專利名稱：抗癌劑作用增強(qiáng)劑及其應(yīng)用、以及癌患者預(yù)后推定用生物標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)抗癌劑的作用的藥劑及其用途、以及癌患者預(yù)后推定用生物標(biāo)記 物及其用途等。
背景技術(shù)：
組蛋白去乙酰化酶(HDACs)通過抑制細(xì)胞的增殖、分化、生存而抑制癌的發(fā)生(非 專利文獻(xiàn)1、2)。從過去的研究已知HDACs的抑制劑(HDACi)在與其他的抗癌劑并用時(shí)發(fā)揮 顯著的協(xié)同效果(非專利文獻(xiàn)2、；3)。然而，還未完全理解HDACi發(fā)揮協(xié)同效果時(shí)的分子機(jī)理。經(jīng)過系統(tǒng)的活體外(in vitro)研究慢慢發(fā)現(xiàn)HDACi對腫瘤細(xì)胞特異性誘導(dǎo)細(xì) 胞增殖的停止、分化、細(xì)胞凋亡以及腫瘤血管新生的抑制等(非專利文獻(xiàn)2、3、4)?；?這種活體外研究，幾種HDACi在接受臨床實(shí)驗(yàn)，其中之一的伏立諾他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)已通過美國食品和藥物管理局(FDA)的許可被應(yīng)用于皮膚T細(xì)胞 性淋巴瘤的治療(非專利文獻(xiàn)4、幻。另外，還報(bào)道有HDACi除了單獨(dú)的作用之外還通過與 多種作用的抗癌劑并用而發(fā)揮協(xié)同效果(非專利文獻(xiàn)2、4)。而且，已知包括順鉬、5-FU、依 托泊苷(etoposide)、阿霉素(Doxorubicin)等的化學(xué)療法劑中，細(xì)胞毒性作用的機(jī)理之一 是誘導(dǎo)活性氧(R0Q的產(chǎn)生(非專利文獻(xiàn)6 9)。還報(bào)道有抗氧化酶或其關(guān)聯(lián)基因的表達(dá) 的改變將調(diào)節(jié)對癌細(xì)胞化學(xué)療法劑的抵抗性(非專利文獻(xiàn)10 13)，而這將支持上述的利 用化學(xué)療法劑的ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)對細(xì)胞毒活性重要這一見解。非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 :Yang，XJ. and Seto, Ε. The Rpd3/Hdal family oflysine deacetylases :from bacteria and yeast to mice and men. Nat RevMo1 Cell Biol. 9(3) 206-18(2008)非專利文獻(xiàn) 2 :Bolden，JE.，Peart，MJ. and Johnstone，RW. Anticancer activities of hi stone deacetylase inhibitors. Nat Rev DrugDiscov. 5(9) 769-84(2006).非專利文獻(xiàn) 3 :Minucci, S. and Pelicci, PG. Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic(and more)treatments forcancer. Nature Reviews Cancer. 6(1) :38-51(2006).# # ^lJ i； K 4 :Xu, WS. ， Parmigiani, RB. and Marks, PA. Histonedeacetylase inhibitors :molecular mechanisms of action. Oncogene. 26(37) :5541-52(2007).非專禾Ij文獻(xiàn) 5 :Marks, PA. and Breslow, R. Dimethyl sulfoxide tovorinostat development of this histone deacetylase inhibitor as ananticancer drug. Nature Biotechnology. 25(1) :84-90(2007).非專利文獻(xiàn) 6 :Miyajima, A. et al. Role of reactive oxygen species incis-dichlorodiammineplatinum-induced cytotoxicity on bladder cancercells. Br J Cancer. 76 (2) :206-10(1997).非專禾Ij文獻(xiàn) 7 :Kurosu，Τ. ，F(xiàn)ukuda， Τ. ，Miki，Τ. and Miura， 0. BCL6 overexpression prevents increase in reactive oxygen species andinhibits apoptosis induced by chemotherapeutic reagents in B_celllymphoma cells. Oncogene. 22(29) :4459-68(2003).非專利文獻(xiàn) 8 :Hwang，IT. et al· Drug resistance to 5-FU linked toreactive oxygen species modulator 1. Biochem Biophys Res Commun. 359(2) :304-10(2007).# 專禾Ij X ^ 9 :Ravid, A. et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 enhancesthe susceptibility of breast cancer cells to doxorubicin-induced oxidativedamage. Cancer Res. 59(4) :862-7(1999).非專禾丨J 文獻(xiàn) 10 Godwin, AK. et al. High resistance to cisplatin inhuman ovarian cancer cell lines is associated with marked increase ofglutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (7) :3070-4(1992).非專利文獻(xiàn) 11 :Yokomizo，A. et al. Cellular levels of thioredoxinassociated with drug sensitivity to cisplatin,mitomycin C，doxorubicinand etoposide. Cancer Res. 55(19) :4293-6(1995).非專利文獻(xiàn) 12 :Sasada，Τ. et al. Redox control of resistance tocis-diamm inedichloroplatinum(II) (CDDP) !protective effect of humanthioredoxin against CDDP-induced cytotoxicity. J Clin Invest.97(10) :2268-76(1996).非專利文獻(xiàn) 13 :Powis, G· and Kirkpatrick，DL. Thioredoxinsignaling as a target for cancer therapy. Curr Opin Pharmacol. 7(4) :392-7(2007).非專利文獻(xiàn)14 :Halkidou K，Gaughan L，Cook S，Leung HY，NealDE，Robson CN. (2004). Upregulation and nuclear recruitment ofHDACl in hormone refractory
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20 =Shimono, Y. ， Murakami, H. ， Kawai, K. ， Wade, P. Α. ， Shimokata, K. and Takahashi, Μ. :Mi_2associates with BRGl and RETfinger protein at the distinct regions with transcriptional activating an (!repressing abilities. J. Biol. Chem. 278 :51638-51645 (2003)非專禾丨J 文獻(xiàn) 21 Shimono, K. , Shimono, Y. , Shimokata, K. , Ishigurο, N. , and Takahashi, Μ. :Microspherule protein 1, Mi~2 β , and RET fingerprotein associate in the nucleolus and up-regulate ribosomal genetranscription. J. Biol. Chem. 280 39436-39447(2005)

發(fā)明內(nèi)容
在癌治療中并用多個(gè)抗癌劑的情況較多。抗癌劑的并用是以提高治療效果為目的 進(jìn)行的，但有時(shí)帶來嚴(yán)重的副作用。其原因在于現(xiàn)在使用的抗癌劑的大部分以增殖迅速的 細(xì)胞作為靶，對癌細(xì)胞以外的正常的細(xì)胞也起到細(xì)胞損傷作用。本發(fā)明在如上的背景下，以提供增強(qiáng)抗癌劑的作用的手段，或提供對把握癌患者 的預(yù)后有用的生物標(biāo)記物及其用途，從而達(dá)成提高癌的治療效果為課題。到目前為止已知HDACi將改變控制細(xì)胞內(nèi)氧化狀態(tài)的硫氧還蛋白 (Thioredoxin), TBP-2的表達(dá)。鑒于該事實(shí)，本發(fā)明人建立如下假說HDACi通過控制細(xì) 胞內(nèi)的抗氧化機(jī)理而使癌細(xì)胞變?yōu)榭拱﹦┟舾行?。為了證實(shí)該假說，著眼于具有(1)在人 的腫瘤中呈高表達(dá)，(2)控制細(xì)胞的增殖、分化、生存這樣特征(Halkidou K，Gaughan L， Cook S, LeungHY, Neal DE, Robson CN. (2004). Upregulation and nuc1earrecruitment of HDACl in hormone refractory prostate cancer. Prostate59 :177-189 (非專利文 獻(xiàn) 14) ；Glozak MA, Seto Ε. (2007). Histonedeacetylases and cancer. Oncogene 26: M20-5432(非專利文獻(xiàn)15))的HDAC1，和具有(1)在癌細(xì)胞株中有高表達(dá)，( 活體 內(nèi)的表達(dá)有局限性這樣的特征(Takahashi M, Inaguma Y, Hiai H, Hirose F. (1988). Developmentally regulated expression of a human " finger " -containinggene encoded by the 5' half of the ret transforming gene. Mol Cell Biol. 4 :1853-6(非 專利文獻(xiàn) 16) ；Tezel,G. et al. Μ. (1999). Differentnuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different celltypes. Pathol, ht. 49 :881-886 (非專利文獻(xiàn) 17))之上還具有C3)其敲除(knockout)鼠不顯示嚴(yán)重的表型這樣的特征(未發(fā)表數(shù)據(jù)) 的(RETfinger protein)，進(jìn)行了深入的研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn) HDACl 對 ThioredoxinBinding Protein-2(TBP-2)的表達(dá)進(jìn)行負(fù)控制，從而增進(jìn)對癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的抵抗性。另外，還發(fā) 現(xiàn)HDACl通過由RFP以及轉(zhuǎn)錄因子NF-Y構(gòu)成的蛋白復(fù)合體而被配置于TBP-2基因的啟動(dòng) 子上。另外，還發(fā)現(xiàn)使用RNAi的RFP的表達(dá)抑制將招致該蛋白復(fù)合體的降解，結(jié)果顯著增 大癌細(xì)胞的順鉬(抗癌劑，也是氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑)敏感性。這些事實(shí)表明RFP是癌細(xì)胞 獲得抗癌劑耐性的重要的控制因子，還表明抑制RFP的表達(dá)或作用，則介由抗癌劑的作用 的增強(qiáng)，可提高癌治療結(jié)果。另一方面，還發(fā)現(xiàn)RFP的高表達(dá)，與人的大腸癌的TBP-2的表達(dá)下降、大腸癌患者 的預(yù)后不良相關(guān)。這表示使用抗癌劑時(shí)抑制RFP的表達(dá)或作用這一治療對策的有效性，還 表明檢查癌細(xì)胞的RFP的表達(dá)水平則能判定對抗癌劑的耐性，而該判定結(jié)果將成為對確定治療方針(有效的治療法的選擇等)、改善預(yù)后、提高患者生存質(zhì)量(QOL)等有貢獻(xiàn)的有益 信息。進(jìn)一步研究的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)RFP的表達(dá)與子宮體癌的預(yù)后不良相關(guān)。引人注意的是得 到了如下的見解在發(fā)現(xiàn)RFP的高表達(dá)時(shí)，采用通過更積極的手術(shù)方式的舉措將改善預(yù)后。 如上所述，表明RFP作為癌患者的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物(指標(biāo))有用。尤其是表明在子 宮體癌中，RFP的表達(dá)將成為決定手術(shù)方式時(shí)的有益的指標(biāo)。本發(fā)明主要是以上述的見解以及成果為基礎(chǔ)，內(nèi)容如下。[1] 一種作用增強(qiáng)劑，是具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用增強(qiáng)劑，其中，以 抑制RFP(RET finger protein)基因的表達(dá)或RFP的作用的化合物為有效成分。[2]如[1]所述的作用增強(qiáng)劑，其中，所述化合物是選自以下的(a) (d)中的化 合物(a)以RFP基因作為靶的s i RNA ；(b)在細(xì)胞內(nèi)生成以RFP基因作為靶的SiRNA的核酸構(gòu)建物；(c)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的反義核酸；(d)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的核酶。[3]如[1]或[2]所述的作用增強(qiáng)劑，其中，與具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑并用。[4] 一種增強(qiáng)具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用的方法，包括在靶癌細(xì)胞 內(nèi)，抑制RFP基因的表達(dá)或RFP的作用的步驟。[5] 一種癌治療法，包括將[1]或[2]所述的作用增強(qiáng)劑給藥的步驟和將具有氧 化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑給藥的步驟。[6] 一種抗癌劑耐性檢測法，包括檢查從活體分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量的步 驟，和基于所述步驟的結(jié)果，判定對具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的所述癌細(xì)胞的耐 性的步驟。[7] 一種癌患者的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物，包含RFP。[8]如[7]所述的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。[9] 一種癌患者的預(yù)后推定法，其中，以從癌患者分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量為 指標(biāo)。[10]如[9]所述的預(yù)后推定法，其中，癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量多是表示預(yù)后不良。[11]如[9]或[10]所述的預(yù)后推定法，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。[12] 一種癌患者的預(yù)后推定用試劑，含有抗RFP抗體。[13]如[12]所述的預(yù)后推定用試劑，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。[14] 一種癌患者的預(yù)后推定用試劑盒，包括[12]或[13]所述的試劑。[15]如[14]所述的預(yù)后推定用試劑盒，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。并用本發(fā)明的作用增強(qiáng)劑，則提高以順鉬為代表的具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌 劑的作用。由此，能夠降低抗癌劑的使用量、抗癌劑的種類(并用2種類以上的抗癌劑的情 況下)。另外，實(shí)現(xiàn)治療效果的提高。


圖1 :HDAC1和RFP的功能上的相互作用。(a) HDACi處理對細(xì)胞的氧化應(yīng)激的影響。將HeLa細(xì)胞分為用TSA (500nM)進(jìn)行3 小時(shí)的前處理的組和未進(jìn)行處理的組，對各組以所述濃度的H2O2進(jìn)行了 10小時(shí)的處理。細(xì) 胞的生死判定是以WST-I法進(jìn)行的。以H2A未處理時(shí)的生存指數(shù)為1，示出相對值。(b)利用siRNA的內(nèi)源性HDACl的敲除。將從導(dǎo)入了對照或HDACl的siRNA的HeLa 細(xì)胞得到的蛋白的樣品，以使用了抗HDACl抗體的免疫印跡進(jìn)行了解析。作為蛋白量的對 照使用抗β肌動(dòng)蛋白抗體。導(dǎo)入了 SiHDACl的細(xì)胞中觀察到了 HDACl的表達(dá)抑制。(C)、 (d)將導(dǎo)入了對照或HDACl的siRNA的HeLa細(xì)胞，以所述的濃度用c =H2O2 (10小時(shí))d 順 鉬04小時(shí))進(jìn)行了處理。細(xì)胞的生死判定和計(jì)算是以與a同樣的方法進(jìn)行的。HDACl的 敲除細(xì)胞中，與對照相比經(jīng)處理的細(xì)胞的生存指數(shù)的減少度大。(e)利用siRNA的內(nèi)源性RFP的敲除。將從導(dǎo)入了對照或RFP的siRNA的HeLa細(xì) 胞得到的蛋白的樣品，以使用了抗RFP抗體的免疫印跡進(jìn)行了解析。使用抗β肌動(dòng)蛋白抗 體作為蛋白量的對照。導(dǎo)入了 siRFP的細(xì)胞中觀察到了 RFP的表達(dá)抑制。(f)、(g)將導(dǎo)入了對照或RFP的siRNA的HeLa細(xì)胞，以所述的濃度的f =H2O2 (10 小時(shí))、g 順鉬04小時(shí))進(jìn)行了處理。細(xì)胞的生死判定和計(jì)算是以與a同樣的方法進(jìn)行 的。RFP的敲除細(xì)胞中，與對照相比，經(jīng)處理的細(xì)胞的生存指數(shù)的減少度大。圖2 =HDACl和RFP之間的結(jié)合域的鑒定。(a) HDACl與RFP相互作用。對HEK293細(xì)胞以HDAC1-V5以及Flag-RFP進(jìn)行一過 性共轉(zhuǎn)染(co-transfect)。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物以抗V5抗體(上側(cè)的板塊)或抗Flag抗體進(jìn) 行免疫沉淀，將免疫沉淀物用免疫印跡進(jìn)行了解析。將抗HA抗體作為空轉(zhuǎn)對照(mock)。(b)將內(nèi)源性HDACl以及RFP用抗HDACl (上側(cè)的板塊)以及抗RFP抗體(下側(cè)的 板塊)分別進(jìn)行免疫沉淀。將免疫沉淀物，以使用了抗HDACl抗體以及抗RFP抗體的免疫 印跡進(jìn)行了解析。(c)HDACl和RFP的相互作用所需的RFP的結(jié)構(gòu)域。左側(cè)的板塊RFP的模式圖。 表示了 Ring-B-box結(jié)構(gòu)域、Coild-coil結(jié)構(gòu)域以及Rfp結(jié)構(gòu)域。在各結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的cDNA 上附加了 Flag標(biāo)簽序列。右側(cè)的板塊將HEK293細(xì)胞用HDAC1-V5以及Flag標(biāo)簽RFP缺 失構(gòu)建物一過性共轉(zhuǎn)染之后，以抗V5抗體進(jìn)行免疫沉淀，用抗Flag抗體或抗V5抗體進(jìn)行 了免疫印跡。使用PFlag載體作為對照。(d)HDACl和RFP之間的相互作用所需的HDACl的區(qū)域。左側(cè)板塊=HDACl的模 式圖。將HDACl的各區(qū)域的對應(yīng)的cDNA片段以V5標(biāo)簽進(jìn)行了標(biāo)記化。將HEK293細(xì)胞用 Flag-RFP以及V5標(biāo)簽HDACl缺失構(gòu)建物一過性共轉(zhuǎn)染之后，用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀， 以抗V5抗體或抗Flag抗體進(jìn)行了免疫印跡。箭頭表示共沉淀片段。使用pcDNA載體作為 對照。圖3 :TBP-2是HDACl和RFP的共通的靶基因，成為增進(jìn)癌細(xì)胞對H2A和順鉬的敏 感性的原因。(a)、(b)通過HDACl以及RFP的敲除而提高TBP-2的表達(dá)。將從對照、導(dǎo)入了 HDACl或RFP的siRNA的HeLa細(xì)胞得到的RNA或蛋白的樣品，用RT-PCR(a)或免疫蛋白印 跡(Western Blotting) (b)進(jìn)行了解析。觀察到了 RT-PCR、免疫印跡均通過HDACl或RFP的敲除而提高TBP-2的表達(dá)。(c) TBP-2的過度表達(dá)。向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入附加了 V5標(biāo)簽的TBP-2的表達(dá)載體，用 免疫蛋白印跡確認(rèn)了表達(dá)。(d)、(e)TBP-2的過度表達(dá)對于癌細(xì)胞對H2O2和順鉬的敏感性帶來的影響。向HeLa 細(xì)胞導(dǎo)入附加了 V5標(biāo)簽的TBP-2的表達(dá)載體，以所述濃度的H2A(10小時(shí))(d)、順鉬(M小 時(shí))(e)進(jìn)行了處理。細(xì)胞的生死判定是通過WST-I法進(jìn)行的。以H2O2或順鉬未處理時(shí)的 生存指數(shù)為1，示出相對值。過度表達(dá)TBP-2的細(xì)胞中，與對照相比經(jīng)處理的細(xì)胞的生存指 數(shù)的減少度大。(f)將從對照、以所述的組合導(dǎo)入了 HDAC1、RFP或TBP-2的siRNA的HeLa細(xì)胞得 到的蛋白的樣品，用免疫蛋白印跡進(jìn)行了解析。顯示了通過HDACl或RFP的敲除而提高的 TBP-2的表達(dá)因siTBP-2而被抑制。(g)、(h)將以f所示的組合導(dǎo)入了 siRNA的HeLa細(xì)胞，用所述濃度的H2A (10小 時(shí))(g)、順鉬04小時(shí))(h)進(jìn)行了處理。細(xì)胞的生死判定和計(jì)算是通過與d、e同樣的方 法進(jìn)行的。通過HDACl或RFP的敲除而減少的藥劑給藥時(shí)的生存指數(shù)由于TBP-2的敲除而 部分被消除。圖4 =HDACl以及RFP將控制大腸癌以及乳癌細(xì)胞株中的TBP-2的表達(dá)，影響細(xì)胞 對H2A或順鉬的敏感性。(a)向大腸癌細(xì)胞株(SW480，HT-29)和乳癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)導(dǎo)入對照、 HDACU RFP的siRNA，對從其細(xì)胞得到的蛋白以免疫蛋白印跡進(jìn)行了解析。發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞株 中，敲除HDACl或RFP則提高TBP-2的表達(dá)。(b)、(c)向大腸癌細(xì)胞株(SW480，HT-29)和乳癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)導(dǎo)入對照、 HDACU RFP的siRNA,以所述的濃度的H202 (10小時(shí))(c)、順鉬(24小時(shí))(d)進(jìn)行了處理。 細(xì)胞的生死判定是通過WST-I法進(jìn)行的。以H2A或順鉬未處理時(shí)的生存指數(shù)為1，示出相 對值。HDACl或RFP的敲除細(xì)胞中，與對照相比經(jīng)處理的細(xì)胞的生存指數(shù)的減少度大。圖5 =RFP介由與NF-YC的相互作用，將HDCl配置于TBP-2啟動(dòng)子。(a)上側(cè)的圖模式性地表示TBP-2啟動(dòng)子。表示了用于染色質(zhì)免疫沉淀法的二個(gè) 區(qū)域。下側(cè)的圖是表示HDACl和RFP配置于TBP-2啟動(dòng)子的情況。免疫沉淀中使用了所 述的各抗體。TBP-2啟動(dòng)子區(qū)域的檢測利用了 PCR。圖中的“投入”是表示總投入的DNA的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(b)由于RFP將去乙?；M蛋白H3以及H4的HDACl配置于TBP-2啟動(dòng)子。將 從shNCl細(xì)胞以及shRFP30細(xì)胞調(diào)制的交聯(lián)染色質(zhì)進(jìn)行了免疫沉淀。以a所述的方法進(jìn)行 了 PCR。(c) RFP 與 NF-YC 相互作用。將 HEK293 細(xì)胞以 Flag-RFP 以及 NF-YC-V5 進(jìn)行了一 過性共轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物用抗V5抗體(上)或抗Flag抗體(下)進(jìn)行免疫沉淀，將 免疫沉淀物用免疫蛋白印跡進(jìn)行了解析。箭頭標(biāo)記表示V5-NF-YC。箭頭表示Flag-RFP。將 抗HA抗體作為空轉(zhuǎn)對照(mock)。(d)內(nèi)源性RFP與NF-YC相互作用。將與抗RFP抗體或?qū)φ誌gG的免疫沉淀物使 用抗RFP抗體以及抗NF-YC抗體以免疫蛋白印跡進(jìn)行了解析。(e)利用NF-YC的HDACl和RFP的免疫共沉淀。將HEK293細(xì)胞以Flag-HDACl、Flag-RFP以及NF-YC-V5共轉(zhuǎn)染之后，用抗V5抗體進(jìn)行了免疫沉淀。將免疫沉淀物提供于 免疫蛋白印跡解析。將抗HA抗體作為空轉(zhuǎn)對照(mock)。(f)NF-Y與TBP-2啟動(dòng)子的基因附近區(qū)域結(jié)合。使用抗NF-YB抗體進(jìn)行了免疫沉 淀分析。以與a所述的方法進(jìn)行了 PCR。(g) HeLa細(xì)胞中的利用siRNA的內(nèi)源性NF-YC的敲除。將以NF-YCsiRNA進(jìn)行了轉(zhuǎn) 染的HeLa細(xì)胞的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物，提供于使用了 NF-YC抗體的免疫蛋白印跡解析。(h) NF-YC是將HDACl以及RFP配置于TBP-2啟動(dòng)子。將從以對照或NF-YC siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞調(diào)制的交聯(lián)染色質(zhì)，用抗HDACl抗體或抗RFP抗體進(jìn)行了免疫沉淀。以與a所 述的方法進(jìn)行了 PCR。(i)模式性表示TBP-2啟動(dòng)子上形成的HDAC1/RFP/NF-YC復(fù)合體。圖6 =RFP導(dǎo)致HDAC1/RFP/NF-YC復(fù)合體的形成。(a)將HDACl、RFP以及NF-YC，以凝膠過濾柱進(jìn)行了共分離。將HeLa細(xì)胞提取液 以Superose 6凝膠過濾色譜法進(jìn)行分離，將各分組提供于SDS-PAGE。接著，使用抗HDACl 抗體、抗RFP抗體以及抗NF-YC抗體進(jìn)行了免疫印跡。在上面標(biāo)示了分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker) 的溶出位置。(b)RFP的表達(dá)增進(jìn)復(fù)合體的形成。將HEK293細(xì)胞以NF_YC_V5、HDACl-myc以及 Flag-RFP進(jìn)行共轉(zhuǎn)染之后，用抗V5抗體進(jìn)行了免疫沉淀。將免疫沉淀物用免疫蛋白印跡進(jìn) 行了解析。(c)以RNAi抑制RFP則抑制復(fù)合體的形成。將NF-YC-V5，與對照或RFP siRNA 一 同共轉(zhuǎn)染于HeLa細(xì)胞。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物用抗V5抗體進(jìn)行免疫沉淀之后，用免疫蛋白印跡 進(jìn)行了解析。將抗HA抗體作為空轉(zhuǎn)對照(mock)。圖7 =RFP的多聚化。(a) RFP將形成同源寡聚體。將HEK293細(xì)胞用GFP-RFP以及Flag-RFP進(jìn)行共轉(zhuǎn)染 之后，以抗Flag抗體進(jìn)行了免疫沉淀。接著使用抗Flag抗體以及抗GFP抗體進(jìn)行了免疫 印跡。將抗HA抗體作為空轉(zhuǎn)對照(mock)。WCL表示全細(xì)胞溶解產(chǎn)物。(b) Ring-B-box 以及 Coiled-coil 是多聚化所必要的。將 HEK293 細(xì)胞用 GFP-RFP 以及具有Flag標(biāo)簽的RFP缺失構(gòu)建物進(jìn)行共轉(zhuǎn)染之后，用抗Flag抗體進(jìn)行了免疫沉淀。使 用pFag載體作為對照。箭頭表示具有Flag標(biāo)簽的RFP構(gòu)建物。圖8 :RFP是新型的癌治療的靶。(a)、(b)、(C)RFP的敲除增強(qiáng)活體內(nèi)的腫瘤的抗癌 劑敏感性。裸小鼠的皮下移植shNCl (對照)、shRFP23、shRFP26三個(gè)細(xì)胞株。腫瘤的體積 達(dá)到50mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為順鉬治療組和未治療組。每4天將用量lmg/kg的順鉬(治 療組)或溶劑(生理食鹽水未治療組)向小鼠的腹腔內(nèi)給藥。(a)代表性腫瘤的照片。與未治療組相比，觀察到RFP敲除細(xì)胞株的治療組中的腫 瘤的體積明顯小。(b)腫瘤的成長曲線。每4天測定腫瘤直徑，計(jì)算體積作成了圖形。與未治療組相 比，RFP敲除細(xì)胞株的治療組中腫瘤的成長明顯慢。(c)將b的第1天和第21天的未治療組的體積設(shè)為100%時(shí)的治療組的體積的 比例制成了圖形。shNCl中第1天相對于未治療組約為92%，第21天減少為77%，而在 shRFP23、shRFP26中分別為95%減少到38%、112%減少到42%。使用RFP敲除細(xì)胞株的組中順鉬的治療效果大幅增強(qiáng)。(d)表示大腸癌試樣中的RFP的表達(dá)的代表性照片。染有茶色的部分表示RFP陽 性部分。將被染色的細(xì)胞為< 10%判定為RFP陰性、> 10%判定為RFP陽性。(e)RFP在大腸癌中抑制TBP-2的表達(dá)。將腫瘤組織以抗RFP抗體(紅)以及抗 TBP-2抗體(綠)進(jìn)行了染色。將細(xì)胞核用DAPK4，，6-diamino-2-phenylindole 青)進(jìn) 行了標(biāo)簽?？芍憩F(xiàn)RFP的表達(dá)的細(xì)胞中TBP-2的表達(dá)低。(f)RFP的表達(dá)與大腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。115例的大腸癌患者的全生存期 以有無RFP的表達(dá)進(jìn)行分段化，以Kaplan-Meier法進(jìn)行了解析。通過時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)發(fā)現(xiàn)RFP的表達(dá)與預(yù)后不良有顯著的關(guān)聯(lián)。圖9 表示RFP的表達(dá)和子宮體癌的預(yù)后不良之間的關(guān)聯(lián)的座標(biāo)圖。對RFP陰性 組和RFP陽性組的全生存期進(jìn)行了比較。(a)患者組全體的比較。(b)分期I的患者組的 比較。(c)分期II IV的患者組的比較。圖10 表示因RFP的表達(dá)和子宮體癌的手術(shù)方式而預(yù)后不同的座標(biāo)圖。對經(jīng) 歷廣泛式子宮切除術(shù)(Radical hysterectomy)的患者組和經(jīng)歷全子宮切除術(shù)(Total hysterectomy)的患者組的全生存期進(jìn)行了比較。(a)患者組全體的比較。(b)RFP陰性組 的比較。(C)RFP陽性組的比較。圖11 表示因RFP的表達(dá)和子宮體癌的手術(shù)方式而預(yù)后不同的座標(biāo)圖。對經(jīng)歷淋 巴結(jié)切除術(shù)(Lymphadenectomy)的患者組和未經(jīng)歷的患者組的全生存期進(jìn)行了比較。(a) 患者組全體的比較。(b)RFP陰性組的比較。(C)RFP陽性組的比較。
具體實(shí)施例方式(抗癌劑的作用增強(qiáng)劑及其用途)本發(fā)明的第1方面是有關(guān)抗癌劑的作用增強(qiáng)劑(以下，稱為“本發(fā)明的藥劑”)。本 發(fā)明的藥劑增強(qiáng)具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用。換言之，本發(fā)明的藥劑是對在靶 癌細(xì)胞中氧化應(yīng)激抵抗性增進(jìn)時(shí)效力變?nèi)趸蚴У目拱﹦┑淖饔眠M(jìn)行增強(qiáng)。本發(fā)明中“對 抗癌劑的作用進(jìn)行增強(qiáng)”或“增強(qiáng)抗癌劑的作用”是指提高抗癌劑的抗癌作用。通過將本 發(fā)明的藥劑與抗癌劑并用而提高癌的治療效果。在此的“提高治療效果”包括(1)治療效 果的增大，( 起效率乃至有效率的提高，( 副作用的降低乃至規(guī)避(根據(jù)本發(fā)明，達(dá)成 其中的至少一個(gè))?？拱﹦┑睦佑许樸f、卡鉬、奧沙利鉬等的鉬制劑、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶 (5-FU)、依托泊苷、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素。本發(fā)明人研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過將硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2(ΤΒΡ1)的表達(dá)進(jìn)行負(fù) 控制而HDACl增進(jìn)癌細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗性。為了阻止HDACl的該作用，提高癌細(xì)胞的 抗癌劑敏感性，本發(fā)明的藥劑以判明了必須向TBP-2基因啟動(dòng)子上配置HDACl的RFP作為 靶。詳細(xì)為，本發(fā)明的藥劑是以抑制RFP基因的表達(dá)或RFP的作用的化合物為有效成分。其 中，兩個(gè)用語“抑制”和“阻止”的所指意義重疊，可以替換使用。在此，本說明書中，除了可 從前后敘述必須特別區(qū)分的情況之外，統(tǒng)一使用用語“抑制”。RFP是具有環(huán)指(ring finger)結(jié)構(gòu)的核蛋白，通過與RET形成融合蛋白而作為癌 Si=If^iSft. (Takahashi, M. and Cooper, G. Μ. :rettransforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosinekinases. Mol. Cell. Biol. 7,1378-1385 (1987)(非專利文獻(xiàn)18)；非專利文獻(xiàn)16)。RFP具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄抑制活性，與各種核蛋白相互作用(Shimono， Y. , Murakami, H. , Hasegawa, Y. and Takahashi, Μ. :RFP is atranscriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb thathas dual transcriptional functions. J. Biol Chem. 275 :39411-39419. (2000)(非專利文獻(xiàn) 19) ；Shimono, Y.，Murakami, H.， Kawai, K. , Wade, P. Α. , Shimokata, K. and Takahashi, Μ. :Mi_2 associates with BRGl andRET finger protein at the distinct regions with transcriptionalactivating and repressing abilities. J. Biol. Chem. 278 :51638-51645 O003)(非專利文獻(xiàn) 20)； Shimono,K. ,Shimono,Y. ,Shimokata,K. ,Ishiguro,N. ,and Takahashi,M. :Microspherule protein 1, Mi_2β , andRET finger protein associate in the nucleolus and up—regulate ribosomalgene transcription. J. Biol. Chem. 280 :39436-39447(2005) (φ 專利文獻(xiàn)21))。報(bào)道有在癌細(xì)胞株中RFP呈高表達(dá)。但是，癌組織中的RFP的表達(dá)狀態(tài)還 未被了解。將RFP基因的序列(序列號(hào)1)、RFP的mRNA的序列(序列號(hào)2)以及RFP的氨 基酸序列(序列號(hào)3)示于序列表。如上所述，從以RFP作為靶的敲除鼠不顯示嚴(yán)重的表型 可知以RFP作為靶在安全性的方面也優(yōu)選。另外，從來源于多個(gè)種類的人的腫瘤或所檢查 的大多的腫瘤的培養(yǎng)細(xì)胞株中確認(rèn)到了高表達(dá)(未發(fā)表數(shù)據(jù)以及非專利文獻(xiàn)16)出發(fā)，可 期待對廣泛的腫瘤發(fā)揮作用。成為本發(fā)明的有效成分的抑制RFP基因的表達(dá)的化合物是抑制RFP基因的表達(dá)過 程(包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯、翻譯后調(diào)控)的化合物。該化合物的例子如下。其中，本 發(fā)明的“表達(dá)的抑制”可以是一過性抑制和長期抑制的任一個(gè)。(a)以RFP基因作為靶的s i RNA(b)在細(xì)胞內(nèi)生成以RFP基因作為靶的SiRNA的核酸構(gòu)建物(c)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的反義核酸(d)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的核酶上述(a)以及(b)是利用通過所謂的RNAi (RNA interference ；RNA干擾)的表達(dá) 抑制的化合物。換言之，根據(jù)以上述(a)或(b)的化合物為有效成分的本發(fā)明的藥劑，通過 RNAi可抑制RFP的表達(dá)。RNAi是能在真核細(xì)胞內(nèi)引起的、序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因抑制的過 程。對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi中，使用與靶mRNA的序列對應(yīng)的短序列雙鏈RNA (siRNA)。通 常，siRNA是21 23堿基對。已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有受雙鏈RNA(dsRNA)的影響的2個(gè)路 徑(序列特異性路徑以及序列非特異性路徑)。序列特異性路徑中，比較長的dsRNA被短的 干擾性RNA(即siRNA)分割。另一方面，序列非特異性路徑被認(rèn)為是只要為規(guī)定長度以上則 與序列無關(guān)地被任意的dsRNA所發(fā)動(dòng)。該路徑中dsRNA活化兩個(gè)酶，即成為活性型、通過磷 酸化翻譯起始因子eIF2而使蛋白合成全部停止的H(R，和與RNAase L活化分子的合成相關(guān) 的2' ,5'-寡腺苷酸合成酶。為了將該非特異性路徑的進(jìn)行停留在最小限度，優(yōu)選使用短 于約 30 堿基對的雙鏈 RNA (siRNA)(參照 Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250 :409-17 ； Manche et al. (1992)Mol Cell Biol 12 :5239-48 ；Minks et al. (1979)J Biol Chem 254 10180-3 ；以及 Elbashir et al. (2001)Nature411 :494-8)。為了生成靶特異性RNAi，將由與靶基因的mRNA序列的一部分相同的正義RNA以及 與其互補(bǔ)的反義RNA構(gòu)成的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，或者在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)即可。上述(a)是與前 者的方法對應(yīng)的化合物，同樣地上述(b)是與后者的方法對應(yīng)的化合物。
以靶基因(本發(fā)明中為RFP基因)作為靶的SiRNA，通常是將由與該基因的mRNA 的序列中連續(xù)的區(qū)域相同的序列形成的正義RNA和由與其互補(bǔ)的序列形成的反義RNA雜交 的雙鏈RNA。在此的“連續(xù)的區(qū)域”的長度通常為15 30堿基，優(yōu)選為18 23堿基，更優(yōu) 選為19 21堿基。已知末端具有數(shù)個(gè)堿基的突出端的雙鏈RNA發(fā)揮高RNAi效果。因此，本發(fā)明中也 優(yōu)選采用這種結(jié)構(gòu)的siRNA。形成突出端的堿基的長度沒有特別限定，優(yōu)選為2堿基(例如 TT,UU)。也可以使用由修飾的RNA形成的siRNA。在此的修飾的例子可舉出磷硫?；?、修飾 堿基(例如熒光標(biāo)記堿基)的使用。siRNA的設(shè)計(jì)以及調(diào)制可用一般法進(jìn)行。siRNA的設(shè)計(jì)中通常利用靶序列中固有 的序列(連續(xù)序列)。其中，已開發(fā)有用于選擇適合的靶序列的程序以及算法。以下，舉出以RFP基因作為靶的siRNA ^序列的例子。5' -GAGTTACTCGGGAGGGAAA-3‘(序列號(hào)4。在后述的實(shí)施例中使用的序列)5' -AACTCTTAGGCCTAACCCAGA-3 ‘(序列號(hào) 5。參照 KrutzfeldtM，Ellis M， Weekes DB,Bull JJ,Eilers Μ,Vivanco MD,Sellers WR,Mittnacht S. (2005). Selective ablation of retinoblastoma proteinfunction by the RET finger protein. Mol Cell. 18(2) :213-24.)5 ' -AAGAGAGGCUCA⑶UAUACUC-3 '(序列號(hào) 6。參照 KrutzfeldtM，Ellis M， Weekes DB,Bull JJ,Eilers M,Vivanco MD,Sellers WR,Mittnacht S. (2005). Selective ablation of retinoblastoma proteinfunction by the RET finger protein. Mol Cell. 18(2) :213-24.)5' -CCCUAUGA⑶GGGAUUGAU-3'(序列號(hào) 7。參照 Fukushige S，Kondo E，Gu Z， Suzuki H, Horii A. (2006). RET finger protein enhancesMBD2_and MBD4_dependent transcriptional repression. BiochemBiophys Res Commun. 351 (1) :85-92.Epub 2006 Oct 10.)5' -GACTCAGTGTGCAGAAAAG-3‘(序列號(hào)8。參照Zha J,Han KJ,Xu LG,He W,Zhou Q,Chen D,Zhai Z,Shu HB. (2006). The Ret fingerprotein inhibits signaling mediated by the noncanonical and canonicalIkappaB kinase family members. J Immunol. Jan 15 ； 176 (2) :1072-80.)5 ' -AGAACCAGCTCGACCATT-3 '(序列號(hào) 9。參照 iTownson SM, Kang K, Lee AV, Oesterreich S. (2006). Novel role of the RET fingerprotein in estrogen receptor-mediated transcription in MCF—7 cells. Biochem Biophys Res Commun. Oct 20 ；349 (2) :540-8. Epub 2006 Aug22.)上述(b)的“在細(xì)胞內(nèi)生成siRNA的核酸構(gòu)建物”是指將其導(dǎo)入細(xì)胞則由于細(xì)胞 內(nèi)的過程生成所希望的siRNA(引起對于靶基因的RNAi的siRNA)的核酸性分子。該核酸 構(gòu)建物的一個(gè)例子為shRNA (shorthairpin RNA)。shRNA是具有將正義RNA和反義RNA介 由環(huán)結(jié)構(gòu)部連接的結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu))，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)部被切斷成為雙鏈siRNA，從而具有 RNAi效果。環(huán)結(jié)構(gòu)部的長度沒有特別限定，通常為3 23堿基。核酸構(gòu)建物的其他例子為可表達(dá)所希望的siRNA的載體。作為這種載體可舉出由于后面的過程而變換為siRNA的表達(dá)shRNA的(插入有編碼shRNA的序列)載體 (被稱為莖環(huán)(stem loop)型或短發(fā)夾型)、分別表達(dá)正義RNA和反義RNA的載體(被 稱為串聯(lián)型)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用一般法制作這些載體(可參考Brummelkamp TR et al. (2002)Science296 :550-553 ；Lee NS et al. (2001)Nature Biotechnology 19 500-505 ；Miyagishi M & Taira K(2002)Nature Biotechnology 19 :497-500 ；Paddison PJ et al. (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :1443-1448 ；PaulCP et al. (2002)Nature Biotechnology 19 :505-508 ；Sui G et al. (2002)Proc Natl Acad Sci USA 99(8) 5515-5520 ；Paddison PJ et al. (2002)Genes Dev. 16 :948-958 等)?，F(xiàn)在，可利用各種各 樣的RNAi用載體。也可以利用這種公知的載體構(gòu)建本發(fā)明的載體。這時(shí)，準(zhǔn)備編碼所希望 的RNA(例如shRNA)的插入DNA之后，插入于載體的克隆位點(diǎn)，作為RNAi表達(dá)載體。shRNA 的具體例示于序列表的序列號(hào)110。序列號(hào)10是編碼以RFP作為靶的shRNA的單鏈寡聚核 苷酸(正義鏈)的序列。并且，只要具有在細(xì)胞內(nèi)生成對靶基因發(fā)揮RNAi作用的siRNA這樣的作用，對載 體的來源、結(jié)構(gòu)沒有限定。因此，可使用各種病毒載體(腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、仙臺(tái)病毒載體等)、非病毒載體(脂質(zhì)體、正電荷 脂質(zhì)體等)等。示出可在載體利用的啟動(dòng)子的例子，則有U6啟動(dòng)子、Hl啟動(dòng)子、tRNA啟動(dòng) 子。這些啟動(dòng)子是RNA聚合酶III類的啟動(dòng)子，可期待高表達(dá)效率。上述(c)是利用于通過反義法的表達(dá)抑制的化合物。換言之，根據(jù)以上述(C)的 化合物為有效成分的本發(fā)明的藥劑，通過反義法可抑制RFP的表達(dá)。通過反義法進(jìn)行表達(dá) 阻止時(shí)，例如在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄時(shí)，使用生成與編碼RFP的mRNA的固有部分互補(bǔ)的RNA 的反義構(gòu)建物。這種反義構(gòu)建物例如以表達(dá)質(zhì)粒的形態(tài)導(dǎo)入于靶細(xì)胞。另一方面，作為反 義·構(gòu)建物可采用在導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)時(shí)，與編碼RFP的mRNA/或基因組DNA序列進(jìn)行雜交而 阻止其表達(dá)的寡核苷酸探針。作為這種寡核苷酸探針優(yōu)選為對外切核酸酶和/或內(nèi)切核酸 酶等的內(nèi)源性核酸酶具有抵抗性的探針。作為反義核酸使用DNA分子時(shí)，優(yōu)選來源于包括編碼RFP的mRNA的翻譯起始部位 (例如-10 +10的區(qū)域)的區(qū)域的脫氧寡核苷酸。雖然優(yōu)選反義核酸與靶核酸之間的互補(bǔ)性嚴(yán)密，但多少可以存在錯(cuò)配。對靶核酸 的反義核酸的雜交能力一般依賴于兩個(gè)核酸的互補(bǔ)性的程度以及長度兩方面。通常，所使 用的反義核酸越長，即使錯(cuò)配的數(shù)多也能在靶核酸之間形成穩(wěn)定的雙鏈(或三鏈)。本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的方法確認(rèn)可容許的錯(cuò)配程度。反義核酸可以是DNA、RNA或者它們的嵌合體混合物或它們的衍生物、變異型。另 外，單鏈和雙鏈均可以。通過修飾堿基部分、糖部分、或磷酸骨架部分而能提高反義核酸的 穩(wěn)定性、雜交能力等。另外，還可以向反義核酸附加促進(jìn)細(xì)胞膜輸送的物質(zhì)(例如可參照 Letsinger et al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 :6553-6556 ；Lemaitre et al., 1987，Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :648-652 ；PCT Publication No. W088/09810, published December 15，1988)、提高對特定的細(xì)胞的親和性的物質(zhì)等。反義核酸例如可通過使用市售的自動(dòng)DNA合成裝置(例如AppliedBiosystems公 司等)等一般法進(jìn)行合成。核酸修飾體、衍生物的制作例如可以參照Mein et al. (1988)， Nucl. Acids Res. 16 3209 ；Sarin et al. , (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 7448-7451 等。為了提高靶細(xì)胞內(nèi)的反義核酸的作用，可以利用pol II、pol III這樣的強(qiáng)力啟動(dòng) 子。即，將包含這樣的啟動(dòng)子的控制下被配置的反義核酸的構(gòu)建物導(dǎo)入靶細(xì)胞，則因該啟動(dòng) 子的作用而能夠確保充分量的反義核酸的轉(zhuǎn)錄。反義核酸的表達(dá)可通過已知作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選為人細(xì)胞)的任意啟動(dòng)子 (誘導(dǎo)性啟動(dòng)子或結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子)而進(jìn)行。例如，可使用SV40初期啟動(dòng)子區(qū)域(Bernoist and Chambon，1981 ,Nature 290 :304-310)、來源于Rous肉瘤病毒的3‘末端區(qū)域的啟動(dòng)子 (Yamamoto et al.，1980，Cell 22 :787-797)、皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子(Wagner et al.，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :1441-1445)等的啟動(dòng)子。本發(fā)明的一個(gè)方式中，使用利用核酶的表達(dá)抑制(上述(d)的化合物的情況)。使 用以部位特異性識(shí)別序列使mRNA裂解的核酶，能使靶mRNA降解，優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘 頭狀核酶的構(gòu)建方法例如可參考 Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334 :585_591。與利用反義法的情況同樣地，例如以提高穩(wěn)定性、靶能力為目的，可使用經(jīng)修飾的 寡核苷酸構(gòu)建核酶。為了在靶細(xì)胞內(nèi)生成有效量的核酶，例如優(yōu)選使用在強(qiáng)力啟動(dòng)子(例 如pol II, pol III)的控制下配置了編碼該核酶的DNA的核酸構(gòu)建物。本發(fā)明的一個(gè)方式中，以抑制RFP的作用的化合物為有效成分。本發(fā)明人研究的 結(jié)果(參照后述的實(shí)施例)，發(fā)現(xiàn)RFP介由與HDACl之間的物理性且功能上相互作用，與由 HDACl導(dǎo)致的氧化應(yīng)激敏感性的控制相關(guān)聯(lián)?；谠撘娊?，該方式的藥劑抑制RFP與HDACl 的相互作用，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)抗癌劑的作用。只要是能夠抑制RFP與HDACl的相互作用，則對化合 物的種類沒有限制。本發(fā)明人研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HFACl的N末端側(cè)，與RFP的Coild-coil結(jié) 構(gòu)域以及RfP結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，以能夠阻止該結(jié)合的化合物作為有效成分使用即可。例 如，可采用與RFP的Coild-coil結(jié)構(gòu)域或Rfp結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的抗體。對抗體的種類、形 態(tài)沒有特別的限定。可以是多克隆抗體、寡克隆抗體以及單克隆抗體的任一個(gè)。另外，可以 使用嵌合體抗體(例如人和小鼠的嵌合體)、人源化抗體、人抗體等。進(jìn)而還可以使用Fab、 Fab'、F(ab' ) 2、scFv、dsFv 等的抗體片段。作為有效成分的抗體可通過使用將HDACl或RFP或它們的一部分(優(yōu)選為與相互 作用相關(guān)的部位)作為抗原利用的免疫學(xué)的方法，噬菌體展示法、核糖體展示法等而調(diào)制。也可以將與RFP競爭性地對HDACl的N末端側(cè)進(jìn)行結(jié)合的化合物作為有效成分。 這種化合物的例子可舉出RFP的Coild-coil結(jié)構(gòu)域樣聚肽、Rfp結(jié)構(gòu)域樣聚肽。并且，也可以不是以抗體自身作為有效成分，而是以細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)所希望的抗體 的載體作為有效成分?？贵w以外的化合物也同樣。本發(fā)明的藥劑的制劑化可基于一般法進(jìn)行。進(jìn)行制劑化時(shí)，可含有制劑上容許的 其它成分(例如，載體、賦形劑、降解劑、緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、麻醉劑、穩(wěn)定劑、保存齊U、 防腐劑、生理食鹽水等)。作為賦形劑可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。 作為降解劑可使用淀粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑可使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙 酸鹽等。作為乳化劑可以使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、黃芪膠等。作為懸浮劑可使用單硬脂 酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二醇硫酸鈉等。作為 麻醉劑可使用苯甲醇、氯代丁醇、山梨糖醇等。作為穩(wěn)定劑可使用丙二醇、二乙基亞硫酸鹽、 抗壞血酸等。作為保存劑可使用苯酚、苯扎氯銨、苯甲醇、氯代丁醇、羥苯甲酯等。作為防腐劑可使用苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯代丁醇等。對制劑化時(shí)的劑型也沒有特別限定。劑型例子有錠劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、膠囊 劑、口服液、注射劑、外用藥以及栓劑。本發(fā)明的藥劑中，為了得到所期待的治療效果(或預(yù)防效果)含有必要量(即治 療上有效的量)的有效成分。本發(fā)明的藥劑中的有效成分量一般因劑型而不同，以能夠?qū)?現(xiàn)所希望的給藥量的方式，例如將有效成分量設(shè)定在約0. 1重量％ 約95重量％的范圍 內(nèi)。本發(fā)明的藥劑根據(jù)其劑型通過經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥(靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、皮 內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)注射、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、經(jīng)粘膜等)而應(yīng)用于對象。這些給藥路徑并不相互排 斥的，也可以并用任意選擇的兩種以上(例如，經(jīng)口給藥的同時(shí)或經(jīng)過規(guī)定時(shí)間后進(jìn)行靜 脈注射等)。以核酸構(gòu)建物作為有效成分時(shí)(例如利用RNAi的方式)，并不局限于活體內(nèi)給藥， 也可以采用離體給藥。對于本發(fā)明的藥劑的給藥“對象”沒有特別限定，包括人以及人以外的哺乳動(dòng)物 (包括寵物動(dòng)物、家畜、試驗(yàn)動(dòng)物。具體例如有小鼠、大鼠、土撥鼠、倉鼠、猴子、牛、豬、山羊、 綿羊、狗、貓、雞、鵪鶉等)。優(yōu)選的一個(gè)方式中本發(fā)明的藥物適用于人。給藥量根據(jù)患者的癥狀、年齡、性別以及體重等而不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)定適 宜適當(dāng)?shù)慕o藥量。給藥計(jì)劃表的設(shè)定中可以考慮患者的癥狀、藥劑的效果持續(xù)時(shí)間等。本發(fā)明的藥劑與抗癌劑并用。即，將本發(fā)明的藥劑與抗癌劑一并給藥。典型的是 準(zhǔn)備本發(fā)明的藥劑和規(guī)定的抗癌劑，將兩者向?qū)ο蠼o藥。此時(shí)，對于對象，同時(shí)或隔規(guī)定時(shí) 間的間隔將兩個(gè)藥劑給藥(應(yīng)用)。在此，“同時(shí)”并不要求嚴(yán)格的同時(shí)性。因此，該“同時(shí)” 自然包括混合兩個(gè)藥劑后向?qū)ο蠼o藥等的在兩者的給藥沒有時(shí)間差的條件下實(shí)施的情況， 也包括單方給藥后，迅速將另一方給藥等的在兩個(gè)藥劑的給藥基本沒有時(shí)間差的條件下實(shí)施 的情況。優(yōu)選為考慮本發(fā)明的藥劑發(fā)揮作用為止所需的時(shí)間，將本發(fā)明的藥劑給藥之后，過規(guī) 定的時(shí)間再將抗癌劑給藥。在此的規(guī)定的時(shí)間例如為1小時(shí) 72小時(shí)(具體例為48小時(shí))。 如此地將本發(fā)明的藥劑先行給藥，則容易發(fā)揮基于本發(fā)明的作用，具有良好的治療效果。并且，也可以準(zhǔn)備混合了本發(fā)明的藥劑和抗癌劑的配合劑，將其向?qū)ο蠼o藥。將本發(fā)明的藥劑與抗癌劑并用給藥，則在靶癌細(xì)胞內(nèi)抑制RFP基因的表達(dá)或RFP 的作用。由此，對由HDACl導(dǎo)致的TBP-2的表達(dá)抑制進(jìn)行抑制甚至消除，其結(jié)果，提高靶癌 細(xì)胞的氧化應(yīng)激敏感性。如此地形成抗癌劑容易起效的狀態(tài)，即形成降低了對抗癌劑的耐 性的狀態(tài)，所以，提高抗癌劑的治療效果。本發(fā)明的藥劑可期待對各種各樣的癌的應(yīng)用。成為本發(fā)明的藥劑的靶的癌可以例 示食道癌、口腔癌、上顎癌、喉頭癌、咽頭癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞 癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱乳頭狀癌、前列腺癌、尿道扁平上皮癌、骨原性肉瘤、軟骨肉 瘤、滑膜肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、扁平上皮癌、惡性黑色素瘤 (melanoma)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳癌、乳房肉瘤、子宮上皮內(nèi)癌、子宮頸部 扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮肉瘤、卵巢癌、惡性黑色素瘤(melanoma)、甲狀腺乳頭狀腺癌、 甲狀腺濾泡狀腺瘤、急性髓細(xì)胞白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白 血病、急性單核細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性未分化型白血病、慢性骨髓細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病。并用的抗癌劑只要是具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力，就沒有特別的限定。例示抗癌劑則 有順鉬、卡鉬、奧沙利鉬等的鉬制劑、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶(5-FU)、依托泊苷、阿霉素、博來霉 素、絲裂霉素。也可以將2種以上的抗癌劑并用?？拱﹦┑慕o藥量是以將其單獨(dú)使用時(shí)的 使用量(即，通常的使用量)為準(zhǔn)。但是，由于通過與本發(fā)明的藥劑并用而能夠期待增強(qiáng)抗 癌劑的作用，所以可以將給藥量設(shè)定成低于通常的給藥量。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮 患者的病狀、年齡、性別、體重等而設(shè)定“通常的使用量”。(抗癌劑耐性檢測法)本發(fā)明人研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RFP的高表達(dá)與人的大腸癌中的TBP-2的表達(dá)的下降、 大腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)(參照后述的實(shí)施例)?；谠撘娊?，本發(fā)明的第2方面是提 供利用RFP基因的表達(dá)量的抗癌劑耐性檢測法(以下稱為“本發(fā)明的檢測法”)。進(jìn)行本發(fā) 明的檢測法則能夠判定癌細(xì)胞的抗癌劑耐性。判定結(jié)果例如被利用于治療方針的確定(有 效的治療法的選擇等)。通過利用判定結(jié)果而能實(shí)現(xiàn)治療效果的提高、預(yù)后改善、患者的生 存質(zhì)量OiOL)的提高等。如此地，本發(fā)明的檢測法對癌治療提供極為有用的信息。本發(fā)明的檢測法中進(jìn)行如下的步驟。即，檢查從活體分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá) 量的步驟(檢測步驟)，以及基于所述步驟的結(jié)果判定對具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑 的所述癌細(xì)胞的耐性的步驟(判定步驟)。 檢測步驟中，首先準(zhǔn)備從活體分離的癌細(xì)胞?！皬幕铙w分離的，，是指通過摘取被檢 測癌細(xì)胞所存在的活體組織的一部分而使被檢測癌細(xì)胞與其來源活體完全隔離的狀態(tài)。只 要滿足該條件，可以是與周圍的細(xì)胞一起形成組織的狀態(tài)的癌細(xì)胞(即，組織片的狀態(tài))， 也可以是從周圍的細(xì)胞分離的狀態(tài)的癌細(xì)胞。關(guān)于前者，例如以進(jìn)行活組織檢查(biopsy) 時(shí)的要領(lǐng)調(diào)制細(xì)胞即可，關(guān)于后者，例如以細(xì)胞檢查時(shí)的要領(lǐng)調(diào)制細(xì)胞即可。接著檢查所準(zhǔn)備的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量。RFP表達(dá)量通常是通過與對照(比較 對照)的比較而計(jì)算。對照可以使用以預(yù)先知道了 RFP表達(dá)量的各種癌細(xì)胞、將被檢測癌 細(xì)胞從活體采取時(shí)混于被檢測癌細(xì)胞中被采取的正常細(xì)胞。對于RFP表達(dá)量無需進(jìn)行嚴(yán)格 的定量，只要能夠檢測到通過與對照比較而能夠評價(jià)被檢測癌細(xì)胞對抗癌劑的耐性的程度 的RFP表達(dá)量即可。并且，根據(jù)通例，將被檢測癌細(xì)胞中確認(rèn)到RFP的表達(dá)的情況還表示 為RFP陽性或RFP+(positive)，將被檢測癌細(xì)胞中未確認(rèn)到RFP的表達(dá)的情況表示為RFP 陰性或RFP-Oiegative)。在以免疫組織化學(xué)測定被檢測癌細(xì)胞的RFP表達(dá)量時(shí)(詳細(xì)如 后述)，例如，在10%以上的被檢測癌細(xì)胞中確認(rèn)到染色性時(shí)(即，被染色的細(xì)胞的比例為 10%以上時(shí))作為RFP陽性(或RFP+)。將區(qū)分陽性和陰性的臨界值(以被染色的細(xì)胞的 比例表示)可根據(jù)檢測法、檢測條件等而適當(dāng)設(shè)定即可。例如，可以在5% 30%之間設(shè)定 臨界值。RFP的表達(dá)量是以蛋白質(zhì)水平或mRNA水平進(jìn)行檢測。若要求高精度則優(yōu)選前者。 將RFP表達(dá)量以蛋白水平進(jìn)行檢測時(shí)，即作為RFP表達(dá)量檢測RFP蛋白量時(shí)，雖然不受此限 制但優(yōu)選利用免疫蛋白印跡法、免疫組織化學(xué)測定(免疫染色)。根據(jù)免疫組織化學(xué)測定， 則能夠同時(shí)檢查出被檢測癌細(xì)胞的形態(tài)、分布狀態(tài)等，可同時(shí)得到附加的信息。免疫組織化學(xué)測定中是使用將RFP特異性識(shí)別的抗體(抗RFP抗體)，將該抗體 的結(jié)合性(結(jié)合量)作為指標(biāo)檢查RFP蛋白量。使用了抗RFP抗體的免疫組織化學(xué)測定例如可通過 ABC (Avidin-Biotin Complex)法、PAP (Peroxydase-anti-Peroxydase Complex) 法、LAB (Linked Avidin-Biotin)法、LSAB (Linked Streptavidin-Biotin)法等進(jìn)行。所述 各方法的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案屬于公知技術(shù)(例如參照“酶抗體法、改訂第3版”、渡邊慶一、中 根一穗編、學(xué)際企畫)。對于免疫組織化學(xué)測定所使用的抗RFP抗體的種類、來源等沒有特別的限定。優(yōu) 選使用單克隆抗體，但只要是具有充分的特異性且能檢測RFP，則也可以使用寡克隆抗體 (數(shù)種 數(shù)十種的抗體的混合物)或多克隆抗體。也可以使用Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、 dsFv抗體等的抗體片段?？筊FP抗體可通過利用免疫學(xué)的方法、噬菌體展示法、核糖體展示 法等而調(diào)制。另夕卜，在文獻(xiàn)"Shimono,Y. et al. RET finger protein is atranscriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb thathas dual transcriptional functions. J Biol Chem. 275 (50) :39411-9 Q000) ” 中記載有抗 RFP 抗體(兔多克隆)的 調(diào)制法及其使用例，可供參考。下面，表示免疫組織化學(xué)測定的方法、步驟的一例。(1)固定、石蠟包埋將從活體(剖檢病例的情況時(shí)為尸體)采取的組織用福爾馬林、仲甲醛等進(jìn)行固 定。其后進(jìn)行石蠟包埋。一般用乙醇進(jìn)行脫水后以二甲苯處理，最后用石蠟進(jìn)行包埋。將 以石蠟包埋的標(biāo)本切片成所希望的厚度(例如3 5μπι)，玻片上展開。并且，有時(shí)也有代 替石蠟包埋標(biāo)本使用凍結(jié)標(biāo)本的情況。(2)脫石蠟一般以二甲苯、乙醇以及凈化水的順序進(jìn)行處理。(3)前處理(抗原的活化)根據(jù)需要，為了活化抗原進(jìn)行酶處理、加熱處理和/或加壓處理等。(4)內(nèi)源性過氧化物酶的除去作為染色時(shí)的標(biāo)記物質(zhì)使用過氧化物酶時(shí)，預(yù)先通過過氧化氫水進(jìn)行處理除去內(nèi) 源性過氧化物酶活性。(5)非特異性反應(yīng)的阻止將切片用牛血清白蛋白溶液(例如溶液)處理數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘左右，阻止非 特異性反應(yīng)。并且，也可以使用含牛血清白蛋白的抗體溶液進(jìn)行下面的一級(jí)抗體反應(yīng)，從而 省略該工序。(6) 一級(jí)抗體反應(yīng)將稀釋為適當(dāng)濃度的抗體在玻片上的切片上滴下，其后進(jìn)行數(shù)十分鐘 數(shù)小時(shí)的 反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以磷酸緩沖液等適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行清洗。(7)標(biāo)記試劑的添加作為標(biāo)記物質(zhì)頻繁使用過氧化物酶。將結(jié)合了過氧化物酶的二級(jí)抗體在玻片上的 切片上滴下，其后進(jìn)行數(shù)十分鐘 數(shù)小時(shí)的反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以磷酸緩沖液等適當(dāng)?shù)木彌_ 液進(jìn)行清洗。(8)顯色反應(yīng)Tris緩沖液中溶解DAB (3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺)。接著添加過氧化氫水。用如此 調(diào)制的顯色用溶液將切片浸透數(shù)分鐘(例如5分鐘)，進(jìn)行顯色。顯色后，將切片用自來水充分清洗，去除DAB。(9)核染色將Mayer蘇木精液反應(yīng)數(shù)秒 數(shù)十秒進(jìn)行核染色。用自來水清洗染固(通常為數(shù) 分鐘)。(10)脫水、滲透、密封用乙醇進(jìn)行脫水之后，用二甲苯進(jìn)行滲透處理，最后用合成樹脂、甘油、橡膠漿等 進(jìn)行密封。以mRNA水平檢查RFP表達(dá)量時(shí)的mRNA的檢測/測定中可利用RT-PCR(Molecular Cloning, Third Edition,8. 46, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)、RNA 印跡(Northern blot)法(MolecularCloning, Third Edition, 7. 42, Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)、斑點(diǎn)印跡法(Molecular Cloning, Third Edition, 7. 46, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)、使用 DNA 芯片(DNA Array)的方法、原位雜 交等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于RFP的序列(NCBI的數(shù)據(jù)庫、Accession :RFPNM_006510、 DEFINITION =Homo sapiens tripartitemotif-containing 27(TRIM27), mRNA. ()ψ Π
2))，通過一般法設(shè)計(jì)適于各方法的核酸引物或核酸探針。在判定步驟中，基于檢測步驟的結(jié)果，即基于RFP表達(dá)量判定對具有氧化應(yīng)激誘 導(dǎo)效力的抗癌劑的癌細(xì)胞的耐性。以下表示基于RFP表達(dá)量的評價(jià)的具體例。預(yù)先設(shè)定使RFP表達(dá)量與抗癌劑耐性相關(guān)聯(lián)的多個(gè)評價(jià)區(qū)。然后基于在檢測步驟 中得到的RFP表達(dá)量，確定被檢測癌細(xì)胞所屬的評價(jià)區(qū)。作為關(guān)于評價(jià)區(qū)的設(shè)定的具體例 下面表示了著眼于有無RFP的表達(dá)的例子(例1)和著眼于RFP的表達(dá)量的程度的例子(例 2)。其中，以區(qū)名與該區(qū)相關(guān)聯(lián)的RFP表達(dá)量與該區(qū)相關(guān)聯(lián)的評價(jià)結(jié)果的順序進(jìn)行記載?！蠢?>區(qū)1 :RFP陽性抗癌劑耐性區(qū)2 =RFP陰性抗癌劑敏感性< M 2>區(qū)1 未確認(rèn)到RFP的表達(dá)抗癌劑敏感性區(qū)2 確認(rèn)到弱RFP的表達(dá)對抗癌劑的耐性低區(qū)3 確認(rèn)到中度的RFP的表達(dá)對抗癌劑的耐性為中度區(qū)4 確認(rèn)到強(qiáng)RFP的表達(dá)對抗癌劑的耐性高評價(jià)區(qū)的數(shù)、與各評價(jià)區(qū)相關(guān)聯(lián)的RFP表達(dá)量以及評價(jià)結(jié)果均不受上述例的任何 限制，可通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)等而任意設(shè)定。并且，本發(fā)明的判定·評價(jià)并不依賴醫(yī)生、檢測人員 等具有專業(yè)知識(shí)的人員的判斷，能夠全部自動(dòng)、機(jī)械性地進(jìn)行。如上所述，可以利用根據(jù)本發(fā)明的檢測法的判定結(jié)果的結(jié)果確定治療方針。表示 一例，則若得到“具有抗癌劑耐性”的判定結(jié)果、“對抗癌劑的耐性高”的判定結(jié)果時(shí)，能夠 預(yù)測單獨(dú)的抗癌劑無法發(fā)揮所希望的治療效果。這時(shí)將本發(fā)明的藥劑與抗癌劑并用給藥， 增強(qiáng)抗癌劑的作用將成為有效的治療方針。另一方面，得到“具有抗癌劑敏感性”的判定結(jié) 果、“對抗癌劑的耐性低”的判定結(jié)果時(shí)，能夠預(yù)測僅通過抗癌劑也能發(fā)揮所期待的治療效 果。這種情況下，將抗癌劑單獨(dú)給藥成為治療方針選擇之一。但強(qiáng)抗癌劑的作用而進(jìn)一步提高治療效果，也可以將本發(fā)明的作用增強(qiáng)劑并用給藥。(預(yù)后推定用生物標(biāo)記物及其用途)本發(fā)明人研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RFP的高表達(dá)與大腸癌患者、子宮體癌患者的預(yù)后不 良相關(guān)聯(lián)(參照后述的實(shí)施例)?；谠撘娊?，本發(fā)明的第3方面是提供含有RFP的癌患者 的預(yù)后推定用標(biāo)記物。該生物標(biāo)記物在把握癌患者的預(yù)后上有用。另外，也成為確定手術(shù) 方式時(shí)的指針。例如，在從子宮體癌的患者采取的試樣(癌細(xì)胞)中確認(rèn)到RFP的表達(dá)時(shí) (例如免疫染色中判斷為陽性時(shí))，可以判定為優(yōu)選采用更積極的手術(shù)方式。作為更積極的 手術(shù)方式可以舉出廣泛式子宮切除術(shù)、淋巴結(jié)廓清術(shù)。該方面中，作為上述生物標(biāo)記物的用途還提供癌患者的預(yù)后推定法。根據(jù)本發(fā)明 的預(yù)后推定法，能夠得到對癌患者的預(yù)后推定有益的信息。該信息例如被利用于治療方針 的確定(有效的治療法的選擇等)。通過利用判定結(jié)果而能夠?qū)崿F(xiàn)治療效果的提高、預(yù)后改 善、患者的生存質(zhì)量OiOL)的提高等。下面，對該方面的發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，其中對于與第1方面或第2方面共同的事項(xiàng) 將援用第1方面或第2方面中的說明。本說明書中，“癌患者的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物”是 指成為癌患者的預(yù)后推定的指標(biāo)的活體分子。對于“癌”的種類沒有特別限定。并且，在患 有大腸癌或子宮體癌的患者的預(yù)后推定中本發(fā)明的生物標(biāo)記物尤其有用。本發(fā)明的預(yù)后推定法中，將本發(fā)明的生物標(biāo)記物用作判定指標(biāo)。具體的是將從癌 患者分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量作為指標(biāo)，預(yù)測癌患者的預(yù)后。更具體的是實(shí)施檢測從 癌患者分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量的步驟(檢測步驟)以及基于檢測結(jié)果預(yù)測預(yù)后的步 驟(預(yù)后推定步驟)。在此的檢測步驟以與上述第2方面的檢測步驟同樣地實(shí)施即可。其 中，癌患者的例是患有大腸癌或子宮體癌的患者。預(yù)后推定步驟中，將癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量作為指標(biāo)推定預(yù)后?；旧喜捎肦FP 表達(dá)量多則預(yù)后不良這樣的判斷基準(zhǔn)。以下，表示根據(jù)RFP表達(dá)量的評價(jià)的具體例。預(yù)先設(shè)定使RFP表達(dá)量和預(yù)后相關(guān)聯(lián)的多個(gè)評價(jià)區(qū)。然后基于檢測步驟中得到的 RFP表達(dá)量，確定被檢測癌細(xì)胞所屬的評價(jià)區(qū)。作為有關(guān)評價(jià)區(qū)的設(shè)定的具體例，下面表示 了著眼于有無RFP的表達(dá)的例子(例1)和著眼于RFP的表達(dá)量的程度的例子(例2)。其 中，以區(qū)名與該區(qū)相關(guān)聯(lián)的RFP表達(dá)量與該區(qū)相關(guān)連的評價(jià)結(jié)果的順序進(jìn)行記載?！蠢?>區(qū)1:RFP陽性預(yù)后差區(qū)2 :RFP陰性預(yù)后良好< M 2>區(qū)1 未確認(rèn)到RFP的表達(dá)預(yù)后良好區(qū)2 確認(rèn)到弱RFP的表達(dá)預(yù)后比較良好區(qū)3 確認(rèn)到中度的RFP的表達(dá)預(yù)后比較差區(qū)4 確認(rèn)到強(qiáng)RFP的表達(dá)預(yù)后差評價(jià)區(qū)的數(shù)、與各評價(jià)區(qū)相關(guān)聯(lián)的RFP表達(dá)量以及評價(jià)結(jié)果均不受上述例的任何 限制，可通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)等而任意設(shè)定。并且，本發(fā)明的判定·評價(jià)并不依賴醫(yī)生、檢測人員 等具有專業(yè)知識(shí)的人員的判斷，能夠全部自動(dòng)、機(jī)械性地進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步還提供癌患者的預(yù)后推定用試劑以及癌患者的預(yù)后推定用試劑盒。本發(fā)明的試劑含有抗RFP抗體。關(guān)于抗RFP抗體的種類、來源將援用第2方面中所對應(yīng)的 說明。作為抗RFP抗體使用標(biāo)記化抗體，則將標(biāo)記量作為指標(biāo)能夠直接檢測結(jié)合抗體量。 因此，能夠構(gòu)建更為簡便的檢測法。反之還具有需要準(zhǔn)備結(jié)合了標(biāo)記物質(zhì)的抗RFP抗體且 檢測敏感度通常變低這樣的問題。因此，優(yōu)選使用利用結(jié)合了標(biāo)記物質(zhì)的二次抗體的方法、 利用結(jié)合了二次抗體與標(biāo)記物質(zhì)的聚合物的方法等的間接檢測的方法。在此的二次抗體 是對抗RFP抗體具有特異結(jié)合性的抗體，例如將抗RFP抗體作為兔抗體調(diào)制時(shí)可使用抗兔 IgG抗體。市場上銷售有作為可對兔、山羊、小鼠等各種的抗體使用的標(biāo)記二次抗體(例如 Funakoshi公司、COSMO BIO公司等)，可根據(jù)本發(fā)明的試劑適宜選擇適當(dāng)?shù)目贵w。標(biāo)記物質(zhì)的例有過氧化物酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸 酶、β -D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶以及葡萄醣6-磷酸脫氫酶等的酶，異硫氰酸熒光素 (FITC)、四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)以及銪等的熒光物質(zhì)、魯米諾(luminol)、異魯 米諾(isoluminol)以及吖啶脂(Acridinium)衍生物等的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，NAD等的輔酶，生 物素、mI以及125I等的放射性物質(zhì)。一個(gè)方式中，本發(fā)明的試劑與其他的用途結(jié)合被固相化。固相化所用的不溶性支 撐體沒有特別限定。例如可以使用聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、硅樹脂、尼龍樹脂等的樹 脂，由玻璃等的對水不溶性物質(zhì)形成的不溶性支撐體?？贵w向不溶性支撐體的搭載可通過 物理吸附或化學(xué)吸附而進(jìn)行。本發(fā)明的試劑盒作為主要構(gòu)成要素含有本發(fā)明的試劑。可以在試劑盒中包含實(shí)施 檢測法時(shí)所使用的其他的試劑(緩沖液、阻斷用試劑、酶的底物、顯色試劑等)和/或裝置 乃至器具(容器、反應(yīng)裝置、熒光儀等)。另外，優(yōu)選作為標(biāo)準(zhǔn)樣品在試劑盒中含有RFP。并 且，本發(fā)明的試劑盒中通常還附加有操作說明書。實(shí)施例在HDACi通過控制細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)理而使癌細(xì)胞變成抗癌劑敏感性這一設(shè)想 下，實(shí)施了以下的實(shí)驗(yàn)。1.材料以及方法(1)質(zhì)粒pCDNA3-HDACl-Flag是由川口博士(愛知縣身心障礙者克隆)提供的。將全長 NF-YA、NF-YB、NF-YC、HDAC1、HDACl 缺失片段以及 TBP_2cDNA 向 pcDNA3. l/V5-His_T0P0載體 進(jìn)行了克隆。按照操作說明書進(jìn)行了操作。將從pcDNA3. 1/V5-His-HDACl切取的HDAClcDNA 插入于pcDNA3. 1/myc-His載體。pFlag-RFP構(gòu)建物如下所述(參考文獻(xiàn)20)。將RFP cDNA 插入pEGFP-Cl載體。(2) RNAiHDACl siRNA 是從 Dhamacon 公司，siRFP、siTBP-2、siNF-YC 是從 QIAGEN 公司購 得的。siRNA是用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)導(dǎo)入于細(xì)胞內(nèi)的。合成了編碼為進(jìn)行 利用shRNA的敲除而以RFP作為靶的shRNA的單鏈寡核苷酸及其互補(bǔ)序列(下面表示正義 鏈)。shRFP 5’-GATCGAGTTACTCGGGAGGGAAATTCAAGAGATTTCCCTCCCGAGTAACTCTTTTTTGGA AA-3，(序列號(hào)10)將該互補(bǔ)的寡核苷酸對插入于pSilencer3. I-Hl neo vector (Ambion)，作為ShRNA表達(dá)載體使用。(3) shRNA穩(wěn)定表達(dá)株的制作將上述的shRNA表達(dá)載體使用Lipofectamine 2000向HeLa細(xì)胞導(dǎo)入，以新霉素 進(jìn)行了 2周的選擇。(4)細(xì)胞生存率的計(jì)測將8X IO3的細(xì)胞播于96孔板，M小時(shí)后用H2A (10小時(shí))或順鉬Q4小時(shí))以所 述濃度進(jìn)行了處理。生存率的計(jì)測是通過使用WST-I法(Roche)進(jìn)行的。座標(biāo)圖是以未處 理的細(xì)胞的值作為1而顯示相對值。(5) RT-PCR使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN公司)，從用siRNA轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞調(diào)制了 全 RNA。使用 Superscript II (Invitrogen 公司)調(diào)制了 cDNA 轉(zhuǎn)錄物。RT-PCR 中 使用了 HDACl 特異性引物(正義5’ -CTCCTGTTTTTTTCAGGCTCC-3’(序列號(hào) 11)、 反義5，-AGGAGAAGACAGACAGAGGGC-3，(序列號(hào)12))、RFP特異性弓丨物(正義 5，-TGCTCGACTGCGGCCATAAC-3，(序列號(hào) 13)、反義5’ -TCGGTGCGCAGCTGCTTTAC-3，(序 列號(hào) 14))、TBP-2 特異性引物(正義5，-TGAGATGGTGATCATGAGACC-3，(序列號(hào) 15)、 反義5，-GTATTGACATCCACCAGATCC-3‘(序列號(hào) I6))GAPDH 特異性引物(正義 5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3，(序列號(hào) 17)、反義5，-GAGATGATGACCCTTTTGGCTC-3，(序 列號(hào)1幻)。(6)免疫沉淀以及免疫蛋白印跡將細(xì)胞用冰冷的PBS清洗2次之后，用含蛋白酶抑制劑的溶解緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4,120mM NaCl,5mM MgCl2,0. 8% Nonidet P-40，10%甘油，ImM DTT 禾口 ImM PMSF)溶解。將溶解產(chǎn)物超聲波處理后，用各抗體進(jìn)行了免疫沉淀。將提純的正常兔抗體或 抗HA標(biāo)簽抗體作為對照使用。利用電泳的分離以及免疫蛋白印跡是按照所述的方法(參 考文獻(xiàn)20)進(jìn)行的。在使用兔多克隆抗體的免疫蛋白印跡中使用了 Relia Blot (Bethyl Laboratories)0(7)染色質(zhì)免疫沉淀(Chip)試驗(yàn)按照所述的方法進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)(參考文獻(xiàn)28)。若簡單說明則將以 甲醛進(jìn)行了交聯(lián)的染色質(zhì)進(jìn)行超聲波處理，將所得的染色質(zhì)片段用抗HDACl抗體、抗乙酰 化H3抗體、抗乙酰化H4抗體、抗RFP抗體或抗NFYB抗體進(jìn)行了免疫沉淀。將提純的正常 兔或小鼠IgG作為對照使用。將5M NaCl以最終濃度成為0. 2M的方式添加后，在65°C下8 小時(shí)培養(yǎng)進(jìn)行了脫交聯(lián)。將提純DNA以及全細(xì)胞DNA用PCR(32 37循環(huán))進(jìn)行了擴(kuò)增。(8)活體內(nèi)的抗癌劑治療的模型將對照或RFP的shRNA的穩(wěn)定表達(dá)株移植到7周齡的雌裸鼠的背部。在腫瘤的體 積到達(dá)50mm3的時(shí)間點(diǎn)上將小鼠隨機(jī)分為順鉬治療組和未治療組。將用量lmg/kg的順鉬 或溶劑(生理食鹽水對照)每4天對小鼠的腹腔內(nèi)給藥。腫瘤的體積是使用游標(biāo)尺測定 腫瘤直徑，通過下式進(jìn)行了計(jì)算。體積=(長徑X短徑X短徑)/2(9)免疫組織化學(xué)測定本次實(shí)驗(yàn)中使用了以福爾馬林進(jìn)行固定并石蠟包埋的大腸癌的組織切片。將標(biāo)本在二甲苯中進(jìn)行脫石蠟處理，通過在階梯性稀釋的乙醇中依次浸泡而親水化。使用ftOtein Blocking Agent(UltraTech HRPStreptavidin-Biotin Detection System, Beckman Coulter)進(jìn)行非特異性信號(hào)的抑制處理。進(jìn)而，以3%過氧化氫水進(jìn)行了內(nèi)源性過氧化物 酶的非活化處理。在含0. 5% NP-40的檸檬酸緩沖液(ρΗ7. 0)中浸泡，進(jìn)行121°C、10分 鐘的高壓釜處理進(jìn)行了抗原的活化。將樣品與抗RFP兔多克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)后，與生物素 化的山羊的二次抗體進(jìn)行了反應(yīng)。進(jìn)而，使附加了過氧化物酶的鏈霉親和素反應(yīng)，使用3， 3' -二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DA^顯色。在10%以上的細(xì)胞中確認(rèn)到茶色的染色的標(biāo)本 判定為RFP陽性。使用統(tǒng)計(jì)解析軟件Mat View,通過Kaplan-Meier法研究了 RFP的表達(dá)與大腸癌 患者的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)性。(10)免疫熒光染色將上述的大腸癌組織標(biāo)本在二甲苯中進(jìn)行脫石蠟處理，通過在階梯性稀釋的乙醇 中依次浸泡而親水化。檸檬酸緩沖液(PH6.0)中進(jìn)行10分鐘的微波處理使抗原活化。通 過將樣品以BSA處理而抑制了非特異性信號(hào)的檢出。將樣品與抗RFP兔多克隆抗體和 抗TBP-2小鼠單克隆抗體反應(yīng)后，使附加了 Alexa Fluor 594的抗兔IgG抗體以及附加了 Alexa Fluor 488的抗小鼠IgG抗體反應(yīng)。將細(xì)胞核用DAPI進(jìn)行了染色。在玻片上放上封 片劑作為標(biāo)本，使用聚焦顯微鏡進(jìn)行了觀察和撮影。(11)子宮體癌的患者將從1992 2007年間在名古屋大學(xué)醫(yī)院接受治療的子宮體癌患者中采取的樣 品(119試樣)，在知情同意下用于實(shí)驗(yàn)?；颊叩哪挲g為觀 86歲(平均年齡57歲)。不 包括接受了新輔助化療的患者。所有患者經(jīng)歷過全子宮切除術(shù)、廣泛式子宮切除術(shù)和雙 側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)中的任一個(gè)。另外，72名的患者進(jìn)行過淋巴結(jié)廓清。按照1998年的 FigO(International Federation of Gynecology and Obstetrics)分期標(biāo)準(zhǔn)，石角定了各患 者的分期。分期I為72名，分期II為16名，分期III為M名，分期IV為7名。組織學(xué)的 分級(jí)是按照世界保健機(jī)構(gòu)的基準(zhǔn)進(jìn)行的。Gl為50名、G2為51名、G3為18名。2.結(jié)果·考察首先研究了 HDACi是否影響HeLa細(xì)胞對氧化應(yīng)激的敏感性。在經(jīng)屬于代表性的 HDACi的Trichostatin A(TSA)的處理的HeLa細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)對作為氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑的H2A 的敏感性得到增進(jìn)(圖la)。為了探明有關(guān)該HDACi導(dǎo)致的敏感性的增進(jìn)的分子機(jī)理，著 眼于HDACl進(jìn)行了研究。將HDACl用siRNA敲除，則H2A和順鉬的細(xì)胞毒性作用顯著增進(jìn) (圖Ib d)。由此可知，HDACi可能是介由抑制HDACl的作用而增進(jìn)氧化應(yīng)激敏感性。關(guān) 于由HDACl導(dǎo)致的應(yīng)激敏感性的控制的分子機(jī)理，推測為是介由與p53之間的相互作用而 導(dǎo)致的(參考文獻(xiàn)16 19)，而在這次使用的HeLa細(xì)胞中由于乳頭瘤病毒的E6蛋白而抑 制P53的表達(dá)，因此介由其他的機(jī)理被控制的可能性高。以前本發(fā)明人的研究組已發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞株中呈高表達(dá)的RFP與HDACl相互作 用，在細(xì)胞內(nèi)顯示共定位(參考文獻(xiàn)20)。由此，考慮RFP是否與由HDACl導(dǎo)致的氧化應(yīng)激 敏感性的控制相關(guān)聯(lián)。最初研究RFP與HDACl的相互作用結(jié)構(gòu)域的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HDACl的N 末端側(cè)，與RFP的Coild-coil (coiled-coil)結(jié)構(gòu)域和Rfp結(jié)構(gòu)域結(jié)合(圖2)。進(jìn)而，發(fā) 現(xiàn)RFP的敲除也如同HDAC1，提高了 HeLa細(xì)胞對H2O2和順鉬的敏感性(圖Ib g)。由此可知，RFP和HDACl物理且功能性地相互作用。根據(jù)HDACl和RFP均具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的報(bào)道(參考文獻(xiàn)1、20、21)，假設(shè)為兩者可能是協(xié)同抑制與應(yīng)激敏感性相關(guān)的共通靶基因的表達(dá)。為了鑒定這種靶基因，制作了恒 定表達(dá)對照和RFP的short hairpinRNA(shRNA 質(zhì)粒載體為基礎(chǔ)在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)目的siRNA) 的HeLa細(xì)胞株，將該兩者的基因表達(dá)譜用DNA微陣列進(jìn)行了比較。并注意到了與表達(dá)對照 shRNA的細(xì)胞相比在敲除RFP的細(xì)胞中表達(dá)得到了提高的基因中的TBP-2。TBP-2是HDACi 的一種，已報(bào)道用SAHA處理細(xì)胞而能提高表達(dá)(參考文獻(xiàn)15)。另外，TBP-2通過與具有除 去ROS的作用的硫氧還蛋白結(jié)合而抑制其作用(參考文獻(xiàn)22、23)，并且通過過度表達(dá)而提 高對氧化應(yīng)激、順鉬的敏感性(參考文獻(xiàn)4、24)。從RT-PCR、免疫蛋白印跡的結(jié)果確認(rèn)到了 TBP-2的表達(dá)由于HDACl和RFP而在轉(zhuǎn)錄水平上受到控制(圖3a，b)。在此，研究了 TBP-2 的表達(dá)在實(shí)際中是否在HeLa細(xì)胞中對H2O2和順鉬的敏感性有影響。在HeLa細(xì)胞中過度表 達(dá)TBP-2的結(jié)果，出現(xiàn)了顯著的敏感性的提高(圖3d，e)。由此可知，由于HDAC1、RFP的敲 除而引起的敏感性的增進(jìn)有可能與TBP-2的表達(dá)的提高相關(guān)。進(jìn)而，研究了由SiHDACl或 siRFP誘導(dǎo)的TBP-2的表達(dá)是否與敏感性的增進(jìn)相關(guān)。對敲除了 HDACl或RFP的細(xì)胞，進(jìn)一 步敲除TBP-2時(shí)，增進(jìn)的敏感性發(fā)生了顯著的下降(圖3f h)。從該結(jié)果可知，由HDAC1、 RFP的敲除引起的敏感性的增進(jìn)的一部分是由于TBP-2的表達(dá)的提高而導(dǎo)致的。進(jìn)而，還確認(rèn)了在使用大腸癌和乳癌的細(xì)胞株時(shí)也能觀察到同樣的結(jié)果(圖4)。利用染色質(zhì)免疫沉淀法研究了 HDACl和RFP是否直接控制TBP-2的表達(dá)。其結(jié) 果，發(fā)現(xiàn)HDACl和RFP被配置于TBP-2啟動(dòng)子的基因附近結(jié)構(gòu)域。另外，熒光素酶報(bào)告基因 檢測中發(fā)現(xiàn)HDACl和RFP協(xié)同抑制TBP-2啟動(dòng)子的活性，并且由于RFP導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄抑制被 HDACi阻止(結(jié)果未圖示)。從因RFP的敲除而TBP-2的表達(dá)提高可認(rèn)為TBP-2啟動(dòng)子結(jié) 構(gòu)域的組蛋白的乙?；谠鲞M(jìn)。使用RFP敲除細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀的結(jié)果，確認(rèn)到了 TBP-2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域的組蛋白H3和H4的乙酰化的增進(jìn)(圖5b)。另外，從HDACl向TBP-2 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域的配置由于RFP的表達(dá)抑制而減弱，可認(rèn)為因RFP敲除而導(dǎo)致的組蛋白的乙 ?；且騂DACl未被配置所導(dǎo)致的。這些結(jié)果強(qiáng)烈表示了 RFP將HDACl配置于TBP-2啟動(dòng) 子上，介由其去乙酰基化酶活性抑制TBP-2的表達(dá)。到目前為止沒有有關(guān)HDACl和RFP直接與DNA結(jié)合的報(bào)道，所以推測HDACl和RFP 是介由與轉(zhuǎn)錄因子等的DNA結(jié)合蛋白的相互作用而被配置于TBP-2啟動(dòng)子。還報(bào)道有TBP-2 啟動(dòng)子在其序列中包含作為轉(zhuǎn)錄因子的NF-Y(Nuclear Factor Y)的結(jié)合序列，因HDACi誘 導(dǎo)TBP-2的表達(dá)時(shí)需要NF-Y (參考文獻(xiàn)15)。由此推測為當(dāng)HDACl和RFP被配置于TBP-2 啟動(dòng)子時(shí)，可能也需要NF-Y。已知NF-Y是由NF-YA、NF-YB, NF-YC這三個(gè)蛋白構(gòu)成的三聚 體轉(zhuǎn)錄因子。本次實(shí)驗(yàn)中，表明RFP與NF-YC特異性結(jié)合(圖5c、d)。其表明HDAC1、RFP， NF-Y有可能形成了蛋白復(fù)合體。為了研究有關(guān)該蛋白復(fù)合體的形成，將附加了 V5標(biāo)簽的 NF-YC,附加了 Flag標(biāo)簽的HDACl以及RFP，一同向HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用對V5標(biāo)簽的抗體進(jìn) 行了免疫沉淀。結(jié)果HDACl和RFP兩者與NF-YC發(fā)生了共沉淀(圖5e)。染色質(zhì)免疫沉淀法中確認(rèn)了 NF-Y實(shí)際上與HDACl、RFP同樣地與TBP-2啟動(dòng)子結(jié) 合(圖5f)。進(jìn)而，在使用敲除了 NF-YC的細(xì)胞的染色質(zhì)免疫沉淀中確認(rèn)HDACl和RFP未被 配置在TBP-2啟動(dòng)子上(圖5g h)。該結(jié)果表明HDAC1、RFP、NF-Y在TBP-2啟動(dòng)子上形 成了蛋白復(fù)合體。進(jìn)而，從凝膠過濾色譜法的結(jié)果確認(rèn)到HDAC1、RFP、NF-YC被包含在相同部分(400kDa前后)中。其支持了這些蛋白形成為復(fù)合體這一觀點(diǎn)。 從圖5所示的結(jié)果認(rèn)為RFP有可能通過借助HDAC1_NF_YC間的相互作用而形成復(fù) 合體。圖6b、c中得到了在外源表達(dá)RFP的細(xì)胞中HDAC1-NF-YC間的相互作用增強(qiáng)，反之 在敲除了 RFP的細(xì)胞中減弱這樣的與上述的認(rèn)識(shí)一致的結(jié)果。進(jìn)而，對該復(fù)合體內(nèi)的RFP 的狀態(tài)進(jìn)行了研究。已報(bào)道有RFP進(jìn)行多聚體化(參考文獻(xiàn)25、26)，從這次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可 知，該多聚化需要Ring-B-box結(jié)構(gòu)域(RB)和Coild-coil結(jié)構(gòu)域(CC)(圖7b)。到此為止 的實(shí)驗(yàn)中已知RFP為了與HDACl和NF-YC結(jié)合而需要Rfp結(jié)構(gòu)域，所以認(rèn)為RFP在N末端 側(cè)的RB和CC上多聚體化，C末端側(cè)的Rfp結(jié)構(gòu)域上分別與HDACl和NF-YC結(jié)合，從而形成 HDACI-RFP-NF-Y 蛋白復(fù)合體(圖 5i)。進(jìn)而，對活體內(nèi)的抗癌劑治療模型中的RFP的表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。向裸鼠的 皮下移植表達(dá)了對照(shNCl)和RFP(shRFP23、shRFP26)的shRNA的細(xì)胞株，對體積成為 50mm3以上的模型，每4天給藥順鉬觀察了經(jīng)過。利用順鉬的治療，與對照組相比在RFP敲 除組中發(fā)揮了強(qiáng)抗腫瘤效果(圖8a c)。最后對癌患者試樣中的RFP的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。使用115例的 大腸癌試樣，以RFP的抗體進(jìn)行免疫染色，檢查了 RFP的陽性試樣的比例(10%以上的細(xì)胞 被染色時(shí)作為RFP陽性)。其結(jié)果，115例中68例(59% )觀察到了 RFP陽性像(圖8d)。 進(jìn)一步將RFP和TBP-2的表達(dá)用免疫熒光染色進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，相互排他性地進(jìn)行表達(dá)，在 大腸癌的試樣的表達(dá)RFP的細(xì)胞中TBP-2的表達(dá)明顯減少(圖8e)。將大腸癌癥例分為RFP 陽性組和陰性組，以Kaplan-Meier法對各組的預(yù)后進(jìn)行研究的結(jié)果，在RFP的表達(dá)和低生 存率之間確認(rèn)到了顯著的關(guān)聯(lián)(圖8f)。從該結(jié)果，認(rèn)為大腸癌的RFP的表達(dá)水平對抗癌劑 的效果有影響，進(jìn)一步對預(yù)后也有影響。通過并用HDACi和抗癌劑而得到的協(xié)同抗腫瘤效果，雖然在癌治療研究領(lǐng)域中備 受矚目，但其分子機(jī)理仍未完全被了解。在多個(gè)研究中表明了 HDACl介由與p53的相互作 用而控制因各種應(yīng)激而誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的可能性(參考文獻(xiàn)16 19)。這次直接表明了 HDACl與RFP和NF-Y形成蛋白復(fù)合體，抑制TBP-2的表達(dá)，從而控制癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激敏感 性。考慮以前的報(bào)道可推測為TBP-2的表達(dá)的提高減弱了硫氧還蛋白的ROS除去作用，能 使癌細(xì)胞對因抗癌劑而誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激變得敏感。從該結(jié)果可認(rèn)為HDACl通過控制抗氧化 機(jī)理而對癌細(xì)胞賦予抗癌劑耐性。進(jìn)而，明確了 RFP的敲除在活體外以及活體內(nèi)使癌細(xì)胞對抗癌劑變得敏感。這表 明RFP在與其他抗癌劑的并用治療中將成為新的治療靶。已知HDACi以毒性低的用量發(fā)揮 抗腫瘤效果，但還報(bào)道有其呈劑量限制性毒性(參考文獻(xiàn)28)。從RFP表達(dá)于局限的組織 (參考文獻(xiàn)29)，以及RFP敲除鼠不表現(xiàn)明顯的損傷的點(diǎn)出發(fā)，可以說以RFP作為靶的治療 策略在副作用方面也優(yōu)異。這次的發(fā)現(xiàn)將對HDACi與抗癌劑的協(xié)同效果的分子機(jī)理賦予新的認(rèn)識(shí)。作為進(jìn)一步研究，調(diào)查了子宮體癌的RFP的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。其結(jié)果，在對 所有患者組的調(diào)查中(圖9(a))，確認(rèn)到RFP的表達(dá)的患者組的預(yù)后明顯差。另外，將患者 組分為分期I和分期II IV進(jìn)行同樣的調(diào)查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)RFP的表達(dá)與分期無關(guān)地與預(yù)后 不良相關(guān)聯(lián)(圖9(b) (c))。接著，將RFP的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系，在采用不同手術(shù)方式的 患者組間進(jìn)行了比較。在此調(diào)查了因廣泛式子宮切除術(shù)(Radicalhysterectomy)和全子宮切除術(shù)(Total hysterectomy)而導(dǎo)致的不同。其結(jié)果，RFP陰性組中未確認(rèn)到因手術(shù)方式 的不同而導(dǎo)致的顯著的預(yù)后差別(圖10(b))，而在RFP陽性組中發(fā)現(xiàn)廣泛式子宮切除術(shù)的 組，與全子宮切除術(shù)的組相比預(yù)后得到了顯著的改善(圖10(c))。另一方面，進(jìn)行了有無淋 巴結(jié)廓清(Lymphadenectomy)而導(dǎo)致的不同。在RFP陰性組中兩組(接受淋巴結(jié)廓清的患 者組(+)和未接受的患者組(_))之間未發(fā)現(xiàn)顯著的預(yù)后差別(圖11(b))，而在RFP陽性組 中發(fā)現(xiàn)接受淋巴結(jié)廓清的組，與未接受廓清的組相比，預(yù)后 得到了顯著的改善(圖11(c))。 綜合考慮圖10和11的結(jié)果，可認(rèn)為對于表達(dá)了 RFP的患者采用更積極的手術(shù)方式可改善 預(yù)后。因此可以說為了診斷子宮體癌進(jìn)行活檢時(shí)通過確認(rèn)RFP的表達(dá)狀態(tài)(例如進(jìn)行免疫 染色)而能得到對手術(shù)方式的選擇有用的信息。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明的作用增強(qiáng)劑將實(shí)現(xiàn)副作用少的癌治療法。本發(fā)明的作用增強(qiáng)劑在利用具 有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑進(jìn)行治療時(shí)并用。在并用2種以上的抗癌劑時(shí)也能應(yīng)用本發(fā) 明的作用增強(qiáng)劑。本發(fā)明并不受到上述發(fā)明的實(shí)施方式以及實(shí)施例的說明的任何限定。在不脫離權(quán) 利要求書所記載的內(nèi)容的情況下進(jìn)行的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地想到的范圍內(nèi)的各種 改變形態(tài)也屬于本發(fā)明。本說明書中指出的論文，專利公開文本以及專利公報(bào)等的內(nèi)容通過援用其所有的 內(nèi)容而引用。<參考文獻(xiàn)>1. 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權(quán)利要求
1.一種作用增強(qiáng)劑，是具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用增強(qiáng)劑，其中，以抑制 RFP(RET finger protein)基因的表達(dá)或RFP的作用的化合物為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作用增強(qiáng)劑，其中，所述化合物為選自以下的(a) (d)中的 化合物(a)以RFP基因作為靶的siRNA；(b)在細(xì)胞內(nèi)生成以RFP基因作為靶的siRNA的核酸構(gòu)建物；(c)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的反義核酸；(d)以RFP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為靶的核酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的作用增強(qiáng)劑，與具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑并用。
4.一種增強(qiáng)具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用的方法，包括在靶癌細(xì)胞內(nèi)抑制 RFP基因的表達(dá)或RFP的作用的步驟。
5.一種癌治療方法，包括將權(quán)利要求1或2所述的作用增強(qiáng)劑給藥的步驟，和將具有 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑給藥的步驟。
6.一種抗癌劑耐性檢測法，包括檢查從活體分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量的步驟，和基于上述步驟的結(jié)果，判定所述癌細(xì)胞對具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的耐性的步驟。
7.—種癌患者的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物，包含RFP。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)后推定用生物標(biāo)記物，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。
9.一種癌患者的預(yù)后推定法，其中，以從癌患者分離的癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量作為指標(biāo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的預(yù)后推定法，其中，癌細(xì)胞內(nèi)的RFP表達(dá)量多是表示預(yù)后不良。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的預(yù)后推定法，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。
12.—種癌患者的預(yù)后推定用試劑，包含抗RFP抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的預(yù)后推定用試劑，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。
14.一種癌患者的預(yù)后推定用試劑盒，包含權(quán)利要求12或13所述的試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的預(yù)后推定用試劑盒，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。
全文摘要
本發(fā)明以提供能夠提高癌的治療效果的手段為課題。提供一種作用增強(qiáng)劑，其以抑制RFP(RET finger protein)基因的表達(dá)或RFP的作用的化合物為有效成分。并用該作用增強(qiáng)劑，則能增強(qiáng)具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)效力的抗癌劑的作用。另一方面，提供對把握癌患者的預(yù)后有用的生物標(biāo)記物及其用途。
文檔編號(hào)A61K38/43GK102131525SQ200980133438
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月1日
發(fā)明者加藤琢哉, 吉川史隆, 高橋雅英 申請人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)