嫩片段；優(yōu)選地，所述方法中采用溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。再一方面，本發(fā)明提供了上述重組質(zhì)粒在制備哺乳動物抗生育基因疫苗中的用途，優(yōu)選地，所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、猴、兔和豬。本發(fā)明還提供了上述基因疫苗在哺乳動物抗生育藥物中的用途，優(yōu)選地，所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、猴、兔和豬。本發(fā)明另外還提供了上述基因疫苗在預(yù)防和/或控制鼠害中的用途。綜上所述，本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)還沒有將基因疫苗應(yīng)用抗生育控制鼠害的空白， 提供了一種可以明顯抗生育控制鼠害的基因疫苗，該疫苗由含有編碼細(xì)胞色素P450家族 26超家族A多肽1-Cyp26al蛋白的基因和篩選出的真核表達(dá)載體PCR 3. 1組成，所述編碼細(xì)胞色素P450家族26超家族A多肽1-Cyp26al蛋白的基因為SD大鼠子宮的全長互補脫氧核糖核酸基因，此基因已登入基因文庫(Cyp26al :DQ317305)。本發(fā)明將實驗室研制的抗生育基因疫苗推向產(chǎn)業(yè)化，有效地控制鼠害，維持生態(tài)平衡，同時為人類控制生育提供新途徑。由此可見，本發(fā)明所提供的pCR3. l_Cyp26al基因疫苗的優(yōu)點在于(1)所需的免疫量較小，20 50微克即可；(2)基因疫苗能同時高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強；(3)不僅具有有效降低鼠生育的作用，而且還能明顯減少新生仔鼠效果；(4)基因免疫安全、長效(免疫能力有長時間的記憶)、穩(wěn)定且操作便捷。


圖1為本發(fā)明實施例1中妊娠大鼠子宮總RNA電泳圖。圖2為本發(fā)明實施例2中由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表達(dá)載體pCR 3. 1 構(gòu)建的重組質(zhì)粒譜圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。在以下各實施例中，所涉及的提取細(xì)胞總RNA、酶切、質(zhì)粒純化、RT-RCR方法、 ELISA方法、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)手段和技術(shù)的具體操作方法參見《精編分子生物學(xué)實驗指南》F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學(xué)出版社，1998。在以下各實施例中，所使用的實驗動物Spreqne-Dawley大鼠、BaLb/c小鼠和昆明白(KMB)小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實施例1 克隆大鼠子宮Cyp26al的cDNA全長本實施例為大鼠子宮Cyp26al的cDNA全長克隆，具體步驟如下(1)動物組織取材選取性成熟，體重220_260g的Spreqne-Dawley雌性大鼠，在動情期與雄性大鼠(1 1)合籠交配，取妊娠D3-D6子宮，剔凈系膜組織和胚胎。(2)妊娠子宮總RNA的提取及純化采用Promega公司RNAgents⑧總RNA提取系統(tǒng)(Total RNA Isolation System kit)提取妊娠子宮總RNA，使用TRIzol —步法提取組織總RNA，具體操作如下1ml TRIzol與子宮組織約50_100mg加入滅菌的勻漿管中， 用滅菌剪刀剪碎組織，勻漿破碎后轉(zhuǎn)入Eppendorf管，加入0. 2ml氯仿，搖動15sec，室溫靜置2-3min，12，000rpm離心15min(4°C )，取上清至以新的Eppendorf管，加入0. 5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置lOmin，12，OOOrpm離心IOmin(4°C )，棄上清，加入Iml 75% 乙醇清洗沉淀，7，500rpm離心5min(4°C )(此步重復(fù)兩次)，真空自然干燥，加入無核酸酶(Nuclease-free)的水500 μ L溶解，-80°C保存。取5 μ L樣品溶液進(jìn)行1. 5 %甲醛變性瓊脂糖凝膠(含0. 2 μ g/mL EB)電泳檢測(具體方法參見Jian-Jun Chang, Jing-Pian Peng*YingYang,Jing-Lingffang,LiXu(2006)Study on the Anti-fertility Effects ofthe Plasmid DNA Vaccine Expressing Partial brLDH-C4. Reprod. 131 :183_192)。凝膠條帶分析結(jié)果如圖1所示，表明在所制備的樣品中，28SrRNA的量約為18S rRNA的二倍。(3)設(shè)計特異性引物根據(jù)人、鼠Cyp26al基因序列始密碼子以及終止密碼子外端的高度保守序列，設(shè)計擴增全長Cyp26al基因的特異性引物(帶有酶切位點)，其序列如下上游引物(SEQID NO. 2)5' -CGA AGC TT(HindIII)A TGG GGC TCC CGG CGC TGC T—3'；下游引物(SEQID NO. 3)5' -CGCTC GAG(XhoI)TCAGATATCTCCCTGGAAGTGG-3‘。(4)克隆并擴增Cyp26al基因采用溫度降落逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)綌U增方法 (TDRT-PCR, Touch-down reverse transcription polymerase chainreaction)克隆擴增大鼠子宮Cyp26al基因cDNA序列，具體操作如下50yL的反應(yīng)體系由IOyL的AMV/Tfl 5 X 反應(yīng)緩沖液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4U μ M的上游引物及上游引物、0. IU/μ L的 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(promega產(chǎn)品，購自北京澤平科技有限責(zé)任公司)、0. IU/μ L的RNasin 核酸酶抑制劑(購自Sigma公司)、2 μ g總RNA和無核酸酶的水組成，并覆蓋50 μ L無核酸酶礦物油。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48°C反應(yīng)45min，接著在95°C滅活5min，啟動TD-PCR擴增反應(yīng)，具體操作如下在第一個變性步驟時加入0. IUz^LWTfl DNA聚合酶(promega產(chǎn)品，購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)，在降落TD-PCR擴增階段，變性溫度為94°C lmin，退火溫度從開始65°C lmin,以每兩個循環(huán)下降1°C的速度降至55°C lmin，延伸溫度為68°C 1. 5min ； 最后在以退火溫度58°C繼續(xù)擴增15個循環(huán)，再于72°C延伸lOmin。(5)回收純化Cyp26al cDNA 利用Wizard PCR Pr印s. DNA樹脂純化體系試劑盒(promega產(chǎn)品，購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)回收純化TDRT-PCR方法擴增的Cyp26al基因cDNA片段。本發(fā)明克隆出大鼠子宮Cyp26al的全長基因，其序列如SEQ ID N0.1所示，其 GeneBank 登錄號為 DQ317305。實施例2 構(gòu)建包含Cyp26al的重組質(zhì)粒本實施例為本發(fā)明包含Cyp26al的重組質(zhì)粒的構(gòu)建，是將Cyp26al全長cDNA片段重組到PCR 3. 1真核表達(dá)質(zhì)粒(Irwitrogen產(chǎn)品，購自北京中原領(lǐng)先科技有限公司)中， 具體的質(zhì)粒圖譜見圖2，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒即抗生育的PCR3. l_Cyp26al基因疫苗，具體操作如下將實施例1純化回收后擴增的PCR產(chǎn)物Cyp26al cDNA片段，連入pMD18_T載體 (Takara產(chǎn)品，購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司)并轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。挑取陽性克隆搖菌，測序鑒定正確后，小提質(zhì)粒PMD18-T-Cyp26al (采用小提質(zhì)粒試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司，具體操作方法參見試劑盒說明書)。用Hind ΙΙΙ/Xba I在37°C雙酶切pMD18-T_Cyp26al和pCR3. 1，產(chǎn)物純化回收采用 Qia28704膠回收試劑盒(購自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司，具體操作方法參見試劑盒說明書)后，將Cyp26al片段與pCR3. 1在DNA連接酶(promega產(chǎn)品，購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)作用下連接得到PCR3. 1-Cyp26al。經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，按照Qiagen大提質(zhì)粒試劑盒操作步驟大量提取PCR3. l_Cyp26al，并利用紫外分光光度計(美國Beckman，型號DU530)定量。實施例3 :pCR3. l_Cyp26al基因疫苗的體外表達(dá)鑒定本實施例為對實施例2所構(gòu)建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，進(jìn)行外源Cyp26al基因體外瞬時表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定，分為Cyp26al基因的體外mRNA表達(dá)和外源Cyp26al體
6外蛋白表達(dá)兩部分。(l)Cyp26al基因的體外mRNA表達(dá)建立人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所細(xì)胞中心)體外瞬時表達(dá)系統(tǒng)，具體操作如下PCR3. 1-Cyp26al真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別于24小時、48小時、72小時收集培養(yǎng)液，提取收集的轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和CHO細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法分析Cyp^al基因的體外表達(dá)。RT-PCR方法擴增出Cyp^al cDNA條帶，結(jié)果表明pCR3. 1-Cyp26al真核表達(dá)質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞和CHO細(xì)胞體外瞬時表達(dá)系統(tǒng)中在mRNA水平上能高效表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對照組(不含Cyp^al基因的空質(zhì)粒)分別高出186%和172%.(2)外源Cyp^al體外蛋白表達(dá)采用免疫熒光的方法檢測轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和CHO細(xì)胞的Cyp^al蛋白的表達(dá)，具體操作如下取轉(zhuǎn)染4 后的HeLa細(xì)胞和CHO細(xì)胞加入4%多聚甲醛室溫固定lh，0. Triton X-IOO加0. 1 %檸檬酸三鈉通透lOmin，PBS漂洗3次，然后1 % BSA室溫封閉lh， 再加入1 50稀釋的抗血清(免疫小鼠血清為一抗)4°C孵育過夜。PBS徹底洗凈后，加入 FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Jackson產(chǎn)品，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育 lh, PBS漂洗后用20 μ g/mL碘化丙啶(PI)在4°C染色2min，PBS漂洗，防猝滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司，型號LSM 510META) 488nm和564nm激發(fā)波長下觀察分析。免疫熒光結(jié)果證實PCR3. 1-Cyp26al能在Hela細(xì)胞和CHO細(xì)胞體外瞬時表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生具有生物活性的Cyp26al蛋白，蛋白水平的表達(dá)量比對照組(空質(zhì)粒)分別高172%和 146%。實施例4 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗的體內(nèi)表達(dá)鑒定本實施例為對實施例2所構(gòu)建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，進(jìn)行體內(nèi)外源 Cyp26al基因表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定，具體操作如下將BALB/C小鼠機分為3組，每組25只，實驗組肌肉注射50 μ gpCR3. 1-Cyp26al基因疫苗；對照組1肌肉注射50 μ g PCR3. 1空質(zhì)粒DNA ；對照組2肌肉注射100 μ L生理鹽水。第3周后收集pCR3. 1-Cyp26al免疫BALB/C小鼠的肌肉、肝臟和脾臟組織，提取組織總RNA (采用常規(guī)Trizol法，Invitrogen產(chǎn)品，購自北京茂健聯(lián)星科技有限公司，具體操作方法參見試劑盒說明書)，RT-PCR檢測外源Cyp^al基因在BALB/C小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。 檢測結(jié)果表明，pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫后肌肉、肝臟和脾臟組織細(xì)胞中Cyp^al在 mRNA水平上表達(dá)，mRNA水平的平均表達(dá)量比對照組(空質(zhì)粒)高出286%。實施例5 =ELISA檢測pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗體液免疫應(yīng)答的檢測本實施例為對實施例2所構(gòu)建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，進(jìn)行ELISA檢測 BALB/C小鼠體液免疫應(yīng)答，具體操作如下實驗分組與PCR3. I-Cyp^al基因疫苗注射方式與部位與實施例4相同。用 1 100倍稀釋的正常血清(未射任何質(zhì)粒)和1 100倍稀釋的肌肉注射50yg PCR3. 1 空質(zhì)粒DNA的血清分別作為對照，收集PCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫BALB/C小鼠三周后的血清按1 100到1 6000的比例稀釋，以2yg/孔的BALB/C小鼠子宮蛋白作包被抗原， 1 2000的羊抗小鼠IgG-HRP 50 μ L/孔作二抗，用酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad3550Microplate Reader)測定490nm OD值。采用ELISA方法檢測體液免疫應(yīng)答，檢測結(jié)果顯示，PCR3. I-Cyp^al基因疫苗免疫后機體能產(chǎn)生高滴度抗體(抗體滴度> 1 4500)。參照實施例2中所述的方法分別以PCMV4和pVAXl 二種載體構(gòu)建出包含Cyp^al 的重組質(zhì)粒，按照上述方法進(jìn)行了免疫小鼠ELISA檢測pCMV4-Cyp26al、pVAXl-Cyp26al基因疫苗體液免疫應(yīng)答的檢測，檢測結(jié)果顯示，pCMV4_Cyp^al和pVAXl-Cyp^al基因疫苗免疫后機體能產(chǎn)生的抗體滴度分別為1 3500和1 2800，因此，確定pCR3. I-Cyp^al基因疫苗所取得的免疫應(yīng)答明顯效果優(yōu)于其他載體與Cyp^al基因cDNA構(gòu)建的基因疫苗實施例6 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗的安全性評估本實施例評估實施例2所構(gòu)建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗對免疫動物的安全性， 具體操作如下檢測不同劑量QO μ g-300 μ g)PCR3. l"Cyp26al基因疫苗免疫35只BALB/C小鼠， 180天后無一只死亡；進(jìn)行不同劑量PCR3. I-Cyp^al基因疫苗注射動物后的毒理性和常規(guī)生理指標(biāo)的觀察測定，利用組織化學(xué)方法(具體方法參見《實用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)》蔡文琴、王伯沄主編，四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994)確定注射疫苗后動物組織病理變化對腦、心、肝臟、脾臟、肺、腎、子宮和肌肉組織等相應(yīng)組織器官進(jìn)行冰凍切片，在顯微鏡(日本Nikon儀器型號Nikon 80i Microscope System ；冷CCD SPOT)下觀察，沒有發(fā)現(xiàn)動物組織有病理變化。實施例7 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫抗生育實驗本實施例為使用實施例2所構(gòu)建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，對不同鼠種進(jìn)行免疫抗生育實驗(1)免疫抗生育實驗-I選取性成熟，體重220160g的Spreqne-Dawley (SD)雌性大鼠45只，雄性大鼠45 只。動物飼養(yǎng)于人工控制的條件下，飼養(yǎng)溫度在25°c左右，光照周期，自由采食、飲水。45只雌性SD大鼠隨機分為三組，每組15只。免疫質(zhì)粒前24h注射100 μ L免疫佐劑 0. 25%普魯卡因，注射前酒精局部消毒，接種部位腿部肌肉三點注射。對照組1 接種100 μ 1生理鹽水。對照組2 接種100 μ 1 pCR3. 1空質(zhì)粒(含pCR3. 1空質(zhì)粒50 μ g)。實驗組接種100 μ 1 PCR3. l_Cyp26al基因疫苗(含PCR3. l_Cyp26al基因疫苗 50 μ g)，上述3組間隔1周免疫一次，共接種免疫三次。經(jīng)三次免疫后與雄性大鼠1 1 合籠交配，驗栓陽性為妊娠第1天(驗栓的具體方法參見《小鼠胚胎操作實驗指南》A.納吉等人著，科學(xué)出版社，2004)。免疫抗生育實驗中，對照組1(生理鹽水處理組)的生育率為93%，對照組 2(pCR3. 1處理組)的生育率為100%，實驗組(PCR3. I-Cyp^al基因疫苗處理組)的生育率為35.7%。與對照組相比，實驗組生育率顯著降低(P <0.01)，實驗組新生大鼠只數(shù)(Fl) 也顯著低于對照組。具體的實驗結(jié)果統(tǒng)計，如表1所示。表1本發(fā)明基因疫苗對SD雌性大鼠的免疫抗生育實驗結(jié)果
8組別只數(shù)驗栓陽性分娩生育率Fl只數(shù)(只)(只)(只)(%)對照組11514139311. 6 士 0. 65 (η= 152 )對照組215131310012.4±0.75 (η= 162 )實驗組1514535.1**7. 1 士 0. 82 ( η= 36 ) **#表示差異極顯著(P < 0. 01)結(jié)論pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低Spreqne-Dawley雌性大鼠生育的作用，與對照組1和對照組2相比抗生育的效果顯著(ρ < 0. 01)。(2)免疫抗生育實驗-II選取性成熟的雌性BaLb/c小鼠75只，雄性BaLb/c小鼠75只。動物飼養(yǎng)于人工控制的條件下，飼養(yǎng)溫度在25°C左右，12h:12h光照周期，自由采食、飲水。75只雌性BaLb/ c小鼠隨機分為三組，每組25只。免疫質(zhì)粒前24h注射100 μ L免疫佐劑0. 25%普魯卡因， 注射前酒精局部消毒，接種部位腿部肌肉三點注射。對照組1 接種100 μ 1生理鹽水。對照組2 接種100 μ 1 pCR3. 1空質(zhì)粒(含pCR3. 1空質(zhì)粒50 μ g)。實驗組接種100 μ 1 pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗(含pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗 50 μ g)，上述3組間隔1周免疫一次，共接種免疫三次。經(jīng)三次免疫后與雄性BaLb/c小鼠
1 1合籠交配，驗栓陽性為妊娠第1天。免疫抗生育實驗結(jié)果統(tǒng)計免疫抗生育實驗中，對照組1(生理鹽水處理組)的生育率為82.6%，對照組
2(pCR3. 1處理組)的生育率為81. 8%，實驗組(pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗處理組)的生育率為45.8%。與對照組相比，實驗組的生育率明顯降低(P <0.05)，實驗組新生小鼠只數(shù) (Fl)顯著低于對照組(P < 0. 01)。具體的實驗結(jié)果統(tǒng)計，如表2所示。表2本發(fā)明基因疫苗對BaLb/c雌性小鼠的免疫抗生育實驗結(jié)果
組別只數(shù)驗栓陽性分娩生育率Fl只數(shù)(只)(只)(只)(%)對照組125231982. 610.8 士 0. 41 (η= 206 )對照組225221881. 811.3 士 0. 35 (η= 204 )實驗組25241145. 8*9. 7± 0. 42 (n=107 ) ****表示差異極顯著(P < 0. 01)結(jié)論pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低雌性BaLb/c小鼠生育的作用，與對照組1和對照組2相比抗生育的效果明顯(ρ < 0. 01)。(3)免疫抗生育實驗-III選取性成熟的雌性昆明白(KMB)小鼠75只，雄性昆明白小鼠75只。動物飼養(yǎng)于人工控制的條件下，飼養(yǎng)溫度在25°C左右，1 : 1 光照周期，自由采食、飲水。75只雌性昆明白小鼠隨機分為三組，每組25只。免疫質(zhì)粒前Mh，注射100 μ L免疫佐劑0. 25%普魯卡因，接種部位腿部肌肉三點注射。對照組1 接種100 μ 1生理鹽水。對照組2 接種100 μ 1 pCR3. 1空質(zhì)粒(含pCR3. 1空質(zhì)粒50 μ g)。實驗組接種100 μ 1 PCR3. l_Cyp26al基因疫苗(含PCR3. l_Cyp26al基因疫苗 50 μ g) ο上述3組間隔1周免疫一次，共接種免疫三次。經(jīng)三次免疫后與雄性小鼠1 1 合籠交配，驗栓陽性為妊娠第1天。免疫抗生育實驗結(jié)果統(tǒng)計免疫抗生育實驗中，對照組1(生理鹽水處理組)的生育率為100%，對照組 2 (pCR3. 1處理組)的生育率為92%，實驗組(PCR3. 1-Cyp26al基因疫苗處理)的生育率為 37.5%。與對照組相比，實驗組生育率明顯降低(P <0.01)，實驗組新生小鼠只數(shù)(Fl)顯著低于對照組(P < 0. 01)。具體的實驗結(jié)果統(tǒng)計，如表3所示。表3本發(fā)明基因疫苗對雌性KMB雌性小鼠的免疫抗生育實驗結(jié)果
組別只數(shù) (只)驗栓陽性 (只)分娩 (只)生育率 (%)Fl只數(shù)對照組12525251009. 8 ± 0. 32 (η= 246 )對照組22525239212. 1 ± 0. 56 (η= 279 )實驗組2524937. 5**9. 5 ± 0. 48 (n=86 ) ****表示差異極顯著(P < 0.01)結(jié)論pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低雌性昆明白(KMB)小鼠生育的作用，與對照組1和對照組2相比抗生育的效果顯著(ρ < 0. 01)。
序列表
<110>中國科學(xué)院動物研究所
<120>抗生育重組質(zhì)粒、基因疫苗及其制備方法和用途
<130>DIC09110031
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1766
<212>DNA
<213>SD 大鼠 Cyp^al cDNA <400>1
acgcgggggcgagggcggcggcggcaggtggcgcgggaggcttgctgcgtgccatggggc60tcccggcgctgctggccagtgctctctgcaccttcgtgctgccgctgctgctcttcctgg120cggcgctcaagctctgggacctgtactgtgtgagcagccgcgatcgcagctgcgctctcc180ccttgcccccgggtaccatgggcttcccattctttggggaaacattgcagatggtgctgc240agcggaggaagtttctgcagatgaagcgcaggaaatacggcttcatctacaagacgcatc300tgtttgggcggcccacggtgcgagtgatgggcgcggataatgtgcggcgcatcttgctgg360gggagcaccggttggtgtcagtgcactggcgctgcctctccaacctgcatgattcctcgcccttcaaccgagaggcgcttcagtgctacggtctggagcagtggctaagctgcggcgagcgcctcatgttccgcatcgccatgcgcatccgcggggaagacgagcagcagctagtggaggctctccccattgacgtgccctttagcgggctccacgcgcgcatcgaggagaacattcgggcggatgcgggctgcaaggacgcactgcagcagaggctggatatgcaggcaC 3.3.3.3. C 3.3. aaactacagccagtgcagccacatcactgatccaaaaagttcgagaagagataaagagcaacaagttagacatggaaactttggaacagccccttcgattgaatcctccggttccgggagtgaacggttaccagattcccaaggggtggaacgtggcagacagcttcactaacaaggaggatccagaggacacctccaggttcagtttcataggcaaagagtttgcaaaaattcttcttagtgactggcagctgctaaatggacctcctatggacaatcttcctgcaagattcacccacttcttggactcatttgaagtgtacattgtttatttaatttctaaatgtatagtataatatt 3.3.3. 3. 3.3.aataatgaatttgtatgatt<210>2<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>2cgaagcttatggggctcccggcgctgct<210>3<211>30<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3cgctcgagtcagatatctccctggaagtgg
ctgcttcggtgcgcaccatcctgggcgccg420acaagcagcgaaagaaggtgattatgcagg480tgccagtgattgctgaagaagtgagcggtt540gcggcctcctggtctaccccgaggtgaagc600tgctgggctgcgagccgggtccagcgggcg660ctttcgaggagatgacccgcaatctcttct720tgtaccggggcgtgaaggcgcggaacctta780ccaagatccgccggcttcaggccgcagagc840tcttgattgagcactcatgggagagaggag900cgtccacagagctcctctttggtggccatg960tcacctacctaggactctacccacatgtcc1020agggcttactttgcaagagccatcacgagg1080tcaaatacattgggtgtgttattaaggaga1140ggtttcgggtggctctgaagacttttgagc1200atgttatttacagtatctgtgacacccatg1260agtttaatcccgaccgatttacatcgcttc1320ttccatttggaggaggccttcggagctgcg1380agatatttaccgtggagctggccagacgtt1440caatgaagacaagccccaccttctaccctg1500tccagggagatatctgacagctatttcagt1560tttttttttaaatagtgtcatgttgccttt1620tatatgtctctactacagccccatggtctt1680tcccaataaagtaaaattttaaagtgtaaa1740 176權(quán)利要求
1.一種用于哺乳動物抗生育基因疫苗的重組質(zhì)粒，其由Cyp26al基因的CDNA片段和真核表達(dá)載體組成，真核表達(dá)載體優(yōu)選為PCR 3. 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自 Spreqne-Dawley大鼠子宮，其堿基序列優(yōu)選如SEQ IDN0. 1所示。
3.包含權(quán)利要求1或2所述重組質(zhì)粒的菌株；優(yōu)選地，所述菌株為大腸桿菌感受態(tài) DH5a菌株。
4.包含權(quán)利要求1或2所述重組質(zhì)粒的細(xì)胞；優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自人宮頸癌細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
5.一種哺乳動物抗生育基因疫苗，其中所述疫苗包含權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因疫苗，其特征在于，所述疫苗還包含佐劑；優(yōu)選地，所述佐劑選自百分比濃度為0. 25 %的普魯卡因。
7.一種制備權(quán)利要求1或2所述重組質(zhì)粒的方法，其特征在于，所述方法采用如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的堿基序列作為引物克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段；優(yōu)選地，該方法采用溫度降落逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)綌U增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。
8.權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒在制備哺乳動物抗生育基因疫苗中的用途；優(yōu)選地，所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、猴、兔和豬。
9.權(quán)利要求5或6所述的基因疫苗在制備哺乳動物抗生育藥物中的用途；優(yōu)選地，所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、猴、兔和豬。
10.權(quán)利要求5或6所述的基因疫苗在預(yù)防和/或控制鼠害中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗生育重組質(zhì)粒、基因疫苗及其制備方法和用途。該重組質(zhì)粒由Cyp26a1基因cDNA片段和真核表達(dá)載體pCR 3.1組成。重組質(zhì)粒及基因疫苗是通過提取并純化大鼠妊娠子宮總RNA，設(shè)計特異性引物，采用溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U增方法克隆擴增大鼠子宮Cyp26a1基因cDNA片段，并將其重組到真核表達(dá)質(zhì)粒中而構(gòu)建的。所制備的基因疫苗可用于哺乳動物抗生育及預(yù)防和/或控制鼠害，具有安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷的優(yōu)點，比其它免疫手段免疫效力更強，所需的免疫量較小，不僅能有效降低鼠生育，而且還能明顯減少新生仔鼠。
文檔編號A61P15/18GK102191272SQ20101012921
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者夏紅飛, 孫敬, 彭景楩, 楊穎 , 韓丙辰 申請人:中國科學(xué)院動物研究所