專利名稱：菠蘿蛋白酶抑制劑及菠蘿蛋白酶抑制劑前體的重組制備的制作方法
菠蘿蛋白酶抑制劑及菠蘿蛋白酶抑制劑前體的重組制備本發(fā)明主要涉及菠蘿蛋白酶(Bromelain)，尤其涉及包含在該復雜的蛋白質(zhì)混合 物中的活性化合物。本發(fā)明提供了重組表達的菠蘿蛋白酶中含有的菠蘿蛋白酶抑制劑前體 和菠蘿蛋白酶抑制劑。重組表達的抑制劑被發(fā)現(xiàn)在治療某些疾病或癥狀時的效果要優(yōu)于來 源于植物提取物的菠蘿蛋白酶或其蛋白質(zhì)組分。菠蘿蛋白酶在生物化學上被定義為菠蘿莖的粗提取物，在藥學上被定義為半胱氨 酸蛋白酶的混合物。其多方面的正面效果至少部分是源自其蛋白分解作用，尤其是纖維蛋 白分解作用。據(jù)知，菠蘿蛋白酶的抗腫瘤效果依賴于其蛋白分解作用之外的活性，但其機制 仍然不清楚。在鳳梨科植物的組織中，特別是莖和果實中發(fā)現(xiàn)的蛋白分解酶統(tǒng)稱為菠蘿蛋 白酶。最常見的菠蘿蛋白酶是來源于菠蘿植物(ananas comosus)的莖的各種成分的混合 物。已知莖菠蘿蛋白酶(以下稱為菠蘿蛋白酶)含有至少五種蛋白分解酶，此外還含有非 蛋白分解酶，包括酸性磷酸酶和過氧化酶；其還可能含有淀粉酶和纖維素酶活性。此外，還 存在多種其他成分。CN1186118中公開了一種菠蘿蛋白酶的物理提取工藝。除其他步驟外，該工藝還包 括對菠蘿植物的預處理步驟，通過冷凍、破碎、擠壓得到汁液，過濾得到澄清液體，通過超濾 膜和反滲透膜進行濃縮，然后冷凍真空干燥得到海綿狀的產(chǎn)品。據(jù)報道，通過控制溫度、時 間和pH值可提高酶活性和產(chǎn)率。U. S. 3658651涉及在對酶進行沉淀之前先對提取自菠蘿植物莖部的含有菠蘿蛋白 酶的汁液進行純化處理，將汁液通過離子交換的方式進行純化，離子交換使用帶碳酸氫鹽 形式的陰離子交換劑和含有弱酸性官能團的陽離子交換劑，以及第二種碳酸氫鹽形式的陰 離子交換劑。U. S. 4，286, 064公開了菠蘿蛋白酶粗提取物制備等內(nèi)容。首先用磷酸將菠蘿莖汁 液的PH值調(diào)至3或4，再加入硫氫化鈉以防止巰基被氧化。惰性材料用例如丙酮進行沉淀 并過濾。澄清的液體用丙酮沉淀，離心收集沉淀物，然后沉淀物再在預先用磷酸酸化的含有 硫氫化鈉的水中重新溶解并重新沉淀，或者直接在真空箱中干燥。粗提取物可以通過過濾、 透析或滲濾來進一步純化，以除去小分子和蛋白，再將所得的溶液進行濃縮，最后凍干。為了避免降解和/或其他不期望的化學反應，如氧化反應，有必要選擇特定的處 理條件，如溫度、PH、溶劑和緩沖液、和/或添加劑，例如穩(wěn)定劑和抗氧劑。除了以上的不足以外，還可能需要對粗提取物進行進一步的純化。這樣的純化可 以使用例如在U. S. 2002/188107中概括的HPLC方法。因此，迫切需要提供化學穩(wěn)定且純的菠蘿蛋白酶藥物活性成分，這些成分可以使 用在藥物組合物、皮膚學組合物、和營養(yǎng)組合物中，并且還不存在現(xiàn)有技術中菠蘿蛋白酶制 劑的不足。以上問題已經(jīng)通過提供異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑得到解決，其中該菠蘿蛋白 酶抑制劑在異源宿主中以可溶形式大量表達。本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶所產(chǎn)生的正面效果可能也歸功于其單獨存在或共 同存在的抑制劑。本發(fā)明的抑制劑可以獲得更高的純度，特別是可以避免其他蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段的存在，從而減少副作用。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑即使在水溶 液中經(jīng)過很長一段時間后仍具有高度的儲存穩(wěn)定性。本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑也可以用 來穩(wěn)定任何含有多肽的藥物組合物，例如含有抗生素的口服組合物。在本發(fā)明研究過程中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶抑制劑的前體蛋白(菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，BIP)代表菠蘿蛋白酶中所含有的半胱氨酸蛋白酶的天然底物。通過異源表達所 述前體蛋白可以獲得具有足夠純度的可溶形式的所述天然底物，用于說明半胱氨酸蛋白酶 的活性和特異性。因為菠蘿蛋白酶抑制劑前體蛋白會被菠蘿蛋白酶所含的各種半胱氨酸蛋 白酶等降解成它實際起效的藥物活性成分，也就是被降解成數(shù)種菠蘿蛋白酶抑制劑，所以 所述菠蘿蛋白酶抑制劑前體也可以在含有例如源自菠蘿蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶的藥物 中用作活性成分。在菠蘿蛋白酶的作用下形成的菠蘿蛋白酶抑制劑反過來會抑制半胱氨酸 蛋白酶的活性，如此可以進一步改變菠蘿蛋白酶的藥物活性和含有半胱氨酸蛋白酶的任何 其它種類組合物的藥物活性。

圖1示出了作為菠蘿蛋白酶抑制劑前體(BIP) —部分的菠蘿蛋白酶抑制劑 IiKbi-IiD0示出的氨基酸序列對應于具有鏈間區(qū)域的輕鏈和重鏈。圖2示出了菠蘿蛋白酶抑制劑III的表達構建子。所用載體(Novagen)適用于大 腸桿菌(E. coli)。可以通過β -內(nèi)酰胺酶來進行篩選?？梢酝ㄟ^與NusA-標記融合從而明 顯提高溶解性。圖3示出了在大腸桿菌粗提物中的菠蘿蛋白酶抑制劑。具體示出了使用大腸桿菌 Rosetta 2作為表達宿主從pET43. la/BIP獲得的粗提物的10% SDS-PAGE電泳結果。箭頭 表示來自NusA-標記和菠蘿蛋白酶抑制劑BI-III的融合蛋白，其分子量將近75kDa。左邊 的條帶指的是大腸桿菌Rosetta 2中表達的對照的pET43. la。圖4示出了菠蘿蛋白酶抑制劑前體的表達。具體示出了用ΙΟΟμΙ來自畢赤酵母 (Pichia pastoris)表達培養(yǎng)物的上清液進行的10% SDS-PAGE電泳結果。左邊的條帶示 出了陽性BIP-克隆4，右邊的條帶示出了陰性BIP-克隆5。圖5示出了菠蘿蛋白酶抑制劑前體的蛋白質(zhì)序列示意圖，其中的多肽通過多肽質(zhì) 量指紋圖譜來確定(下劃線表示)。圖6示出了信號P之后的ER信號多肽。圖7示出了含有半胱氨酸蛋白酶anl的載體pPIChlphaanvitrogen)。所述構 建子可以在畢赤酵母中進行表達，并可以用來對菠蘿蛋白酶抑制劑活性進行定量/定性分 析。圖8示出了用圖7所示的構建子在畢赤酵母中表達重組Ananain。畢赤酵母KM71H的 表達培養(yǎng)物的上清液，其中表達的前酶(35kDa箭頭)激活得到的Ananain (25kDa箭頭)具 有很高的產(chǎn)率(45kDa箭頭表示分泌的酵母蛋白)。重組Ananain可以用來測試菠蘿蛋白酶 抑制劑的活性。圖9示出了菠蘿蛋白酶抑制劑前體的DNA序列(圖9a)和蛋白質(zhì)序列(圖9b)。圖10-14示出了單個菠蘿蛋白酶抑制劑bi-I，bi-II，bi-III，bi-VI*bi-VII的 DNA序列(圖10-14a)和蛋白質(zhì)序列(圖10_14b)。所述DNA序列包括起始密碼子、輕鏈、 鏈間區(qū)域、重鏈和終止密碼子。圖15示出了編碼抑制劑蛋白bi-III、bi_VI和bi-VII的菠蘿蛋白酶抑制劑前體 Bromein0所述抑制劑蛋白被結構域間的區(qū)域(ID)共享，該區(qū)域可能被肽鏈內(nèi)切酶切開。抑制劑由以鏈間區(qū)域(IC)連接的輕鏈和重鏈組成(分別表示為LC和HC)，鏈間區(qū)域作為菠蘿 蛋白酶“靶標”，并允許抑制劑的自動調(diào)控。根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方式，本發(fā)明提供了異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑(Bi) 或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體(BIP)，其中所述菠蘿蛋白酶抑制劑(Bi)或者菠蘿蛋白酶抑制 劑前體(BIP)已經(jīng)以可溶蛋白的形式被大量異源生產(chǎn)。本申請中所用的術語異源表達，是指在不同于原始有機體的宿主有機體中進行蛋 白表達，在本申請中是指使用非菠蘿屬的宿主進行表達，即不是菠蘿植物。這樣的宿主的實 例包括畢赤酵母或大腸桿菌等。本申請中所用的菠蘿蛋白酶抑制劑是指菠蘿蛋白酶粗提取物的任意組分中所含 的單一抑制劑，其在氨基酸序列上區(qū)別于菠蘿蛋白酶中含有的其他抑制劑。一般而言，抑制 劑的活性主要取決于其活性位點以及位于其附近的可影響其反應性能所需的特定三維結 構的區(qū)域，但是更遠一點的氨基酸伸展區(qū)域(stretches)例如圈和層，可能影響抑制劑底 物的親和力，在抑制劑表面上的氨基酸區(qū)域則可影響對底物的接近和抑制劑的水溶性。菠蘿蛋白酶抑制劑前體是指一種或多種單個菠蘿蛋白酶抑制劑的無活性的前體 蛋白，該前體需要通過蛋白酶活化的方式來“釋放”所述抑制劑。活化可能一方面需要通過 半胱氨酸蛋白酶來進行，另一方面還需要通過肽鏈內(nèi)切酶來進行。菠蘿蛋白酶抑制劑前體 可以形成如圖15所示結構。本申請中所用的術語“大量”是指，菠蘿蛋白酶抑制劑前體或者活性菠蘿蛋白酶 抑制劑異源表達量彡lmg/L,優(yōu)選彡4mg/L、彡8mg/L、彡12mg/L,彡16mg/L、彡20mg/L、 彡30mg/L或者彡40mg/L,以及更優(yōu)選彡50mg/L。本申請中所用的術語“可溶的”是指，抑制劑或者抑制劑前體，其表現(xiàn)出與相應的 天然的野生型抑制劑基本相同的三維結構。這確保了該抑制劑對半胱氨酸蛋白酶表現(xiàn)出理 想的活性，并且可避免添加其他物質(zhì)，例如為了復性的需要而添加其他物質(zhì)，這一方面確保 了服用時耐受度的提高，在另一方面也避免了對多肽進行不需要的修飾。該抑制劑可進一 步對其周圍環(huán)境展現(xiàn)出足夠的親水性氨基酸，也就是與水分子形成氫鍵，這樣該抑制劑可 以具有足夠的生物利用度從而使其適用于醫(yī)藥用途。術語生物利用度是指活性成分或活性 片段從藥品中被吸收并且在作用位點可獲得的速度和程度?？诜z入的藥物的生物利用度 由多種因素決定，包括分子的性質(zhì)、穩(wěn)定性和給藥劑型，以及病人的因素，例如由于急腹痛 疾病和腸切除等導致的腸表面積降低、以及是否在進餐時服藥等。影響生物利用度的因素 可以包括但不限于，胃腸道吸收不佳、肝首過效應以及藥物在到達系統(tǒng)循環(huán)前的部分降解。 本發(fā)明的表達系統(tǒng)可使本發(fā)明的抑制劑達到意想不到的高產(chǎn)率和意想不到的高溶解度，而 且由于減少或避免了被蛋白酶消化的量，因此可產(chǎn)生更高產(chǎn)的活性抑制劑。本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體可以通過，例如從植物材 料中分離RNA來獲得，例如，第一步通過使用TRIzol ρIusRNA純化系統(tǒng)Gnvitrogen)。DNA 以及蛋白可以通過TRIzoI方法(Invitrogen)分離。由于淀粉會破壞從蛋白中分離出RNA 所需的梯度，因此需要先通過使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)從淀粉富集的部位例 如莖中分離出更大量的RNA。下一步，可建立cDNA文庫。這可以通過技術人員已知的任何 方法進行，例如通過使用 SMART cDNA LibraryConstruction Kit (Clontech)。cDNA 可以 引入到適當?shù)馁|(zhì)?；蜉d體，隨后再轉(zhuǎn)化到容易處理的宿主有機體中，例如大腸桿菌。這可以使用技術人員已知的任何方法來進行?？梢酝ㄟ^標準的DNA測序技術對插入片段進行測 序。DNA序列可以連接到適當?shù)谋磉_載體中，在組成型啟動子或可誘導的啟動子的控制下進 行表達。合適的表達系統(tǒng)例如是pPIChlpha (Invitrogen)，該表達系統(tǒng)可通過任何適當?shù)?技術例如電穿孔轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，例如是釀酒酵母或優(yōu)選地畢赤酵母。畢赤酵母作為 異源表達的宿主具有特別的優(yōu)勢，其糖基化模式基本上與高等真核生物相匹配，這是因為 在所述的有機體中不含有α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的類似物。其他表達用的宿主可以是白 念珠菌或者昆蟲細胞系。單個菠蘿蛋白酶抑制劑也可以通過提供菠蘿蛋白酶抑制劑前體來 獲得，通過用含有蛋白酶，如菠蘿蛋白酶的組分處理，通過本領域技術人員已知的方法例如 色譜法分離獲得單個抑制劑。轉(zhuǎn)化和隨后的蛋白表達可以根據(jù)本技術領域現(xiàn)有的試驗方法進行。重組DNA技 術所需要的知識可以參閱 Maniatis 等人；Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第 二版，(1989)。表達的抑制劑的活性可以通過使用例如來自菠蘿蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶 容易地測得。這樣的蛋白酶可以使用酪蛋白作為底物并能將其切開/降解成酪蛋白水解 產(chǎn)物。這種轉(zhuǎn)化可以進行定性和定量測定。定性測定通過使用含有酪蛋白的固體基質(zhì)并 將蛋白酶加到基質(zhì)表面上的方式來進行。酪蛋白降解會在蛋白酶周圍形成清楚的暈圈現(xiàn) 象。定量測定時，可以使用一定濃度的酪蛋白溶液并加入不同量的蛋白酶。酪蛋白到水解 產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)化可以通過分光光度計來監(jiān)測，該分光光度計的工作波長在可見光范圍內(nèi)， 例如600nm?？梢岳斫?，被測試的化合物，也就是推定的菠蘿蛋白酶抑制劑可以包含于樣品 中，可以通過與只含有蛋白酶和酪蛋白而不含被測試的化合物的樣品進行比較，可以測得 其效果。因此，可以對用于測試半胱氨酸蛋白酶或者相似的水解酶的其他合適的檢測方法 進行改進并調(diào)適。其他檢測方法的實例可以參閱Bornscheuer U. T.，Kazlauskas, R. J.， Hydrolases in OrganicSynthesis, Wiley-VCH, Weinheim(Germany), 1999)。重組 DNA 技 術所需要的知識可以參閱 Maniatis 等人；Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第二 版，(1989)。推定的菠蘿蛋白酶抑制劑的抑制效果也可以與已知的特定的半胱氨酸蛋白酶 抑制劑進行比較，例如E64(Merck)。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過移除ER-轉(zhuǎn)移肽，可以在大腸桿菌中表達抑制劑前體和抑 制劑。此外，相比于仍然帶有ER-轉(zhuǎn)移肽的菠蘿蛋白酶抑制劑/抑制劑前體的異源表達，本 發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑/抑制劑前體的產(chǎn)率明顯提高了 2倍，優(yōu)選3或4倍，更優(yōu)選5倍 或更多。在不受任何理論束縛的前提下，可以假定ER-轉(zhuǎn)移肽促使蛋白粘附到細胞膜上，這 阻止了細胞分裂，顯示ER-轉(zhuǎn)移肽可能對表達宿主產(chǎn)生毒性作用。除了其他好處外，這還可 以使菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體在大腸桿菌中的表達無需使用折疊蛋 白/分子伴侶(chaperones)來獲得正確的三維結構。 因此，本發(fā)明的第一個方面是提供異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶 抑制劑前體，其中已經(jīng)去除了編碼相應菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體的 ER-轉(zhuǎn)移肽的DNA?？梢岳斫?，ER-轉(zhuǎn)移肽的DNA序列可以根據(jù)本領域技術人員的知識容易 地確定。 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿 蛋白酶抑制劑前體。BI或者BIP具有不同于菠蘿屬表達系統(tǒng)所賦予的翻譯后修飾，這取決 于所用的表達系統(tǒng)。通過使用非菠蘿屬的有機體，可以確保不同的翻譯后修飾(PTM)。PTM一般是指蛋白在翻譯后的化學修飾，在翻譯中信使RNA被解碼從而生成特定多肽或蛋白。 可以根據(jù)對翻譯后的蛋白質(zhì)的作用對PTM進行分類。PTM可以添加官能團或其他蛋白/多 肽，使得形成蛋白質(zhì)的氨基酸的化學結構改變從而導致蛋白結構改變。翻譯后修飾的一個 例子就是糖基化，在這個過程中多糖被添加到蛋白質(zhì)上。尤其是，不同的糖基化可能導致不 同的水溶性，其可以反過來正面影響蛋白質(zhì)的生物利用度。本領域技術人員也可以理解，菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體的功 能可以通過多種不同氨基酸序列來實現(xiàn)，在本發(fā)明的另一個實施方式中，異源表達的BI或 者BIP與對應的BI或者BIP具有至少90%的序列一致性。優(yōu)選地，該序列一致性至少為 95%,98%,99%或者99. 5%，更優(yōu)選地至少為99. 8%。與本發(fā)明的BI或者BIP之一分別具有上面提到的序列一致性的這樣的BI或者 BIP，是一種在對活性而言非必需的氨基酸殘基處有改變的多肽，即雖然與原始菠蘿蛋白酶 抑制劑在氨基酸序列上存在差異，但仍然保留其生物功能或活性。例如，氨基酸可以在“非 必需”氨基酸殘基處被替換?！胺潜匦琛卑被釟埢侵敢环N殘基，其可以與野生型序列不 同，而不改變其生物功能或折疊結構，但“必需”氨基酸殘基對于生物功能則是必要的。相 似的功能通常可通過相似結構或化學性質(zhì)的氨基酸實現(xiàn)，例如，用異亮氨酸替代亮氨酸。較 少見地，異構體可以帶有“非保守”改變，例如，用色氨酸替換甘氨酸。同樣的道理不僅適用 于單個氨基酸殘基，還適用于整條氨基酸序列，其可以被添加或刪除而不改變蛋白質(zhì)生物 功能。因此，相似的小改變也可包括氨基酸刪除或插入，或兩者均有。較常見地，在相對大 得多的多肽中，是由某段短的氨基酸序列主要負責蛋白質(zhì)的生物活性或功能。因此，本發(fā)明也包括BI或者BIP的同源物。蛋白質(zhì)序列的同源性或序列相 似性或序列一致性可以通過本領域中熟知的技術來容易地確定，例如，通過使用已有 的軟件或電腦程序，如，基于Altschul，S. F等人做的BLAST(Basic Local Alignment and Search Tool)程序(J. Mol. Biol. ；215(1990)403-410 和 Nucleic Acids Res.； 25(1997)3389-3402)提供了一組相似性搜索程序，其設計用于檢索所有可使用的序列數(shù)據(jù) 庫，不論查詢的序列是蛋白還是DNA。BLAST程序的設計考慮到速度，并且最小程度地犧牲 對相關性低的序列的敏感度。在BLAST檢索中打的分數(shù)有明確的統(tǒng)計學解釋，使得可以很 容易地從隨機的背景配對中辨別出真實的配對。BLAST使用了啟發(fā)式的(heuristic)算法， 其尋找局部而不是全局的配對，因此可檢測到僅在某些獨立區(qū)域存在相似性的序列間的關 系。所述的程序是基于 Smith 和 Waterman 的(J. Mol. Biol ； 147 (1981) 195-197)
的(Bull. Math. Biol. ；46 (1984) 501-514)改進的算法，以尋找在兩條序列間相同或相似的 最佳區(qū)段。當使用序列比對程序例如BLAST，來確定序列同源性、相似性或一致性時，可以使 用默認配置，或選用適當?shù)拇蚍志仃?，例如BLOSUM或PAM，用于優(yōu)化一致性分數(shù)、相似性分 數(shù)或同源性分數(shù)。可以理解，本發(fā)明重組生產(chǎn)的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體可以 用來闡釋其在植物中的生物活性和作用。對于抑制劑的情況，這尤其適用于闡釋抑制劑與 半胱氨酸蛋白酶之間的相互作用，而且也適用于與其他菠蘿蛋白酶抑制劑，而菠蘿蛋白酶 中含有的那些形成半胱氨酸蛋白酶的天然底物的菠蘿蛋白酶抑制劑前體可用于進行，例如 活性測試，或者用于其他天然底物或者具有類似的或改進性能的底物的體外和計算機模擬 (in-silico)石幵究。
為了覆蓋可能因為多種原因而引入的氨基酸序列的人工修飾，本發(fā)明還包括了那 些不是同源的但具有至少如上述定義的序列相似性，或如本發(fā)明所述的菠蘿蛋白酶蛋白的 三維結構，或如本發(fā)明所述的菠蘿蛋白酶蛋白的功能的序列?？梢岳斫?，通過特定調(diào)換單個 氨基酸或通過調(diào)換糖基化模式，可以得到不同性質(zhì)的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體。這種調(diào)換的一個作用可能在于，例如，提高生物利用度，例如獲得與不含該特定 調(diào)換的抑制劑或者抑制劑前體相比更高的溶解度。在本發(fā)明的另一個實施方式中，異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑具有SEQ ID. No. 1-5(對應于圖10-14b所示的蛋白質(zhì)序列)中的任意序列。異源表達的菠蘿蛋白酶 抑制劑前體具有SEQ ID. No. 6的序列(對應于圖9a所示的蛋白質(zhì)序列)。優(yōu)選地，通過移除ER-轉(zhuǎn)移肽，可以將具有序列SEQ ID. No. 1-6的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率 提高至上面定義的范圍。對應于如SEQ ID. No. 1-6表示的蛋白的DNA序列表示為序列 SEQ ID. No. 7-12(圖 10-14a 示出了 DNA 序列 SEQ ID. No. 7-11，圖 9a 示出了 DNA 序列 SEQ ID. No. 12)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，將異源表達的蛋白區(qū)別于野生型蛋白的所述翻譯后 修飾可導致不同的糖基化模式。本領域技術人員知道，用于異源表達多肽的不同有機體可 以導致不同的糖基化模式，從而影響多肽的生物利用度等性能。 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，異源表達的BI或者BIP的翻譯后修飾通過選自于 下組的宿主系統(tǒng)實現(xiàn)酵母、昆蟲細胞、植物細胞和大腸桿菌。對此等表達宿主的選擇是在 技術人員的知識范圍內(nèi)的，包括初步地調(diào)整編碼抑制劑或者抑制劑前體的核苷酸序列中密 碼子的使用，以確保高表達水平。密碼子的使用是指不同有機體在編碼相同的特定氨基酸 的多種密碼子中偏好于某一種的現(xiàn)象，密碼子也就是指確定多藍中一個氨_殘基的三個 核苷酸。為了適應這樣的偏好，可能有必要通過例如化學合成編碼蛋白的DNA，其中密碼子 的使用已經(jīng)被調(diào)整為匹配所選的表達宿主。這在技術人員的知識范圍內(nèi)。BI或者BIP的表 達可以根據(jù)本領域技術人員公知的實驗方法來進行?？梢岳斫猓磉_的條件包括溫度、培養(yǎng) 基、容器種類、通風等，都在技術人員的知識范圍內(nèi)，并且可以根據(jù)各自的要求作相應的調(diào) 離
iF. ο 畢赤酵母已被認可為特別合適的表達宿主。該菌株已被證明不會影響B(tài)I或者 BIP的表達，也不會影響使用上面提到的半胱氨酸蛋白酶和酪蛋白進行的相關測試。優(yōu)選 的畢赤酵母菌株為KM71或KM71H，其允許基因整合到A0X2-基因位點以及緩慢的甲醇代 謝。一般認為，緩慢的甲醇消耗和相應的BI或者BIP的緩慢生成可以促使抑制劑正確地 折疊和分泌。在畢赤酵母中使用合適的質(zhì)粒進行表達，如PPIC9或pPIChlpha(都來自于 hvitrogen)，可保證高效率的轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制 劑前體保持了可溶性，并且活性多肽的進一步降解得以減少或甚至避免。本發(fā)明的BI或者 BIP進一步表現(xiàn)出對宿主有機體無明顯毒性。使用酵母，如畢赤酵母，作為表達宿主的另一 好處在于，可進行縮小規(guī)模的生長實驗，即，使用帶有如M孔或甚至96孔的微量滴定板替 代培養(yǎng)瓶。這確保了可高通量地測試蛋白質(zhì)性能，如抑制半胱氨酸蛋白酶以及其他蛋白酶 的性能。可以通過使用一種本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑來改變所述蛋白酶降解相應底物的 能力，例如半胱氨酸蛋白酶切開酪蛋白的能力。所述抑制劑的此等活性反過來可以標示潛 在的藥用活性，其至少部分對應于菠蘿蛋白酶的藥用活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，異源表達的BI或者BIP帶有允許抑制劑純化的結 構。這些技術手段為技術人員所公知，可以通過例如，生成和表達抑制劑或者抑制劑前體與 某特定氨基酸序列的融合多肽來實現(xiàn)，該特定氨基酸序列可以與濾柱材料的基質(zhì)可逆地結 合。該氨基酸序列可以是，例如，與需純化的多肽的N或C末端融合的聚組氨酸標記序列。 蛋白表達后，該標記與其親和材料結合并通過咪唑梯度的方式釋放，從而從其他蛋白和蛋 白片段中分離得到該融合蛋白或融合多肽。如果需要的話，該標記可以被除去。這樣的技 術為技術人員所公知。可以理解，本發(fā)明可以使用任何種類的標記。根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，可以預見藥物組合物、皮膚學組合物或營養(yǎng)組合物可 以含有一種或多種異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體。可以理解， 當使用菠蘿蛋白酶抑制劑前體時，所述組合物也需要包含可以將菠蘿蛋白酶抑制劑前體消 化成活性形式的蛋白酶。蛋白酶可以，例如以菠蘿蛋白酶的形式提供或者以半胱氨酸蛋白 酶和其他肽鏈內(nèi)切酶混合物的形式提供。本領域技術人員可以容易地調(diào)整實驗方法以確定 能將菠蘿蛋白酶抑制劑前體轉(zhuǎn)化成其活性形式的蛋白酶混合物。根據(jù)另一種實施方式，本發(fā)明的組合物可以配制成任何適于服用的劑型。營養(yǎng)組 合物可以在服用前直接制備或者在生產(chǎn)過程中制備。但是，營養(yǎng)組合物優(yōu)選為可直接使用 的形式?；钚猿煞职谶m于口服的可接受的輔料和/或載體中。短語“營養(yǎng)學上或藥學 上可接受的載體”是指一種營養(yǎng)學或藥學用的載體，其可將活性組分輸送至作用位點且對 人或動物接受者不會產(chǎn)生明顯的傷害。但是，該載體的實際形式并不是關鍵。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式涉及一種或多種本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑和/ 或菠蘿蛋白酶抑制劑前體在制備藥物中的應用，所述藥物可以用于預防和/或治療與半胱 氨酸蛋白酶的表達增加有關聯(lián)的疾病。菠蘿蛋白酶抑制劑產(chǎn)生的正面效果包括降水腫、溶血、纖維蛋白分解、消炎、抗腫 瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤抑制作用。因此，另一個實施方式涉及一種或多種本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑和/或菠蘿蛋 白酶抑制劑前體用于制備藥物的應用，所述藥物用于預防和/或治療癌癥、動脈粥樣硬化、 細菌感染、炎癥、血栓和水腫。所述癌癥優(yōu)選自前列腺癌、結腸癌、乳腺癌和皮膚癌?？梢岳斫?，菠蘿蛋白酶抑制劑前體需要通過例如前面提到過的菠蘿蛋白酶來進行 合適的活化。根據(jù)另一個實施方式，可以預見菠蘿蛋白酶抑制劑在任意含有多肽的組合物中作 為穩(wěn)定劑的應用，例如用于口服使用的含有抗生素的藥物組合物中。因為本發(fā)明的菠蘿蛋白酶抑制劑具有與Bowman-Birk-抑制劑相似的三維結構， 因此還可以預見與Bowman-Birk-抑制劑相似的用途。Bowman-Birk-抑制劑最初是在大豆中發(fā)現(xiàn)的，其中所述蛋白含有71個氨基酸。 BBI具有潛在的化學預防活性，其含有明顯的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制位點。目前還 不清楚BBI抑制癌形成的準確機制，但BBI抑制增殖的活性似乎與胰凝乳蛋白酶的抑制區(qū) 域有關聯(lián)。以上機理預示本發(fā)明的抑制劑可能在血液凝結和炎癥過程中起到一定的作用。此 外，還預示本發(fā)明的抑制劑可以用來抑制彈性蛋白酶。BBI蛋白可以進一步提高口服藥物的 穩(wěn)定性，并且已知可以作為殺蟲劑(Qi等人，2005)。
以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不對本發(fā)明構成任何限制。 實施例除非另有說明，重組DNA技術的進行根據(jù)Maniatis等人；MolecularCloning ；A Laboratory Manual 第二版，(1989)。純水通過使用 PURELABultra(ELGA)獲得。RNA 分離使用Qiazol試劑盒(Invitrogen)分離RNA以及DNA和蛋白質(zhì)，按照生產(chǎn)商的說 明書操作將Iml Qiazol與50_100mg新鮮重量的植物材料混合。為除去多糖，將混合物在 室溫下以12，OOOXg離心10分鐘。上清液在30°C下培養(yǎng)5分鐘。按照每Iml Qiazol加 0. 2ml的量加入氯仿，充分混合溶液15秒?；旌衔镌?0°C培養(yǎng)分鐘。然后混合物在4°C下以 2，OOOXg離心15分鐘。提取含有RNA的上層，并按照每Iml Qiazol加0. 5ml的量與異丙 醇混合?；旌衔镌?°C下以12，OOOXg離心10分鐘并除去上清液。RNA沉淀物按照每Iml Qiazol加Iml的量用75%乙醇(用DEPC水配成)沖洗，充分混合并在4°C下以7500Xg下 離心5分鐘。除去上清液后，用無RNA酶的水重懸沉淀物。另使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)得到來源于菠蘿莖的不含DNA和蛋白質(zhì) 的更大量的RNA。津立基因組cDNA庫為建立基因組cDNA文庫，使用了 SMART IV cDNA文庫構建試劑盒(SMART IVTMcDNA Library Construction Kit (Clontech))。按照生產(chǎn)商的說明書，進行第一條和 第二條鏈的合成，用蛋白酶K消化，用SfiI消化，cDNA按尺寸排斥分級(size exclusion fractionation)，連接SfiI剪切的cDNA和SfiI剪切的去磷酸化的pDNR-LIB載體，將所得 的含有插入片段的載體進行轉(zhuǎn)化。制備PCR產(chǎn)品菌落PCR的PCR反應包括在94°C下進行5分鐘的單步反應，以及30個循環(huán)，每個 循環(huán)為94°C下進行1分鐘下進行1分鐘+72°C下進行1分鐘，然后是72°C下進行7 分鐘，和4°C儲藏。為克隆目的進行序列擴增的PCR反應包括，在98°C下進行1分鐘的單步反應，以及 25個循環(huán)，每個循環(huán)為98°C下進行8秒鐘+59°C下進行20秒鐘+72°C下進行25秒鐘，然后 是72°C下進行5分鐘，和4°C儲藏。表1列出了所用的引物。Bl-for和Bl-rev是指用于前 體的引物，剩下的引物用于單個菠蘿蛋白酶抑制劑/異構體的表達。表 權利要求
1.異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體，其中所述菠蘿蛋白酶抑 制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體被以可溶形式大量異源表達。
2.根據(jù)權利要求1所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體， 其中已經(jīng)除去了編碼菠蘿蛋白酶抑制劑ER-轉(zhuǎn)移肽的DNA序列。
3.根據(jù)前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，其中所述菠蘿蛋白酶抑制劑具有不同于菠蘿屬所賦予的翻譯后修飾。
4.根據(jù)前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，其中所述異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體與相應的菠 蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體具有至少90 %的序列一致性。
5.根據(jù)前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，其中所述菠蘿蛋白酶抑制劑具有如SEQ ID. No. 2-6中任一所示的序列，或者所述 菠蘿蛋白酶抑制劑前體具有如SEQID. No 1 ？所示的序列。
6.根據(jù)前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，其中所述翻譯后修飾導致了不同的糖基化模式。
7.根據(jù)權利要求6所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體， 其中所述翻譯后修飾是由宿主有機體所賦予，該宿主有機體選自酵母、昆蟲細胞、植物細 胞和大腸桿菌。
8.根據(jù)前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體，其中所述菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑前體帶有允許純化的結構。
9.含有前述任一項權利要求所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑 制劑前體的藥物、皮膚學或營養(yǎng)組合物。
10.根據(jù)權利要求9所述的藥物、皮膚學或營養(yǎng)組合物，以組合物總重計，所述組合物 含有0. 1-15%重量百分比范圍內(nèi)的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或者菠蘿蛋白酶抑制劑 前體。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的藥物、皮膚學或營養(yǎng)組合物，其中所述營養(yǎng)組合物選 自巧克力、牛奶、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵奶、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、發(fā)酵的谷物產(chǎn)品、 基于奶的粉末、嬰兒配方食品或?qū)櫸锸称?，?或，其中所述皮膚學組合物選自乳液、洗發(fā) 水、乳霜、防曬霜、曬后乳霜或抗衰老乳霜，和/或軟膏；和/或，其中所述藥物組合物選自 片劑、液體混懸劑、干的口服補充劑、濕的口服補充劑、干的管喂食劑或濕的管喂食劑。
12.根據(jù)權利要求9-11中任一項所述的藥物組合物，其進一步含有選自以下組的輔 料稀釋劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、助流劑、調(diào)味劑和著色劑。
13.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或菠蘿蛋白酶抑 制劑前體在制備藥物組合物中的應用，所述藥物組合物用于治療和/或預防與半胱氨酸蛋 白酶表達增加有關聯(lián)的疾病。
14.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的異源表達的菠蘿蛋白酶抑制劑或菠蘿蛋白酶抑 制劑前體在制備藥物組合物中的應用，所述藥物組合物用于治療和/或預防癌癥、動脈粥 樣硬化、細菌感染、炎癥、血栓和水腫。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及菠蘿蛋白酶，尤其涉及該復雜的蛋白質(zhì)混合物所含有的活性化合物。本發(fā)明提供了重組表達的菠蘿蛋白酶中含有的菠蘿蛋白酶抑制劑前體和菠蘿蛋白酶抑制劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重組表達的抑制劑在治療疾病和狀態(tài)上的效果優(yōu)于來源于植物提取物的菠蘿蛋白酶或者它的蛋白組分。
文檔編號A61K38/16GK102105161SQ200980129181
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權日2008年7月31日
發(fā)明者克勞斯·埃斯克曼, 諾拉·朗尼克, 魯夫·穆勒 申請人:烏爾薩法姆藥物有限責任公司