專利名稱：在cns神經(jīng)性損傷后非-急性期間處理的組合物及方法
在CNS神經(jīng)性損傷后非-急性期間處理的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明領(lǐng)域涉及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷。更特別是，本發(fā)明針對(duì)在創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷后非-急性或慢性期間給受試者施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白[例如，神經(jīng)膠質(zhì)生長因子 2(GGF2)]。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷是嚴(yán)重的健康問題。此類別的損傷包括事件，例如缺血性損傷，出血性損傷，穿透性創(chuàng)傷及非-穿透性創(chuàng)傷。CNS損傷通常不完全痊愈，留給受試者變動(dòng)于極其弱到死亡的一些程度的永久的功能障礙。殘留的功能障礙可包括運(yùn)動(dòng)，感覺， 認(rèn)知，情緒及自主異常。關(guān)鍵類別的CNS神經(jīng)損傷包括腦損傷。腦損傷是導(dǎo)致一些程度的永久的殘疾包括運(yùn)動(dòng)，感覺及認(rèn)知缺乏及情緒不穩(wěn)定性(例如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙，注意力缺乏病癥，抑郁癥及情緒不穩(wěn)定性)的破壞性病情。腦損傷的常見原因包括缺血性中風(fēng)，出血性中風(fēng)，硬膜下血腫，硬膜上血腫，閉合性頭損傷(加速/減速，腦震蕩及旋轉(zhuǎn))，穿透性腦損傷(槍傷及其他投射物傷)。中風(fēng)是死亡的第三-主導(dǎo)原因，及是西方世界中殘疾的主要原因。因此，中風(fēng)造成大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)負(fù)擔(dān)。中風(fēng)的病因?qū)W可為缺血性中風(fēng)(其為大部分中風(fēng)的情形)或出血性中風(fēng)。缺血性中風(fēng)可由在體內(nèi)別處形成凝塊及經(jīng)血流行進(jìn)到腦導(dǎo)致(栓塞性中風(fēng))，或由腦動(dòng)脈內(nèi)側(cè)形成的血凝塊導(dǎo)致(血栓性中風(fēng))。在由于缺失葡萄糖及氧而立即梗塞核心內(nèi)大量細(xì)胞死亡后，由于第二機(jī)理(例如谷氨酸鹽興奮性中毒，凋亡性機(jī)理，及自由基產(chǎn)生)，梗塞區(qū)擴(kuò)展數(shù)天。神經(jīng)損傷后(例如缺血性事件)動(dòng)物及人可經(jīng)幾天，幾周及幾個(gè)月不用任何治療劑而恢復(fù)功能。但是，時(shí)常，此恢復(fù)僅為部分，及動(dòng)物及人患有可包括運(yùn)動(dòng)，感覺及認(rèn)知缺乏的永久的殘疾。熟知增加個(gè)體患中風(fēng)的可能性的危險(xiǎn)因素。這些包括，及不限于，不可變化的危險(xiǎn)因素老年，遺傳，ace，性別，中風(fēng)或心臟病的之前歷史；及可變化，治療或控制的危險(xiǎn)因素高血壓，吸煙，糖尿病，頸動(dòng)脈或其他動(dòng)脈疾病，心房顫動(dòng)，其他心臟病，鐮形細(xì)胞病，高血膽留醇，差的攝食，及身體不活動(dòng)及肥胖癥。至今，缺血性中風(fēng)的非-減輕性治療限于在中風(fēng)后急性期施用治療劑。急性期跨神經(jīng)損傷(例如，中風(fēng))的起始時(shí)間到神經(jīng)損傷后大致6小時(shí)。急性期之后是半-急性期， 其跨神經(jīng)損傷后大致6小時(shí) 2天。因此，使用當(dāng)前非-減輕性治療劑力圖反轉(zhuǎn)血流阻塞， 恢復(fù)腦的氧合作用及限制喪失腦結(jié)構(gòu)的程度。不同于用于急性使用的tPA，無用于治療中風(fēng)的藥物獲得批準(zhǔn)?；颊弑Ａ粢恍┧降墓δ苷系K，其最佳可多少內(nèi)源性地改善大致60天。 此恢復(fù)可僅通過物理治療增加。不幸的是，許多患者被留下有少的改善希望的永久的殘疾。目前，被食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于治療缺血性中風(fēng)的藥物僅有組織纖溶酶原活化子(tPA)。tPA是將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶然后斷裂纖維蛋白，其是阻塞腦中血管及導(dǎo)致中風(fēng)的凝塊的成分。其在理想情況下在自癥狀起始的3小時(shí)內(nèi)施用。一般而言，認(rèn)為僅3% 5%的患中風(fēng)的個(gè)體及時(shí)達(dá)到醫(yī)院得到此治療。理想情況下，阻塞后頭3小時(shí)內(nèi)施用tPA，但可在晚至阻塞后6小時(shí)由一些臨床醫(yī)師施用。不幸的是，對(duì)于此治療認(rèn)為絕大部分經(jīng)歷中風(fēng)的患者未及時(shí)達(dá)到醫(yī)院。對(duì)于那些在有效的時(shí)間窗內(nèi)到達(dá)醫(yī)院的患者，tPA施用力圖反轉(zhuǎn)血流阻塞，恢復(fù)腦的氧合作用及限制喪失腦結(jié)構(gòu)的程度。但是，有一些限制tPA持續(xù)使用的顯著的禁忌癥。在約3 6小時(shí)的初始時(shí)期后， 至多，tPA可導(dǎo)致腦內(nèi)出血及出血性中風(fēng)。由于所述理由，tPA限于急性期期間施用，以便實(shí)現(xiàn)任何治療性功效。至今無其他用于治療中風(fēng)的治療已獲得批準(zhǔn)。其他實(shí)驗(yàn)治療(例如動(dòng)脈遞送的促尿激酶)處于研究中作為用于破裂凝塊及恢復(fù)血流的潛在手段。但是，科學(xué)文獻(xiàn)已描述許多被證明對(duì)于保護(hù)腦質(zhì)有益及在中風(fēng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中恢復(fù)功能的試劑。全部這些試劑致力于降低急性細(xì)胞死亡，發(fā)炎，及凋亡及因此，必需在缺血性事件后幾小時(shí)內(nèi)(一些達(dá)M小時(shí))遞送。迄今，都知道急切需要CNS損傷(例如中風(fēng))的治療手段。(Abe等人，2008年，J Cereb Blood Flow Metab. 7 月 23 日，電子公開首頁，Sun 等人，2008 年，Stroke, 7 月 10 日， 電子公開首頁(頁碼還不可用)；Dohare等人，2008年，Behav Brain Res. 193(2) :289 97 ；Belayev 等人，2001 年，Stroke, 32 (2) :553 60)。但是，所述試劑尚未顯示當(dāng)在幾小時(shí)的滯后時(shí)間后，至多在一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中約在中風(fēng)后一天時(shí)施用時(shí)限制中風(fēng)后對(duì)腦的損傷，恢復(fù)功能或增強(qiáng)恢復(fù)。僅知的對(duì)于中風(fēng)后顯示功效數(shù)天及數(shù)周的治療是減輕性或康復(fù)性的，例如職業(yè)性或物理治療。的確，本發(fā)明人未發(fā)現(xiàn)任何已顯示在中風(fēng)后增強(qiáng)恢復(fù)數(shù)天或數(shù)周的試劑或藥物。急性阻塞后，常有毀壞的腦質(zhì)的局限區(qū)，其被半影區(qū)域圍繞，其如果不恢復(fù)循環(huán)， 將在數(shù)小時(shí)內(nèi)死。此半影區(qū)域的至死亡的時(shí)間可用神經(jīng)保護(hù)劑(例如NMDA拮抗劑，鈣通道阻斷劑，自由基清除劑及捕獲劑，抗-凋亡劑，胱天蛋白酶抑制劑，parp抑制劑，等)在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒娱L幾小時(shí)。為此目的，“神經(jīng)保護(hù)劑”可在它們死于在急性期呈于它們的各種損傷之前解救神經(jīng)元。M 48小時(shí)后，但是，有少的希望從壞死性死亡及凋亡性死亡保護(hù)細(xì)胞持續(xù)幾天(見圖1，用于抗-凋亡性治療的治療性窗未證明相比急性保護(hù)治療寬得多 [Schulz et al.，1998，Cell Death Differ. 5(10) :847-57 ；Komjati et al.，2004，Int J MolMed. 13(3) :373-82]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白呈現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)，如上述其他試劑，其顯示降低中風(fēng)后數(shù)小時(shí)內(nèi)遞送到動(dòng)物見到的殘疾的益處。見美國申請系列號(hào)09/530，884，將其整個(gè)內(nèi)容通過引用并入本文。從神經(jīng)損傷的發(fā)病率來看，特別關(guān)于中風(fēng)，有可有效施用給受試者以限制神經(jīng)損傷后對(duì)腦的損傷，恢復(fù)功能和/或增強(qiáng)恢復(fù)的治療劑的需求。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)及NRG受體包括用于涉及神經(jīng)，肌肉，上皮，及其他組織中器官發(fā)生的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長因子-受體酪氨酸激酶系統(tǒng)(Lemke，Mol. Cell. Neurosci. 7 :247-262,1996 and Burdenet al. ,Neuron 18 :847_855，1997)。NRG家族由編碼多種含表皮生長因子(EGF)-樣，免疫球蛋白(Ig)，及其他可識(shí)別結(jié)構(gòu)域的配體的4種基因構(gòu)成。多種分泌的及膜-附接的異構(gòu)體發(fā)揮此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中配體的作用。NRG配體的受體是EGF受體(EGFI )家族的全部成員，及包括EGFR (或ErbBl)，ErbB2，ErbB3，及ErbB4， 在人中也分別被稱為 HERl HER4(Meyer et al.，Development 124 :3575-3586,1997 ；Orr-Urtreger et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1867-71,1993 ；Marchionni et al., Nature 362 :312_8，1993 ；Chen et al.，J.Comp. Neurol. 349 =389-400,1994 ；Corfas et al.，Neuron 14 :103_115，1995 ；Meyer et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91 1064-1068, 1994 ；andPinkas-Kramarski et al. ，Oncogene 15 :2803-2815,1997)。4種NRG基因，NRG-1，NRG-2, NRG-3,及NRG-4，定位于不同的染色體座位 (Pinkas-Kramarski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9387-91,1994 ；Carraway et al.，Nature 387 :512_516，1997 ；Chang et al.，Nature 387 :509_511，1997 ；and Zhang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :9562_9567，1997)，及共同編碼多種 NRG 蛋白。NRG-1 的基因產(chǎn)物，例如，包括一組大致15種不同的結(jié)構(gòu)上-相關(guān)的異構(gòu)體(Lemke，Mol. Cell. Neurosci. 7 247-262,1996 and Peles andYarden, BioEssays 15 :815—824，1993)。首鑒定的 NRG-I 的亞型包括 Neu 分化因子(NDF ；Peles et al.，Cell 69，205-216，1992 and Wen etal.，Cell 69，559-572，1992)，神經(jīng)生長因子(HRG ；HoImes et al.，Science 256 1205-1210，1992)，乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA ；Fallset al.，Cell 72 :801_815，1993)， 及神經(jīng)膠質(zhì)生長因子 GGFl，GGF2，及 GGF3 (Marchionni et al. Nature 362:312-8,1993)。NRG-2基因通過同源性克隆(Chang et al.，Nature 387 :509_512，1997 ；Carraway et al. , Nature 387 :512_516,1997；and Higashiyama etal. , J.Biochem. 122 :675_680, 1997)及通過基因組方法(Busfield et al.，Mol. Cell. Biol. 17 :4007_4014，1997)鑒定。 NRG-2 cDNA也已知為ErbB激酶(NTAK ；Genbank登錄號(hào)No. AB005060)的神經(jīng)-及胸腺-來源的活化子，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Don-I)的趨異劑，及小腦-來源的生長因子(CDGF;PCT申請 WO 97/09425)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，表達(dá)ErbB4或ErbB2/ErbB4組合的細(xì)胞可能顯示對(duì)NRG-2 的特別穩(wěn)健的應(yīng)答(Pinkas-Kramarski et al.，Mol. Cell. Biol. 18 :6090_6101，1998)。 NRG-3基因產(chǎn)物(Zhang等人，supra)也已知結(jié)合及活化ErbB4受體(Hijazi et al.，Int. J. Oncol. 13 1061-1067,1998)。EGF-樣結(jié)構(gòu)域以全部形式的NRG的核心存在，及需要結(jié)合及活化ErbB受體。3種基因中編碼的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的推斷的氨基酸序列大致30 40%相同(比對(duì))。而且，NRG-I 及NRG-2中似乎有至少2種亞型的EGF-樣結(jié)構(gòu)域，其可賦予不同的生物活性及組織_特異性潛力。對(duì)NRG的細(xì)胞應(yīng)答通過表皮生長因子受體家族的NRG受體酪氨酸激酶EGFR， ErbB2，ErbB3，及ErbB4介導(dǎo)。全部NRG的高-親和力結(jié)合主要經(jīng)ErbB3或ErbB4介導(dǎo)。NRG 配體的結(jié)合導(dǎo)致與其他ErbB亞基的二聚化，及通過對(duì)特異性酪氨酸殘基的磷酸化的反式激活。在某些實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，ErbB受體的幾乎全部組合似乎能響應(yīng)NRG-I異構(gòu)體的結(jié)合形成二聚體。但是，看起來ErbB2是可在穩(wěn)定配體-受體復(fù)合物中起重要的作用的優(yōu)選的二聚化偶體。ErbB2不結(jié)合其自身的配體，但必需與其他受體亞型之一異源配對(duì)。ErbB3不具有酪氨酸激酶活性，但是其他受體的磷酸化的靶。NRG-1，ErbB2，及ErbB4的表達(dá)已知必要于小鼠發(fā)育期間心室心肌小梁形成。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療哺乳動(dòng)物神經(jīng)損傷后的新方法。方法基于可通過給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的多肽來實(shí)現(xiàn)含表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽的治療性益處的觀察；在某些實(shí)施方式中，在神經(jīng)損傷后第1小時(shí)，第2小時(shí)，第8小時(shí)，第12小時(shí)，第24小時(shí)，第30小時(shí)，第36小時(shí)、第42小時(shí)，第2天或更久時(shí)或后進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中在急性窗損傷后之后起始治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中在半-急性窗損傷后之后起始治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中期間及仍持續(xù)在急性窗損傷后之后起始治療。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中治療在半_急性窗損傷后期間起始及在半_急性窗損傷后之后仍持續(xù)。因此，本發(fā)明包括給哺乳動(dòng)物施用含EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽(或編碼多肽的核酸)， 其在神經(jīng)損傷后第1，2或3天甚至達(dá)及包括第4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14天；在神經(jīng)損傷后一周或多于一周，2周或多于2周；在神經(jīng)損傷后3周或多于3周；在神經(jīng)損傷后4周或多于4周；在神經(jīng)損傷后1個(gè)月或多于一個(gè)月；在神經(jīng)損傷后2個(gè)月或多于2個(gè)月；在神經(jīng)損傷后3個(gè)月或多于3個(gè)月；在神經(jīng)損傷后4個(gè)月或多于4個(gè)月；在神經(jīng)損傷后5個(gè)月或多于5個(gè)月；在神經(jīng)損傷后6個(gè)月或多于6個(gè)月起始。根據(jù)本發(fā)明，EGF-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼。根據(jù)本發(fā)明的施用包括以對(duì)于治療哺乳動(dòng)物的神經(jīng)損傷后慢性期有效的量施用包括EGF-樣結(jié)構(gòu)域的肽，或編碼所述多肽的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供哺乳動(dòng)物缺血性事件后急性或半_急性期外期間促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)的方法。本發(fā)明的治療可在急性或半-急性時(shí)期內(nèi)開始，但包括超過急性或半-急性時(shí)期分別至少1次，2次，3次，4次，5次，6次或多于6次治療。本發(fā)明的方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用包括表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)-I基因編碼，及所述施用在缺血性事件后進(jìn)行至少2或3或4天，盡管治療可在急性或半急性時(shí)間框架內(nèi)開始，及以足以在所述哺乳動(dòng)物缺血性事件后慢性期期間促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)的有效量治療。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因可為NRG-I基因，NRG-2基因， NRG-3基因或NRG-4基因。本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽可，進(jìn)而，由這4種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因任之一編碼；本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽可，進(jìn)而，由這4種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因任之一的變體或同系物編碼。見圖6A 6D是全長人GGF2 (NRG-1的亞型)的氨基酸及核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，適宜哺乳動(dòng)物包括但不限于，小鼠，大鼠，兔，狗，猴或豬。在本發(fā)明的更特定的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人。 定義本文中的術(shù)語‘約”包括指定的值士1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15%的
指定的值。在一實(shí)施方式中“約”表示98 102%的指定的值。在一實(shí)施方式中“約”表示 95 105%的指定的值。損傷后，“急性期”跨神經(jīng)損傷(例如，中風(fēng))起始時(shí)間到神經(jīng)損傷后大致6小時(shí)。 急性期之后是“半_急性期”，其跨神經(jīng)損傷后大致6小時(shí) 2天。在一實(shí)施方式中，“半_急性期”跨神經(jīng)損傷后大致6小時(shí) 3天。半-急性期之后時(shí)期稱為神經(jīng)損傷后“慢性期”。 后_急性期包括半_急性及慢性損傷后時(shí)期。通過〃表皮生長因子-樣結(jié)構(gòu)域〃或〃 EGF-樣結(jié)構(gòu)域〃是指結(jié)合及活化ErbB2， ErbB3, ErbB4，或其組合，及與如公開于 Holmes 等人，Science 256 1205 1210，1992 年； 美國專禾Ij No. 5，530，109 ；美國專利 No. 5，716，930 ；美國專利 No. 7，037，888 ；Hijazi 等人， Int. J. Oncol. 13 1061 1067，1998 年；Chang 等人，Nature 387 509 512，1997 年； Carraway^A,Nature 387 512~516,1997^ ；Higashiyama^A,J Biochem. 122 675~680，1997年；及TO 97/09425)的EGF受體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域帶有結(jié)構(gòu)相似性的由NRG-I，NRG_2， 或NRG-3基因編碼的多肽基序。對(duì)于對(duì)應(yīng)于由NRG-I基因編碼的EGFL結(jié)構(gòu)域1 6的核酸及氨基酸序列見圖7 12?！氨磉_(dá)載體"是指源于，例如，噬菌體，腺病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，痘病毒，皰疹病毒，或人工染色體的，用于轉(zhuǎn)移，運(yùn)作性連接到啟動(dòng)子的多肽(例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)編碼序列到宿主細(xì)胞，以至于編碼的肽或多肽在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的遺傳加工的質(zhì)粒或病毒。術(shù)語“神經(jīng)損傷”及“損傷”常在本文中互換使用?！吧窠?jīng)創(chuàng)傷”是“神經(jīng)損傷”的一實(shí)施方式及可通常認(rèn)為是同義詞?！吧窠?jīng)損傷”是導(dǎo)致神經(jīng)組織的一些破壞或死亡的損傷。 神經(jīng)損傷通常作為后遺癥具有一些損失，例如，心理，感覺或肌肉功能減少。“神經(jīng)保護(hù)劑”可在它們死于在急性或半-急性損傷后期呈于它們的各種損傷之前解救神經(jīng)元。急性阻塞后，常有被半影區(qū)域圍繞的毀壞的腦質(zhì)的局限區(qū)，所述半影區(qū)如果不恢復(fù)循環(huán)將在數(shù)小時(shí)內(nèi)死。此半影區(qū)域至死亡的時(shí)間可用“神經(jīng)保護(hù)劑”(例如NMDA拮抗劑，鈣通道阻斷劑，自由基清除劑及捕獲劑，抗-凋亡劑，胱天蛋白酶抑制劑，parp抑制劑， 等)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒娱L幾小時(shí)。為此目的“神經(jīng)保護(hù)劑”可在它們死于在急性期呈于它們的各種損傷之前解救神經(jīng)元?！吧窠?jīng)調(diào)節(jié)蛋白〃或〃NRG"是指由NRG-I，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因或核酸 (例如，cDNA)編碼，及結(jié)合及活化EGFR，ErbBl，ErbB2,ErbB3,或ErbB4受體，或其組合的多肽。〃神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1”，“ NRG-1","神經(jīng)生長因子”，“GGF2”，或〃 pl85erbB2 配體"是指結(jié)合ErbB2受體及由描述于美國專利No. 5，530，109 ；美國專利No. 5，716，930 ； 及美國專利No. 7，037，888 (將各均通過引用整體并入本文)的pl8krbB2配體基因編碼的多肽。結(jié)合到erbB2受體可為通過erbB2受體與erbBl，erbB3或erbB4的異源配對(duì)的間接
社a
？口口。“神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣多肽"是指具有由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的EGF-樣結(jié)構(gòu)域， 以及結(jié)合及活化EGFR，ErbBl，ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4,或它們的組合的多肽。結(jié)合到erbB2 受體可為通過erbB2受體與erbBl，erbB3或erbB4的異源配對(duì)的間接結(jié)合。本文中的術(shù)語“神經(jīng)恢復(fù)”用于指在損傷，疾病，感染或其他神經(jīng)系統(tǒng)分裂后，腦， 脊髓或外周神經(jīng)的神經(jīng)系統(tǒng)向正常狀態(tài)恢復(fù)其功能的過程?！斑\(yùn)作性連接的"是指編碼多肽(例如，cDNA)與一或多個(gè)調(diào)控序列的核酸以當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化子蛋白)結(jié)合到調(diào)控序列時(shí)使基因表達(dá)的方式連接。本文所用的“肽”包括約625，600，575，550，525，500，475，450，425，400，375，350， 325，300，275，250，225，200，175，150，125，100，75，50 或少于 50 個(gè)氨基酸，或者基本上由其
構(gòu)成或由其構(gòu)成的肽?！皢?dòng)子"是指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小的序列。本發(fā)明也包括足以致使啟動(dòng)子-依賴性基因表達(dá)基于細(xì)胞類型或生理狀態(tài)(例如，含氧量低的對(duì)比含氧量正常的條件)可控制的，或可被外部信號(hào)或試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子元件；所述元件可位于天然的基因的5'或3' 或內(nèi)部區(qū)中。術(shù)語"治療有效量"旨在表示引起由研究者，獸醫(yī)，醫(yī)學(xué)醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師觀察的組織，系統(tǒng)，動(dòng)物或人的生物或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的藥物或藥學(xué)試劑的量。治療性變化是以期望減輕疾病或解決病情的方向所測的生物化學(xué)特征性中的變化。更具體而言，“治療有效量"是足以降低與醫(yī)學(xué)病情或虛弱相關(guān)的癥狀，以標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致特異性身體功能損傷的疾病或病癥中的身體功能，或提供改善in —或多種臨床上所測的疾病參數(shù)的量。本文中的術(shù)語“治療”指神經(jīng)損傷后獲得至無損傷的恢復(fù)；加速神經(jīng)損傷后自然恢復(fù)的速度；或促進(jìn)恢復(fù)到更高功能水平。不被理論束縛，在慢性損傷后窗中，其未含蓋將有能力減少任何進(jìn)一步神經(jīng)性死亡，即，已知在慢性窗發(fā)生時(shí)神經(jīng)死亡。但是，本發(fā)明的治療包括，在慢性時(shí)期期間，例如，減少組織(例如，肌肉或骨)的將由包括的神經(jīng)提供的組織中別樣發(fā)生的降低功能或活力。此外，本發(fā)明的治療包括，在慢性時(shí)期期間，例如，減少由包括的神經(jīng)提供的組織中別樣發(fā)生的萎縮(例如，肌肉或骨)。通過〃轉(zhuǎn)化的細(xì)胞〃是指已利用重組DNA技術(shù)或已知的基因治療技術(shù)導(dǎo)入編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或具有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽的DNA分子的細(xì)胞(或細(xì)胞后代)。除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

圖1顯示中風(fēng)/缺血后進(jìn)行期的示意圖。圖中“0T”表示職業(yè)療法及“PT”表示物
理治療。圖2示中腦動(dòng)脈的永久的結(jié)扎后的前肢行為分值。將大鼠如所示用GGF2，NRGl, FGF，或媒質(zhì)處理。以100yg/kg的FGF及GGF2在第21天行為測試中展示顯著的改善。(，， +，Y，*表示通過ANOVA及后-Tukey顯著不同于媒質(zhì)(對(duì)于bFGF，NRGl，GGF2以6. 5 μ g/ kg,及對(duì)于 GGF2 以 100 μ g/kg))。圖3示中腦動(dòng)脈的永久的結(jié)扎后的后肢行為分值。將大鼠如所示用GGF2，NRGl, FGF，或媒質(zhì)處理。GGF2以6. 5 μ g/kg及NRG以1· 0 μ g/kg,在第7天及第14天行為測試，但不在第21天的研究終點(diǎn)顯著好于媒質(zhì)。GGF2以100 μ g/kg及FGF在處理后全部行為時(shí)間點(diǎn)顯著好于媒質(zhì)。(11，+，Y，*表示通過ANOVA及后-Tukey顯著不同于媒質(zhì)(對(duì)于bFGF， NRGl，GGF2 以 6. 5 μ g/kg 及對(duì)于 GGF2 以 100 μ g/kg))。圖4示中腦動(dòng)脈永久的結(jié)扎后的身體擺動(dòng)行為分值。將大鼠如所示用GGF2，NRG1， FGF，或媒質(zhì)處理。GGF2以100 μ g/kg及FGF在第21天相比媒質(zhì)顯著改善。(▼，+，Y，* 表示通過重復(fù)的測量ANOVA及后-hoc Tukey顯著不同于媒質(zhì)(對(duì)于bFGF，NRG1, GGF2以 6. 5 μ g/kg 及對(duì)于 GGF2 以 100 μ g/kg))。圖5A顯示中腦動(dòng)脈的永久的結(jié)扎后前肢行為分值。將大鼠在結(jié)扎后起始1，3或 7天用GGF2處理。將GGF2每天以0. lmg/kg靜脈內(nèi)遞送10天。用全部處理范例在第21 天時(shí)間點(diǎn)前肢行為分值顯著好于媒質(zhì)。(*，Y，+表示通過重復(fù)的測量ANOVA及后-hoc Tukey,分別在第1，3及7天處理組顯著不同于媒質(zhì))。圖5B顯示中腦動(dòng)脈的永久的結(jié)扎后的后肢行為分值。將大鼠在結(jié)扎后起始1，3 或7天用GGF2處理。將GGF2每天靜脈內(nèi)以0. lmg/kg遞送10天。當(dāng)在結(jié)扎后1或7天起始治療時(shí)后肢行為分值顯著好于媒質(zhì)，及相比在第21天時(shí)間點(diǎn)結(jié)扎后3天起始治療的媒質(zhì)改善。(*，Y，+表示通過重復(fù)的測量ANOVA及后-hoc Tukey，分別在第1，3及7天處理組顯著不同于媒質(zhì))。圖5C顯示中腦動(dòng)脈永久的結(jié)扎后的身體擺動(dòng)行為分值。將大鼠在結(jié)扎后起始1，3 或7天用GGF2處理。將GGF2每天靜脈內(nèi)0. lmg/kg遞送10天。當(dāng)結(jié)扎后1天起始治療時(shí)身體擺動(dòng)分值顯著好于媒質(zhì)，及相比結(jié)扎后3或7天起始治療的媒質(zhì)改善。(*，Y，+表示通過重復(fù)的測量ANOVA及后-hoc Tukey，分別在第1，3及7天處理組顯著不同于媒質(zhì))。圖6A D顯示全長GGF2的核酸及氨基酸序列。圖7 12顯示表皮生長因子樣(EGFL)結(jié)構(gòu)域1 6的核酸及氨基酸序列。圖13顯示來自NRG-I基因的表皮生長因子樣肽的核酸及氨基酸序列。圖14顯示來自NRG-I的表皮生長因子樣(EGFL) β片段的核酸及氨基酸序列。圖15顯示來自NRG-I的表皮生長因子樣(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。圖16顯示來自NRG-2的表皮生長因子樣(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。圖17顯示來自NRG_2i3的表皮生長因子樣(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。圖18顯示各EGF-樣肽的氨基酸序列比對(duì)。EGF-樣結(jié)構(gòu)域可定義為NRG的亞結(jié)構(gòu)域，序列比對(duì)顯示，其與人EGF分子(序列Ρ01133|971 1023，在圖中比對(duì)底部)相比，在氨基酸序列上具有至少 25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43， 44或45%同源性。同源氨基酸具有相同的，保守的或半-保守的物理-化學(xué)及結(jié)構(gòu)性質(zhì)， 如分別通過符號(hào)‘*’，‘ ，及‘.，標(biāo)識(shí)。發(fā)明詳述如所示本文中，缺血性中風(fēng)的非-減輕性治療迄今限于在中風(fēng)后急性期施用治療劑。急性期期間觀察到至少部分由于氧剝奪的立即細(xì)胞死亡。此外，如圖1中所示，血流阻塞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)貯存的自由基，谷氨酸鹽，及鈣及鈉釋放，這被理解為毀壞腦組織及擴(kuò)展損傷區(qū)。神經(jīng)損傷后大致6小時(shí) 2天(或通過一些定義是3天)的半-急性期的特征在于持續(xù)的自由基釋放，谷氨酸鹽清除，鈣及鈉釋放，阻塞的區(qū)的氧剝奪，及立即局限的細(xì)胞死亡。至今，無已知的用于人中風(fēng)后半-急性期期間的臨床上獲得批準(zhǔn)的試劑。如圖1中所示，藥學(xué)神經(jīng)損傷后治療的有限的窗至少部分被病理生理學(xué)及暫時(shí)的損傷進(jìn)展解釋。例如阻塞的數(shù)分鐘內(nèi)，在梗塞核心的神經(jīng)元?dú)?。阻塞后?shù)小時(shí)時(shí)，自由基， 興奮毒性及炎癥試劑釋放/產(chǎn)生，及這些分子持續(xù)毀壞腦組織及擴(kuò)展損傷區(qū)。如上所述，損傷的程度可有限，通過恢復(fù)血流(使用臨床上獲得批準(zhǔn)的溶栓劑，即，tPA)從而達(dá)到疫區(qū)的再-氧合作用。如通過科學(xué)文獻(xiàn)所示，各化合物似乎在急性及半-急性時(shí)期呈現(xiàn)功效。但是，CNS 神經(jīng)損傷后M，36或48小時(shí)標(biāo)記后，潛在治療進(jìn)行性喪失治療損傷的能力。實(shí)際上，在急性時(shí)期具有效應(yīng)的一些治療劑模式，例如tPA，隨著損傷后時(shí)間經(jīng)過開始具有嚴(yán)重的，威脅生命的禁忌癥。缺血性事件后數(shù)天，數(shù)周或數(shù)個(gè)月，在中風(fēng)后慢性期期間，治療必需旨在促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。創(chuàng)傷性事件(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的中風(fēng))后神經(jīng)恢復(fù)的促進(jìn)相比前-慢性窗中所采用的涉及明顯不同的生理學(xué)現(xiàn)象及治療性策略。前-慢性治療通常涉及旨在恢復(fù)血流及減少急性細(xì)胞死亡的試劑。相反，可在損傷后48小時(shí)或更久，或72小時(shí)或更久時(shí)有效施用的治療劑通過其不改變?nèi)毖該p傷大小而恢復(fù)功能的能力從急性期治療劑分化出。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療在缺血性CNS損傷的基本上完全損傷后死亡后開始；“缺血性CNS 損傷的基本上完全損傷后死亡”是指直接導(dǎo)致缺血性事件的CNS細(xì)胞死亡將發(fā)生，其他由于年齡或治療(無關(guān)治療是否設(shè)計(jì)用于解決缺血)的細(xì)胞死亡不在此定義的范圍內(nèi)。如所示本文中，本發(fā)明人展示，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對(duì)在神經(jīng)創(chuàng)傷性損傷的慢性期期間恢復(fù)神經(jīng)性功能有效。在一實(shí)施方式中，神經(jīng)創(chuàng)傷性損傷是缺血性中風(fēng)。如本文所述，本發(fā)明人作出驚人的發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在缺血性事件后慢性期期間起始施劑時(shí)有效。甚至更驚人的是發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白甚至當(dāng)晚至在缺血性事件后7天時(shí)起始施劑時(shí)有效。本數(shù)據(jù)顯示，達(dá)到的有利的結(jié)果不通過與發(fā)現(xiàn)在立即缺血后治療中有效的機(jī)理相同的機(jī)理發(fā)生。中風(fēng)后慢性期期間的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理不改變?nèi)毖該p傷的大小(見表 1)。此明顯顯示，病理生理學(xué)的急性及半-急性期完全在這些期，及慢性期期間施用的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)，而非建立再灌注及保護(hù)神經(jīng)元。表1 梗塞體積(％ )
bFGF21. 3±3. 3NRG 1. 0μ g/kg26. 8±3. 0GGF26. 5 μ g/kg27. 1±3. 7GGF2100u g/kg26. 3±3. 5媒質(zhì)25. 0±3. 本發(fā)明的組合物如上所述，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是由NRG-1，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因編碼的多肽及具有使它們結(jié)合及活化ErbB受體的EGF-樣結(jié)構(gòu)域。Holmes等人(Science 256 :1205 1210， 1992)顯示，EGF-樣結(jié)構(gòu)域單獨(dú)足以結(jié)合及活化pi邪erbB2受體。因此，由NRG-1，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因編碼的任何多肽產(chǎn)物，或任何神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_樣多肽，例如，具有由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或cDNA編碼的EGF-樣結(jié)構(gòu)域(例如，含NRG-I肽亞結(jié)構(gòu)域C-C/D或C-C/ D'的 EGF-樣結(jié)構(gòu)域，如 USPN 5，530，109，USPN 5，716，930，及 USPN 7，037，888 中所述；或如公開于wO 97/09425的EGF-樣結(jié)構(gòu)域)的多肽可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的組合物可為單元?jiǎng)┬?。包括本發(fā)明的組合物和/或根據(jù)本發(fā)明的使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可將本發(fā)明的組合物與藥學(xué)-可接受的稀釋劑，載質(zhì)，或賦形劑一同施用于的患者。采用常規(guī)藥學(xué)實(shí)踐提供制劑或組合物以將所述組合物施用給患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。盡管靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的，可采用任何適當(dāng)?shù)氖┯猛緩?，例如，腸胃外，皮下，肌內(nèi)，顱內(nèi)，眶內(nèi)，眼， 心室內(nèi)，囊內(nèi)，脊柱內(nèi)，腦池內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，氣霧劑，口服，或經(jīng)皮(例如，通過施加帶制劑的粘合貼劑能交叉真皮及進(jìn)入血流)或局部施用。治療性制劑可取液體溶液或懸浮液形式；對(duì)于口服施用，制劑可取片劑或膠囊形式；及對(duì)于鼻內(nèi)制劑，以粉末，鼻滴液，或氣霧劑的形式。本領(lǐng)域中熟知的用于制備制劑的方法見于，例如，“Remington' sPharmaceutical Sciences",,用于腸胃外施用的制劑可， 例如，含賦形劑，無菌水，或鹽水，聚烯基甘醇(例如聚乙二醇)，蔬菜來源的油，或氫化萘。 用于施用本發(fā)明的分子的其他潛在地有用的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子，滲透泵，可植入的輸注系統(tǒng)，及脂質(zhì)體。用于吸入的制劑可含賦形劑，例如，乳糖，或可為含，例如，聚氧乙烯-9-月桂醚，甘膽酸鹽及脫氧膽酸鹽的水溶液，或可為用于以鼻滴液的形式施用的油性溶液，或作為凝膠。本發(fā)明的其他方面提供了將本化合物用作尤其是治療或預(yù)防前述病情及疾病的藥物。本文也提供本化合物在制備用于治療或預(yù)防前述病情及疾病之一的藥物中的用途。關(guān)于靜脈內(nèi)注射，劑量水平通常在從以下列表中的一個(gè)值到列表中的更高值的范圍內(nèi)約 0. 001mg/kg，約 0. 01mg/kg,約 0. lmg/kg,約 lmg/kg,及約 10mg/kgo 施劑周期性通常在從約每對(duì)，48，72，或96小時(shí)的規(guī)則的時(shí)間間隔內(nèi)。在替代性實(shí)施方式中，施劑周期性通常在從約每1，2，3，4，5，6，7，數(shù)天的規(guī)則的時(shí)間間隔內(nèi)。在替代性實(shí)施方式中，施劑周期性通常在從約每1，2，3，4，或5周的規(guī)則的時(shí)間間隔內(nèi)。所述施劑時(shí)期后，可采用欠頻繁的施劑，例如每月，每3個(gè)月，每4個(gè)月，或每年。選擇經(jīng)皮劑量來提供相比使用注射劑量實(shí)現(xiàn)的基本上相同的，類似或更低生理學(xué)水平(血漿，組織，CSF)?？蓪⒈景l(fā)明的化合物作為單獨(dú)的活性劑施用，或它們可與其他試劑(包括可發(fā)現(xiàn)展示相同的或類似治療性活性及測定為對(duì)于所述組合的施用安全的及有效的其他化合物) 組合施用。含蓋的用于治療急性或半-急性神經(jīng)損傷的其他所述化合物包括造血因子(例如，G-CSF和/或GM-CSF)；具有溶血栓活性的物質(zhì)，例如，tPA，鏈激酶，尿激酶，和/或安克洛酶；抗血小板劑，例如乙酰水楊酸(阿司匹林)，氯吡格雷(Plavix)，與緩釋雙嘧達(dá)莫 (Aggrenox)組合的阿司匹林；抗凝劑，例如殺鼠靈(Coumadin)或肝素；和/或干擾凋亡性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)(例如胱天蛋白酶抑制劑)或孕酮。但是，已知以預(yù)防中風(fēng)發(fā)展的目的(例如，用于抗血小板劑或抗凝劑)，或在中風(fēng)后急性期期間(tPA)施用以上化合物。為了評(píng)估根據(jù)本發(fā)明有效治療的運(yùn)動(dòng)，感覺或認(rèn)知缺乏，本領(lǐng)域中可用幾種工具。熟知的監(jiān)控治療功效的標(biāo)志包括細(xì)微精神狀態(tài)檢查(MMSE)，改良的細(xì)微精神狀態(tài)檢查(3MS)，功能損傷測量(FIM，Barthel測試，F(xiàn)ugl-Meyer運(yùn)動(dòng)分值，Wolf運(yùn)動(dòng)功能測試，Jebsen-Taylor手功能測試，Nottingham健康特征部分1及運(yùn)動(dòng)評(píng)定標(biāo)尺(MAS)， S0dring運(yùn)動(dòng)評(píng)估標(biāo)尺(SMES)，Berg平衡標(biāo)尺(BBS)及日常生活Barthel活性(ADL)，及
其他臨床測試，例如影響，語言，吞咽，認(rèn)知，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，強(qiáng)度，感覺及自主功能測量，以及存活率及住院率可用于評(píng)定疾病進(jìn)展。損傷后，疾病，感染或其他神經(jīng)系統(tǒng)分裂，腦，脊髓或外周神經(jīng)由于任何的組合總破壞，凋亡，分裂的通路及突觸，發(fā)炎，改變的化學(xué)環(huán)境，細(xì)胞代謝變化及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及翻譯變化而不恰當(dāng)?shù)仄鹱饔?。本文中的術(shù)語“神經(jīng)恢復(fù)”用于指神經(jīng)系統(tǒng)向正常狀態(tài)恢復(fù)其功能的過程。此過程可通過修正，防止，反轉(zhuǎn)或消除以上提及的任何原因來發(fā)生。此外，目前已知顯著的神經(jīng)恢復(fù)可通過稱為‘可塑性’的處理發(fā)生，其中神經(jīng)系統(tǒng)形成新聯(lián)系以補(bǔ)償或適應(yīng)于其他變化。CNS損傷導(dǎo)致造成分裂的功能及殘疾的局部及長-范圍聯(lián)系的分裂?？伤苄允羌扔械纳窠?jīng)元之間形成新聯(lián)系的事件?？伤苄砸扬@示是包括視覺系統(tǒng)(Pizzorusso 等人)及脊髓(Fawcett Jff (2009) Brain 132:1417-1418)的 CNS系統(tǒng)中的神經(jīng)恢復(fù)機(jī)理。在可塑性中，新突觸形成或既有的突觸加強(qiáng)，減弱或去除，以使既有的結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)補(bǔ)償已在損傷中毀壞或分裂的那些。其他形式的可塑性可包括改變既有的細(xì)胞的神經(jīng)化學(xué)，以變化直接突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及旁分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。可塑性也可取改變受體水平的形式，以使神經(jīng)元及其他細(xì)胞更或欠敏感于直接的突觸或旁分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些過程良好被接受為學(xué)習(xí)及記憶的機(jī)理。文獻(xiàn)，行為，材料，裝置，物品等的討論包括在此說明書中僅旨在提供本發(fā)明的背景。不推薦或代表，任何或全部這些東西形成部分現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或是本申請的各權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)中的公知常識(shí)。本發(fā)明已聯(lián)系其特定實(shí)施方式描述，需知，能進(jìn)一步改良及本申請，一般而言，旨在覆蓋遵循本發(fā)明的原理的本發(fā)明的任何變化，使用，或適應(yīng)，及包括在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中已知的或習(xí)慣的實(shí)踐內(nèi)從本公開內(nèi)容脫離，及可將應(yīng)用于前述必要的特征，及落入隨附的權(quán)利要求的范圍。以下實(shí)施例將輔助本領(lǐng)域技術(shù)人員更佳了解本發(fā)明及其原理及優(yōu)點(diǎn)。期望這些實(shí)施例為闡明本發(fā)明及不限制其范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1材料及方法動(dòng)物準(zhǔn)備將50只，成年，雄性Sprague-Dawley用于研究(定購10只額外的動(dòng)物)。全部大鼠籠養(yǎng)及進(jìn)行用于以適應(yīng)環(huán)境目的在手術(shù)之前7天行為評(píng)定的操作。操作時(shí)期末，大鼠隨機(jī)化及分配到不同的組。大鼠通過尾標(biāo)記給予唯一的識(shí)別號(hào)。10只額外的大鼠也操作。手術(shù)準(zhǔn)備中腦動(dòng)脈阻塞(MCAO)，Tamura模型此大鼠手術(shù)損傷模型是本領(lǐng)域中良好接受的中風(fēng)模型(Tamura etal,1981, J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1) :53-60 ；Tamura et al,1981, JCereb Blood Flow Metab. 1 (1) :61-9)。通過使用Tamura等人方法的改良方法的近端右中腦動(dòng)脈(MCA)永久的阻塞來制備病灶腦梗塞。用在N2O O2 (2 1)的混合物中的2 3%氟烷麻醉雄性 Sprague-Dawley大鼠(在手術(shù)時(shí)300 400g)，及用在N2O O2 (2 1)的混合物中的1 1.5%氟烷維持。兩斷顳肌，及通過在眼及耳道之間中位切開來呈現(xiàn)。通過顳下顱骨切除術(shù)不去除髖弓及不橫斷面神經(jīng)地暴露近端MCA。然后通過從剛好接近嗅覺通路到大腦下靜脈的顯微雙極性凝固阻塞動(dòng)脈，及橫斷。貫穿整個(gè)過程于37.5°C 士0.5°C體溫維持。在MCAO 前一天及 MCAO 剛后腹膜內(nèi)(i. p.)給予頭孢唑林(40mg/kg ；Baxter, Lot 06014. 1，Exp。1 月2009年)，以阻止感染。在MCAO手術(shù)之前作為鎮(zhèn)痛劑皮下(0. 05 0. lmg/kg)給予丁丙諾啡(NDC12496-0757-1, Lot#700Y02, exp :1 月 1 日 2010 年)。化合物制備及施劑[GGF2 及 NRG-I (NRG-EGF)在Acorda Therapeutics制備濃儲(chǔ)物溶液及保存于0 5°C。如下述制成劑量NRG_l[NRGlb2EGF結(jié)構(gòu)域(156Q)]的克隆，表達(dá)及純化DNA 從人腦cDNA克隆NRGlb2 egf結(jié)構(gòu)域及使用Ndel及BamHl限制性位點(diǎn)克隆進(jìn)pet 15b 載體(Novagen cat#69661 3)。得到的蛋白是 6. 92kda+ 3kDa His 標(biāo)簽(= 9. 35kDa)。NRGlb2egf pet 15 克隆的 DNA 序列有下劃線的序列是克隆位點(diǎn)(Ndel及BamHl)CATATGAGCCA TCTTGTAAAA TGTGCGGAGA AGGAGAAAAC TTTCTGTGTGAATGGAGGGG AGTGCTTCAT GGTGAAAGAC CTTTCAAACC CCTCGAGATACTTGTGCAAG TGCCCAAATG AGTTTACTGG TGATCGCTGC CAAAACTACGTAATGGCCAG CTTCTACAAG GCGGAGGAGC TGTACCAGTA AGGATCC從petMb載體最終翻譯的蛋白示于下。egf結(jié)構(gòu)域加了下劃線。1020304050MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSHLVKCAEK EKTFCVNGGE CFMVKDLSNP607080SRYLCKCPNE FTGDRCQNYV MASFYKAEEL YQ理論pI/Mw 7. 69/9349. 58蛋白表達(dá)使用過夜表達(dá)自動(dòng)誘導(dǎo)系統(tǒng)(Novagen)在LB培養(yǎng)基中于25°C將克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)用于蛋白表達(dá)的B121細(xì)胞M小時(shí)。表達(dá)主要在不溶性包含體中。蛋白再折疊從Novagen蛋白再折疊試劑盒改造，70123-3。蛋白純化將蛋白以2. 5ml/分鐘裝在陰離子交換柱DEAE。NRG_1片段仍在流通中， 然而混入物結(jié)合及以更高鹽洗脫。裝載及洗滌緩沖液是50mM Tris pH7. 9，及洗脫緩沖液是含IM NaCl的50mM TrispH7. 9。將流通液合并，及用來自Millipore的Centripr印YM-3 濃縮。蛋白印跡通過蛋白印跡評(píng)定蛋白表達(dá)。得到的條帶以約IOkD運(yùn)行。將4 20%標(biāo)準(zhǔn)凝膠(Biorad)用于蛋白解析，然后轉(zhuǎn)移到Protran硝酸纖維素紙 (來自khliecher&khull的0. Iym孔徑)。印跡在TBS-T(0. 1 % )中的5%乳中封閉。 在TBS-T中的5%乳中的1 1000稀釋的第一抗體(來自R&D系統(tǒng)的抗EGF人NRGl-α/ HRGl-α親和力純化的多克隆抗體Cat#AF-296-NA)_于室溫1小時(shí)(也于4°C工作過夜)。 以TBS-T中的5%乳中的1 10，000稀釋液使用兔抗山羊HRP第二抗體，于室溫1小時(shí)。 全部在TBS-T中進(jìn)行洗滌。NRG-1的純化流程將培養(yǎng)物于25°C在來自Novagen的過夜表達(dá)自動(dòng)誘導(dǎo)系統(tǒng)1 (cat#71300-4)中生長。有非常少的可溶性NRG-I存在。將培養(yǎng)物離心沉降及將沉淀提取，溶解及在純化可發(fā)生之前再折疊以獲取NRG-I。用于提取，增溶及再折疊的物質(zhì)IOX 洗滌緩沖液:200mM Tris-HCl, pH 7. 5，IOOmM EDTA, 10% Triton X-10010X 增溶緩沖液500mM CAPS, pH 11. 050 X 透析緩沖液:1M Tris-HCl, pH 8. 530% N-月桂基肌氨酸-作為粉末添加(Sigma 61739-5G)IM DTT
還原的谷胱甘肽(Novagen 3541)氧化的谷胱甘肽(Novagen 3542)IL細(xì)胞裂解及包含體的制備-解凍及在30ml1 X洗滌緩沖液中重懸浮細(xì)胞沉淀。根據(jù)需要，為完全重懸浮而混合。-將蛋白酶抑制劑(25μ 1 的 10 X /50ml)，DNA 酶 QOO μ 1 的 lmg/ml/50ml)及 MgC12(500y 1的lM/50ml)添加到懸浮液。-通過超聲處理裂解細(xì)胞。a.貫穿此步驟在冰上冷卻細(xì)胞。b.使用方形端，以6，10次水平超聲處理30秒鐘，直到懸浮液粘性減小。各超聲處理之間使懸浮液在冰上冷卻60秒鐘。當(dāng)超聲處理時(shí)，保持50ml圓錐形管內(nèi)的體積不高于 40ml。-當(dāng)完成時(shí)，將各懸浮液轉(zhuǎn)移到用于以F-16/^250轉(zhuǎn)子使用的250ml曲頸離心瓶。-通過以IOOOOXg離心12分鐘來收集包含體。-去除上清(留下用于可溶性蛋白分析的樣品)及在30ml的IX洗滌緩沖液中充分重懸浮沉淀。-如在步驟4中重復(fù)離心及留下沉淀。-再次，在30ml的1X洗滌緩沖液中充分重懸浮沉淀。-通過以IOOOOXg離心10分鐘來收集包含體。倒出上清及通過在紙巾上敲打顛倒的管來去除最后痕量的液體。B.增溶及再折疊-從待處理的包含體濕重，計(jì)算對(duì)于以10 15mg/ml濃度重懸浮包含體必需的 IX增溶緩沖液的量。如果計(jì)算的體積大于250ml，使用250ml。-于室溫，制備計(jì)算的體積的補(bǔ)充了0. 3% N-月桂基肌氨酸(可使用達(dá)2%，如果進(jìn)一步優(yōu)化中需要)(300mg/100mL緩沖液)及ImMDTT的IX增溶緩沖液。-將計(jì)算的量的IX增溶緩沖液來自步驟2的添加到包含體及輕輕混合。可將大的碎片通過重復(fù)的移液打碎。-在冰箱搖床中于25°C，以50 IOOrpm溫育4 5小時(shí)。-通過于室溫以10000Xg離心10分鐘來澄清。C.蛋白再折疊的透析流程-制備所需的體積的用于溶解的蛋白透析的緩沖液。透析應(yīng)以至少2次大于樣品體積50倍的緩沖液變更進(jìn)行。-將50X透析緩沖液稀釋到期望的體積的IX，及補(bǔ)充0. ImM DTT。-于4°C透析至少4小時(shí)。更換緩沖液及持續(xù)。透析額外的4或更多小時(shí)。-制備額外的如在步驟1中測定的透析緩沖液，但省略DTT。-通過2次額外的變更(分鐘。各4hr)，用缺少DTT的透析緩沖液持續(xù)透析。D.促進(jìn)二硫鍵形成的氧化還原再折疊緩沖液-制備在IX透析緩沖液中含ImM還原的谷胱甘肽(1.2g/4L)及0.2mM氧化的谷胱甘肽(0. 48g/4L)的透析緩沖液。體積應(yīng)25倍大于溶解的蛋白樣品體積。冷卻至4°C。
-透析來自步驟1的再折疊的蛋白于4°C過夜。純化全部過程于4°C進(jìn)行?；瘜W(xué)品氨基丁三醇鹽酸鹽(SigmaT5941-500G)氯化鈉5M 溶液(Sigma S6546-4L)氫氧化鈉10N(JT Baker 5674-02)E.在DEAE HiPrep 16/10 陰離子柱 _20ml (GE Healthcare)上的純化緩沖液A :50mM Tris-HCL ρΗ8· 0緩沖液B 含 IM NaCl pH 8. 0 的 50mM Tris-HCL柱平衡緩沖液A-5CV，緩沖液B-5CV，緩沖液A-10CV-每次運(yùn)行以2.Oml/分鐘負(fù)荷50ml的樣品到20ml柱(NRG-1在流通中)。-用5CV的緩沖液A洗滌20ml柱20ml柱用至100% B的梯度用5CV。這是為洗脫下混入物。-用IOCV的100%緩沖液B清潔。-用15CV的緩沖液A平衡-用SDS-PAGE銀染色分析級(jí)分-用NRG-I (IOkDa)合并級(jí)分F. NRG-I的濃度-用Millipore Centripr印 3000 MWCO 15ml 濃縮機(jī)(UltracelYM-3，4320)濃縮-使用改良的Lowry蛋白測定來測定濃度。G.His-標(biāo)簽去除用來自Novagen (Cat#69022-;3)的A凝血酶切割捕獲試劑盒進(jìn)行His-標(biāo)簽去除。 基于之前測試，最佳條件對(duì)于每10 μ g的NRG-I蛋白是于室溫以0. 005U的酶/ μ 1的凝血酶4小時(shí)。溫育4小時(shí)后，添加16 μ 1的鏈霉親和素瓊脂糖漿/單元的凝血酶。于室溫?fù)u動(dòng)樣品30分鐘。通過自旋-過濾或無菌過濾(取決于體積)回收NRG-1。用EGF及抗-His 蛋白印跡確定完全切割。H.最終緩沖液中的儲(chǔ)存于4°C儲(chǔ)存在含 0. 2% BSA 的 IXPBS 中。GGF2的表達(dá)及純化對(duì)于GGF2的克隆及背景信息，見USPN 5，530，109。細(xì)胞系描述于USPN 6，051，401。將各USPN 5，530，109及USPN 6，051，401的整個(gè)內(nèi)容均通過引用整體并入本文。CH0-(Alpha2HSG)-GGF細(xì)胞系此細(xì)胞系設(shè)計(jì)來產(chǎn)生足夠的量的胎球蛋白(人 alpha2HSG)，以支持在無血清條件下rhGGF2的高產(chǎn)生速度。用如下顯示的表達(dá)載體(pSV-AHSG)轉(zhuǎn)染Cho (dhfr_)細(xì)胞。在氨芐西林壓力下穩(wěn)定的細(xì)胞生長。細(xì)胞系標(biāo)識(shí)為(dhfr7a2HSGP)。然后將dhfr7a2HSGP細(xì)胞使用陽離子脂質(zhì)DMRIE-C試劑(LifeTechnologies#10459-014)用如下顯示的含人GGF2的編碼序列的 PCMGGF2載體轉(zhuǎn)染。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程使用甲氨喋呤(100ηΜ，200ηΜ，400ηΜ，1μΜ)以4 6周間隔衍生穩(wěn)定的及高產(chǎn)的細(xì)胞系。使細(xì)胞逐漸從含血清的培養(yǎng)基脫離。克隆通過標(biāo)準(zhǔn)限制稀釋方法分離。培養(yǎng)基要求之細(xì)節(jié)見于上述報(bào)道。為增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，將GGF2編碼序列放置在EBV BMLF-I干擾序列(MIS)后。見以下圖。
MIS [229 bpi
miixri mi 丨丨丨 niiiiim 丨 mnrnwnffl nin
Lniron (177 bpjMIS 序列CGAT「AACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG(GTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCCCGATAACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG(GTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCCGTGGAGCCGGGGGCATCCGGTGCCTGAGACAGAGGTGCTCAAGGCAGTCTCCACCTTTTGTCTCCCCTCTGCAG)AGAGCCACATTCTGGAA]GTTGGF2編碼序列atgagatgg cgacgcgccc cgcgccgctc cgggcgtccc
0190]301ggcccccgggcccagcgccccggctccgccgcccgctcgtcgccgccgctgccgctgctg0191]361ccactactgctgctgctggggaccgcggccctggcgccgggggcggcggccggcaacgag0192]421gcggctcccgcgggggcctcggtgtgctactcgtccccgcccagcgtgggatcggtgcag0193]481gagctagctcagcgcgccgcggtggtgatcgagggaaaggtgcacccgcagcggcggcag0194]541cagggggcactcgacaggaaggcggcggcggcggcgggcgaggcaggggcgtggggcggc0195]601gatcgcgagccgccagccgcgggcccacgggcgctggggccgcccgccgaggagccgctg0196]661ctcgccgccaacgggaccgtgccctcttggcccaccgccccggtgcccagcgccggcgag0197]721cccggggaggaggcgccctatctggtgaaggtgcaccaggtgtgggcggtgaaagccggg0198]781ggcttgaagaaggactcgctgctcaccgtgcgcctggggacctggggccaccccgccttc0199]841ccctcctgcgggaggctcaaggaggacagcaggtacatcttcttcatggagcccgacgcc
901aacagcaccagccgcgcgccggccgccttccgagcctctttcccccctctggagacgggc
961cggaacctcaagaaggaggtcagccgggtgctgtgcaagcggtgcgccttgcctccccaa
1021ttgaaagagatgaaaagccaggaatcggctgcaggttccaaactagtccttcggtgtgaa
1081accagttctgaatactcctctctcagattcaagtggttcaagaatgggaatgaattgaat
1141cgaaaaaaca3.3. C C 3. C 3.3.3.3.tatcaagatacaaaaaaagccagggaagtcagaacttcgc
1201attaacaaagcatcactggctgattctggagagtatatgtgcaaagtgatcagcaaatta
1261ggaaatgacagtgcctctgccaatatcaccatcgtggaatcaaacgctacatctacatcc
1321accactgggacaagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaat
1381ggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgc
1441ccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacagtacg
1501tccactccctttctgtctctgcctgaatagGGF2蛋白序列MRWRRAPRRSGRPGPRAQRPGSAARSSPPLPLLPLLLLLGTAALAPGAAAGNEAAPAGA SVCYSSPPSVGSVQELAQRAAVVIEGKVHPQRRQQGALDRKAAAAAGEAGAWG⑶REPPAAGPRALGPPAEEPLLAA NGTVPSWPTAPVPSAGEPGEEAPYLVKVHQVWAVKAGGLKKDSLLTVRLGTWGHPAFPSCGRLKEDSRYIFFMEPDA NSTSRAPAAFRASFPPLETGRNLKKEVSRVLCKRCALPPQLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGN ELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNATSTSTTGTSHLVKCAEKE KTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPEGGF2產(chǎn)生將一瓶2. 2 X IO6細(xì)胞/mL的GGF2解凍到IOOml的Acorda培養(yǎng)基1 (見表2)，及擴(kuò)展直到達(dá)到足夠數(shù)，以接種產(chǎn)生容器。將細(xì)胞在21通氣的滾瓶中以1. 0 X IO5細(xì)胞/mL接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基Acorda培養(yǎng)基2 (見表幻。將滾瓶維持于37°C 5天，然后降低到 27°C^6天。監(jiān)控滾瓶的細(xì)胞計(jì)數(shù)及總體外觀，但它們不進(jìn)料。一旦活力到10%以下，將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)出，及收獲條件培養(yǎng)基及無菌過濾。表2:培養(yǎng)基1
物品供應(yīng)商貨號(hào)終濃度CD-CHOInvitrogen10743-029-移出50ml，然后添加以下成分FeSO4-EDTASigmaF-0518Ix ( 10ml/L)L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CI4mM ( 20ml/L )重組人胰島素Sigma1-9278290 V/L ( lml/L)非-必要的氨基酸Cellgro25-025-CIIx ( 10ml/L)胨 4 型大豆 -HySoySigmaP0521粉末-制備20 χ在CD-CHO ( 50ml/L )中慶大霉素Invitrogen15750-078IOOpg ( 2ml/L )表3:培養(yǎng)基權(quán)利要求
1.給哺乳動(dòng)物施用包括表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳動(dòng)物神經(jīng)損傷后施用包括表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽；及， 在神經(jīng)損傷后至少2天時(shí)起始所述施用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述起始步驟在神經(jīng)損傷后至少3天時(shí)開始。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述起始步驟在神經(jīng)損傷后至少7天時(shí)開始。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)-I基因，(NRG)-2 基因，(NRG)-3基因，(NRG)-4基因編碼。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽是GGF2。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
7.給哺乳動(dòng)物施用包括表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳動(dòng)物神經(jīng)損傷后施用包括表皮生長因子-樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽； 在神經(jīng)損傷后6小時(shí)內(nèi)起始所述施用；及， 持續(xù)所述施用步驟至多于損傷后6小時(shí)的時(shí)期。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述持續(xù)步驟包括持續(xù)施用步驟至多于損傷后48小時(shí)的時(shí)期。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述持續(xù)步驟包括持續(xù)施用步驟至多于損傷后72小時(shí)的時(shí)期。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)-I基因， (NRG)-2基因，(NRG)-3基因，(NRG)_4基因編碼。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述多肽是GGF2。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
13.在哺乳動(dòng)物缺血性中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后施用包括表皮生長因子-樣 (EGF-樣)結(jié)構(gòu)域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳動(dòng)物神經(jīng)損傷后施用所述肽；及，在哺乳動(dòng)物達(dá)到完全損傷后缺血性損傷細(xì)胞死亡體積后起始所述施用。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)-I基因， (NRG)-2基因，(NRG)-3基因，(NRG)_4基因編碼。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽是GGF2。
全文摘要
本發(fā)明涉及在神經(jīng)損傷后在急性窗后或在慢性時(shí)期治療神經(jīng)損傷。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102159237SQ200980136712
公開日2011年8月17日 申請日期2009年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者A·卡加諾, J·艾希 申請人:阿索爾達(dá)治療公司