專利名稱：多價疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及一種免疫原性組合物(例如疫苗)，具體而言涉及一種多價免疫原性組合物，例如多價HIV疫苗，并且涉及使用它的方法。本發(fā)明還涉及使用遺傳算法以創(chuàng)建適于用例如疫苗接種策略的多價抗原組的方法。
背景技術(shù)：
設計一種有效的HIV疫苗是多面性的挑戰(zhàn)。該疫苗優(yōu)選引起免疫應答，該免疫應答要么能預防感染，要么至少也能在發(fā)生感染時控制病毒的復制，盡管對自然感染的免疫應答已失效，從而消除病毒(Nabel，Vaccine 20 1945-1947 (2002))或者免受重復感染 (Altfeld et al，Nature 420:434-439(2002))。需要一種強力疫苗，其具有優(yōu)化的載體、 免疫學流程和佐劑(Nabel，Vaccine 20 1945-1947 (2002))，并結(jié)合有能針對多種譜系的流行病毒來激發(fā)交互反應性應答的抗原(Gaschen et al, Science 296:2354-2360(2002)， Korber et al，Br. Med. Bull. 58 19-42 (2001))。困擾了流感疫苗學家數(shù)十年的問題突顯了由HIV-I造成的挑戰(zhàn)遭受抗原漂移的人流感病毒株每年在相互之間偏移約1 2%，而疫苗抗原通常年復一年地不能引起交互反應性B細胞應答，這就需要對同期的病毒株進行持續(xù)監(jiān)測，并每隔幾年就要對疫苗進行更新(Korber et al，Br. Med. Bull. 58 :19_42 (2001))。 相比之下，共流行的個體HIV-I病毒株彼此之間的差異在相對保守的蛋白質(zhì)中達20%或更多，而在包膜蛋白中高達35% (Gaschen et al, Science 296 :2354_2360 (2002)，Korber et al, Br. Med. Bull. 58 19—42 (2001))。在地區(qū)性HIV-I流行病中病毒多樣性的不同程度為疫苗設計策略提供了潛在有用的層次。某些地域再現(xiàn)了全球多樣性，在這些地域中，大部分的已知HIV-I亞型或進化枝共流行(例如剛果民主共和國(Mokili & Korber, J. Neurovirol ll(Suppl.l) 66-75(2005))，其余地域主要為兩種亞型和它們的重組體(例如烏干達(Barugahare et al, J. Virol. 79 :4132-4139 (2005))，剩下的為單一亞型(例如南非(Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19 133-144 (2003)) 即使是單一亞型流行病占主導地位的地區(qū)，也必須注意大范圍的進化枝內(nèi)多樣性(Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19 :133-44 (2003))，但是，由于可期待國際旅行能進一步使地理性差異模糊化，所有的國家都可受益于一種全球性疫苗。于此提出了多價疫苗抗原集合的設計，其注重于T淋巴細胞應答，并且為通常的B 亞型和C亞型而優(yōu)化，或是為在全球流行的所有HIV-I變體[HIV-1主(M)組]而優(yōu)化。細胞毒T淋巴細胞(CTL)直接殺死受感染的產(chǎn)生病毒的宿主細胞，其利用人白細胞抗原(HLA) 分子通過存在于受感染細胞表面的病毒蛋白片段(抗原表位)來識別它們。輔助性T細胞的應答通過細胞因子的釋放來控制免疫應答的各個方面。二者對于HIV-I疫苗來說可能都是至關(guān)重要的早已指出CTL應答與減緩疾病進展有關(guān)(Oxenius et al, J. Infect. Dis. 189 1199-208 (2004))；非人靈長類動物中由疫苗引發(fā)的細胞免疫應答有助于控制病原性SIV或SHIV，降低免疫激發(fā)(challenge)后生病的可能性(Barouch et al, Science 290 =486-92(2000))；并且⑶8+T細胞的實驗性耗盡導致感染SIV的恒河猴體內(nèi)病毒血癥的增長(Schmitz et al, Science 283:857-60(1999))。此外，CTL逃逸突變與疾病進展有關(guān)(Barouch et al,J. Virol. 77 7367-75 (2003))，所以阻塞潛在逃逸路徑的由疫苗刺激的記憶應答可能是有價值的。高可變性包膜蛋白是用于針對HIV來中和抗體的首要目標；由于免疫防護有可能同時要求 B 細胞和 T 細胞應答(Moore and Burton，Nat. Med. 10 :769_71 (2004))，同樣需要對包膜疫苗抗原進行單獨優(yōu)化以引起抗體應答。相比之下，由T細胞引導的疫苗成分可定位于更加保守的蛋白質(zhì)，但即使是最保守的HIV-I蛋白也是非常多樣化的，這樣變異就成為了一個問題。人工中央序列疫苗法(例如共有序列——其中每種氨基酸可見于多條序列，或者是祖先序列的最大可能重構(gòu)物(Gaschen et al, Science 296 :2354_60 (2002)，Gao et al, J. Virol. 79 1 154-63(2005)，Doria-Rose et al, J. Virol. 79 1 1214-24(2005)， Weaver et al，J. Virol.，印刷中))是有前景的；盡管如此，即使是中央化的病毒株也只能提供HIV-I變體的有限覆蓋，而基于共有序列的試劑無法檢測出多種自體T細胞應答 (Altfeld et al，J. Virol. 77 :7330_40(2003))。單個氨基酸的改變會讓表位從T細胞的監(jiān)視下逃逸；由于在各種HIV-I病毒株之間很多T細胞表位在一個或多個位置處不同，對任意單種疫苗抗原的潛在應答是有限的。某一特定突變是否導致逃逸取決于特定表位/T細胞的組合，盡管某些改變會寬泛地影響亞型之間的交互反應性(Norris et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 315-25(2004))。在多價疫苗中包括多個變體能對更廣范圍的流行變體進行應答，還能使免疫系統(tǒng)針對通常的逃逸突變做好準備(Jones et al, J. Exp. Med. 200 1243-56 (2004))。 從一個T細胞受體中逃逸會創(chuàng)建出易受他者影響的一個變體(Allen et al, J. Virol. 79 12952-60(2005)，F(xiàn)eeney et al, J. Immunol. 174 :7524_30 (2005))，所以激發(fā)針對表位變體的多克隆應答可能是有益的(Killian et al，Aids 19 :887_96 (2005))。抑制操作(Milicic et al, J. Immunol. 175 4618-26 (2005))或 HLA 結(jié)合(Ammaranond et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 21 =395-7(2005))的逃逸突變無法由具有不同特異性的T細胞來直接對抗， 但是針對重疊區(qū)表位的應答可至少阻塞這些逃逸途徑的其中一些。本發(fā)明涉及一種多價疫苗，其包含幾個“鑲嵌”蛋白(或編碼這些蛋白的基因)。 候選疫苗抗原可以是k種復合蛋白的混合物(k為混合物中序列變體的數(shù)目)，其經(jīng)優(yōu)化以在一組輸入的病毒蛋白中包括最大數(shù)目的潛在T細胞表位。鑲嵌體由天然序列產(chǎn)生它們類似于天然蛋白，并包括潛在表位的最常見形態(tài)。由于CD8+表位是毗連的，并且通常為9 個氨基酸那么長，所以鑲嵌體組可由天然序列中九聚物(九聚體)的“覆蓋率”來打分(相似長度的片段都能良好地得到表示)。至少三次未被發(fā)現(xiàn)的九聚體可被排除。這種策略使得多樣性覆蓋率的水平由非常多價的多聯(lián)肽疫苗實現(xiàn)，但其具有重要的優(yōu)勢其使得疫苗能像完整的蛋白質(zhì)或基因那樣遞送，排除了與流行病毒株無關(guān)的低頻率或非天然的表位， 并且其完整的蛋白抗原更加可能像是在自然感染中那樣進行處理。

發(fā)明內(nèi)容
總體而言，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及一種多價免疫原性組合物(例如HIV疫苗)，并且涉及使用它的方法。本發(fā)明還涉及使用遺傳算法以設計適于作為疫苗使用的多價抗原組的方法。本發(fā)明的目的和優(yōu)點通過后述的描述將會更加清晰。


圖IA 圖IF =HIV-IM組的潛在表位覆蓋率的上限。示出了針對增加變體數(shù)目的九聚體的群體覆蓋率的上限，k = 1 8個變體。長度為9的移動窗口放在比對序列上，逐次下移一個位置。不同顏色表示不同數(shù)目序列的結(jié)果。在每個窗口中，針對Gag(圖IA和圖lB)、Nef (圖IC和圖1D)和Env gpl20(圖IE和圖1F)，以k個最常見的9聚物給出的覆蓋率制圖。為維持比對而插入的間隙被視作字符。加入更多變體時，返回結(jié)果會明顯減少， 這是因為當k增大時，愈加稀有的形式也會增加。在圖1A、圖IC和圖IE中，每條連續(xù)九聚體的得分都按照它們的天然順序作圖，以示出多樣性在不同蛋白區(qū)域中是如何變化的；Gag 中心的P24和Nef的中心區(qū)域的保守程度都特別高。在圖1B、圖ID和圖IF中，每條九聚體的得分都按覆蓋率重新排列(圖4中同樣使用的一種策略)，以提供對給定蛋白的整個群體覆蓋率的判斷。gpl20的覆蓋率即使采用8種變異九聚體也是特別差的(圖IE和圖1F)。圖2A 圖2C 鑲嵌體的初始化、打分和優(yōu)化。圖2A)通過天然序列的隨機兩點重組產(chǎn)生一組k個群體(1 6個具有50 500條序列的群體，每個群體均經(jīng)過測試)。從每一群體中選擇一條序列(最初是隨機的)用于該鑲嵌體混合物，其隨后被優(yōu)化。通過計算覆蓋率(定義為包括在該混合物中的天然序列九聚體的平均分數(shù)，有輸入數(shù)據(jù)組中的所有天然序列平均而得到)來對該混合物序列打分。覆蓋更多表位的任何新序列都會提高整個混合物的得分。圖2B)任何個體序列的適合度得分為含有該序列以及來自其他群體的當前代表的混合物的覆蓋率。圖2C)優(yōu)化1)選擇兩個“親代”隨機選擇的一對重組序列的較高得分者，以及要么是(50%可能性)隨機的第二對中的較高得分序列，要么是隨機選擇的天然序列。2)使用兩個親代之間的兩點重組以產(chǎn)生“子代”序列。如果該子代包含非天然的或稀有的九聚體，則立即將其剔除，相反則對其打分(Gaschen et al, Science 296 2354-2360(2002))。如果該得分高于四個隨機選擇的群體成員中任一者的得分，則將該子代插入到該群體中，以取代這四個中的最弱者，由此進化出改良的群體；4)如果其得分為最高得分，則用該新的子代取代群體中的當前混合物成員。依次對于每一群體重復進行十次循環(huán)的子代生成，重復進行該過程直至改進停止。圖3:所有HIV蛋白的鑲嵌株覆蓋率。示出了由每種HIV蛋白的四個 鑲嵌蛋白組獲得的九聚體覆蓋率的水平，其中使用用M組或C亞型優(yōu)化的鑲嵌體。對C亞型進行優(yōu)化 (進化枝內(nèi)優(yōu)化)的鑲嵌體所覆蓋的C亞型序列九聚體的部分以灰色示出。由C亞型優(yōu)化的鑲嵌體在非C亞型M組序列中得到的九聚體覆蓋率(進化枝間覆蓋率)以白色示出。由 M組優(yōu)化的鑲嵌體得到的C亞型序列的覆蓋率以黑色示出。B進化枝的比較得到了類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。 圖4A 圖4F:不同候選疫苗的M組序列覆蓋率，每個九聚體逐個進行。每幅圖由單個三價候選疫苗得到的M組天然序列比對的逐個位點的覆蓋率(即，對于每一個九聚體)。沿χ軸的豎條代表對于給定比對位置，與候選疫苗匹配的序列的比例9/9匹配(紅色)，8/9匹配(黃色)，7/9匹配(藍色)。比對的九聚體沿χ軸按完全匹配的覆蓋率值分類。656個位置包括完整的Gag以及Nef的中心區(qū)域。對于每一個比對位置，最大可能的匹配值(即，在該九聚體中沒有間隙的比對序列的比例)以灰色示出。圖4A)從在疫苗研究中使用的病毒株中選出的非最優(yōu)天然序列(Kong et al,J. Virol. 77 12764-72 (2003))，包括個體進化枝A、B和C的病毒序列(Gag =GenBank編號AF004885、K03455和U52953 ；Nef核心序列AF069670、K02083和TO2953)。圖4B)通過選擇具有最大覆蓋率的單條序列而選定的天然序列[分離序列US2 (B亞型，USA)，70177 (C亞型，印度)和99TH。R2399 (CRF15_01B 亞型，泰國)；編號AY173953、AF533131和_AF530576]的最優(yōu)組，隨后是在與針對M組覆蓋率所選擇的第一序列(即，最佳互補序列)等結(jié)合時具有最佳覆蓋率的序列。圖4C)共有序列混合物(M組、B亞型和C亞型)。圖4D)三條鑲嵌序列，圖4E)四條鑲嵌序列，圖4F) 六條鑲嵌序列。圖4D 圖4F均針對M組覆蓋率進行了優(yōu)化。圖5A和圖5B 候選疫苗的總體覆蓋率C進化枝序列中的九聚體的覆蓋率，其使用針對鑲嵌體優(yōu)化的不同輸入數(shù)據(jù)組，提供不同數(shù)目的抗原，并與不同的候選疫苗進行比較。對于如下四種測試情況進化枝內(nèi)(對C進化枝覆蓋率打分的C進化枝優(yōu)化的候選序列)、進化枝之間(對C進化枝覆蓋率打分的B進化枝優(yōu)化的候選序列)、全球性抗單一亞型(對C進化枝覆蓋率打分的M組優(yōu)化的候選序列)、全球性抗全球性(對全球性覆蓋率打分的M組優(yōu)化的候選序列)，針對Gag (圖5A)和Nef (核心序列)(圖5B)的單價和多價候選疫苗計算完全匹配(藍色)>8/9匹配(一個不匹配，紅色)和7/9匹配(兩個不匹配，黃色)的覆蓋率。在每組結(jié)果中，候選疫苗按照混合物中的序列數(shù)目(1 6)進行分組；鑲嵌序列用較深顏色繪制?！胺莾?yōu)化序列(Non-opt) ”指的是一組進入疫苗實驗的序列(Kong et al,J. Virol. 77 12764-72 (2003))；“鑲嵌體(mosaic) ”表示由遺傳算法產(chǎn)生的序列；“優(yōu)化的天然序列(opt. natural)”表示根據(jù)最大九聚體覆蓋率而選擇的完整天然序列；“MBC共有序列(MBC consensus)”表示M組、B亞型和C亞型的三條共有序列的混合物。為便于比較，用虛線標出M組鑲嵌體的四序列組的覆蓋率(73. 7 75.6%)。測試了鑲嵌體數(shù)目、病毒亞群、蛋白區(qū)域以及優(yōu)化和測試組的超過150種組合。在該圖中描繪的C進化枝/B進化枝/M組的比較通常是進化枝內(nèi)、進化枝之間以及M組覆蓋率的代表。具體而言，B進化枝和C進化枝的鑲嵌體覆蓋率水平非常接近，盡管在Gag集合中有更多的C進化枝序列，而在 Nef集合中有更多的B進化枝序列(見圖6的對B進化枝和C進化枝的完整比較)。在比對中A進化枝和G進化枝的序列相對較少(24Gag，75Nef)，而M組優(yōu)化的鑲嵌體的九聚體覆蓋率不如B進化枝和C進化枝的亞型高(A亞型和G亞型的四鑲嵌體覆蓋率對于Gag為63%， 對于Nef為74% )，這比非優(yōu)化的混合物要好得多(對于Gag為52%，對于Nef為52% )。圖6A和圖6B 候選疫苗的總體覆蓋率B進化枝、C進化枝和M組序列中的九聚體的覆蓋率，其使用針對鑲嵌體優(yōu)化的不同輸入數(shù)據(jù)組，提供不同數(shù)目的抗原，并與不同的候選疫苗進行比較。對于如下七種測試情況進化枝內(nèi)(B進化枝或C進化枝優(yōu)化的候選序列，對同一進化枝打分)、進化枝之間(B進化枝或C進化枝優(yōu)化的候選序列，對另一進化枝打分)、全球性疫苗抗單一亞型(對B進化枝或C進化枝打分的M組優(yōu)化的候選序列)、全球性疫苗抗全球性病毒(對所有M組序列打分的M組優(yōu)化的候選序列)，針對Gag (圖6A) 和Nef (核心序列)(圖6B)的單價和多價候選疫苗計算完全匹配(藍色)>8/9匹配(一個不匹配，紅色)和7/9匹配(兩個不匹配，黃色)的覆蓋率。在每組結(jié)果中，候選疫苗按照混合物中的序列數(shù)目(1 6)進行分組；鑲嵌序列用較深顏色繪制。“非優(yōu)化序列”指的是先前提出用于疫苗的一組特定天然序列(Kong, W. P. et al. J Virol 77，12764-72 (2003))； “鑲嵌體”表示由遺傳算法產(chǎn)生的序列；“優(yōu)化的天然序列”表示根據(jù)最大九聚體覆蓋率而選擇的完整天然序列；“MBC共有序列”表示M組、B亞型和C亞型的三條共有序列的混合物。 對于針對M組優(yōu)化的四價鑲嵌體組的完全匹配M組覆蓋率的水平標以虛線。 圖7A和圖7B 在天然序列、共有序列和鑲嵌序列中九聚體的出現(xiàn)頻率的分布。對于由幾種方法制備的疫苗混合物，不同九聚體的頻率為X軸，發(fā)生次數(shù)為y軸。圖7A :0 60%的頻率(九聚體頻率>60%時，所有方法的分布是相當?shù)?。圖7B:低頻率九聚體的詳細情況。天然序列具有大量的稀有或分離方式獨特(imique-to-isolate)的九聚體(圖 7A和圖7B的下右部分)；它們不大可能引發(fā)有用的疫苗應答。選擇最優(yōu)的天然序列確實是在選擇那些更加常見的九聚體，但仍然會包括稀有和獨特的九聚體(圖7A和圖7B的上右部分)。與之相比，共有序列混合物不能代表并非常見的九聚體，特別是頻率低于20% (圖 7A和圖7B的下左部分)。對于鑲嵌序列來說，較低頻率的九聚體的數(shù)目隨著序列的數(shù)目而單調(diào)增加(每幅圖的上左部分)，但分離方式獨特的九聚體完全排除在外(右圖的上左部分廣標示出缺少頻率< 0. 005的九聚體)。圖8A 圖8D 候選疫苗的HLA結(jié)合潛能。圖8A和圖8B) =HLA結(jié)合基序計數(shù)。圖 8C和圖8D)不理想的氨基酸的數(shù)目。在所有圖中天然序列標示為黑色圓形(·)，共有序列標示為藍色三角形(▲)，推斷的祖先序列標示為綠色正方形(■)，而鑲嵌序列標示為紅色菱形( )。左側(cè)的圖(圖8A和8C)顯示了對于個體序列計算出的HLA結(jié)合基序計數(shù) (圖8A)以及不理想的氨基酸的計數(shù)(圖8C)；右側(cè)的圖(圖8B和8D)顯示了對于序列混合物計算出的HLA結(jié)合基序計數(shù)(圖8B)以及不理想的氨基酸的計數(shù)(圖8D)。每一幅圖的頂部(箱線圖)顯示了基于M組序列的比對(對于個體序列，圖8A和圖8C)或基于100種隨機組成的三序列(A亞型、B亞型和C亞型各一)的混合物(對于序列混合物，圖8B和圖 8D)的各自計數(shù)(基序計數(shù)或不理想的氨基酸的計數(shù))的分布。該比對下載自Los Alamos HIV數(shù)據(jù)庫。箱部從25百分點延伸至75百分點，線段位于中值處。延伸到箱部之外的線部顯示了最高值和最低值。作為C端錨定殘基而非常罕見的氨基酸為G、S、T、P、N、Q、D、E和 H，并且傾向于很小、有極性或帶負電荷(Yusim et al，J. Virol. 76 :8757_8768 (2002))。顯示了 Gag的結(jié)果，但同樣的定性結(jié)果也適用于Nef核心序列和完整Nef。對超型基序進行了同樣的過程，其結(jié)果就定性而言與HLA結(jié)合基序(數(shù)據(jù)未示出)的結(jié)果類似。圖9:限制為4條序列(k = 4)的鑲嵌蛋白組，跨過Gag以及Nef的中心區(qū)域，針對B亞型、C亞型和M組進行了優(yōu)化。圖10 =Env和Pol的鑲嵌體組。圖11 該圖不依賴于比對，其基于將所有M組的蛋白(數(shù)據(jù)庫和CHAVI，每人一條序列)分解為所有可能的九聚體，其關(guān)注它們的頻率，然后尋找每一疫苗抗原或混合物與數(shù)據(jù)庫的匹配和接近匹配的情況。
圖12 另外的覆蓋率概覽。圖13 九聚體覆蓋率相對于位置的圖(Mos. 3疫苗混合物)。圖14A 圖14D 與提議使用的每種疫苗匹配的九聚體頻率的圖。圖15A 圖15D 標示出全部數(shù)據(jù)庫比對中的每條序列中每一氨基酸的圖。圖16 3個鑲嵌體，M組優(yōu)化。圖17 =HIV數(shù)據(jù)庫連同CHAVI序列(N = 2020)的覆蓋率。圖18 急性感染患者的序列與患者共有序列相比的差異。圖19 在Env M組覆蓋率對亞型特異性設計方面的折中和益處。圖20 所提議的Gag和Env的疫苗鑲嵌體的覆蓋率。圖 21 :Gag、Nef 禾口 Env 序列。圖22 鑲嵌體的gag和nef基因，以及M共有序列的gag和nef基因。
具體實施例方式本發(fā)明源自于以下認識，即含有合成病毒蛋白的多價抗原組能構(gòu)成良好的候選疫苗，所述合成病毒蛋白的序列提供了對流行病毒序列的非稀有短鏈的最大覆蓋率。本發(fā)明提供了 “遺傳算法”策略以建立作為天然蛋白序列的不確定組的片段的鑲嵌體混合物的多價抗原組，所述天然蛋白序列作為輸入序列而提供。對于HIV的情形，蛋白Gag和Nef是這種抗原的理想候選序列。為擴大覆蓋率，還可使用Pol和/或Env。本發(fā)明還提供了這些蛋白的優(yōu)化組。本發(fā)明的遺傳算法策略利用來自普通群體的未經(jīng)比對的蛋白序列作為輸入數(shù)據(jù)組，從而具有“不依賴比對”的優(yōu)點。其建立了類似于自然界所發(fā)現(xiàn)的蛋白的人造鑲嵌蛋白，在小型動物模型中共有抗原的成功證明了這是有效的。九聚體是此處描述的研究重點， 但根據(jù)預期的目標，也可選擇不同長度的肽。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以將在自然界中不存在或者非常稀有的九聚體(舉例)排除在外，相對于共有序列和天然病毒株而言，這是一種進步，因為共有序列可包含在自然界中未發(fā)現(xiàn)的某些九聚體(舉例)，而天然病毒株幾乎總是含有對于該病毒株而言是獨一無二的某些九聚體(舉例)。用于所述遺傳算法的適合度的定義為最“適合”的多價混合物是鑲嵌病毒株的組合，該組合能提供群體中所有九聚體的最大覆蓋率(完全匹配的最高分數(shù))，并且還受九聚體在所述群體中不缺失或者不稀有的限制。本發(fā)明的鑲嵌蛋白組能根據(jù)不同的輸入數(shù)據(jù)組進行優(yōu)化，使得可采用目前的數(shù)據(jù)從T細胞的角度評估亞型或者區(qū)域特異性疫苗的優(yōu)點。舉例來說，經(jīng)過比較的可選方案包括1)基于M組、B進化枝和C進化枝的最優(yōu)多價鑲嵌體組。所存在的疑問是，進化枝內(nèi)覆蓋率與進化枝之間覆蓋率或者全球性覆蓋率相比能好多少。2)不同數(shù)目的抗原1、3、4、6。3)目前用于疫苗程序的天然病毒株僅例示了 “典型”病毒株(Merck，VRC)。4)經(jīng)選擇能在群體中獲得九聚體最佳覆蓋率的天然病毒株。5)共有序列組A+B+C。6)經(jīng)優(yōu)化的混合物，其包括多價抗原中的一個“指定”病毒株，一個祖先序列+3個鑲嵌病毒株，一條共有序列+3個鑲嵌病毒株。7)完全匹配的九聚體覆蓋率與匹配度為8/9、7/9和6/9或更少的九聚體覆蓋率比較。

這是一個計算難題，因為覆蓋一個九聚體的最佳組不一定是覆蓋重疊型九聚體的最佳組。通過閱讀本公開內(nèi)容應當理解，描述于此的方法能用于設計肽試劑以測試HIV免疫應答，還可用于其他易變病原體。例如，本方法可適用于高度可變的丙型肝炎。采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可將本發(fā)明的蛋白/多肽/肽(“免疫原”)與藥用載體和/或佐劑配制成組合物。適宜的施藥途徑包括全身(例如肌肉內(nèi)或皮下)、口服、陰道內(nèi)、 直腸內(nèi)和鼻內(nèi)施藥。本發(fā)明的免疫原能采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行化學合成并純化。該免疫原也可通過公知的重組DNA技術(shù)合成。編碼本發(fā)明免疫原的核酸可用作例如DNA疫苗的組分，在該疫苗中該編碼序列以裸露DNA方式施用，或者，例如編碼該免疫原的小基因可存在于病毒載體中。該編碼序列例如可在分枝桿菌、重組的嵌合型腺病毒或重組的減毒型水泡性口炎病毒中表達。該編碼序列還可存在于例如復制型或者非復制型腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、減毒型結(jié)核分枝桿菌載體、卡介苗(BCG)載體、牛痘載體或修飾的安卡拉痘苗(MVA)載體、其他痘病毒載體、重組脊髓灰質(zhì)炎病毒載體和其他腸病毒載體、沙門氏菌載體、志賀氏菌載體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體、塞姆利基森林病毒載體或煙草花葉病毒載體。該編碼序列也可作為具有例如活性啟動子如CMV啟動子的DNA質(zhì)粒來表達。還可用其他活載體來表達本發(fā)明的序列。 通過將編碼本發(fā)明免疫原的核酸導入患者自身細胞中，可以在這些細胞中誘導該免疫原的表達，所述表達優(yōu)選使用在人類細胞中優(yōu)化表達的密碼子和啟動子。制造和使用DNA疫苗的方法的例子公開于美國第5，580，859號、第5，589，466號和第5，703，055號專利。密碼子優(yōu)化的方法的例子描述于 Haas et al, Current Biology 6:315-324(1996)和 Andre et al, J. Virol. 72(2) 1497-1503(1998)。應當理解，在本發(fā)明的組合物中可包含佐劑(或者另行施用以增強免疫原效果)。 合適的佐劑的例子包括TRL-9激動劑、TRL-4激動劑、以及TRL_7、8和9激動劑的組合(以及明礬)。佐劑可采用油和水乳液的形式。也可使用角鯊烯佐劑。本發(fā)明的組合物在藥用輸送體系中含有免疫有效量的本發(fā)明免疫原，或編碼該免疫原的核酸序列。該組合物可用于預防和/或治療病毒感染(例如HIV感染)。如上所述， 可使用佐劑、乳化劑、藥用載體或其他在疫苗組合物中常提供的組分來配制本發(fā)明的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地設計最優(yōu)化的制劑，該制劑可包括用于立即釋放的制劑和/ 或用于緩釋的制劑，以及用于誘導全身免疫和/或誘導局部粘膜免疫的制劑(例如該制劑可設計為鼻內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)施用)。如上所述，本發(fā)明的組合物可通過任何便捷的途徑， 包括皮下、鼻內(nèi)、口服、肌肉內(nèi)或其他腸胃外或腸道途徑施用。該免疫原可以單劑量或多劑量施用。最優(yōu)免疫方案可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定并根據(jù)患者、組合物以及所尋求的效果不同而改變。本發(fā)明設想了直接使用本發(fā)明免疫原和/或編碼它的核酸和/或如上所述進行表達的免疫原。例如，編碼該免疫原的小基因可用于初免和/或加強免疫。
本發(fā)明包括公開于此的任何和所有的氨基酸序列，以及編碼該氨基酸序列的核酸序列(以及與該編碼序列互補的核酸)。具體公開于此的是針對以區(qū)域性流行病為目標的單一 B亞型或C亞型以及全球流行的所有HIV-I變體[所述HIV-I主(M)組]進行優(yōu)化的疫苗抗原組。在隨后的實施例1中描述的研究中，重點在于設計特別針對T細胞應答的多價疫苗。對于HIV-I特異性疫苗應答而言，HIV-I特異性T細胞似乎至關(guān)重要CTL應答與人類疾病進程的減緩相關(guān)(Oxenius et al, J. Infect. Dis. 189 1199-1208 (2004))，并且 CTL 應答在非人靈長類動物疫苗接種模型中的重要性也已非常明確。疫苗引發(fā)的細胞免疫應答有助于控制致病性SIV或SHIV，并降低用致病性病毒免疫激發(fā)后發(fā)病的可能性(Barouch et al, Science 290 :486_492 (2000))。CD8+T細胞的暫時缺失導致感染SIV的恒河猴體內(nèi)病毒血癥的增加(Schmitz et al, Science 283:857-860(1999))。此外，逃逸突變的進化與疾病進程相關(guān)，表明CTL應答有助于抑制體內(nèi)病毒的復制(Barouch et al, J. Virol. 77 7367-7375(2003))，因此能阻斷潛在逃逸途徑的由疫苗激發(fā)的記憶應答可能具有價值。雖然高度可變的包膜(Env)是抗HIV中和抗體的首要標靶，并且疫苗抗原也需要定制成引發(fā)這些抗體應答(Moore & Burton，Nat. Med. 10 :769_771 (2004))，但是T細胞疫苗組分能靶向更保守的蛋白以觸發(fā)更容易交叉反應的應答。但是，即使是最保守的HIV-I蛋白也具有足夠的多樣性，因此變異將是個問題。人造中心序列疫苗法、共有序列和祖先序列(Gaschen et al, Science 296 :2354_2360(2002)，Gao et al, J.Virol. 79 1154-1163(2005),
Doria-Rose et al, J. Virol. 79 11214-11224(2005))-它們基本上在病毒株之間“折
中”——顯示出前景，其刺激出與天然病毒株疫苗相比具有更強的交叉反應性的應答(Gao et al, J. Virol. 79 1154-1163 (2005)) (Liao et al. and Weaver et al.，已交稿)。然而， 即使是中心病毒株也只能覆蓋范圍非常有限的HIV多樣性譜，而基于共有序列的肽試劑也不能檢測許多自體 CD8+T 細胞應答(Altfeld et al, J. Virol. 77 =7330-7340 (2003)) 單一氨基酸取代能介導T細胞逃逸，并且由于HIV-I病毒株之間許多T細胞表位有一個或多個氨基酸差異，因此對任何一種疫苗抗原的應答的潛在有效性是有限的。特定的突變是否減小T細胞交叉反應性是表位特異性的并且是T細胞特異性的，盡管某些變化能廣泛地影響進化枝之間的交叉反應性(Norris et al，AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 315-325(2004))。在多價疫苗中包括更多變體能對更廣泛的流行變體產(chǎn)生應答。其也可以使免疫系統(tǒng)對普通逃逸變體產(chǎn)生初免(Jones et al, J. Exp. Med. 200 1243-1256 (2004))； 從一個T細胞受體中逃逸會產(chǎn)生易受另一個影響的變體(Lee et al, J. Exp. Med. 200 1455-1466(2004))，因此對表位變體的多克隆應答進行刺激是有益處的(Killian et al, AIDS 19:887-896(2005))。涉及抑制加工(Milicic et al, J. Immunol. 175 4618-4626(2005))或 HLA 結(jié)合(Ammaranond et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 21: 395-397 (2005))的途徑的免疫逃逸能防止表位呈遞，并且在 這種情況下，逃逸變體不會受到具有不同特異性的T細胞的抵抗。然而，存在這樣的可能，即，能識別重疊型表位的T細胞的存在在一些情況下會阻斷這些逃逸途徑。在以下非限制性實施例中將對本發(fā)明的某些方面進行更詳細的描述。實施例1實驗詳述
HlV-I序列數(shù)據(jù)。采用來自2005HIV序列數(shù)據(jù)庫(http://hiv. lanl. gov)的參考比對，其中包含每人一條序列，并另外補充有最近可以獲得的來自南非德班的C亞型 Gag 和 Nef 序列(GenBank 編號 AY856956-AY857186) (Kiepiela et al, Nature 432 769-75(2004))。該組含有來自全球的551條Gag和1，131條NefM組序列；還包括重組序列以及用來考察M組多樣性的純亞型序列。這些含有18個A亞型、102個B亞型、228個C 亞型和6個G亞型(Gag)以及62個A亞型、454個B亞型、284個C亞型和13個G亞型序列(Nef)序列的比對亞群用于單進化枝內(nèi)以及單進化枝間的優(yōu)化和比較。遺傳算法。GA是用于尋找解決難以通過分析來解決的問題的解決方案的生物過程 (進化、群體、選擇、重組)的計算模擬(Hoiland，Adaptation in Natural and Artificial Systems :An Introductory Analysis with Applicatins to Biology, Control, and Artificial Intelligence, (M. I. T. Press，Cambridge，MA(1992)))。給定輸入的解決方案是根據(jù)“適合度”(最優(yōu))標準通過隨機修飾和選擇的過程而“進化”的。GA有許多特性 (flavor)；執(zhí)行“穩(wěn)態(tài)共進化多群體”。“穩(wěn)態(tài)”是指一次產(chǎn)生一個新的候選方案，而不是一次產(chǎn)生一整個群體；而“共進化”是指同時進化到數(shù)個不同的群體，該群體共同工作，形成一個完整的解決方案。所述輸入是未比對的天然序列組；候選方案是k個假天然“鑲嵌”序列的集合，其中每一條序列由各段天然序列串聯(lián)形成。適合度標準為群體覆蓋率，其定義為所有9氨基酸序列片段(潛在表位)在混合物中發(fā)現(xiàn)的輸入序列中的比例。為了初始化GA(圖2)，通過隨機選擇的天然序列間的兩點重組而生成k個具有η 條初始候選序列的群體。因為所輸入的天然序列并未經(jīng)過比對，所以采用“同源”基因轉(zhuǎn)換 (crossover)每條序列里的基因轉(zhuǎn)換點是通過搜索兩條序列里的短匹配串來選擇的；當?shù)湫偷谋砦婚L度為c = 9時使用c-1 = 8的串。這確保了重組序列類似于天然蛋白衍生自不同病毒株的序列段之間的邊界是無縫的，跨越該邊界的局部序列在自然界中總能找到， 并且防止鑲嵌體出現(xiàn)氨基酸的大插入/缺失或者非天然組合。作為鑲嵌體構(gòu)建的結(jié)果，鑲嵌序列長度落在天然序列長度的分布范圍之內(nèi)重組僅僅允許在相同的區(qū)域進行，并通過顯式軟件加強以防止過長的長度，從而防止重復區(qū)域的再復制(再復制的表位的這種“框架內(nèi)”插入能提供提高覆蓋率的另一途徑而不生成非天然的九聚體，但其插入將產(chǎn)生“非天然”蛋白)。起初，混合物含有一個隨機選自每個群體的“勝者”。在群體中任一條個體序列的適合度得分是由該序列與其他群體的當前勝者構(gòu)成的混合物的覆蓋率值。因此，在群體中任何序列的個體適合度動態(tài)地取決于在其他群體中找到的最佳序列。一次對一個群體進行優(yōu)化。對于每次迭代，選擇兩條“親代”序列。采用“兩人淘汰賽”選擇來選定第一條親代從當前群體中隨機挑出兩條序列，打分，然后選擇較好的一條。這樣選擇的親代，其概率與該親代在群體內(nèi)的適合度等級成反比，實際上不需要計算所有個體的適合度。第二條親代按照相同方法(50%的時間)進行選擇，或者從天然序列組中隨機選擇。然后采用親代之間的兩點同源基因轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生“子代”序列。任何含有在天然群體中非常稀有(發(fā)現(xiàn)少于三次)的九聚體的子代立即放棄。相反，則對新序列進行打分， 并將其適合度與四條從同一群體中隨機選擇的序列的適合度進行比較。如果四條隨機選擇的序列中的任一條的得分低于該新序列的得分，則在該群體中該序列將被那條新序列所替換。只要遇到比當前群體的“勝者”獲得更高的分數(shù)的序列，則該序列將成為當前群體的勝者，并隨后用于混合物以評價其他群體中的序列。依次對每個群體進行數(shù)次這樣的優(yōu)化循環(huán)(通常為10次)，對所有群體持續(xù)進行該過程循環(huán)直至進化停止(即，對于確定數(shù)目的代數(shù)不再有改進)。此時，采用新生成的隨機起始群體重新開始整個過程，并持續(xù)進行該重新開始直至不再發(fā)現(xiàn)有進一步的改進。對η = 50或500的每個數(shù)據(jù)組運行GA ；每次運行在 2GHz的奔騰處理器上持續(xù)運行12 24小時，直至不再發(fā)生進一步的改進。產(chǎn)生了 k = 1、 3、4或6條鑲嵌序列的混合物。
GA還能在混合物中非強制性地包括一條或多條令人感興趣的固定序列(例如，共有序列)，并進化出混合物的其他要素，以最優(yōu)地補充該固定病毒株。由于這些方法是次優(yōu)的，所以它們并未包括于此。附加程序從輸入文件中選擇能以組合形式提供最佳群體覆蓋率的k個最佳天然病毒株。與其他多價候選疫苗的比較。針對其他潛在的單價或多價疫苗，計算群體覆蓋率得分，以與鑲嵌序列疫苗進行直接比較，從而跟蹤與群體九聚體的同一性以及與8/9和7/9 氨基酸的相似性?；谔烊徊《局甑臐撛诤蜻x疫苗包括單一病毒株(例如，用于南非的疫苗的單一 C 病毒株(Williamson et al，AIDS Res. Hum. Retroviruses 19 133-44 (2003))) 或者天然病毒株的組合(例如，分別來自A亞型、B亞型和C亞型中的一種(Kong et al, J. Virol. 77 12764-72 (2003))) 0時至今日，還未系統(tǒng)性地選擇天然病毒株候選疫苗以使?jié)撛诘腡細胞表位覆蓋率最大化；從文獻中挑選出候選疫苗來代表可由未選擇的候選疫苗預期到的疫苗。覆蓋率的上限也僅僅采用完整的天然病毒株來確定通過選擇具有數(shù)據(jù)組中最佳覆蓋率的單條序列來生成最優(yōu)的天然序列混合物，然后依次加入最佳互補序列直至指定的k。所述比較包括各種大小的最佳天然序列混合物以及共有序列(單獨或組合形式) (Gaschen et al, Science 296 :2354_60 (2002))，以代表中心合成疫苗的概念。最后，在GA 中使用固定序列方案，在對比中采用共有序列+鑲嵌序列的組合；這些得分基本等于對于指定k而包括在內(nèi)的所有鑲嵌組合的得分(數(shù)據(jù)未示出)。用于進行這些分析的代碼可得自:ftp//ftp-tlO/pub/btk/mosaics。MM蛋白變異。在保守的HIV-I蛋白中，大多數(shù)位置基本上是不變的，最可變的位置僅僅有兩至三個以可察覺的頻率出現(xiàn)的氨基酸，并且可變的位置通常很好地分散在保守位置之間。因此，在CD8+T細胞表位(8 12個氨基酸，通常為九個)的范圍之內(nèi)，非常少的幾種變體即能覆蓋絕大多數(shù)的群體多樣性。圖1顯示了九聚體(九個相鄰氨基酸的串)的群體覆蓋率的上限，針對增加的變體數(shù)目對Gag、Nef和Env進行了比較，并依次加入有能提供最佳覆蓋率的變體。在保守區(qū)域中，用2 4種變體能實現(xiàn)高度群體覆蓋率。與之相比，在可變區(qū)域如Env，即使利用八種變體也只能得到有限的群體覆蓋率。由于每次新加入的變體都更加稀有，每次加入的相對益處隨著變體數(shù)目的增加而減少。疫苗設計優(yōu)化策略。圖1顯示了九聚體覆蓋率的理想化水平。實際上，高頻率的九聚體經(jīng)常會有沖突由于局部共變異的緣故，一個九聚體的最優(yōu)氨基酸可能不同于重疊型九聚體。為了設計優(yōu)化了群體覆蓋率的鑲嵌蛋白，每種氨基酸的相對益處必須結(jié)合附近的變體進行評價。例如，丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)各自會經(jīng)常出現(xiàn)在相鄰的位置上，但如果Ala-Glu組合在自然界中從未觀察到，則應將其從疫苗中排除。已考察了幾種優(yōu)化策略貪婪算法、半自動相容九聚體裝配策略、基于比對的遺傳算法(GA)和與比對無關(guān)的GA。該與比對無關(guān)的GA生成具有最佳群體覆蓋率的鑲嵌體。該GA從一組未比對的蛋白序列中生成用戶指定數(shù)目的鑲嵌序列，其中明確地排除了能誘導非保護性疫苗-抗原特異性應答的稀有或非天然的表位長度片段(可能在重組斷點引入)。這些候選疫苗序列類似于天然蛋白，但由數(shù)據(jù)庫序列的在同源斷點重組的頻率加權(quán)片段裝配而成(圖2)； 它們接近于輸入群體的九聚體的最大覆蓋率。選擇用于初始鑲嵌疫苗的HIV蛋白區(qū)域。初始設計著重于符合以下具體標準的蛋白區(qū)域i)相對較低的變異性， )自然感染中的高水平識別，iii)高密度的已知表位，和 iv)對感染的早期應答或者與感染患者中的良好結(jié)果相關(guān)的CD8+T細胞應答。首先，通過不同HIV蛋白的鑲嵌序列實現(xiàn)的九聚體覆蓋率水平進行評估(圖3)。對于每種蛋白，采用 M組或者單獨采用B亞型和C亞型生成四鑲嵌體組；對C亞型的覆蓋率進行打分。有幾項結(jié)果值得注意i)亞型內(nèi)優(yōu)化提供了最好的亞型內(nèi)覆蓋率，但亞型間覆蓋率明顯較差—— 然而，B亞型優(yōu)化的鑲嵌體提供了比單一的天然B亞型蛋白更好的C亞型覆蓋率(Kong et al，J. Virol. 77 12764-72 (2003)) ；ii) Pol和Gag最具引起廣泛交叉反應性應答的潛力，然而，Rev, Tat和Vpu具有甚至比高度可變的Env蛋白更少的保守九聚體，iii)M組優(yōu)化的鑲嵌體組的亞型內(nèi)覆蓋率接近于亞型內(nèi)優(yōu)化組的覆蓋率，尤其是對于更保守的蛋白而言。Gag以及Nef的中心區(qū)域滿足以上所列的四條標準。Nef是T細胞最經(jīng)常識別到的 HIV蛋白(Frahm et al, J.Virol. 78 =2187-200(2004))并且是在自然感染中最早應答的標靶(Lichterfeld et al，Aids 18 1383-92 (2004))。雖然總體而言它是可變的(圖3)，但其中心區(qū)域如同Gag —樣保守(圖1)。還不清楚哪一種優(yōu)化蛋白將包含在疫苗中，而且鑲嵌體能被設計為使?jié)撛诟采w率最大，即使是最可變的蛋白的潛在覆蓋率也是如此(圖3)，但對于保守蛋白而言，全球性覆蓋率的前景更佳。通過向含有Gag、Pol和Env的疫苗中加入Rev、 Tat和Nef，證明可在獼猴中改善免疫保護(Hel et al, J. Immunol. 176 :85_96 (2006))，但這是對于同源免疫激發(fā)的情形而言，其中變異性并不是問題。在流行病毒群體中調(diào)節(jié)蛋白的極端變異性可排除交叉反應性應答；就保守性而言，？01、6叫(尤其是？24)和Nef的中心區(qū)域(HXB2的65 149位)是具有前途的潛在免疫原(圖1、圖3)。然而，Pol在自然感染中被識別的頻率較小(Frahm et al, J. Virol. 78 :2187_200 (2004))，所以它沒有包括在初始免疫原的設計中。被包括在其中的Nef保守部分含有HIV-I中最常被高度識別的肽(Frahm et al，J. Virol. 78 :2187_200 (2004))，但作為蛋白片段，則不允許Nef的免疫抑制功能(例如 HLA 第 I 類的向下調(diào)節(jié)(Blagoveshchenskaya, Cell 111 :853_66 (2002)))。 Gag和Nef均緊密地包裝有重疊型的得到充分表征的⑶8+和⑶4+T細胞表位，該表位由許多不同的 HLA 分子所呈遞(http://www. hiv. lanl. gov//content/immunology/maps/maps, html)，而Gag特異性CD8+(Masemola et al, J. Virol. 78 :3233_43 (2004))和 CD4+(Oxenius et al，J. Infect. Dis. 189 :1199-208 (2004)) T細胞應答則與受感染的個體中的低病毒組點相關(guān)(Masemola et al，J. Virol. 78 :3233_43 (2004))。為測試地理變化和輸入樣品大小的潛在影響，使用已公開的C亞型序列進行有限的測試。將該C亞型Gag數(shù)據(jù)分為大小相當?shù)娜M——兩個南非組(Kkpiela et al, Nature 432 =769-75(2004))和一個非南非C亞型組。就每一組對鑲嵌序列進行獨立優(yōu)化， 然后針對所有三組測試所得的鑲嵌體。對于相同的培養(yǎng)測試組，九聚體的覆蓋率更好一點 (77 % 79 %的9/9覆蓋率)，但當該培養(yǎng)測試組是兩個不同的南非數(shù)據(jù)組(73 % 75 % )， 或者該南非組中的任意一組和非南非C亞型序列(74% 76%)時，九聚體的覆蓋率基本相當。因此，國家間和國家內(nèi)覆蓋率近似于進化枝內(nèi)覆蓋率，并且在此情形中，未發(fā)現(xiàn)國家特異性C亞型鑲嵌體設計具有優(yōu)勢。
Gag和Nef的鑲嵌體設計以及疫苗策略的比較。為評估不同疫苗設計策略的亞型內(nèi)和亞型間的交叉反應性，對它們提供的用于天然M組序列的覆蓋率進行計算。計算了天然序列中與疫苗抗原的九聚體完全匹配的所有九聚體的分數(shù)，以及那些具有8/9或7/9匹配氨基酸的九聚體的分數(shù)，這是由于表位內(nèi)的單取代(有時為雙取代)會保留有交叉反應性。圖4顯示了在由各種策略設計得到的混合物的Gag和Nef的中心區(qū)域中每個九聚體的 M組覆蓋率a)用作疫苗抗原的來自A亞型、B亞型、C亞型的三條非最優(yōu)天然病毒株(Kong et al,J. Virol. 77 12764-72 (2003)) ；b)經(jīng)計算選擇以得到最佳M組覆蓋率的三個天然病毒株；c) M組、B亞型和C亞型共有序列；以及d)、e)、f)三、四和六鑲嵌蛋白。對于多病毒株的混合物，即k = 3、k = 4和k = 6的組，鑲嵌體明顯具有最佳表現(xiàn)，而覆蓋率接近k病毒株的上限。它們之后是經(jīng)優(yōu)化選擇的自然病毒株、共有蛋白混合物以及最后的非最優(yōu)的天然病毒株。允許更多的抗原可以提供更高的覆蓋率，但隨著k增加，每次加入的增益減小 (圖1和圖4)。圖5概括了不同疫苗設計策略的總體覆蓋率，從單蛋白至鑲嵌蛋白的組合，并對比了亞型內(nèi)優(yōu)化和M組優(yōu)化。單鑲嵌體的表現(xiàn)與最好的單天然蛋白病毒株或共有序列相當。雖然單共有序列的表現(xiàn)要超過單個最好的天然病毒株，但經(jīng)優(yōu)化的天然序列混合物確實比共有序列混合物更好相對于天然病毒株而言，所述共有序列相互之間更加類似，因此有點冗余。然而，即使僅僅包含兩種鑲嵌變體，覆蓋率也得到顯著提高，而四鑲嵌蛋白和六鑲嵌蛋白得到漸次地比天然或者共有病毒株的多價混合物更好的覆蓋率。亞型內(nèi)優(yōu)化的鑲嵌體表現(xiàn)最好——四鑲嵌抗原有80% 85%的九聚體完全地匹配——但這些組的亞型間的覆蓋率急劇下降至50 % 60 %。與之相比，利用完整M組進行優(yōu)化的鑲嵌蛋白對于個體亞型得到大約75% 80%的覆蓋率，這與M組作為整體的覆蓋率相當(圖5和圖6)。如果允許有非完全的8/9匹配，M組優(yōu)化和亞型內(nèi)優(yōu)化的鑲嵌體均接近90%的覆蓋率。由于通過逐漸加入更稀有的九聚體可增加覆蓋率，并且稀有表位可能會導致問題 (例如通過誘導疫苗特異性免疫顯性應答)，因此對在疫苗構(gòu)建體中九聚體相對于用以產(chǎn)生該疫苗構(gòu)建體的天然序列的頻率分布進行考察。與k = 4的混合物相比，在k = 6的混合物中，大部分額外表位的頻率低(< 0. 1，圖7)。盡管提高了覆蓋率，但是這些表位相對稀有，因此它們誘發(fā)的應答會脫離針對更普通因而更有用的表位的疫苗應答。天然序列混合物實際上比鑲嵌體具有更少的適度低頻率表位事件，隨著覆蓋率的優(yōu)化，這也產(chǎn)生了一些頻率較低的九聚體。另一方面，鑲嵌體排除了獨特的或者非常稀有的九聚體，而天然病毒株通常含有不存在于其他序列中的九聚體。例如，天然M組Gag序列的每條序列平均具有 35個(0 148的范圍)獨特的九聚體。還探討了 HLA錨定基序的保留，發(fā)現(xiàn)錨定基序頻率在四鑲嵌體和三個天然病毒株之間是相當?shù)摹Ｌ烊豢乖靠乖幕驍?shù)目的確顯示為增力口，這可能是因為包含病毒株特異性基序的緣故(圖8)。隨著k增加，更稀有的表位也增加，并且擔心疫苗點稀釋和試劑開發(fā)成本，導致鑲嵌蛋白組的初始制造會限于4序列(k = 4)，其跨過Gag和Nef中心區(qū)域，針對B亞型、C亞型和M組優(yōu)化過(這些序列包含在圖9中，Env和Pol的鑲嵌組如圖10所示)。各種四序列Gag-Nef鑲嵌體的合成以及初始抗原性研究正在進行中。在初始鑲嵌疫苗中，靶向的僅為Gag和Nef蛋白的中心，它們保守到足以提供優(yōu)異的全球群體覆蓋率，并且就天然應答而言，具有上述所需要的性質(zhì)(Bansal et al, Aids 19:241-50(2005))。此外，在Elispot 肽混合物中包括B亞型p24變體以檢測對感染的天然CTL應答明顯提高了所檢測到的應答的數(shù)目和強度，這支持了以下觀點，即包括即使是最保守的蛋白的變體也是有用的。最后， 給恒河猴施用的多價HIV-I疫苗中的蛋白混合物不會影響對每種抗原的強烈應答的形成 (Seaman et al, J. Virol. 79 :2956_63 (2005))，并且抗原混合物在鼠類模型中沒有產(chǎn)生拮抗性應答(Singh et al, J. Immunol. 169 :6779_86 (2002))，這表明抗原混合物適用于T細胞疫苗。即使是鑲嵌體，可變蛋白如Env仍只具有有限的九聚體覆蓋率，盡管相對于天然病毒株而言，鑲嵌體提高了覆蓋率。例如三種M組天然蛋白(A進化枝、B進化枝和 C進化枝各選出一種，而且當前正在進行疫苗設計研究)(Seaman et al, J. Virol. 79 2956-63(2005))在M組蛋白質(zhì)中九聚體完全匹配的僅有39%，65%具有至少8/9的匹配。 與之相比，三個M組Env鑲嵌體與47%的九聚體完全匹配，70%具有至少8/9的匹配。為設計多價鑲嵌抗原而編寫的代碼是可以得到的，并且可方便地用于任何可變蛋白的輸入組， 并可針對任何所需數(shù)量的抗原進行優(yōu)化。該代碼允許對k個天然病毒株的最優(yōu)組合進行選擇，從而可以對用于多價疫苗的天然抗原進行合理選擇。表1中所包括的是對于當前數(shù)據(jù)庫比對的Gag和Nef群體覆蓋率而言為最佳的天然病毒株。 表1對于不同基因、亞型組和序列數(shù)目而言具有最佳的可獲得的九聚體覆蓋率的天然序列混合物Gag, B亞型，1條天然序列
權(quán)利要求
1.一種多肽或蛋白，其包含至少一條圖21或圖22所示的氨基酸的序列。
2.—種核酸，其編碼權(quán)利要求1的多肽或蛋白。
3.—種核酸，其包含至少一條圖22所示的核苷酸的序列。
4 一種載體，其包含權(quán)利要求2或3的核酸。
5.權(quán)利要求3的載體，其中所述載體為病毒載體。
6.一種組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1的多肽或蛋白以及載體。
7.一種組合物，其包含至少一種權(quán)利要求2或3的核酸以及載體。
8.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括給所述哺乳動物施用足以產(chǎn)生所述誘導的量的至少一種權(quán)利要求1的多肽或蛋白。
9.一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括給所述哺乳動物施用足以產(chǎn)生所述誘導的量的至少一種權(quán)利要求2或3的核酸。
全文摘要
本發(fā)明總體而言涉及一種免疫原性組合物(例如疫苗)，具體而言涉及一種多價免疫原性組合物，例如多價HIV疫苗，并且涉及使用它的方法。本發(fā)明還涉及使用遺傳算法以創(chuàng)建適于用例如疫苗接種策略的多價抗原組的方法。
文檔編號A61K39/21GK102177175SQ200980140421
公開日2011年9月7日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者威廉·費舍爾, 巴頓·F·海恩斯, 廖華新, 比阿特里斯·H·哈恩, 諾曼·萊文, 貝特·T·科貝爾 申請人:Uab研究基金會, 杜克大學, 洛斯阿拉莫斯國家安全股份有限公司, 貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心