專利名稱：基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物大分子藥物技術(shù)領(lǐng)域的藥物制劑及其制備方法，具體是
一種基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物大分子藥物如蛋白，核酸等的口服給藥效果很不理想，其原因之一在于多肽及核酸等分子在胃腸道不穩(wěn)定，很容易被胃腸道的酸性環(huán)境，表面活性劑，以及各種蛋白酶所降解。為了避免多肽或核酸藥物遭受胃腸中苛刻環(huán)境的影響，研究人員選擇適宜的載體來保護(hù)這些疫苗或多肽藥物。脂質(zhì)體制劑由于生物相容性好，而且大小、表面電荷以及膜流動(dòng)性可控，作為口服載體的研究備受關(guān)注。 經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索，如Kisel等人的論文《PE脂質(zhì)體作為胰島素口服制劑載體的研究》(Int J Pharm 2001 ;216(1-2) :105-14。)中公開了以酯鍵構(gòu)成的磷脂制備得到的普通脂質(zhì)體，能夠裝載抗原或多肽藥物，并對它們具有一定保護(hù)作用。又如Lasic DD在綜述論文《脂質(zhì)體的新應(yīng)用》Trends in Biotechnology (1998 ; 16 (7) :307-21。)中也公開了普通脂質(zhì)體作為疫苗口服輸送載體的應(yīng)用，但仍然面臨的主要障礙之一就是普通磷脂脂質(zhì)體在腸道中膽汁鹽的影響下極不穩(wěn)定。因此，現(xiàn)階段急需一種更加穩(wěn)定的載體系統(tǒng)以保護(hù)這些生物活性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑及其制備方法，由四醚脂質(zhì)為主要脂質(zhì)成分，制備脂質(zhì)體，其外膜由多個(gè)具有單分子層跨度的醚脂分子組成，內(nèi)部包裹生物大分子藥物，如多肽，蛋白，和核酸分子等。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明涉及一種基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其粒徑大小在0. l-10微米之間，該脂質(zhì)體膜包括四醚脂質(zhì)的單分子層，其中四醚脂質(zhì)占總脂質(zhì)質(zhì)量的50-100 % ，蛋白或核酸藥物溶解在脂質(zhì)體膜內(nèi)部的水溶液相中。 本發(fā)明涉及上述基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑的制備方法，以四醚脂質(zhì)為原料與含有蛋白或核酸藥物的水性緩沖溶液水合，反復(fù)凍融并經(jīng)帶孔薄膜擠出，制得包裹蛋白藥物的四醚脂質(zhì)體。 所述的以四醚脂質(zhì)為原料是指將古細(xì)菌菌液經(jīng)低溫萃取并純化后制備獲得四醚脂質(zhì)； 所述的古細(xì)菌(Archaea)又稱古菌、太古菌或太古生物，是一類生活在類遠(yuǎn)古生態(tài)環(huán)境中的微生物。 所述的含有蛋白或核酸藥物的水性緩沖溶液，是通過物理包封的方法被包含在四醚脂質(zhì)體的內(nèi)水相中，其中的蛋白藥物和核酸藥物濃度，可根據(jù)具體藥物的有效濃度決定。
所述的反復(fù)凍融并經(jīng)帶孔薄膜擠出，是指在-70 3(TC下反復(fù)凍融3-10次，并
3經(jīng)lOOnm-lOOOnm孔徑的薄膜擠出。 本發(fā)明提出基于四醚脂質(zhì)的應(yīng)用方法可以作為各種多肽，蛋白，寡核苷酸，基因等藥物的口服載體，保護(hù)其在胃腸道的穩(wěn)定性，提高生物利用度和藥效。由于其中的蛋白和基因藥物是通過物理包封的形式被包含在四醚脂質(zhì)體內(nèi)水相中的，所以其具體結(jié)構(gòu)和功能的變化不影響本發(fā)明的執(zhí)行，本發(fā)明可以普遍適用于各種不同結(jié)構(gòu)不同適應(yīng)癥的蛋白和基因藥物，其中蛋白藥物包括但不限定為胰島素，人白細(xì)胞集落生長因子，紅細(xì)胞生成素，人生長因子，降鈣素，艾賽納肽，腸肽激素，胸腺肽，蛋白疫苗抗原包括但不限定為肝炎病毒抗原，皰疹病毒抗原，人乳頭狀病毒抗原，天花病毒抗原，愛滋病毒抗原，腫瘤相關(guān)抗原，核酸藥物包括但不限定為各種基因的質(zhì)粒，帶有各種基因序列的寡核苷酸分子及其化學(xué)修飾結(jié)構(gòu)。


圖1為實(shí)施例四醚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)圖。 圖2為實(shí)施例四醚脂質(zhì)體的原子力顯微鏡示意圖。 圖3為實(shí)施例血糖時(shí)間變化圖。 圖4為實(shí)施例四醚脂質(zhì)體的穩(wěn)定性示意圖。 圖5為實(shí)施例IgG抗體時(shí)間變化圖。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 實(shí)施例1 古細(xì)菌的培養(yǎng)和四醚脂質(zhì)的提取和純化 將古細(xì)菌S. acidocaldarius接種在的ATCC1733培養(yǎng)液中，pH 2.5，置于65t:細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)，通過紫外分光光度計(jì)分別在420nm和540nm監(jiān)控古細(xì)菌的生長情況，當(dāng)古細(xì)菌生長至對數(shù)期時(shí)，通過離心收集(8800rpm， 10min)，收集的菌液在-70 3(TC下反復(fù)凍融3次為四醚脂質(zhì)的提取備用。
將提取的脂質(zhì)以氯仿甲醇水=i : 2 : o. 8混懸12hr后，加入適量氯仿至混
懸液中使氯仿甲醇水的比例調(diào)至為2 : 2 : O. 8，繼續(xù)混懸12h后通過離心(1800rpm，6min)得到含有脂質(zhì)的有機(jī)相，經(jīng)過過濾去除雜質(zhì)后用甲醇水(1 : l)超聲溶解后上樣
于預(yù)先制備好的反相ci8柱(3xi0cm);接著依次以甲醇水=i : i，氯仿甲醇水=o. 8 : 2 : o. 8以及氯仿甲醇水=65 : 25 : 4洗脫；最終收集、濃縮氯仿甲醇水
=0. 8 : 2 : 0. 8洗脫的下來的樣品；濃縮液進(jìn)一步通過TLC硅膠板純化(20X20cm)，以
氯仿甲醇水=65 : 25 : 4作為展開劑，刮下Rf " o. 2處的硅膠帶；以氯仿甲醇
水=1 : 2 : 0.8的溶液把含有PLFE的脂質(zhì)從硅膠洗脫下來，并濃縮。最后以冷甲醇沉淀PLFE三次。 如圖l所示，為本實(shí)施例制備所得，其中圖1A為glycerol dialkyl calditoltetraether (GDNT)禾口 (B) glycerol dialkyl glycerol tetraether (GDGT) 。 Rl代表肌醇磷
4酸，R2代表13 -D-半乳糖-13 -D-吡喃葡萄糖，R3代表13 -D-吡喃葡萄糖。 實(shí)施例2 空白四醚脂質(zhì)體的制備 取PLFE的儲(chǔ)備液適量，加入50mL梨形瓶中，再加入6mL氯仿/甲醇(2 : 1)混合均勻，真空泵抽真空之壓力達(dá)到0. lMpa，水溫設(shè)為50°C， 120rpm，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)60min，在瓶壁形成均勻透明的脂膜，充氮?dú)馐孤确潞图状汲浞謸]干。按照適量的脂質(zhì)濃度在梨形瓶中加入PBS水溶液水合，超聲得到的脂質(zhì)體通過Zetasizer 3000HS激光衍射粒度分析儀(PCS)測定粒徑分布、平均粒徑以及Zeta電位。結(jié)果表明空白四醚脂質(zhì)體粒徑大小為235. 6±12. 3nm，分布均勻，多聚分布系數(shù)(polyindex) < 0. 3 ;表面電荷約_35. lmV。
四醚脂質(zhì)體的穩(wěn)定性分析 以PLFE為脂質(zhì)原料，以含有鈣黃綠素(80mM)的緩沖鹽溶液水合制備的脂質(zhì)體粒徑為230nm左右。以含膽汁鹽的溶液(pH 6. 2)模擬腸道環(huán)境。試驗(yàn)時(shí)，lyL脂質(zhì)體加入到裝有1. 5mL的反應(yīng)緩沖液的熒光管中，37t:下不斷攪拌反應(yīng)，并于2min，20min，60min和90min取出熒光管置于熒光分光光度計(jì)下檢測鈣黃綠素的熒光信號，以確定從脂質(zhì)體釋放的鈣黃綠素。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)管中加入10% (W/V)的OBG(octyl-P-D-glucopyranoside) 60 ii L并于37t:下孵育30min完全裂解脂質(zhì)體，測定包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部所有鈣黃綠素的熒光。最后計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放的鈣黃綠素的百分比。 穩(wěn)定結(jié)果表明，普通脂質(zhì)體是極不穩(wěn)定的，僅在反應(yīng)初2min，幾乎釋放出所有包裹的鈣黃綠素；而穩(wěn)定性明顯的提高來自粒徑大小相當(dāng)?shù)乃拿阎|(zhì)體，在同樣的條件下反應(yīng)90min內(nèi)釋放不足30X的鈣黃綠素，橫坐標(biāo)為口服后的時(shí)間(小時(shí))；縱坐標(biāo)為血糖水平百分比(％)，如圖2所示。
實(shí)施例3 胰島素四醚脂質(zhì)體制劑的口服給藥效果 PLFE為脂質(zhì)原料，以含有胰島素(insulin, 17. 5IU/mL)的PBS水溶液水合，制得包含蛋白藥物的四醚脂質(zhì)體，其的粒徑大小為268. 9±4. 8nm，分布均勻，polyindex < 0. 5，包封率為20%左右。取糖尿病模型小鼠20只，禁食12h，隨機(jī)分成4組第一組灌胃給予溶于磷酸鹽緩沖液的胰島素溶液(insulin, ig);第二組腹腔注射胰島素溶液(insulin, ip);第三組灌胃給予普通脂質(zhì)體包裹的胰島素溶液(Conventional liposomes, ig);第四組灌胃給予四醚脂質(zhì)體包裹的胰島素溶液(Archaeosomes，ig) 。 口服和腹腔注射的胰島素濃度分別為350IU/Kg和50IU/Kg。分別在0、 1、2、4、6、8和12h，于小鼠眼底靜脈叢取血0。 lmL，離心，取20ii L血清，以零時(shí)為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血糖的百分率。 糖尿病小鼠通過口服途徑給藥后的血糖隨時(shí)間的變化情況如圖4所示，橫坐標(biāo)為孵育時(shí)間(分鐘)；縱坐標(biāo)為包裹的熒光分子的百分比(％)。 結(jié)果表明口服裝載胰島素的四醚脂質(zhì)體可以使糖尿病小鼠在口服后4小時(shí)內(nèi)維持20%以上的降血糖作用，以及在口服后的1小時(shí)到4小時(shí)達(dá)到最大降血糖效果(約為28% )。而普通脂質(zhì)體載體系統(tǒng)和胰島素溶液系統(tǒng)，口服后卻沒有明顯的降糖效果。
實(shí)施例4 疫苗抗原OVA的四醚脂質(zhì)體制劑的口服免疫效果 PLFE為脂質(zhì)原料，以含有卵清白蛋白(OVA， 4mg/mL)的PBS水溶液水合，制得包括
5蛋白抗原的四醚脂質(zhì)體，再經(jīng)-70 3(TC下反復(fù)凍融3次，平均粒徑約可達(dá)500nm以上。用裝載OVA的四醚脂質(zhì)體免疫小鼠，免疫時(shí)間分別為0、2和28天各一次，免疫劑量為8mg。免疫后每周眼眶后靜脈叢取血，存樣。另外，初次免疫后第6周，切除從十二指腸頂端到回腸末端約15cm的小腸部分，去除腸系膜，用灌腸洗脫液清洗。通過ELISA來定量測量血漿中IgG或者腸灌洗收集液中IgA的量?？诜拿阎|(zhì)體包裹OVA的疫苗，血漿中產(chǎn)生了明顯(p<0。 01)的0VA特異性的IgG抗體，如圖5中的a、b、c所示，橫坐標(biāo)為口服后的時(shí)間(天數(shù))；縱坐標(biāo)為是每個(gè)樣測定的IgG抗體水平與在第O天的抗體水平的比例。同時(shí)，小鼠腸道洗脫液中測得的OVA特異性的IgA抗體水平也比普通脂質(zhì)體作為載體產(chǎn)生的水平明顯提高(P < 0。 05)，如圖3、4所示。
實(shí)施例5 : CpG序列分子的四醚脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性 將CpG序列分子TCCATGACGTTCCTGACGTT混合protamine分子包裹在四醚脂質(zhì)體中，得到包裹效率超過80%的載體制劑，在模擬腸道環(huán)境的緩沖液中放置120分鐘，凝膠色譜分析其穩(wěn)定性，可以看到70%以上的寡核苷酸分子沒有被降解。而對照的普通脂質(zhì)體制劑則已經(jīng)沒有任何檢測得到的寡核苷酸分子了。 上述實(shí)施例成功的從古細(xì)菌S. acidocaldarius中提取四醚脂質(zhì)(PLFE)以制備四醚脂質(zhì)體。并對其粒徑，表面電荷以及形態(tài)特征等方面進(jìn)行了表征，結(jié)果表明由PLFE組成的四醚脂質(zhì)體表面高的負(fù)電荷導(dǎo)致粒徑分散指數(shù)好，不容易聚集。而在模擬腸道環(huán)境的緩沖液中，四醚脂質(zhì)體是相當(dāng)穩(wěn)定的。在應(yīng)用效果方面，首先作為多肽藥物的口服載體，四醚脂質(zhì)體包裹的胰島素對糖尿病小鼠具有明顯的降血糖作用。其次作為模型抗原OVA的口服疫苗載體，四醚脂質(zhì)體不但能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生持久增強(qiáng)的、特異的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，而且也有利于產(chǎn)生增強(qiáng)特異的黏膜免疫反應(yīng)。
權(quán)利要求
一種基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征在于，該脂質(zhì)體膜包括四醚脂質(zhì)的單分子層，其中四醚脂質(zhì)占總脂質(zhì)質(zhì)量的50-100％，蛋白藥物或核酸藥物溶解在脂質(zhì)體膜內(nèi)部的水溶液相中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所述的四醚脂質(zhì)是指將古細(xì)菌菌液經(jīng)低溫萃取并純化后制備獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所 述四醚脂質(zhì)來自于S. Acidacaldarius古生菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所 述的蛋白藥物為多肽藥物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所 述的蛋白藥物為胰島素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所 述的蛋白藥物為疫苗抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑，其特征是，所 述的核酸藥物為聚合聚核苷酸結(jié)構(gòu)和寡聚核苷酸結(jié)構(gòu)的分子。
8. —種基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑及其制備方法，其特征在于，將四 醚脂質(zhì)與蛋白或核酸藥物的水性緩沖溶液混合，再經(jīng)反復(fù)凍融和特定粒徑的薄膜擠出，得 到所述的四醚脂質(zhì)體制劑。
全文摘要
一種生物大分子藥物技術(shù)領(lǐng)域的基于四醚脂質(zhì)的蛋白或核酸藥物脂質(zhì)體制劑及其制備方法，該脂質(zhì)體膜包括四醚脂質(zhì)的單分子層，其中四醚脂質(zhì)占總脂質(zhì)質(zhì)量的50-100％，蛋白藥物或核酸藥物溶解在脂質(zhì)體膜內(nèi)部的水溶液相中。本發(fā)明可以作為各種多肽，蛋白，寡核苷酸，基因等藥物的口服載體，保護(hù)其在胃腸道的穩(wěn)定性，提高生物利用度和藥效，其中的多肽和蛋白藥物包括胰島素，人白細(xì)胞集落生長因子，紅細(xì)胞生成素，人生長因子，降鈣素，艾賽納肽，腸肽激素，胸腺肽等；疫苗抗原包括各種肝炎病毒，艾滋病毒，人乳頭病毒，皰疹病毒的抗原等；核酸藥物包括各種基因的質(zhì)粒，帶有各種基因序列的寡核苷酸分子及其化學(xué)修飾結(jié)構(gòu)。
文檔編號A61K38/00GK101744768SQ201010128338
公開日2010年6月23日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者徐宇虹, 李正榮 申請人:上海交通大學(xué)