專利名稱：6313/G2(抗血管緊張肽Ⅱ 1型受體)單克隆抗體可變區(qū)的合成的scFv類似物的制作方法
6313/G2(抗血管緊張肽M 1型受體)單克降抗體可孌厭 的合成的scFv類似物本發(fā)明涉及6313/G2抗血管緊張肽II 1型受體單克隆抗體可變結(jié)構(gòu)域的合成的 scFv 類似物(R6313/G2)。血管緊張肽-II在哺乳動(dòng)物電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)和血壓控制中起重要作用(Peach Physiol. Rev 57313-370(1977) ；Vinson et al "The Adrenal Cortex", Prentice Hall, Englefield Heights (1992))。已經(jīng)識(shí)別了兩種主要類型的血管緊張肽-II受體，稱作1和 2型(ATI和AT2)，但是血管緊張肽-II的主要的公知作用通過(guò)ATl亞型發(fā)生(Herblin et al Am. J. Hypertens. 4299S-302S (1991) ；Ouali et al J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43 271-280(1992))?？笰TI 受體亞型的單克隆抗體 6313/G2(Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245(1993))已經(jīng)用于研究該受體的分布(Vinson et alMol. Med. Today 1 35-38(1995))。已經(jīng)提議該單克隆抗體用作治療劑來(lái)控制血管收縮，例如，用于治療高血壓 或其他平滑肌細(xì)胞(例如，子宮)收縮。該抗體已經(jīng)被用作多種組織，如喉癌(Marsigliante et al CancerLetters 110 19-27(1996))，腎(Harrison-Bernard et al Am. J. Physiol. 42F170-F177(1997)； Cheng et al Am. J. Physiol. 43 F10—F17 (1998))，禾口腦(Yang et al J. Neuroscience 17 1660-1669(1997))中的特定顯像劑。已經(jīng)表明該抗體阻斷血管緊張肽-II誘導(dǎo)的ATI受 體內(nèi)化和PKC活化但是相反地促進(jìn)鈣應(yīng)答(Kapas et al Biochem. Biophys. Res. Comm. 204 1292-1298(1994) ；Vinson et al J. Endocrinol. 141 R5-R9 (1994))。通過(guò)血管緊張肽的 局部產(chǎn)生已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了乳腺腫瘤中存在ATI和AT2受體(Inwang et al Brit. J. Cancer 75 1279-1283(1997) ；Tahmasebi et al Eur. J. Cancer 34 1777-1782(1998))。單克隆抗體6313/G2是根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1993年7月22日保藏在大不列顛聯(lián) 合王國(guó)Porton Down的歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏號(hào)為93072117的雜交 瘤細(xì)胞系分泌的。所述保藏物是倫敦El 4NS，Mile End路，Queen Mary & Westfield學(xué)院 生物化學(xué)系的Gavin P Vinson博士和Stewart Barker博士制備的。保藏人授權(quán)本申請(qǐng)人 在申請(qǐng)書(shū)中引用經(jīng)保藏材料并根據(jù)歐洲專利公約28(1) (d)條法則，無(wú)保留并不可取消地 同意公眾可獲得經(jīng)保藏材料。該雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生與大鼠血管平滑肌ATl受體第8至17位氨基酸殘基特異結(jié) 合的抗體，在人及牛細(xì)胞的ATl受體中也發(fā)現(xiàn)所述氨基酸殘基序列。表位序列如下EDGIKRIQDD或備選地表示為，NH2-Glu-Asp-Gly-IIe-Lys-Arg-IIe-Gln-Asp-Asp-COOH已經(jīng)制備了抗包含血管緊張肽-II 1型受體的N-末端序列的肽序列的單克 隆抗體(Barker et al Journal of Molecular Endocrinology 11 241-245(1993) ；WO 95/09186)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)此類單克隆抗體在某些醫(yī)學(xué)狀況中具有額外的治療用途，在這些狀況 中此類用途以前沒(méi)有提示或表明(W02004/018519)。在所述單克隆抗體阻斷有關(guān)醫(yī)學(xué)狀況中血管緊張肽-II的有害作用而保留該分子的有益作用的能力中看到了這些治療效果。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)ATl受體特異的單克隆抗體的合成SCFv類似物具有有利的和出 乎意料的性質(zhì)，其提供了此類類似物在疾病的療法或治療中的用途。發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了鼠 scFv類似物和鼠scFv類似物的人源化變體。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了特異結(jié)合分子，該分子特異結(jié)合具有氨基酸序 列EDGIKRIQDD的肽并且包含具有與免疫球蛋白Vh結(jié)構(gòu)域連接的免疫球蛋白\結(jié)構(gòu)域的多 肽，其中\(zhòng)結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)VIXDRl，VIXDR2和VIXDR3，并且其中Vh結(jié)構(gòu)域包 含互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) VHCDRl，VHCDR2，VHCDR3，各自具有如下的各自氨基酸序列，其中VHCDRl 是 GYSFTGYNMN，VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3 是 EVDY，VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH，VLCDR2 是 LVSNLES，VLCDR3 是 QHIRELTRSEG，或者與其有至少70%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合分子，該分子特異結(jié)合具有氨基酸序 列EDGIKRIQDD的肽并且包含具有與免疫球蛋白Vh結(jié)構(gòu)域連接的免疫球蛋白\結(jié)構(gòu)域的多 肽，其中\(zhòng)結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)VIXDRl，VIXDR2和VIXDR3，并且其中Vh結(jié)構(gòu)域包 含互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) VHCDRl，VHCDR2，VHCDR3，各自具有如下的各自氨基酸序列，其中VHCDRl 是 GYSFTGYNMN 或 GYSFTGY匪S，
VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，
VHCDR3 是 EVDY，
VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH,
VLCDR2 是 LVSNLES，
VLCDR3 是 QHIRELTRSEG，
或者與其有至少80%同一性的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述特異結(jié)合分子的CDR具有如下氨基畫(huà)？序列
VHCDRl 是 GYSFTGYNMN 或 GYSFTGY匪S，
VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，
VHCDR3 是 EVDY，
VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH,
VLCDR2 是 LVSNLE S 或 LVSDLED，
VLCDR3 是 QHIRELTRSEG。
根據(jù)保守序列定義(Kabat et al in" Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，Nat，1. Inst. Health, Bethesda, MD(1987))和結(jié)構(gòu)定義(Chothiaand Lesk
J.Mol Biol. 196 901-17 (1987))的組合命名CDR。這些定義也隨后描述于Carter et al, Proc Nat’ 1 Acad Sci U S Α. 89 :4285_9(1992)。 使用三字母和單字母密碼，氨基酸可以如下表示甘氨酸(G或Gly)，丙氨酸(Α 或Ala)，纈氨酸(V或Val)，亮氨酸(L或Leu)，異亮氨酸(I或lie)，脯氨酸(P或Pro)，苯丙氨酸(F或Phe)，酪氨酸(Y或Tyr)，色氨酸(W或Trp)，賴氨酸(K或Lys)，精氨酸(R或 Arg)，組氨酸(H或His)，天冬氨酸(D或Asp)，谷氨酸(E或Glu)，天冬酰胺(N或Asn)，谷 氨酰胺(Q或Gln)，半胱氨酸(C或Cys)，甲硫氨酸(M或Met)，絲氨酸(S或Ser)和蘇氨酸 (T或Thr)。當(dāng)殘基可以是天冬氨酸或天冬酰胺時(shí)，可以使用符號(hào)Asx或B。當(dāng)殘基可以是 谷氨酸或谷氨酰胺時(shí)，可以使用符號(hào)Glx或Z。除非上下文指出相反，天冬氨酸的指代包括 天冬氨酸鹽，谷氨酸包括谷氨酸鹽。本發(fā)明還延及上面提到的肽序列的變體。本發(fā)明變體的一個(gè)實(shí)例是除了一個(gè)或多 個(gè)氨基酸用一個(gè)或多個(gè)其他氨基酸替代之外，包含如上定義的肽的融合蛋白。技術(shù)人員明 白多種氨基酸具有相似的性質(zhì)。物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以通常被一個(gè)或多個(gè)其他此類 氨基酸替代而不消除該物質(zhì)的期望的活性。從而，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸可以通常相互替代(具 有脂族側(cè)鏈的氨基酸)。在這些可能的替代中，優(yōu)選甘氨酸和丙氨酸用于相互替代(因?yàn)樗?們具有相對(duì)短的側(cè)鏈)并且纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸用于相互替代(因?yàn)樗鼈兙哂休^大 的疏水脂肪族側(cè)鏈)?？梢韵嗷ヌ娲钠渌被岚ū奖彼?、酪氨酸和色氨酸(具有 芳族側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷 氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和半胱 氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。該性質(zhì)的替代通常被稱作“保守”或“半保守”氨基酸替代。也可以相對(duì)于上面提到的融合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸缺失或插入。從而， 例如，可以缺失對(duì)多肽活性沒(méi)有實(shí)質(zhì)影響或者至少不消除此類活性的氨基酸。此類缺失可 以是有利的，因?yàn)槎嚯牡目傞L(zhǎng)度和分子量可以減小而保留活性。這可以使得減少具體目的 所需的多肽量，例如，可以降低劑量水平。 也可以進(jìn)行相對(duì)于上面融合蛋白的序列的氨基酸插入。這可以改變本發(fā)明物質(zhì)的 性質(zhì)(例如，幫助鑒定、純化或表達(dá)，如上面關(guān)于融合蛋白所解釋的)。使用任何合適的技術(shù)，如通過(guò)使用位點(diǎn)定向誘變或者固態(tài)合成可以進(jìn)行相對(duì)于上 面給出的序列的氨基酸改變。應(yīng)該理解可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸進(jìn)行本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基 酸替代或插入。不管使用天然的還是合成的氨基酸，都優(yōu)選僅僅存在L-氨基酸。如本領(lǐng)域已知的“同一性”是兩個(gè)或更多多肽序列或者兩個(gè)或更多多核苷酸序列 之間的關(guān)系，如通過(guò)比較序列確定。在本領(lǐng)域中，同一性也指多肽或多核苷酸序列之間的序 列相關(guān)性程度(看情況)，如通過(guò)此類序列串之間的匹配確定。盡管存在許多測(cè)量?jī)蓚€(gè)多肽 或兩個(gè)多核苷酸序列之間同一性的方法，但是通常用于確定同一性的方法在計(jì)算機(jī)程序中 編碼。確定兩個(gè)序列之間同一性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux， et al.，Nucleic acids Research, 12,387(1984), BLASTP，BLASTN，和 FASTA(Atschul et al. , J. Molec. Biol. 215,403(1990)。優(yōu)選地，使用HGMP (Human Genome Mapping Project)提供的 BLAST 計(jì)算機(jī)程序 (Atschul et al. , J. Mol. Biol. 215,403-410 (1990)的默認(rèn)參數(shù)，在氨基酸水平上，本發(fā)明 的⑶R的氨基酸序列與上述Vh和\⑶Rs的氨基酸序列有至少70%同一性。更優(yōu)選地，在氨基酸水平上，⑶R序列可以與上面所示序列有至少75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%或至少 90% 同一性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特定結(jié)合分子可以具有CDR的下面排列之一(R6313克隆12D和人源化變體HuCY和var3)VHCDRl :GYSFTGYNMNVHCDR2 :NIDPYYGGTTYNQKFKGVHCDR3 :EVDYVLCDRl :RASKSVSTSTSGYSYMHVLCDR2 :LVSNLESVLCDR3 :QHIRELTRSEG或(R6313 克隆 11B)VHCDRl :GYSFTGY匪SVHCDR2 :NIDPYYGGTTYNQKFKGVHCDR3 =EVDYVLCDRl :RASKSVSTSTSGYSYMHVLCDR2 : LVSNLESVLCDR3 :QHIRELTRSEG或(人源化變體var4)VHCDRl :GYSFTGYNMNVHCDR2 :NIDPYYGGTTYNQKFKGVHCDR3 =EVDYVLCDRl :RASKSVSTSTSGYSYMHVLCDR2 :LVSDLEDVLCDR3 :QHIRELTRSEG。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特異結(jié)合分子可以包含通過(guò)肽接頭連接的可變重鏈 (Vh)和可變輕鏈(Vl)。接頭可以包含1到20個(gè)氨基酸，如1、2、3、或4個(gè)氨基酸、5、10或15 個(gè)氨基酸，或者1到20范圍內(nèi)的其他中間數(shù)字(如方便)。肽接頭可以從任何通常方便的 氨基酸殘基如甘氨酸和/或絲氨酸形成。合適接頭的一個(gè)實(shí)例是Gly4Sert5可以使用此類 接頭的多聚體，如二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，如(Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 或(Gly4Ser)5t5然而，在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可以不存在肽接頭并且\結(jié)構(gòu)域可以通 過(guò)肽鍵連接到Vh結(jié)構(gòu)域。特異結(jié)合分子可以是單鏈可變類似物(scFv)。特異結(jié)合分子或者scFv可以連接 到其他特異結(jié)合分子(例如，其他scFv、Fab抗體片段、嵌合IgG抗體(例如，具有人構(gòu)架)) 或者連接到本發(fā)明的其他scFv，以便形成為多特異性結(jié)合蛋白的多聚體，如二聚體、三聚體 或四聚體。雙特異性scFv有時(shí)稱作雙抗體，三特異性，如三抗體和四特異性，如四抗體(當(dāng) 二聚體、三聚體或四聚體中的每個(gè)scFv具有不同特異性時(shí))。當(dāng)二聚體、三聚體或四聚體中 的每個(gè)scFv具有相同特異性時(shí)，雙抗體、三抗體和四抗體也可以是單特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特異結(jié)合分子可以是鑒定為R6313/G2的單克隆抗體類似物scFv。該scFv在本文中也稱作R6313克隆12D或克隆12D并且具有

圖14中顯示的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，特異結(jié)合分子可以是鑒定為R6313克隆IlB的單 克隆抗體類似物scFv，在本文中也稱作克隆11B，其序列也在圖14中顯示。使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)可以通過(guò)任何合適的技術(shù)制備scFv。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案中，從幼稚人抗體噬菌體展示文庫(kù)可以將單克隆抗體類似物制備為 scFv (McCafferty et al.，Nature 348,552-554(1990)；并且如 WO 92/01047 中描述)。通過(guò)修飾scFv的氨基酸序列可以人源化單克隆抗體類似物。降低本發(fā)明特異性 結(jié)合分子的免疫原性的方法可以包括將CDR移植到合適的抗體構(gòu)架支架或者可變表面殘 基重建，例如，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變或者其他常用的分子生物學(xué)技術(shù)(Roguska et al Protein Eng. 9895-904(1996))?？蓱?yīng)用的其他方法可包括鑒定分子內(nèi)的潛在T細(xì)胞表位，和隨后去除這些表位， 例如，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變(去免疫化)。當(dāng)分子用作治療劑時(shí)，特異結(jié)合分子的人源化可以 是所希望的?？梢匀缦Ｍ倪M(jìn)行CDR區(qū)或者周圍構(gòu)架序列的人源化。本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了 scFv R6313/G2的人源化變體，如實(shí)施例中所述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特異結(jié)合分子可以是鑒定為HuCY，var3和/或var4 的人源化scFvs的任何一種或多種。這些人源化scFvs的序列在圖14中顯示。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含如上述特異結(jié)合分子的藥物組合物?？梢耘渲聘鶕?jù)本發(fā)明該方面使用的組合物用于通過(guò)任何方便的途徑使用。藥物將 通常作為無(wú)菌的藥物組合物的一部分提供，該組合物將通常包括可藥用載體。本發(fā)明的組 合物可以與一種或多種可藥用載體或可藥用佐劑和/或稀釋劑組合使用。此類載體可以包 括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、脂質(zhì)體、水、甘油、聚乙二醇、乙醇和其組合。該藥物組 合物可以以任何合適形式使用(取決于其施用于患者的希望方法)。它可以以單位劑型提供，將通常在密封容器中提供并且可以作為藥盒的部分提 供。此類藥盒將一般(盡管不是必須)包括使用說(shuō)明。它可以包括許多所述單位劑型。藥物組合物可以適應(yīng)于通過(guò)任何合適途徑施用，例如，通過(guò)經(jīng)口(包括含服或舌 下)、直腸、鼻、局部(包括含服、舌下或經(jīng)皮)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮 內(nèi))途徑。此類組合物可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域中任何公知的方法制備，例如，通過(guò)在無(wú)菌條件下 混合活性成分與一種或多種載體或賦形劑。適應(yīng)于經(jīng)口施用的藥物組合物可以作為離散單位如膠囊劑或片劑；作為粉劑或粒 劑；作為溶液劑、糖漿劑或混懸劑(在水性或非水性液體中；或作為可食用泡沫或whips ； 或作為乳劑)給出。用于片劑或硬明膠膠囊劑的合適賦形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物，硬脂酸 或其鹽。用于軟明膠膠囊劑的合適賦形劑包括例如植物油、蠟、脂肪、半固體，或液體多元醇等。對(duì)于溶液劑和糖漿劑的制備，可以使用的賦形劑包括例如水、多元醇和糖。對(duì)于混懸劑的制備，油(例如，植物油)可用于提供水包油或油包水混懸劑。適應(yīng)于經(jīng)皮施用的藥物組合物可以作為離散貼劑給出，其將長(zhǎng)期保持與接受者皮膚的緊密接觸。例如，活性成分可以通過(guò)如一般在PharmaceuticalResearch, 3 (6)318(1986)中描述的離子透入法從貼劑遞送。適于局部施用的藥物組合物可以配制為軟膏劑、乳膏劑、混懸劑、洗劑、粉劑、溶液 劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油。對(duì)于眼或其他外部組織，如口和皮膚的感染，組合物 優(yōu)選作為局部軟膏劑或乳膏劑應(yīng)用。當(dāng)以軟膏劑配制時(shí)，活性成分可以與石蠟或者水混溶 的軟膏基質(zhì)使用。備選地，活性成分可以與水包油膏基或者油包水基質(zhì)以乳膏配制。適于 局部施用于眼的藥物組合物包括眼滴劑，其中將活性成分溶解或懸浮在合適的載體，特別 是水性溶劑中。適于局部施用于口的藥物組合物包括錠劑、軟錠劑和口洗劑。適于直腸施用的藥物組合物可以作為栓劑或灌腸劑給出。適于經(jīng)鼻施用的藥物組合物(其中載體為固體)包括具有例如20到500微米范 圍內(nèi)顆粒大小的粗粉劑，其以經(jīng)鼻吸入的方式施用，例如，通過(guò)鼻腔從接近鼻子的粉劑容器 快速吸入。用于作為鼻噴霧劑或作為鼻滴劑施用的合適的組合物(其中載體為液體)包括 活性成分的水或油溶液。適于通過(guò)吸入施用的藥物組合物包括細(xì)顆粒粉劑或霧，其可以通過(guò)多種類型的按 計(jì)量的劑量加壓氣霧劑、噴霧器或者吸入器產(chǎn)生。適于陰道施用的藥物組合物可以作為子宮托、止血栓、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫 劑或者噴霧劑制劑給出。適于腸胃外施用的藥物組合物包括水性和非水性無(wú)菌注射液，其可以含有抗氧化 劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使得制劑與預(yù)期接受者的血液基本上等滲；和水性和 非水性無(wú)菌混懸劑，其可以包括懸浮劑和增稠劑?？梢杂糜谧⑸淙芤旱馁x形劑包括例如水、 醇、多元醇、甘油和植物油。組合物可以在單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿和小瓶中 給出，并且可以儲(chǔ)存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在將使用前加入無(wú)菌液體載體，例 如，注射用水。臨時(shí)注射溶液和混懸液可以從無(wú)菌粉劑、粒劑和片劑制備。藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、增濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、芳 香劑、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)可以自身以可藥用鹽的形式提供)、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。除 了本發(fā)明的物質(zhì)，它們也可以含有治療活性劑。在一些實(shí)施方案中，活性藥物濃縮物的制劑可以包含可藥用張度劑、緩沖劑，和可 藥用表面活性劑。備選地，制劑可以包含活性成分加上磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、聚山梨酯 80或聚山梨酯20 (表面活性劑用于減小攪拌導(dǎo)致的聚集的風(fēng)險(xiǎn))和水(USP/Ph. Eur)，任選 地調(diào)節(jié)pH到約6. 0到7. 0，例如約6. 5?；钚运幬餄饪s物可以凍干或不凍干。其他制劑可以包含三水合乙酸鈉作為緩沖劑、氯化鈉作為張度調(diào)節(jié)劑、乙酸用于 PH調(diào)節(jié)，和注射用水?；钚运幬餄饪s物也可以在施用前在0. 9%氯化鈉中稀釋。本發(fā)明的物質(zhì)劑量可以在寬范圍內(nèi)改變，取決于待治療的疾病或病癥、待治療個(gè) 體的年齡和狀況等等，并且醫(yī)生將最終決定使用的合適劑量。如合適，可以通常重復(fù)該劑量。如果產(chǎn)生副作用，那么可以根據(jù)一般的臨床實(shí)踐減 少劑量和/或劑量頻率。對(duì)于施用于哺乳動(dòng)物，尤其是人類，預(yù)期活性劑的日劑量將為lyg/kg到10mg/kg體重，通常約10μ g/kg到lmg/kg體重。醫(yī)生最終將決定最適于個(gè)體的實(shí)際劑量，其將取決 于多種因素，包括個(gè)體的年齡、體重、性別和反應(yīng)。上面的劑量是一般病例的實(shí)例。當(dāng)然，可 以存在應(yīng)該使用更高或更低劑量的情況，并且這些情況在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如上述的特異結(jié)合分子可以用于藥學(xué)，例如用于治療癌癥。不希望局限于理論，認(rèn) 為含有血管緊張肽1型受體(ATlR)的癌癥對(duì)使用本發(fā)明的特異結(jié)合分子的療法尤其敏感。 此類癌癥有許多并且包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、垂體癌、絨 毛膜癌、霍奇金病、皮膚癌、腎癌、腎上腺瘤、肝癌、肺癌、白血病和成神經(jīng)瘤細(xì)胞。本發(fā)明的該方面因此也包括治療受試者中癌癥的方法，包括對(duì)該受試者施用如上 述的特異結(jié)合分子。本發(fā)明因此延及如上述的特異結(jié)合分子在生產(chǎn)用于癌癥治療的藥物中 的用途。治療方法可以是人或動(dòng)物受試者的治療方法并且本發(fā)明同樣延及在人和/或獸醫(yī) 藥物中的用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了如上述特異性結(jié)合分子和血管緊張肽-II的組合制 劑，其單獨(dú)、同時(shí)或隨后施用以治療受試者的癌癥。癌癥如上述。本發(fā)明還提供了包含如上定義的本發(fā)明的特異結(jié)合分子和血管緊張肽-II的組 合物。此類組合物可以配制成包含可藥用佐劑和/或稀釋劑的藥物組合物。備選地，本發(fā)明還提供了藥盒，其包含本發(fā)明的特異結(jié)合分子和血管緊張肽-II， 各自配制用于藥物施用，包括但不限于，作為片劑用于經(jīng)口施用，吸入器用于經(jīng)肺施用和可 注射溶液用于靜脈內(nèi)施用。涉及血管緊張肽II用途的本發(fā)明實(shí)施方案可包含適用于人或獸醫(yī)藥物的任何通 常方便形式的血管緊張肽。適當(dāng)?shù)兀芫o張肽II可以以凍干產(chǎn)品的形式提供，其中殘余 物來(lái)自含有血管緊張肽II、海藻糖、人血清白蛋白和乙酸的溶液。藥物級(jí)血管緊張肽II 的一種來(lái)源是NIBSC，SouthMimms, UK，其提供了含有凍干殘余物的安瓿形式的血管緊張 肽II，所述殘余物從包含2. 5 μ g血管緊張肽II (Ileu5)，3mg海藻糖，Img人血清白蛋白， 2xl0_3mol/l乙酸的0. 5ml溶液制備。6313/G2單克隆抗體的可變區(qū)的合成類似物，如稱作R6313/G2的scFv，具有獨(dú)特 和有利的性質(zhì)，特別是當(dāng)與最初的雜交瘤抗體比較時(shí)。例如1.在中空纖維中帶有癌細(xì)胞的完整nu/nu小鼠中，R6313/G2顯著抑制癌細(xì)胞生 長(zhǎng)。這是令人驚奇的，因?yàn)樵诿刻靸纱?，每?3nmol/kg的濃度下，它對(duì)體重、循環(huán)的醛固酮 濃度，或者動(dòng)物活力沒(méi)有影響。即其他血管緊張肽相關(guān)的功能不受影響。(注最初的雜交 瘤抗體增加了體內(nèi)醛固酮分泌)。2. R6313/G2 在 50 和 250nmol/L 濃度下，通過(guò)來(lái)自 Engelbroth-Holm-Swam(EHS)小 鼠腫瘤的重構(gòu)基膜基質(zhì)蛋白(ECM)單獨(dú)抑制T-47D細(xì)胞侵入(見(jiàn)圖9(b))。純化的單克隆 抗體(lOOnmol/L)沒(méi)有顯著抑制效果。此外，在IOOnmolL血管緊張肽II存在下(0 9(b) 中)，R6313/G2的效果在最高濃度的R6313/G2(250nmol/L)下變得明顯更顯著-在24小時(shí) 的測(cè)定期內(nèi)細(xì)胞侵入高達(dá)25%的抑制。3.在高達(dá)每升R6313/G2 IOOnmol血管緊張肽II存在下，顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞 增殖。這是令人驚奇的，因?yàn)樾枰芫o張肽II的存在，并且R6313/G2在不存在血管緊張 肽II時(shí)沒(méi)有效果。4.在完整大鼠體內(nèi)，R6313/G2顯著抑制了應(yīng)激誘導(dǎo)的血壓升高。這是令人驚奇的，因?yàn)樗唤档筒⑶疑踔辽哽o息血壓。5.在高達(dá)IOOnmol血管緊張肽II/L存在而不是不存在下，R6313/G2增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞中胱天蛋白酶驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡。血管緊張肽的省略阻斷了它的效果。所以血管緊張 肽II的存在令人驚奇地是R6313/G2的活性所需的。6.令人驚奇地，R6313/G2在體內(nèi)比在體外更有效。從而，25nmol/Kg的體內(nèi)劑量導(dǎo)致與3. 3micromol/L體外劑量實(shí)現(xiàn)相等的抗癌細(xì)胞效果。7.在帶有異種移植癌細(xì)胞腫瘤的完整nu/nu小鼠中，R6313/G2在13nmol/kg下顯著抑制了癌細(xì)胞生長(zhǎng)，再次沒(méi)有其他效應(yīng)。8.如從圖12可以看出，在再表面化(人源化)scFv中與鼠scFv相比，存在對(duì)肽抗 原的結(jié)合增加。這因此在每次治療的潛在費(fèi)用方面存在優(yōu)勢(shì)而且具有在人類中引起免疫反 應(yīng)的潛力更小的益處。此外，人源化變體var4與親本鼠scFv相比顯示出最顯著增加的結(jié) 合。這是令人驚奇的，因?yàn)樵撟凅w的⑶Rs(VLCDR2)之一在親本鼠scFv方面被修飾。本發(fā)明的第二方面和隨后方面的優(yōu)選特征為在第一方面在細(xì)節(jié)上做必要的修正。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合分子，其包含具有圖14中所示序列的 多肽。本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)例參考下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述，給出這些實(shí)施例僅僅用于 說(shuō)明的目的。在實(shí)施例中，參考許多附圖，其中圖1顯示了血管緊張肽II受體亞型的免疫印跡。在三種乳腺癌細(xì)胞系(泳道B， T47D ；泳道C，MDA-MB-231 ；泳道D，MCF-7)和平滑肌細(xì)胞(泳道A)的裂解物中分析了 ATl 受體(A)和AT2受體(B)含量。僅僅來(lái)自三種乳腺癌細(xì)胞系的裂解物(泳道B-D)含有AT2 受體，盡管MDA-MB-231細(xì)胞含有相對(duì)較少在RASMC(泳道A)中沒(méi)有可檢測(cè)的AT2受體。圖2顯示了(A)在每升IOOnmol血管緊張肽II存在下，R6313/G2對(duì)細(xì)胞存活的 劑量依賴性抑制，其通過(guò)XTT測(cè)定法在48小時(shí)后測(cè)定。三種細(xì)胞系的閾值(* ) (P < 0. 05 或更好)為:MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的為0. 05 μ Μ, T47D細(xì)胞的為1. 25 μ M ； IC50值為 對(duì)于 T47D，MDA-MB-231 和 MCF-7 細(xì)胞，分別為 2. 8 μ mol/L, 1. 53nmol/L 和 30nmol/L。(B) 氯沙坦單獨(dú)在25 μ mol/L下產(chǎn)生T47D細(xì)胞的43 %抑制，其他細(xì)胞類型在所用的所有濃度下 不受影響。結(jié)果為八個(gè)樣品的平均值士S. D。圖3顯示了 (A和B)在IOOnmol/L血管緊張肽II存在和不存在下，12和48小時(shí) 后，R6313/G2對(duì)T47D細(xì)胞中胱天蛋白酶_3/7活性的影響。在12小時(shí)后，與未處理的對(duì)照 值相比，血管緊張肽II抑制了胱天蛋白酶-3/7活性并且該抑制被R6313/G2阻斷。R6313/ G2的該阻斷作用在較高的使用劑量下較不顯著，但是在48小時(shí)后，R6313/G2單獨(dú)導(dǎo)致了胱 天蛋白酶-3/7活性的劑量依賴性增加。(C)在MCF7細(xì)胞中，R6313/G2單獨(dú)降低了胱天蛋 白酶-3/7活性，但是在血管緊張肽II存在下，它劑量依賴性提高了胱天蛋白酶-3/7活性。 數(shù)據(jù)為8個(gè)樣品的平均值士S. D。* P < 0. 05，* * P < 0. 01。圖4顯示了㈧在體外中空纖維測(cè)定中，在血管緊張肽II存在下48小時(shí)后，R6313/G2劑量依賴性抑制了所有三種乳腺細(xì)胞系(T47D，MCF-和MDA-MB-231)的存活。(B) 在皮下部位，在體內(nèi)中空纖維測(cè)定中，R6313/G2劑量依賴性抑制了僅僅MCF-7細(xì)胞中的細(xì) 胞存活，盡管在最高劑量下MDA MB 231細(xì)胞被抑制。(C)在腹膜內(nèi)部位，在體內(nèi)中空纖維測(cè) 定中，在每天兩次用0. 07和0. 7mg/kg(2. 5and 25nmol/kg)治療的動(dòng)物中R6313/G2抑制了MCF7細(xì)胞的存活，以及每天兩次用0. 7mg/kg(25nmol/kg)處理的T47D和MBA MB 231細(xì)胞 中，R6313/G2抑制了細(xì)胞的存活。值表示為平均值士S. D。* P < 0. 05，* * P < 0. 001。 (D)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重在治療期內(nèi)沒(méi)有顯示出改變。圖5顯示了具有MCF7細(xì)胞異種移植物的動(dòng)物中，體內(nèi)R6313/G2處理在0. 4mg/ kg(13nmol/kg ；- ■-)和0. 8mg/kg(27nmol/kg ；- ▲-)；每天兩次的劑量下沒(méi)有導(dǎo)致體重 減輕，并且在治療期內(nèi)沒(méi)有死亡，但是在0. 8mg/kg組中，到第8天四只小鼠死亡。在接受 1. 36mg/kg(45. 3nmol/kg ；- · - * P < 0. 05)的動(dòng)物中體重顯著減輕，并且到第8天所有 動(dòng)物死亡。除了指出相反之外，數(shù)據(jù)為平均值士S.E.M.，n = 8(n括號(hào)中的數(shù)目)。對(duì)照 (- _)。圖6顯示了 R6313/G2對(duì)MCF-7細(xì)胞異種移植物的體內(nèi)作用。(A)MCF_7腫瘤體積， 平均值士 S.E.M。(B)與A相同的數(shù)據(jù)，處理值表示為平均對(duì)照值的百分比。*P<0.05，
女女 P < 0. 001。圖7顯示了用0. 4mg/kg R6313/G2每天兩次持續(xù)7天處理(如對(duì)于圖6)后，對(duì)照 (上面)和(下面)中樣品MCF7細(xì)胞異種移植物。圖8顯示了與僅僅接受PBS的對(duì)照(Con)相比，用R6313/G2 (scFv，0. 4mg/kg每天， 持續(xù)3天)處理的大鼠的血壓。圖9顯示了在使用T-47D乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞侵入測(cè)定法中，來(lái)自雜交瘤上清液 (Mab ；圖9a)和scFv, R6313/G2克隆12D (scFv ；圖9b)的純化的單克隆抗體之間的比較。 在該測(cè)定法中，侵入細(xì)胞將通過(guò)建立的細(xì)胞外基質(zhì)模型被破裂。圖9b表明scFv在50和 250nmol/L (b)濃度下單獨(dú)顯著抑制T-47D細(xì)胞通過(guò)來(lái)自Engelbreth-Holm-Swam(EHS)小鼠 腫瘤的重建基膜基質(zhì)蛋白(ECM)的侵入。純化的單克隆抗體(IOOnM)沒(méi)有顯著抑制效果。 此外，在100nmol/L(b中)血管緊張肽II (Ang II)存在下，scFv效果在最高的scFv濃度 (250nM)下變得明顯更顯著。圖10顯示了克隆12D和IlB的完整序列的比對(duì)。scFv變體的有效氨基酸序列在 該圖中給出的序列的氨基酸9處開(kāi)始，并且從末端數(shù)9個(gè)殘基處結(jié)束。在每個(gè)末端的額外 氨基酸包括pCANTAB 5E載體前導(dǎo)序列的部分(N-末端到scFv序列)，和包括E-標(biāo)記表達(dá) 肽的部分的肽序列(C末端到scFv序列)，其使用pCANTAB 5E表達(dá)并且用于scFv的親和純 化。具體地，有效氨基酸序列在MA信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)(其是周質(zhì)靶定前導(dǎo)序列的部分)后 開(kāi)始并且在三丙氨酸橋接序列和GAPVPY E標(biāo)記序列前結(jié)束。圖11 顯示了克隆 12D，11B，10D，10E，4F，6C，6E，7F，8B，8C，8D 和 8E 的完整序列的比對(duì)。圖12的小圖a-b代表以一式三份進(jìn)行的四次單獨(dú)的ELISA比較。這顯示了五種 不同的scFv變體與肽抗原(來(lái)自ATl受體N-末端區(qū))的結(jié)合量。數(shù)據(jù)顯示為450nm下每 μ g蛋白質(zhì)/孔的吸收值在扣除背景后的平均值士S. E. M.。圖13顯示了針對(duì)從最初雜交瘤純化的IgM的鼠SCFv(12D)和工程化變體scFvs 的間接比較。使用scFvs的抗His標(biāo)記過(guò)氧化物酶二級(jí)抗體綴合物(1 1000)和雜交瘤 來(lái)源的IgM的抗IgM過(guò)氧化物酶二級(jí)抗體綴合物(1 2500)進(jìn)行ELISA。圖14顯示了克隆12D，IlB和人源化變體HuCY、變體3和變體4的序列的比對(duì)。圖15小圖a)顯示了 IgM和scFv變體之間共振頻率(以Hz/表示的表觀結(jié)合率(on-rate))改變的比較。這些數(shù)據(jù)使用Attana 100QCM生物傳感器獲得并且表示為使 用生物素化肽抗原作為結(jié)合靶標(biāo)的鏈霉抗生物素蛋白包被的QCM芯片共振頻率的平均值 士S.E.M.。ScFvs 12D，var3和var4顯示了在100秒注射期內(nèi)共振頻率的顯著更大的改變。 小圖b)比較了類似測(cè)定的多種抗體蛋白質(zhì)的表觀解離率(off-rates)。在這些實(shí)驗(yàn)條件下 沒(méi)有觀察到這些終末解離率的顯著差異。實(shí)施例1 :scFv的制備如前述培養(yǎng)6313/G2小鼠單克隆抗體雜交瘤(Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11241-245(1993))。來(lái)自mRNA的cDNA庫(kù)用于通過(guò)PCR得到重鏈和輕鏈。編 碼(Gly4Ser)3的接頭片段用于裝配插入片段的scFv文庫(kù)并且通過(guò)將這些插入片段直接克 隆到 pCANTAB 5 E 噬菌粒載體(Amersham Pharmacia, High Wycombe, UK)產(chǎn)生噬菌體展示 文庫(kù)。表達(dá)的序列GAPVPYPDPLEra的E-標(biāo)記被包括在該載體中并用于隨后的淘選和純化 步驟。然后將噬菌粒文庫(kù)用于轉(zhuǎn)化TGl大腸桿菌，并使用M13K07輔助質(zhì)粒進(jìn)行噬菌粒挽救 并進(jìn)行幾輪淘選。通過(guò)ELISA使用最初抗原肽(EDGIKRIQDD)包被的96孔板鑒定陽(yáng)性表達(dá) 克隆并使用HRP-連接的二級(jí)抗體檢測(cè)抗E-標(biāo)記抗體(Amersham Pharmacia)。一個(gè)具體克 隆用于表達(dá)和純化并基于抗原ELISA中給出最高信號(hào)來(lái)進(jìn)行功能評(píng)估。使用HiTrap E-標(biāo)記柱(Amersham Pharmacia)純化 6313/G2scFv (R6313/G2，克隆 12D)，接著使用蛋白L柱(BD Clontech, Cowley, Oxford, UK)進(jìn)行純化，該柱結(jié)合免疫球蛋 白，包括scFv。對(duì)于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，必須進(jìn)行培養(yǎng)基規(guī)模純化，接著對(duì)PBS進(jìn)行過(guò)夜透析 并使用30kDa截留的濃縮器(Millipore，Watford, UK)進(jìn)行濃縮。最終抗體儲(chǔ)液以IOmg/ ml的濃度在PBS上進(jìn)行常規(guī)重構(gòu)。用于侵入測(cè)定法中比較的單克隆抗體用固定化的甘露聚糖結(jié)合蛋白柱(Perbio Science UK Ltd)進(jìn)行純化，接著使用IOOkDa分子量截留濾器濃縮。初步研究似乎表明最高活性與克隆R6313克隆12D (也描述為R6313/G2)和R6313 克隆IlB有關(guān)，其中⑶R如下
0141]R6313 克隆 12D0142]VHCDRl :GYSFTGYNMN0143]VHCDR2:NIDPYYGGTTYNQKFKG0144]VHCDR3=EVDY0145]VLCDRl:RASKSVSTSTSGYSYMH0146]VLCDR2LVSNLES0147]VLCDR3:QHIRELTRSEG0148]或0149]R6313 克隆 IlB0150]VHCDRl :GYSFTGY匪S0151]VHCDR2:NIDPYYGGTTYNQKFKG0152]VHCDR3:EVDY0153]VLCDRl:RASKSVSTSTSGYSYMH0154]VLCDR2LVSNLES0155]VLCDR3:QHIRELTRSEGo
在來(lái)自最初雜交瘤細(xì)胞群體的RNA的cDNA文庫(kù)的淘選中，這些⑶R是ELISA平板 測(cè)定法中顯著更強(qiáng)的抗原結(jié)合劑。CDR中的唯一改變?cè)赩HCDRH1中。然而，在這兩個(gè)序列的 N-末端之間存在另一差異，分別是KLQQ和QLQE。額外的10個(gè)克隆顯示出CDR和該結(jié)構(gòu)的 其他地方的其他改變(見(jiàn)圖11)，然而，在ELISA測(cè)定中，這些較弱地結(jié)合ELISA抗原平板?？寺?2D和IlB的完整序列如圖10中所示的比對(duì)。前6個(gè)氨基酸和最后8個(gè)氨 基酸是來(lái)自pCANTAB 5E載體的前導(dǎo)序列，最后5個(gè)包含存在于用于這些實(shí)驗(yàn)的表達(dá)的蛋白 質(zhì)產(chǎn)物中的E-標(biāo)記的部分?？寺?2D和IlB的有效氨基酸序列在圖14中顯示。實(shí)施例2 活件測(cè)定法在下面的測(cè)定法中研究了 scFv R6313/G2的活性細(xì)胞培養(yǎng)步驟MCF-7，T47D和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞得自美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(LGC Promochem, Teddington, UK) 0大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMC)從原代培養(yǎng)物發(fā)育而來(lái) (Barker et al.，1996)。MCF-7 細(xì)胞維持在最小必需培養(yǎng)基(MEM)中，T47D 和 MDA-MB-231 細(xì)胞維持在RPMI 1640培養(yǎng)基中，RASMC維持在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。 所有培養(yǎng)基都補(bǔ)充2mM L-谷氨酰胺，10%胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素和0. 05mg/ml鏈 霉素。細(xì)胞保持在37°C增濕的空氣中(95%氧氣，5% CO2)。細(xì)胞活力測(cè)定法使用胰蛋白酶/EDTA從組織培養(yǎng)瓶除去匯合的細(xì)胞單層。對(duì)于每種細(xì)胞系，將細(xì) 胞(每孔15xl03個(gè))接種到含有合適培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板中。24小時(shí)后，將細(xì)胞用 濃度為0. 005到25 μ M的血管緊張肽II (IOOnM)和R6313/G2或者用相似濃度范圍的氯沙 坦處理，并繼續(xù)培育48小時(shí)。通過(guò)代謝活性細(xì)胞將2，3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-硫代 苯基]-2Η-四唑-5-羧基苯胺內(nèi)鹽(XTT)還原為有色甲月暫產(chǎn)物的能力評(píng)估細(xì)胞活力。使用 MultiskanAscent 微量平板讀出器(Thermo Labsystem，Helsinki ,Finland)在 450nm 波長(zhǎng) 和630nm的參考波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。一式三份進(jìn)行每次測(cè)量。使用GraphPad Prism v4. 0 軟件(GraphPad Software Inc，San Diego CA，USA)用非線性回歸公式計(jì)算 IC50。蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡細(xì)胞在血管緊張肽IiaOOnmol/L)存在或不存在下生長(zhǎng)24小時(shí)，然后用無(wú)菌 PBS(pH 7.4)洗滌三次，在裂解緩沖液(PBS pH 7.4,1% NP-40/Triton X-100,0. 1% SDS 和0. 5%脫氧膽酸鈉，具有蛋白酶抑制劑抑酶醛肽10μ g/ml，抑肽酶30μ g/ml和0. lmmol/ L苯甲基磺酰氟)中溫育5分鐘，并收獲。細(xì)胞裂解物用超聲發(fā)生器(2x5sec周期； Bandelin Sonoplus, SLS, Hessle UK)勻菜。勻菜后，將細(xì)胞在 4°C下以 20，OOOg 離心 10 分鐘。取出上清液并在-80°C保存。用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定法(Bio-RadLaboratories， Hemel Hempstead Μ)估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，將含有50 μ g總細(xì)胞裂解物的 樣品上樣到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上并進(jìn)行電泳。用transBlot轉(zhuǎn)移裝置(Bio-Rad Laboratories,Hemel HempsteadUK)以120mA在4°C下進(jìn)行1. 5小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移 緩沖液(39mmol/L 甘氨酸，48mmol/L Tris-Base，20% 甲醇，和 0. 037% SDS)中的 Hybond-C 膜(Amersham Biosciences Ltd,Chalfont St Giles UK)。洗滌膜并在室溫下封閉緩沖液 (IX Tris-緩沖鹽水(TBS) ,0. 1% Tween 20和5%奶粉)中溫育1小時(shí)，隨后在洗滌緩沖液(IX TBS和0. 1% Tween 20)中洗滌3次10分鐘。膜用以1 500的稀釋度在封閉緩沖液 中稀釋的多克隆兔抗ATl受體或抗AT2受體抗體溫育。在4°C過(guò)夜溫育后，如上述洗滌膜 并用抗兔IgG 二級(jí)抗體(Amersham Biosciences) (1 2000)在室溫下溫育1小時(shí)。進(jìn)行 額外的洗滌并通過(guò)將膜在ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑中溫育1分鐘進(jìn)行免疫檢測(cè)，并曝光于 Biomax 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)膜(Kodak, Rochester NY, USA)。細(xì)胞凋亡-胱天蛋白酶-3/7活性使用Apo-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7 測(cè)定法(Promega Corp, Southampton UK)，根 據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞凋亡期間胱天蛋白酶的活性。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合 并用無(wú)菌PBS洗滌三次。用胰蛋白酶/EDTA收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞(每孔104個(gè))接種到96 孔板中并在100nmol/L血管緊張肽II存在或不存在下，用0.1到3 μM濃度的R6313/G2溫 育細(xì)胞24到48小時(shí)，總體積150 μl。溫育后，向每孔中加入胱天蛋白酶-3/7Z-DEVD-R110 底物(100μ1)?？瞻卓缀袃H僅試劑，并且對(duì)照省略了抗體和/或血管緊張肽II。使用 Fluostar Optima 熒光分光劑 (BMG Laboratories, Offenburg Germany), 用 485nm的激發(fā)波長(zhǎng)和535nm的發(fā)射波長(zhǎng)，在8小時(shí)內(nèi)每2小時(shí)測(cè)量熒光。中空纖維測(cè)定法中空纖維步驟按照 Hollingshead 的方法(Hollingshead et al Life Sci 57131-41(1995))。中空纖維的制備使用平頭21號(hào)針頭和IOml注射器，用70%乙醇沖洗聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維 (500kDa 截留，1mm 內(nèi)徑；Spectrum Europe B. V.，Breda, Netherlands)。然后將纖維浸入 70%乙醇中72小時(shí)，再次用70%乙醇沖洗，然后用蒸餾水沖洗，之后在131°C高壓滅菌。最 后，在裝入細(xì)胞懸液前，纖維用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗。將細(xì)胞(MCF-7，T47D和MDA-MB-231) 以2. 5到3. OxlO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度導(dǎo)入纖維。然后將纖維以2cm間隔熱封閉并置于含有 3ml細(xì)胞合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。為了在體內(nèi)使用前測(cè)試該方法的功效。在濃度為0. 33 μ M到33 μ mol/L的抗體和 血管緊張肽II (lOOnmol/L)存在或不存在下在體外溫育裝載細(xì)胞的纖維48小時(shí)。體內(nèi)中空纖維測(cè)定法將裝載細(xì)胞的中空纖維段在37°C于培養(yǎng)基中過(guò)夜溫育，然后植入純系5-6周齡 雌性balb/c nu/nu小鼠中。將纖維植入麻醉(2%異氟烷)中的動(dòng)物中。向每只動(dòng)物皮 下(s. c.)和腹膜內(nèi)(i.p.)部位植入三根2cm纖維，每根纖維含有細(xì)胞系MCF-7、T47D或 MDA-MB-231之一。對(duì)于腹膜內(nèi)植入物，通過(guò)皮膚和腹壁肌肉組織產(chǎn)生小的切口。將纖維置 入腹腔并且用金屬縫合夾(Harvard Instruments,Edenbridge UK)閉合切口。對(duì)于皮下植 入物，在背部產(chǎn)生小的切口。將纖維以頭顱方向植入背部中線左側(cè)。用金屬縫合夾閉合小 切口。抗體處理用R6313/G2 (0.1ml PBS 中 0. 07mg/kg (2. 5nmol/kg)，和 0.7mg/kg (25nmol/kg)，皮 下)處理具有中空纖維植入物的小鼠(n = 5/組)，每天兩次，持續(xù)6天。對(duì)照動(dòng)物(n = 5)僅僅接受載體。最后注射后24小時(shí)，通過(guò)頸脫位法處死動(dòng)物并回收纖維并轉(zhuǎn)移到含有 20% FBS的預(yù)熱RPMI 1640培養(yǎng)基中30分鐘。
中空纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的評(píng)估使用改良的MTT測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞活力。將纖維在含有l(wèi)mg/ml MTT的具有20% FBS 的RPMI 1640中溫育，并在37°C下在95% 02，5% CO2中溫育4小時(shí)。將試劑吸出，并加入 2ml無(wú)菌過(guò)濾的2. 5%硫酸魚(yú)精蛋白(100ml水中0. 9g NaCl, 2. 5g硫酸魚(yú)精蛋白)。將樣品 在黑暗中4°C下保存至少24小時(shí)以固定甲脂產(chǎn)物。加入新鮮硫酸魚(yú)精蛋白(2.5%)并將纖 維在4°C繼續(xù)保存2到4小時(shí)。每個(gè)纖維轉(zhuǎn)移到24孔板中的孔中，避光下切成兩半并過(guò)夜 風(fēng)干。向每個(gè)孔加入二甲亞砜(DMSO) (300 μ 1)并提取甲臘產(chǎn)物。將來(lái)自每孔的等分試樣 (190 μ 1)轉(zhuǎn)移到96孔板并用Multiskan Ascent光度微量平板讀出器(Thermo labsystem) 讀出540nm下的吸光度。處理的值計(jì)算為對(duì)照的百分比。體內(nèi)異種移棺物測(cè)定法用含有7. 5x106MCF-7細(xì)胞的150 μ 1無(wú)菌PBS皮下注射到小鼠右側(cè)腹。在沒(méi)有激 素支持下允許腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)4周，之后小鼠每周接受皮下注射芝麻油中的17 β -雌二醇戊 酸酯(0. lmg/Kg體重)8周。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的一般健康，每周兩次測(cè)量體重。用游標(biāo)卡尺 每周三次測(cè)量腫瘤大小，并以(L XW2)/2計(jì)算體積，其中L和W分別是大徑和小徑。一旦 腫瘤體積達(dá)到150到200mm3，就將小鼠隨機(jī)化到治療組和對(duì)照組，每組8到10只。通過(guò)以 0. 4mg/kg(13nmol/kg) ,0. 8mg/kg (27nmol/Kg)，禾口 1. 36mg/kg (45. 3nmol/kg)體重皮下注射 無(wú)菌PBS (0. Iml)中的R6313/G2，每天兩次持續(xù)7天來(lái)處理小鼠。對(duì)照小鼠接受無(wú)菌PBS。 研究結(jié)束時(shí)，通過(guò)頸脫位法處死動(dòng)物。相對(duì)體重(％ )計(jì)算為(Wt/Wi)X100，其中Wt是任一 給定時(shí)間的體重，Wi是處理開(kāi)始時(shí)的體重。凈腫瘤體積計(jì)算為Vt-Vi，其中Vt是任一給定 時(shí)間的腫瘤體積，Vi是開(kāi)始處理時(shí)的腫瘤體積，并且表示為Vi的百分比。大鼠血壓考慮到大鼠在血壓測(cè)定中更溫順，在該部分的研究中選擇大鼠。實(shí)驗(yàn)前，雌性 Wistar 首先適應(yīng)處理和血壓設(shè)備 4-5 天。使用 Kent ScientificCorporation(Torring ton CT, USA) Coda 6+尾巴輕拍系統(tǒng)測(cè)定有意識(shí)動(dòng)物的血壓，其中將動(dòng)物在加熱的限制器 (restrainers)中保持，并評(píng)估血壓。處理前動(dòng)物首先被穩(wěn)定并測(cè)量它們的基礎(chǔ)血壓。然后 將它們從限制器快速取出用于皮下注射無(wú)菌PBS中的0. 4mg/kg R6313/G2 (0. lml)。對(duì)照僅 僅接受PBS。然后在1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)隔一段時(shí)間測(cè)量血壓，然后返回到籠子。每天重復(fù)所述 步驟3天。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都以平均值士SE給出。使用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在ANOVA中 顯著結(jié)果的情況下，將斯氏t檢驗(yàn)用于劑量反應(yīng)曲線。認(rèn)為小于0. 05的P值是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 的。熒光侵入測(cè)定法所用的方法為QCM 細(xì)胞侵入測(cè)定法(Chemicon Cat No. ECM555)。這使用細(xì) 胞的熒光檢測(cè)，所述細(xì)胞已經(jīng)突破來(lái)自Engelbreth-Holm-Swam(EHS)小鼠腫瘤(Itepesh LA(1989) Invasion Metastasis 9 192-208)的重構(gòu)基膜基質(zhì)蛋白(ECM)。將ECM包被的插入皿置于96孔板中并向插入皿的內(nèi)部加入100μ 1預(yù)熱的無(wú)血清 培養(yǎng)基以便在l-2h內(nèi)室溫下水化ECM層。取出培養(yǎng)基并向容納插入皿的96孔板的孔中加 入150 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基。然后引入含有每插入皿105個(gè)細(xì)胞的100 μ 1培養(yǎng)基。蓋上平板并在37°C下5% C02/95%空氣增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。從插入皿內(nèi)取出細(xì)胞并用PBS 沖洗后，將插入皿置于含有細(xì)胞脫落溶液(Cell Detachment Solution)的96孔板中并在 37°C下溫育30分鐘。已經(jīng)通過(guò)ECM侵入插入皿底部的細(xì)胞以這種方式從插入皿移去用于 隨后的分析并使用在Fluostar Optima熒光計(jì)(BMGLabtech)中的480/520濾光片組，根據(jù) 生產(chǎn)商的使用說(shuō)明測(cè)量熒光。實(shí)施例3 人源化變體的設(shè)計(jì)人源化變體基于上述鼠序列12D。通過(guò)使用以前公開(kāi)的方法與一定程度的 智力范圍的組合選擇氨基酸替代。首先，鼠scFv序列用于使用BLAST搜索在NCBI數(shù) 據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)最同源的可變重鏈和可變輕鏈。其次，Padlan(Molecular Immunology 28 (4/5) 489-498 (1991))描述的方法用于指出哪些氨基酸殘基可能是完整scFv分子中的 暴露(即親水)或埋藏的(疏水)殘基。Padlan的文章的參考文獻(xiàn)也提供了人種系氨基酸 可以用于適當(dāng)?shù)靥娲髿埢倪x項(xiàng)，并且以這種方式，產(chǎn)生再表面化的scFv，其中通常，這 些暴露的鼠殘基的替代將導(dǎo)致免疫原性較低的完整scFv蛋白。在⑶R(因此CY)之一的任一邊包括額外的兩個(gè)取代，認(rèn)為其對(duì)改變敏感，因?yàn)楦?據(jù)Padlan的公開(kāi)(上文)，這兩個(gè)位置中的人種系殘基在四個(gè)亞組的可變區(qū)中完全保守。通過(guò)ELISA，通過(guò)該方法鑒定的所有三種人源化變體HuCY、var3和var4都比兩種 鼠scFv——12D和1IB更強(qiáng)烈地結(jié)合肽抗原(來(lái)自ATl受體N-末端區(qū))。僅僅在可變重鏈和可變輕鏈中所含的構(gòu)架區(qū)中修飾鼠scFv蛋白質(zhì)序列以便產(chǎn)生 人源化變體HuCY和var3。然而，人源化變體var4也在輕鏈的CDR2中具有兩個(gè)額外的改
J^m O
人源化變體的CDR如下
HuCY 禾口 var3
VHCDRl:GYSFTGYNMN
VHCDR2:NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3:EVDY
VLCDRl:RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2LVSNLES
VLCDR3:QHIRELTRSEG
var4
VHCDRl:GYSFTGY匪S
VHCDR2:NIDPYYGGTTYNQKFKG
VHCDR3:EVDY
VLCDRl:RASKSVSTSTSGYSYMH
VLCDR2LVSDLED
VLCDR3:QHIRELTRSEG
克隆12D，IlB和人源化變體HuCY、變體3和變體4的序列在圖14中顯示。
實(shí)施例4 人源化變體的活件測(cè)定法
在下面的測(cè)定法中研究了人源化變體的活性
ScFv生產(chǎn)和純化用于比較性結(jié)合研究
所有基因序列都由Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA, USA)合成并整合到 細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體中位于His標(biāo)記編碼序列的上游，處于T71ac啟動(dòng)子控制下。使用的 載體包括周質(zhì)靶向前導(dǎo)序列，其在到達(dá)細(xì)菌宿主的周質(zhì)空間后被信號(hào)肽酶切割。技術(shù)人員 將理解也可以使用其他合適的載體產(chǎn)生本發(fā)明的scFv。根據(jù)生產(chǎn)商的方案將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到Rosetta 2 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞 (Merck-Novagen)中。菌株常規(guī)地在37 °C生長(zhǎng)在LB培養(yǎng)液或LB瓊脂上，其含有30mg/升 卡那霉素和34mg/升氯霉素。使用在37°C下在2L帶有擋板的培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)24小時(shí)的IL 細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。然后通過(guò)在25°C加入終濃度0. 4mM的IPTG維持5小時(shí)來(lái)誘 導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在4°C下在Beckman Coulter Avanti J-30I離心機(jī)中以5000g(rcf)離心 20分鐘收獲細(xì)菌細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞沉淀以IOml (每升培養(yǎng)物)重懸浮在下面的緩沖液 中0. 4M Tris-HCL pH 8，ImM EDTA。然后將所得的細(xì)胞沉淀在_20°C保存直到純化。為了制備周質(zhì)級(jí)分，將IL沉淀解凍并加入下面的緩沖液10ml IM蔗糖和30ml 1/5TES 緩沖液(40mM Tris-HCL pH 8,0. ImM EDTA，0. IM 蔗糖和 5mM MgSO4)。然后在冰上 攪拌該細(xì)胞懸浮液40分鐘，之后在4°C以17418g(rcf)離心20分鐘來(lái)分離可溶的周質(zhì)上清 液° 該滲透休克方案是來(lái)自 Ausubel et al·, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons，New York(1989)的Novagen手冊(cè)中所給方法的改良版本。然后將周質(zhì)級(jí)分通過(guò)0. 45 μ M濾器過(guò)濾并加到裝載NiSO4的Iml預(yù)先灌注的His 結(jié)合柱(Merck-Novagen)。根據(jù)pET系統(tǒng)手冊(cè)使用說(shuō)明，使用在His-Bind Buffer試劑盒 (Merck-Novagen)中提供的緩沖液進(jìn)行純化。所得的洗脫液通過(guò)穿過(guò)PD-IO柱(Pharmacia) 進(jìn)行緩沖液交換，該柱子已經(jīng)事先用磷酸緩沖鹽水PH 7. 4(PBS5Sigma P4417)平衡。然后 使用IOkDa分子量截留旋轉(zhuǎn)離心機(jī)(Amicon)濃縮所得的scFv級(jí)分。通過(guò)運(yùn)行10-15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定法并記錄280nm處的UV吸光度，將吸光度 通過(guò)除以消光系數(shù)1. 7(摩爾消光系數(shù)除以蛋白質(zhì)的分子量- 25. 7kDa)轉(zhuǎn)化成濃度，來(lái) 驗(yàn)證PBS中scFv級(jí)分的濃度。如以前關(guān)于細(xì)胞侵入研究所述的純化用于比較性結(jié)合研究的IgM。用于IgM的消 化系數(shù)為 1. 18 (Johnstone A, Thorpe R. Immunochemistry inpractice. 2nd ed. Oxford Blackwell Scientific Publications(1987))。使用ELISA測(cè)試抗原結(jié)合在肽抗原EDGIKRIQDDC-生物素(碳酸鹽緩沖液pH9. 6中2_8ug/ml)包被的 Maxisorp 96孔板中4或37°C下過(guò)夜進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISAs)。包被的孔用堿 性可溶性酪蛋白(封閉緩沖液)室溫下封閉1小時(shí)，然后用含有0. v/v Tween 20的PBS 洗滌三次。加入在PBS-T中1 1到1 100之間稀釋的ScFv樣品并在室溫下溫育1小 時(shí)，然后如前洗滌。然后加入二級(jí)HRP綴合的抗-His標(biāo)記抗體(在封閉緩沖液中1 1000 稀釋)，在室溫下保持1小時(shí)。然后將孔用PBS-T洗滌三次，用PBS (無(wú)Tween 20)洗滌兩次。 加入100 μ 1 TMB底物溶液，并允許顯色30分鐘，此時(shí)加入100 μ 1 2Μ硫酸終止反應(yīng)。在平 板讀出分光光度計(jì)上讀出450nm下的吸光度。使用Eppendorf Biophotometer在280nm下 讀數(shù)并使用如上對(duì)于scFv 1.7的消光系數(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果在圖12中顯示。如從圖12可看出，在再表面化的scFv(HuCY, var3和var4)中與鼠scFv(12D和 11B)相比存在對(duì)肽抗原的增加的結(jié)合。出乎意料地觀察到在鼠scFv的構(gòu)架區(qū)中進(jìn)行的改變得到蛋白質(zhì)HuCY，其與相同量和純度的鼠scFv相比時(shí)在ELISA中以高5倍的親合力結(jié)合 到抗原肽EDGIKRIQDDC-生物素。此外，與親本鼠scFv相比，人源化變體var4顯示出與該 抗原的結(jié)合提高5-10倍。這是令人驚奇的，因?yàn)関ar4的⑶Rs (VIXDR2)之一與親本鼠scFv 相比被修飾。圖13顯示了鼠scFv (12D)和工程化的變體scFvs (HuCY和var4)針對(duì)來(lái)自最初雜 交瘤的純化的IgM的間接比較。如可以從圖13看出，變體scFvs比鼠scFv具有更高的活 性。使用石英晶體微量天平比較結(jié)合特征使用Attana 100石英晶體微量天平比較scFv變體和IgM與固定化肽抗原的結(jié)合 特征得到數(shù)據(jù)。這涉及使用鏈霉抗生物素蛋白(0.1mg/ml)-包被的生物素“芯片”(Attana 100生物傳感器(石英晶體微量天平(QCM)中金包被的石英晶體)(Attana AB, Stockholm, Sweden)。然后跨芯片以4μ g/ml的濃度運(yùn)行在C-末端生物素化的肽抗原，該肽抗原對(duì)應(yīng)于 用于產(chǎn)生最初鼠雜交瘤的序列，以產(chǎn)生scFvs和IgM的結(jié)合靶標(biāo)，隨后scFvs和IgM經(jīng)QCM 芯片的表面運(yùn)行。用Attester軟件(Attana，Sweden)監(jiān)測(cè)響應(yīng)測(cè)試抗體與抗原的結(jié)合，QCM 芯片的共振頻率的改變。為9 μ g/ml濃度下的每種抗體測(cè)定在100秒的樣品注射期間偏轉(zhuǎn) (Hz)幅度(Hz/秒)。隨著抗體逐漸從芯片脫離以及芯片共振頻率降低，也以Hz/秒測(cè)量來(lái) 自生物傳感器跡線的直線部分中抗體從QCM芯片釋放的速率。運(yùn)行緩沖液為含有0. 005% Tween 20的PBS (PBST)，并且這也用于制備抗體稀釋液以在每種情況下得到9 μ g/ml的最 終蛋白質(zhì)濃度。Attana 100以50 μ 1注射環(huán)設(shè)置并且用20 μ 1/min的恒定泵速度運(yùn)行。在 100秒內(nèi)注射樣品和PBST緩沖液對(duì)照，得到跨芯片33 μ 1的樣品體積。用IOOmM(6. 6 μ 1體 積)磷酸溶液再生各實(shí)驗(yàn)樣品運(yùn)行之間的鏈霉抗生物素蛋白-抗原表面。結(jié)果在圖15中顯示。在注射期間內(nèi)，ScFvs 12D、var3和var4與IgM相比顯示出 共振頻率的顯著更大的增加，而在這些實(shí)驗(yàn)條件下抗體從QCM芯片釋放的速率中沒(méi)有觀察 到顯著差異。
權(quán)利要求
特異結(jié)合分子，其特異結(jié)合具有氨基酸序列EDGIKRIQDD的肽并且包含具有連接到免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域的多肽，其中VL結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，并且其中VH結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，各自具有如下的各自氨基酸序列，其中VHCDR1是GYSFTGYNMN，VHCDR2是NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3是EVDY，VLCDR1是RASKSVSTSTSGYSYMH，VLCDR2是LVSNLES，VLCDR3是QHIRELTRSEG，或與其有至少70％同一性的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的特異結(jié)合分子，其中CDR具有如下氨基酸序列 VHCDRl 是 GYSFTGYNMN 或 GYSFTGY匪S，VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG， VHCDR3 是 EVDY， VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH, VLCDR2 是 LVSNLES 或 LVSDLED， VLCDR3 是 QHIRELTRSEG。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的特異結(jié)合分子，其中CDR具有如下氨基酸序列 VHCDRl 是 GYSFTGYNMN，VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3 是 EVDY，VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH,VLCDR2 是 LVSNLES，VLCDR3 是 QHIRELTRSEG，或VHCDRl 是 GYSFTGY匪S，VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3 是 EVDY，VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH,VLCDR2 是 LVSNLES，VLCDR3 是 QHIRELTRSEG，或VHCDRl 是 GYSFTGYNMN，VHCDR2 是 NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3 是 EVDY，VLCDRl 是 RASKSVSTSTSGYSYMH,VLCDR2 是 LVSDLED，VLCDR3 是 QHIRELTRSEG。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子，其包含具有如圖14所述氨基酸序列的多肽。
5.包含如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子的藥物組合物。
6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子，其用于藥物中。
7.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子，其用于治療癌癥。
8.治療受試者中癌癥的方法，其包括對(duì)受試者施用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子。
9.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子用于生產(chǎn)治療癌癥的藥物的用途。
10.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子和血管緊張肽-II的組合制劑，其用于單獨(dú)、同時(shí)或隨后施用以治療受試者的癌癥。
11.包含如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子和血管緊張肽-II的組合物。
12.包含如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的特異結(jié)合分子和血管緊張肽-II的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異結(jié)合分子，其特異結(jié)合具有氨基酸序列EDGIKRIQDD的肽并且包含具有連接到免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域的多肽，其中VL結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，并且其中VH結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，各自具有如下的各自氨基酸序列，其中VHCDR1是GYSFTGYNMN，VHCDR2是NIDPYYGGTTYNQKFKG，VHCDR3是EVDY，VLCDR1是RASKSVSTSTSGYSYMH，VLCDR2是LVSNLES，VLCDR3是QHIRELTRSEG或與其有至少70％同一性的氨基酸序列。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101990548SQ200980112660
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月18日
發(fā)明者G·P·文森, J·R·普代福特, S·巴克 申請(qǐng)人:瑪麗王后·威斯特費(fèi)爾學(xué)院