專利名稱：內(nèi)皮細(xì)胞生長因子vegf抗原表位的模擬短肽7b及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
VEGF是1989年Ferrara在牛垂體濾泡星形細(xì)胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來的一 種相對分子量在34 42KD的同源二聚體蛋白。人類的VEGF基因結(jié)構(gòu)位于染色體的6p21. 3 上，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子交替構(gòu)成。根據(jù)其mRNA的剪切方式不同，產(chǎn)生了 5種不同 的 VEGF 異構(gòu)體，包括 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145 和 VEGF121。這 5 種 VEGF 的異 構(gòu)體均具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生的活性，是一種有效的血管形成和通透性誘導(dǎo)因子，其差異 主要在于它們與細(xì)胞表面以及細(xì)胞外基質(zhì)中肝素的親和力的不同。VEGF與其相應(yīng)的VEGF受體結(jié)合來發(fā)揮作用。目前克隆出的VEGF受體主要有 Flt-I和KDR/Flk-Ι兩種，二者均具有酪氨酸激酶活性，是一種跨膜的糖蛋白，選擇性的表 達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞表面，通過啟動(dòng)不同的信號(hào)通路來發(fā)揮生物學(xué)作用，即促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促 進(jìn)血管的形成以及血管通透性的增加。噬菌體展示技術(shù)(Phage Display Technology)是一種將外源肽或者蛋白質(zhì)與特 定的噬菌體衣殼蛋白PIII或者PVIII相融合，展示于噬菌體表面來構(gòu)建蛋白質(zhì)或多肽文 庫，并從中篩選出目的蛋白、多肽或抗體的基因工程高新技術(shù)。它的優(yōu)勢在于可以將表現(xiàn)型 與基因型直接聯(lián)系在一起，確保能方便快捷的展示出目的蛋白以及該蛋白的基因序列。基 于此，近年來在多肽序列鑒定、多肽模擬物的結(jié)構(gòu)和功能的研究以及在人類病毒、細(xì)胞、腫 瘤等多種生物靶組織多肽的研究方面，噬菌體展示技術(shù)發(fā)揮著重要的不可替代的作用。研究表明，VEGF和其受體在許多腫瘤組織中有高表達(dá)，在乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃 癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤、腺瘤等多種腫瘤組織內(nèi)、外都可檢測到大量的VEGF。原位雜交 試驗(yàn)顯示VEGF的mRNA主要分布在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，且腫瘤細(xì)胞也高度表達(dá)Flk-I，提示腫瘤局 部存在自分泌和旁分泌機(jī)制促進(jìn)血管生長。VEGF的表達(dá)程度與腫瘤的組織學(xué)類型、原發(fā)腫 瘤的大小、有無血管或淋巴管轉(zhuǎn)移等多種因素有關(guān)肺腺癌組織中VEGF的表達(dá)程度顯著高 于鱗癌；VEGF高表達(dá)者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯增高；低分化腫瘤患者的VEGF表達(dá)高 于高分化者；VEGF陽性患者的復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差、早期死亡率高。而腫瘤患者的年齡、性別、 腫瘤生長部位等與VEGF表達(dá)無關(guān)。鑒于此，研究者們設(shè)想，如果能通過噬菌體展示技術(shù)和 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)得到一系列VEGF的相關(guān)表位序列，制成小分子多肽，為今后抗原肽疫苗的 研發(fā)提供支持，在人體內(nèi)產(chǎn)生專門針對VEGF的抗體，將會(huì)對人體內(nèi)惡性腫瘤的治療發(fā)揮巨 大作用。目前多肽類藥物中，在抗腫瘤方面，Kathleen等人通過人工化學(xué)合成了 2個(gè)多肽， 結(jié)果表明該多肽對人宮頸癌細(xì)胞的抑制率較高，但該肽段與人源性VEGF并無明顯的同源 性，而Maruta等人得到的具有抗腫瘤活性的保守基序MXXP也與FGFs沒有同源性。這些肽 段人工合成費(fèi)用高，而且若作為疫苗，可能會(huì)在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生該肽段特異性的抗體，從而阻止其抗腫瘤效用的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 VEGF抗原表位的模擬短肽7B。本發(fā)明的另一目的在于提供所述內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B 的應(yīng)用本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的 模擬短肽 7B，其氨基酸序列為 Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met ArgCys Gly Gly Cys Cys Asn，即 FKPSCVPLMRCGGCCN ； 所述內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B的核苷酸序列如下所示TT CAAACCGTCCTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGTGCAACG ；所述的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7Β用于制備多肽疫苗、腫瘤 血管生長抑制劑或者腫瘤導(dǎo)向藥物；所述的腫瘤優(yōu)選為黑色素瘤。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明所述內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 VEGF抗原表位的模擬短肽7Β根據(jù)人的VEGF189肽段序列通過生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)，接著 通過噬菌體展示技術(shù)獲得。體外相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證明模擬短肽7Β在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、成管、腫瘤 細(xì)胞增殖和遷移過程中具有明顯的抑制作用，也就是其具有明顯的抗腫瘤和抗血管新生作 用。本發(fā)明所述的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7Β對于以VEGF受體為目 標(biāo)、診斷預(yù)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展，探討小分子多肽對腫瘤血管新生抑制劑的開發(fā)以及腫瘤導(dǎo) 向性藥物的開發(fā)和研究具有十分重要的參考價(jià)值。


圖1是重組載體7B-pCANTAB5-E酶切鑒定的電泳圖。圖2是用兔抗人VEGF多抗對噬菌體表位肽7Β進(jìn)行ELISA檢測的結(jié)果圖。圖3是模擬短肽7Β抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖的結(jié)果圖。圖4是模擬短肽7Β抑制腫瘤細(xì)胞Β16增殖的結(jié)果圖。圖5是模擬短肽7Β抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC成管的顯微鏡觀察圖。圖6是模擬短肽7Β抑制腫瘤細(xì)胞B16F10遷移的結(jié)果圖。圖7是模擬短肽7Β抑制腫瘤細(xì)胞B16F10遷移的顯微鏡觀察圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1(1)通過生物信息學(xué)方法，模擬得到內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽 7Β的核苷酸序列如下所述TTCAAACCGTCCTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGTGCAACG ；
(2)為了將只有48個(gè)堿基的模擬短肽7B高效的構(gòu)建到噬菌體載體pCANTAB5_E 上，先根據(jù)PCANTAB5-E上的堿基序列和酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物1和引物2進(jìn)行第一輪PCR，兩 者PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板。然后根據(jù)模擬短肽7B的堿基序列以及第一輪PCR得到 的產(chǎn)物堿基序列，設(shè)計(jì)引物A和引物B，進(jìn)行第二輪PCR。擴(kuò)增得到堿基長度在100 200bp、 包含有模擬短肽7B的產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 第一輪PCR 條件94°C 5min，55°C 5min，72°C 5min，7 個(gè)循環(huán)。 第二輪PCR 條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，56°C退火 35s，72°C延伸 40s，30 個(gè)循環(huán)。 (3)將第二輪PCR產(chǎn)物切膠回收，連入T載體(Takara公司)，轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌(Takara公司)中挑取單菌落，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送樣測序。測序由上海生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司完成。載體的構(gòu)建、連接及轉(zhuǎn)化通過HindIII和Not I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)將多肽片段從T 載體上切下，連入具有同樣酶切位點(diǎn)的PCANTAB5-E載體(Pharmacia公司)中，得到重組載 體7B-pCANTAB5-E。酶切條件和體系如下37°C水浴酶切16h。
連接條件和體系如下16°C水浴連接24h。
將構(gòu)建好的載體7B-pCANTAB5-E轉(zhuǎn)化入TGl大腸桿菌(Pharmacia公司)中，挑取 單克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定結(jié)果如圖1所示。
(4) VEGF表位肽噬菌體展示及鑒定用輔助噬菌體VCSM13 (Stratagene公司)去 感染構(gòu)建好位于對數(shù)生長期的TGl菌，靜置30min后加入卡那霉素至70mg/L ；在4°C條件下 8000rpm離心獲得菌液上清，加入滅菌飽和硫酸銨冰浴沉淀3h，4°C下8500rpm離心獲得噬 菌體沉淀，去除上清至無上清液流出狀態(tài)，DMEM溶解，4°C保存；取10μ 1稀釋后測滴度。模 擬短肽7Β的滴度為4. 6Χ 1012pfu/mL。將該噬菌體表位肽進(jìn)行ELISA鑒定在酶標(biāo)板中以 9ng/100 μ L包被兔抗人VEGF多抗(購自Abcam公司)，37°C，2h ；用1 XPBS-T洗板3次，每 次3min ；200 μ L/孔5%脫脂奶粉37°C封閉Ih ；用1 XPBS-T洗板3次，每次3min ；加入不 同稀釋度的噬菌體表位肽并設(shè)立VCSM13對照、空白對照，100μ L/孔，37°C，Ih ；用IXPBS-T 洗板3次，每次3min ；加入抗噬菌體HRP酶標(biāo)二抗(1 2500) 100 μ L/孔，37°C，30min ；用 1 XPBS-T洗板5次，每次3min ；加底物顯色液(TMB) 100 μ L/孔，避光IOmin,加終止液2M H2SO4 50 μ L/孔，測0D450nm值。如圖2所示，可知模擬短肽7B已經(jīng)被展示在噬菌體表面。(5)對內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的檢測A、MTT法測噬菌體表位肽對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制作用⑴原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞HUVEC的分離和培養(yǎng)取新生兒臍帶一段(廣州華僑醫(yī)院提供)，用PBS將靜脈沖洗干凈， 用止血鉗夾閉血管一端；用0. 25%胰酶消化液灌注，室溫消化15min ；用含10%小牛血清 的培養(yǎng)液沖洗并終止胰蛋白酶的消化作用，將沖洗液收集到50mL無菌離心管中，1500rpm 離心IOmin ；加入含有20%胎牛血清的完全SFM(購自Gibco公司)培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶 中，37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，換液，去除紅細(xì)胞和其他未貼壁細(xì)胞；待細(xì)胞貼 壁生長至90%融合狀態(tài)后消化傳代；(2)取對數(shù)生長期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC， 棄盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入適量0. 025%胰酶溶液消化，輕搖使消化液均勻作用于細(xì)胞，當(dāng)成片 細(xì)胞圓縮、呈單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)時(shí)去除消化液，迅速加入適量培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使成單細(xì) 胞懸液；取該單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后以每孔5000個(gè)細(xì)胞的濃度分至96孔板中，用含10%小牛 血清的M199的培養(yǎng)液于37°C、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；換用含0. 2%小牛血 清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h至單層細(xì)胞狀態(tài)；加入不同稀釋度的噬菌體表位肽、M13噬 菌體，并設(shè)立空白對照，于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ；每孔加入5g/L MTT溶液 20μ 1，37°C，繼續(xù)孵育3h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μ 1 DMSOjM 蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔收值，記錄結(jié) 果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該噬菌體表位肽具有明顯的抑制原代HUVEC增殖的效用， 如圖3所示，在1/30的表位肽稀釋度下，表位肽7B對HUVEC的生長抑制率達(dá)到50. 9%。B、MTT法測噬菌體表位肽對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期的黑色素瘤 細(xì)胞系B16 (購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，棄盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入適量0. 25% 胰酶溶液消化，輕搖使消化液均勻作用于細(xì)胞，當(dāng)成片細(xì) 胞圓縮、呈單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)時(shí)去除消 化液，迅速加入適量培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使成單細(xì)胞懸液；取該單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后以每 孔5000個(gè)細(xì)胞的濃度分至96孔板中，用含10%小牛血清的DMEM的培養(yǎng)液于37°C、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；換用含0. 2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h至單層細(xì) 胞狀態(tài)；加入不同稀釋度的噬菌體表位肽、M13噬菌體，并設(shè)立空白對照，于37°C、5% CO2恒 溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ；每孔加入5g/L MTT溶液20 μ 1，37°C，繼續(xù)孵育3h，終止培養(yǎng)，小心吸 棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0,振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490nm波 長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔收值，記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。如圖4所示，在1/30的表位肽稀釋度下，表位肽7B對B16的生長抑制率達(dá)到58. O%。(6)對內(nèi)皮細(xì)胞成管抑制作用的檢測取450 μ 1的ECM gel置于4°C活化過夜。將ECM gel與450 μ 1的DMEM混勻，注意不要出現(xiàn)氣泡。每孔取60μ1鋪于96孔板中，室溫靜置5min，待其鋪平后置于37°C C02 培養(yǎng)箱中備用。取原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，用0.025%的胰酶消化成單細(xì)胞懸 液，吹勻，以1. 5X104/50 μ 1的量加入鋪好ECM gel的96孔板中。取VEGF表位肽7B禾口 VCSMl3用1640基本培養(yǎng)基稀釋至1/100，加入96孔板中，同時(shí)設(shè)立空白對照，將96孔板置 于37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5hr后觀察拍照(40X)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，表明7B能有效 抑制HUVEC的成管作用。(7)對腫瘤細(xì)胞遷移抑制作用的檢測A、取對數(shù)生長期的黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10 (南京凱基生物有限公司)，用 0. 25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，用1640基本培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞數(shù)至5X 105/ml。B、在放入Tranwell小室的24孔培養(yǎng)板中，于小室下層加入含10%小牛血清的 1640完全培養(yǎng)基600 μ 1。C、在小室上層加入B16F10細(xì)胞懸液100 μ 1，并相應(yīng)加入7Β的噬菌體表位肽，濃度 為101Qpfu/ml，同時(shí)設(shè)立VCSM13(濃度為101Qpfu/ml)對照和空白對照。D、將24孔板置于37°C含5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h。Ε、將小室取出，用1640基本培養(yǎng)基淋洗2次，室溫下放入70%乙醇中固定15min。F、將固定完畢的小室用0. 015M pH7. 4的PBS淋洗3次，風(fēng)干，放回24孔板中，小室 上層加入100 μ 1吉姆薩染液，下層加入800 μ 1吉姆薩染液，染色15min后取出，用0. 015M PH7. 4的PBS淋洗3 4次，用棉簽輕輕將小室上層的細(xì)胞擦去、風(fēng)干。G、放入顯微鏡下計(jì)數(shù)(40X)，以Control組細(xì)胞遷移率100%做對照，用藥組細(xì)胞 遷移率=用藥組遷移到小室下層的細(xì)胞數(shù)/Control組遷移到小室下層的細(xì)胞數(shù)X 100% 計(jì)算，如圖6所示，可知7B表位肽能抑制高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10的遷移作用，抑制遷移率超 過80%;拍照(IOOX)0如圖7所示，可直觀的看到用藥組與VCSM13以及Control組相比， 明顯抑制了 B16F10的遷移作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽 7B，在一定程度上可在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖作用，并且能明顯抑制HUVEC 成管和以及B16F10的遷移作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B及其應(yīng)用<130>2<160>6<170>PatentIn version 3. 2<210>1
<211>16<212>PRT<213>artificial sequence<220><223>內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B的氨基酸序列<400>1Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn151015<210>2<211>48<212>DNA<213>artificial sequence<220><223>內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B的核苷酸序列<400>2ttcaaaccgt cctgcgttcc gctgatgcgt tgcggtggtt gtgcaacg 48<210>3<211>54<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 1<400>3aagctttgga gccttttttt tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgc 54<210>4<211>59<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 2<400>4ggccggctgg gccgcataga aaggaacaac taaaggaatt gcgaataata attttttca 59<210>5<211>56<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 A
<400>5
tatgcggccc agccggcctt caaaccgtcc tgcgttccgc tgatgcgttg cggtgg 56<210>6<211>35<212>DNA <213>artificial sequence<220><223> 引物 B<400>6gcggccgcgt tgcagcaacc accgcaacgc atcag 3權(quán)利要求
一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B，其特征在于所述模擬短肽7B的氨基酸序列如下所示Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬短肽7B，其特征在于所述模擬短肽7B的核苷酸序列如 下所示TTCAAACCGTCCTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGTGCAACG。
3.權(quán)利要求1或2所述內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B的應(yīng)用，其特征 在于所述模擬短肽7B用于制備腫瘤多肽疫苗、腫瘤血管生長抑制劑或者腫瘤導(dǎo)向藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF抗原表位的模擬短肽7B及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的模擬短肽7B的氨基酸序列為FKPSCVPLMRCGGCCN，核苷酸序列為TTCAAACCGTCCTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGTGCAACG。體外實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的模擬短肽7B在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、成管、腫瘤細(xì)胞增殖和遷移過程中具有明顯的抑制作用。因此，本發(fā)明所述的模擬短肽7B可用于制備多肽疫苗、腫瘤血管生長抑制劑或者腫瘤導(dǎo)向藥物，而且其對于以VEGF受體為目標(biāo)、診斷預(yù)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展，探討小分子多肽對腫瘤血管新生抑制劑的開發(fā)以及腫瘤導(dǎo)向性藥物的開發(fā)和研究具有十分重要的參考價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/10GK101838311SQ201010019510
公開日2010年9月22日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者宋其芳, 王宏, 趙鑫, 鄧寧 申請人:暨南大學(xué)