專利名稱：治療與dna重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，具體涉及與在編碼或非編碼序列有不穩(wěn)定重復的基因相關 的遺傳病癥的治療，最具體而言是導致人類亨廷頓病的HD基因或導致強直性肌營養(yǎng)不良1 型的DMPK基因中的不穩(wěn)定重復。
背景技術：
基因特異微衛(wèi)星和小衛(wèi)星重復序列的不穩(wěn)定性，導致隨體中重復序列長度的增 加，與35種人的遺傳病癥相關。例如發(fā)現(xiàn)基因中三核苷酸重復不穩(wěn)定性導致X連接脊髓和 延髓性肌萎縮(SBMA)、強直性肌營養(yǎng)不良1型(DM1)、脆性X綜合征(FRAX基因A、E、F)、亨 廷頓病(HD)和數(shù)種脊髓小腦共濟失調(SCA基因家族)。不穩(wěn)定重復發(fā)現(xiàn)于基因例如亨廷 頓病基因的編碼區(qū)域，因此所述疾病的表型是由蛋白質功能和/或蛋白質折疊的改變引起 的。不穩(wěn)定重復單元也發(fā)現(xiàn)于非翻譯區(qū)域，例如強直性肌營養(yǎng)不良1型中，發(fā)現(xiàn)于3’UTR或 內含子序列，例如強直性肌營養(yǎng)不良2型中。對于DMPK重復的正常數(shù)目為約5-37，但是在前 突變和完全發(fā)病狀態(tài)增加到2-10倍或更多，至50、100并且有時1000或更多重復單元。對 于 DM2/ZNF9 ±曾力口至 10，000 或更多重復(Cleary 禾口 Pearson，Cytogenet. Genome Res. 100 25-55,2003)。亨廷頓病的致病基因，HD，位于4號染色體。亨廷頓病以常染色體顯性方式遺傳。 當所述基因擁有超過35個編碼聚谷氨酰胺延伸的CAG三核苷酸重復時，重復的數(shù)目可以在 連續(xù)世代擴增。由于重復長度的累進增加，所述疾病在連續(xù)世代中趨向嚴重性增加和在更 早年齡出現(xiàn)，此過程稱為早現(xiàn)(anticipation)。HD基因的產(chǎn)物是348kDa的細胞質蛋白亨 廷頓蛋白(himtingtin)。亨廷頓蛋白在正常形式具有少于40個谷氨酰胺氨基酸殘基的特 征序列；導致疾病的突變亨廷頓蛋白有超過40個殘基。在神經(jīng)細胞中突變亨廷頓蛋白分 子的持續(xù)表達導致形成最終引起細胞死亡的大塊蛋白質沉積，尤其是在額葉和基底神經(jīng)節(jié) (主要在尾狀核)。所述疾病的嚴重性通常與額外的殘基的數(shù)目成比例。DMl是成人中最常見的肌營養(yǎng)不良癥并且是遺傳的、累進的、退行性多系統(tǒng)病癥， 主要累及骨骼肌、心臟和腦。DMl是由位于人染色體19q的DMPK基因(強直性肌營養(yǎng)不良 蛋白激酶)的3’非翻譯區(qū)域中不穩(wěn)定三核苷酸(CTG)n重復的擴增導致的(Brook et al, Cell, 1992)。強直性肌營養(yǎng)不良2型(DM2)是由ZNF9基因的內含子1中CCTG的擴增導致 的(Liquori et al, Science 2001)。對于強直性肌營養(yǎng)不良1型，DMPK轉錄本的核-胞 質輸出由重復的增加的長度所阻斷，所述重復形成在核灶(nuclear foci)積聚的發(fā)夾狀二 級結構。攜帶長(CUG)n區(qū)的DMPK轉錄本可以形成發(fā)夾狀結構，所述發(fā)夾狀結構結合盲肌 (muscleblind)蛋白家族并且隨后聚集在核中的核糖核酸灶。這些核內含物被認為隱蔽盲 肌蛋白質和其他可能的因子，然后成為細胞的限制。在DM2中，攜帶(CCUG)n擴增重復的 ZNF9RNA的積累形成相似的灶。由于盲肌蛋白是剪接因子，其消耗導致其他轉錄本剪接中顯 著的重排。許多基因的轉錄本因而成為異常剪接的，例如通過包含胎兒外顯子、或外顯子遺 漏產(chǎn)生了無功能蛋白質和導致受損的細胞功能。上述觀察和新發(fā)現(xiàn)使人們理解了諸如強直性肌營養(yǎng)不良1型、亨廷頓病等不穩(wěn)定重復疾病可以通過全部或者至少部分移除導致疾病的異常轉錄本來治療。對于DM1，在核 中積聚的異常轉錄本可以被下調或完全移除。甚至所述異常轉錄本相對小的減少可以釋放 大量的和可能充足數(shù)量的被隱蔽的細胞因子從而促進恢復DM中正常RNA加工和細胞代謝 (Kanadia et al.，PNAS 2006)。對于HD，減少HD患者細胞中積聚的亨廷頓蛋白沉積物可 以改善疾病癥狀。已經(jīng)做了一些嘗試使用反義核酸、RNA干擾或核酶設計用于不穩(wěn)定重復疾病強直 性肌營養(yǎng)不良1型的治療方法和藥物。(i) Langlois et al. (Molecular Therapy, Vol. 7 No. 5，2003)設計了能夠裂解 DMPK mRNA的核酶。錘頭狀核酶具有與在DMPK中恰好在CUG重復前面的3’ UTR互補的延 伸RNA。在體內，載體轉錄核酶能夠在被轉染的細胞里分別裂解和減少包含擴增CUG重復 的mRNA和正常mRNA種類63%和50%。因此，通過此方法正常轉錄本也受嚴重影響，并且 帶有擴增重復的受累及的mRNA種類并非被特異性靶向。(ii)Langlois et al.，(Journal Biological Chemistry, vol280, no.17，2005) 采用了利用RNA干擾的另一種方法。慢病毒遞送的短發(fā)夾RNA(shRNA)被導入到DMl成肌 細胞并且被證明可下調核中保留的突變DMPK mRNA。測試了 4種shRNA分子，兩種與DMPK 的編碼區(qū)域互補，一種與3’ UTR的獨特序列互補和一種為有不相干序列的陰性對照。前兩 種shRNA能夠下調具有擴增重復的突變DMPK轉錄本至約50 %，但是更有效地下調細胞質野 生型轉錄本至約30%或更少。通過陽離子脂質遞送的等量的合成的siRNA是無效的。針對 3’ UTR序列的shRNA被證實對兩種轉錄本都是無效的。因此，這種方法也不是選擇性地靶 向擴增的重復mRNA種類。(iii)來自 Furling et al. (Gene Therapy, Vol. 10，p795_802，2003)的第三種方 法使用表達149bp長的反義RNA的重組逆轉錄病毒在人DMl成肌細胞中抑制DMPK mRNA水 平。逆轉錄病毒被設計用于向DMl細胞提供與39bp長的(CUG) 13重復和在該重復之后的 IlObp區(qū)域互補的149bp長的反義RNA以增加特異性。與野生型DMPK轉錄本50%的減少 的相比，這種方法導致了突變的(重復擴增的)DMPK轉錄本80%的減少，以及在被轉染的 DMl成肌細胞中恢復分化和功能特征。因此，這種方法也沒有選擇性靶向擴增的重復mRNA 種類，它取決于非常長的反義RNA并且只能與重組病毒遞送技術組合使用。發(fā)明詳述上述方法和技術為與重復不穩(wěn)定性和/或擴增相關的遺傳疾病提供了導致受累 的重復擴增的等位基因和未受累的或正常等位基因均非選擇性降解的基于核酸的方法。此 外，本領域使用的序列特異于與所述疾病相關的基因但沒有提供可應用于數(shù)種與重復擴增 相關的遺傳病癥的方法。最后，本領域只教導了涉及使用重組DNA載體遞送系統(tǒng)的方法，所 述系統(tǒng)需要適應每個寡核苷酸和靶細胞并且仍然需要進一步優(yōu)化。本發(fā)明提供通過使用包含或含有次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺 動堿基對的堿基的核苷的短核酸分子或寡核苷酸提供了這些問題的解決方案，所述核酸分 子包含只與擴增的重復區(qū)域互補的序列或由其組成，即其不依賴與包含重復的基因的外顯 子或內含子的獨特序列的雜交。第二種解決方案包括使用包含只與擴增重復區(qū)域互補并且 基本上不能招募和/或激活RNA酶H的序列或由其組成的短核酸分子；即RNA酶H基本上 非依賴的核酸分子。兩種解決方案也可以結合本發(fā)明提供了包含次黃嘌呤核苷和/或尿
5嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸或核酸分子的用途，所述寡核 苷酸基本上不能招募和/激活RNA酶H。不希望被理論限制，本發(fā)明可以通過改變未成熟RNA的轉錄后加工和/或剪接導 致轉錄本水平的減少。通過可變剪接和/或轉錄后加工減少轉錄本水平可以產(chǎn)生缺乏過度 擴增的或不穩(wěn)定的(三)核苷酸重復，但仍具有功能活性的轉錄本。另外或可選擇地，通過 結合于mRNA的靶序列后啟動或激活降解機制mRNA的穩(wěn)定性會減少。通過改變的RNA加工 和/或剪接和/或RNA穩(wěn)定性減少異常轉錄本可以預防異常的、重復擴增轉錄本在細胞中 的積累和/或翻譯。不希望被理論限制，本發(fā)明的方法也考慮提供針對具有擴增重復的受累的轉錄本 的特異性，因為針對擴增重復雜交的動力學是更有利的。重復特異性互補的核酸寡核苷酸 分子與RNA或DNA分子中互補延伸雜交的可能性隨著重復延伸的大小增加而增加。RNA分 子并且特別是包含互補序列的RNA分子通常內部配對，形成包含開環(huán)和封閉發(fā)夾狀部分的 二級結構。只有所述開環(huán)部分對于互補核酸相對容易接近。與疾病無關的野生型轉錄本的 短重復延伸經(jīng)常只有5至約20-40重復并且由于其二級結構相對難以與互補核酸進行堿基 配對。相反，擴增的重復和與疾病相關的等位基因的重復單元通常至少是兩倍擴增的但經(jīng) 常更多，3、5、10倍、高達100或對于某些不穩(wěn)定重復病癥甚至高于1000倍擴增。相對于野 生型等位基因，這種擴增增加了重復部分是，至少臨時是，處于開環(huán)結構的可能性并且因此 而更易接近以與互補核酸分子進行堿基配對。所以盡管事實是寡核苷酸與野生型和重復擴 增的轉錄本中都存在的重復序列互補并且理論上與兩種轉錄本都雜交，但本發(fā)明教導了與 重復域互補的寡核苷酸優(yōu)選與疾病相關的或導致疾病的轉錄本雜交并且相對不影響正常 轉錄本的功能。不管異常轉錄本降解的機制，這種選擇性對于治療重復不穩(wěn)定性相關疾病 是有益的。另外，至少2倍擴增但經(jīng)常更多，3、5、10倍、高達100或甚至高于1000倍擴增允 許結合更多寡核苷酸，這可以對減少突變轉錄本的機制有額外的效果。在本文語境中，本文 設計的寡核苷酸能夠在患者的細胞中、在患者的組織中和/或在患者中減少“包含重復的 基因轉錄”和/或“治療任何不穩(wěn)定順式元件DNA重復相關的遺傳病癥”。它優(yōu)選意味著其 減少包含延伸或不穩(wěn)定數(shù)目重復的重復的疾病相關的或導致疾病的或突變的轉錄本在所 述患者的細胞中、在所述患者的組織中和/或在所述中可檢測數(shù)目?？蛇x擇的或與前一句 組合的，所述寡核苷酸可以減少所述突變轉錄本的翻譯。因此本發(fā)明提供了不穩(wěn)定順勢元件DNA重復相關的遺傳病癥的治療方法，通過提 供只與重復序列互補和/或可以雜交的核酸分子。因此本方法優(yōu)先靶向擴增重復轉錄本并 且相對不影響正常的、野生型等位基因的轉錄本。這是有利地，因為正常的等位基因可以因 此提供基因的正常功能，取決于具有不穩(wěn)定DNA重復的特定基因，這至少是理想的，并且可 能在許多情況下對于待治療細胞和/或個體是必需的。因此在本發(fā)明語境中，本文設計的 寡核苷酸可被用于治療任何“順勢元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥”。所述病癥優(yōu)選任何 疾病，其中指定基因的等位基因包含重復序列即所謂的不穩(wěn)定重復序列，因為出現(xiàn)于所述 重復序列中重復的數(shù)目會隨著所述疾病發(fā)展而增加或擴增。所述重復數(shù)目的增加或擴增發(fā) 生在一個指定個體和/或指定個體的連續(xù)世代(后代)中。而且，本方法不限于特定不穩(wěn)定DNA重復相關的遺傳病癥，而是可應用于任何已 知的不穩(wěn)定DNA重復疾病，例如，但不僅限于有聚谷氨酰胺(CAG)重復的編碼區(qū)重復疾
6病亨廷頓病、霍河綜合征(Haw River syndrome)、肯尼迪氏病/脊髓延髓性肌萎縮、脊 髓小腦共濟失調或有聚丙氨酸(GCG)重復的疾病例如嬰兒痙攣癥、顱骨鎖骨發(fā)育異常 (cleidocranial dysplasia)、瞼裂狹小/上瞼下垂/倒轉型內眥贅皮綜合征、手腳生殖器癥 (hand-foot-genital syndrome)、并指(趾)多指(趾)畸形(synpolydactyly)、眼咽型肌 營養(yǎng)不良、前腦無裂畸形。如發(fā)明所述在基因非編碼區(qū)有重復的待治療的疾病包括三核苷 酸重復病癥(主要為CTG和/或CAG和/或CCTG重復)強直性肌營養(yǎng)不良1型、強直性肌 營養(yǎng)不良2型、弗里德賴希氏共濟失調(主要為GAA)、脊髓小腦共濟失調、自閉癥。而且本 發(fā)明的方法可用于易脆位點相關的重復病癥包括多種脆性X綜合征、雅各布森綜合征和其 他不穩(wěn)定重復元件病癥例如癲癇性肌陣攣、面肩胛臂營養(yǎng)不良和糖尿病2型的某些形式。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是重復區(qū)域特異的寡核苷酸可被直接給藥至細胞并且不依 賴基于載體的遞送系統(tǒng)。在現(xiàn)有技術中描述的技術，例如那些上文提到的用于治療DMl的 和從細胞中去除DMPK轉錄本的技術，需要使用基于載體的遞送系統(tǒng)以給予細胞足夠水平 的寡核苷酸。然而，由于目前對治療用重組DNA載體的嚴格的安全規(guī)范、用于廣泛臨床應用 的充足重組載體的生產(chǎn)和應用后對擴大的(或非特異的)應答有限的控制和逆轉，治療用 途的質?；虿《据d體的使用還較不理想。盡管如此，將來的優(yōu)化在這些領域是可能的，且質 粒的病毒遞送可以產(chǎn)生有利的長期持久的效應。本發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)了包含次黃嘌呤核苷 和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含 與擴增重復轉錄本的重復序列互補的序列或由其組成，由于它們用于雜交的分子靶標的擴 增，所述寡核苷酸相對于對轉錄本中獨特的序列特異的寡核苷酸，具有對其靶標顯著增加 的親和性和/或親和力。由于這種對重復擴增靶標轉錄本的高親和性和親和力，較低量的 所述寡核苷酸足夠產(chǎn)生足夠的抑制和/或通過RNA酶H降解、RNA干擾降解或改變的轉錄后 加工(包含但不僅限于剪接或外顯子遺漏)活性減少重復擴增的等位基因。包含次黃嘌呤 核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸 只與重復序列配對，可以通過合成產(chǎn)生并且當使用直接遞送寡核苷酸至細胞和/或組織的 普通應用技術直接遞送至細胞時足夠有效。當需要時，重組載體遞送系統(tǒng)可以通過使用本 發(fā)明的方法和寡核苷酸規(guī)避。如下文所解釋的，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含 有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸的用途十分有吸引力。例如，次黃嘌呤核苷 是已知的修飾的堿基，可以與三種堿基配對尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶。次黃嘌呤核苷是通 過將次黃嘌呤以β_Ν9-糖苷鍵連接到核糖環(huán)(也稱為呋喃核糖)上形成的核苷。次黃嘌 呤核苷通常存在于tRNA中并且對于在擺動堿基對中遺傳密碼的正確翻譯是必需的。擺動 堿基對是RNA 二級結構中基本的G-U和I-U/I-A/I-C對。其熱力學穩(wěn)定性與沃森-克里克 配對相當。擺動堿基對對于遺傳密碼的正確翻譯是重要的。遺傳密碼通過在反密碼子第一 個堿基使用修飾的堿基對彌補了氨基酸(20)和三重密碼子(64)的數(shù)量差異。相似地，當 設計用于聚合酶鏈式反應的引物時，次黃嘌呤核苷是有用的，在于它會無差別地與腺嘌呤、 胸腺嘧啶、胞嘧啶配對。這允許人們設計跨越單個核苷酸多態(tài)性的引物，而不需要擔心所述 多態(tài)性會干擾引物的退火效率。本發(fā)明中，出現(xiàn)在本文定義的寡核苷酸中的次黃嘌呤核苷 和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷優(yōu)選出現(xiàn)在所述寡核苷酸與本文 定義的重復序列互補的部分。然而，次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿 基對的堿基的核苷也可以出現(xiàn)在所述寡核苷酸不與重復序列互補的部分，例如在如本文隨后鑒定的靶向配體中。在本發(fā)明中，mRNA中(三)核苷酸重復擴增的表達可以導致多種依賴于三核苷酸 重復序列和相關基因的疾病。例如，DMl是由DMPK轉錄本的外顯子15中(CUG)n重復引起 的，而HD是由亨廷頓轉錄本的外顯子1中(CAG)n重復引起的。特異靶向這些擴增重復需要 兩種寡核苷酸，然而，使用包含次黃嘌呤核苷的寡核苷酸可以導致設計同時針對兩種轉錄 本激活的一種寡核苷酸，即包含(CIG)n、(IGC)n或(GCI)n或由其組成，優(yōu)選核苷酸總長為 9-50，更優(yōu)選為12-40，最優(yōu)選為15-30個。在整個申請的語境中，本領域技術人員會理解η 是優(yōu)選為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多的整數(shù)。然而， 所述寡核苷酸的長度本身并非是3的倍數(shù)。在實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸有3的倍數(shù) 的長度。因此，使用次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷可以減少必須設計或開發(fā)的可能用于針對數(shù)種疾病的藥物的核酸分子的數(shù)量。表2舉例 說明如何設計針對每種已知重復的包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶的寡核苷酸。在第一方面，本發(fā)明公開和教導了優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含 有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸用于制備診斷、治療或預防人類與順式元件 重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的藥物的用途，所述寡核苷酸優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴 的，以及所述寡核苷酸包含只與人類基因轉錄本的重復序列互補的序列或由其組成。因此 本發(fā)明提供了與順勢元件重復不穩(wěn)定相關的遺傳病癥的治療方法。在第二方面，本發(fā)明還涉及優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形 成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的并 且所述寡核苷酸優(yōu)選用于本發(fā)明的第一方面和/或應用于本發(fā)明的方法中以預防重復擴 增的轉錄本在細胞中積累和/或翻譯。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷 的寡核苷酸優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴的并且可以包含只與如下文定義的重復序列互補 的序列。這意味著所述寡核苷酸還可以包含不與待治療細胞中存在的序列互補的額外部 分。例如所述額外部分可以是克隆過程中加入的，和/或是如本文隨后定義的靶向部分。在可選擇的實施方案中，這可以意味著所述寡核苷酸還可以包含與待治療細胞中 存在的序列互補的額外部分。例如這一額外部分可以是側翼連接于重復區(qū)域的序列?；蛘?， 這一額外部分可以例如是不直接側翼連接于重復區(qū)域的序列?；蛘撸@一額外部分可以例 如是不直接側翼連接于重復區(qū)域并且包含功能基序(例如，但不僅限于，ESE)的序列。或 者，例如這一額外部分可以是不直接側翼連接于重復區(qū)域但由于二級或三級結構而接近。 優(yōu)選地，所述重復序列是本發(fā)明的寡核苷酸全長的至少50 %，更優(yōu)選至少60 %，甚至更優(yōu) 選至少70 %，甚至更優(yōu)選至少80 %，甚至更優(yōu)選至少90 %或更多。在最優(yōu)選實施方案中，本 發(fā)明的寡核苷酸由只與下文定義的重復序列互補的序列組成。例如，寡核苷酸可以包含只 與下文定義的重復序列互補的序列和隨后稱為靶向配體的靶向部分。重復或重復元件或重復序列或重復延伸在本文定義為至少3、4、5、10、100、1000 或更多連續(xù)重復的重復單元或重復核苷酸單元或包含在受試者包括人受試者的基因組中 轉錄的基因序列中的三核苷酸重復單元、或可選地4、5或6核苷酸重復單元的重復核苷酸 單元。本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選含有或包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷。更優(yōu)選地，所述寡核苷酸包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶。在本 發(fā)明的語境中，含有(contain)優(yōu)選意味著包含(comprise)。包含次黃嘌呤核苷和/或尿 嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸可以定義為其中至少一個核 苷被次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷取代的寡核苷 酸。本領域技術人員知道如何測試核苷是否含有能形成擺動堿基對的堿基。例如由于次黃 嘌呤核苷可與尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成堿基對，這意味著至少一個可與尿嘧啶、腺 嘌呤和/或胞嘧啶形成堿基對的核苷被次黃嘌呤核苷取代。然而，為了維護特異性，包含次 黃嘌呤核苷的寡核苷酸優(yōu)選包含至少一個可與尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成堿基對的核 苷取代。更優(yōu)選地，所有可與尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成堿基對的核苷都被次黃嘌呤核 苷取代。例如，與重復元件(CAG)n或(CUG)n互補的包含次黃嘌呤核苷的寡核苷酸會包含 (CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n 或由其組成。表 2 示出可與(CAG)n、(CUG)η, (CGG)η, (GCG) η、(GAA)η, (GCC)n或(CCUG)n互補的包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶的寡核苷酸的實例。 為了便利，在此表中η采用2。本領域技術人員會理解對于本發(fā)明的寡核苷酸，如本文隨后 定義的，η優(yōu)選為包含3-17的整數(shù)。可以通過在指定重復序列(或基序)的任意位置開始 或結束設計特異寡核苷酸，而沒有一個或其他因而產(chǎn)生的序列更有效的的損害，這對于本 領域技術人員也是顯而易見的。例如與重復元件(CAG)n或(CUG)n互補的包含次黃嘌呤核 苷的寡核苷酸會包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其組成。本發(fā)明也包括由于如本文 定義的寡核苷酸中至少一個核苷被次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基 對的堿基的核苷取代，與重復元件諸如(CAG)n互補的寡核苷酸可以包含(CIG)n或由其組 成。如上所提及的，所述互補的寡核苷酸也可以包含(IGC)n或(GCI)n或由其組成。如果以 (CIG)n為例，以η為3為例，本發(fā)明包括基于諸如(CIG) 3的指定式的在所示位置包含1或 2或3個次黃嘌呤核苷的任何可能的寡核苷酸(CTG) (CIG) (CTG)、(CIG) (CTG) (CTG)、(CIG) (CTG)(CIG)、(CIG)(CIG) (CTG)、(CIG)(CIG) (CIG)。包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡 核苷酸，所述寡核苷酸優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴的，可以是單鏈的或雙鏈的。雙鏈的意 味著寡核苷酸是兩條互補鏈形成的異質二聚體，例如在siRNA中。在優(yōu)選實施方案中，寡核 苷酸是單鏈的。本領域技術人員會理解盡管單鏈寡核苷酸可以形成內部雙鏈結構。然而這 種寡核苷酸在本發(fā)明語境中仍然被稱為單鏈核苷酸。單鏈寡核苷酸與雙鏈siRNA寡核苷酸 相比有數(shù)種優(yōu)勢(i)其合成預期比兩條互補siRNA鏈更為簡單；(ii)有更寬的化學修飾 可能性范圍以優(yōu)化更有效地攝入細胞、更好的(生理的)穩(wěn)定性和減少可能的遺傳不利效 應；(iii) siRNA有更高的非特異作用(包括脫靶基因)和放大的藥理學(例如，通過治療 方案或劑量對有效性和選擇性的較小控制可能性)的可能性和(iv) siRNA較不可能在細胞 核中起作用并且不能直接針對內含子。因此，在第一方面的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及優(yōu) 選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的單鏈寡核 苷酸用于制備用于診斷、治療或預防人類與順式元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的藥物 的用途，所述寡核苷酸優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴的，以及所述寡核苷酸包含只與人類基 因轉錄本的重復序列互補的序列或由其組成。寡核苷酸優(yōu)選包含至少9至約50個與重復元件互補的連續(xù)核苷酸，或至少9-50 個與重復元件互補的連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選12-45個核苷酸，甚至更優(yōu)選12-40個核苷酸，甚
9至更優(yōu)選12-30個，甚至更優(yōu)選15-30個核苷酸以及最優(yōu)選為與優(yōu)選有三核苷酸重復單元 或四核苷酸重復單元的重復延伸互補的12-25個核苷酸。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿 嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴 的，可以與轉錄本編碼區(qū)域優(yōu)選聚谷氨酰胺(CAG)或聚丙氨酸(GCG)編碼域中的重復延伸 互補和/或能夠與之雜交。所述寡核苷酸也可以與存在于前體RNA分子中的非編碼區(qū)域例 如5’或3’非翻譯區(qū)域或內含子序列互補和/或能夠與之雜交。在優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動 堿基對的堿基的核苷、優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴的并且用于本發(fā)明的方法的寡核苷酸 包含與具有選自(CAG) n、(GCG) η、(CUG) η、(CGG) η、(GAA) η、(GCC) η 和(CCUG) η 的重復核苷 酸單元作為重復核苷酸單元的重復元件互補的序列或由其組成。所述寡核苷酸可以是單或 雙鏈寡核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，所述寡核苷酸是雙鏈的。因為寡核苷酸優(yōu)選包含至少9 至約50個與重復元件互補的連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選包含至少9-50個與重復元件互補的連續(xù) 核苷酸，這意味著η是包含3-17的整數(shù)，更優(yōu)選為4-15，甚至更優(yōu)選為4_14，甚至更優(yōu)選為 4-13，甚至更優(yōu)選為4-10，甚至更優(yōu)選為5-10和最優(yōu)選為4-8或4_9。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷 和優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中聚谷氨酰胺(CAG)n域互補的序列 或由其組成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防由于HD、HDL2/JPH3、SBMA/ AR、SCAl/ATXU SCA2/ATX2、SCA3/ATX3、SCA6/CACNAIA、SCA7、SCA17、AR 或 DRPLA 人基因重 復擴增引起的人類病癥亨廷頓病、幾種形式的脊髓小腦共濟失調或霍河綜合征、X連鎖的脊 髓和延髓性肌萎縮和/或齒狀核紅核蒼白球萎縮癥。這類寡核苷酸，優(yōu)選包含次黃嘌呤核 苷的這類寡核苷酸優(yōu)選包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其組成。對于其他優(yōu)選可能 性見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中聚丙氨酸(GCG)n域互補的序列 或由其組成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防由于ARX、CBFA1、F0XL2、 HOXAl3, H0XD13、0PDM1PABP2、TCFBRl或ZIC2人基因重復擴增引起的人類病癥嬰兒痙攣 癥、顱骨鎖骨發(fā)育不良、瞼裂狹小、手腳生殖器癥、并指(趾)多指(趾)畸形、眼咽型肌營 養(yǎng)不良和/或前腦無裂畸形。對于優(yōu)選的寡核苷酸見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中(CUG)n重復互補的序列或由其組 成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防分別由于DM1/DMPK、SCA8或JPH3基 因重復擴增引起的人類遺傳病癥強直性肌營養(yǎng)不良1型、脊髓小腦共濟失調8和/或類亨 廷頓病2。優(yōu)選地，這些基因來自人的來源。這類寡核苷酸，優(yōu)選這類含有次黃嘌呤核苷的 寡核苷酸優(yōu)選包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其組成。對于其他優(yōu)選的寡核苷酸， 見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中(CCUG)n重復互補的序列或由其 組成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防由于DM2/ZNF9基因重復擴增引起 的人類遺傳病癥強直性肌營養(yǎng)不良2型。對于優(yōu)選的寡核苷酸，見表2。
優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中(CGG)n重復互補的序列或由其 組成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防由于FRAXA/FMR1、FRAXE/FMR2和 FRAXF/FAM11A基因重復擴增引起的人類脆性X綜合征。對于優(yōu)選的寡核苷酸，見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中(CCG)n重復互補的序列或由其組 成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防由于FRA11B/CBL2基因重復擴增引起 的人類遺傳病癥雅各布森綜合征。對于優(yōu)選的寡核苷酸，見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與轉錄本中(GAA)n重復互補的序列或由其組 成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防人類遺傳病癥弗里德賴希氏共濟失 調。對于優(yōu)選的寡核苷酸，見表2。優(yōu)選包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及包含與內含子中(ATTCT)n重復互補的序列或由其 組成的寡核苷酸的用途，特別用于診斷、治療和/或預防人類遺傳病癥脊髓小腦共濟失調 10型(SCAlO)。對于優(yōu)選的寡核苷酸，見表2。所述重復互補的寡核苷酸或用于本發(fā)明方法中的寡核苷酸可以包含以下或 由以下組成RNA、DNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、嗎啡啉磷酰二胺(morpholino phosphorodiamidates) (PMO)、乙烯橋核酸(ENA)或其包含天然存在的DNA和RNA核苷酸 以及合成的、修飾的核苷酸組合物的混合物或雜交物。本領域技術人員也會認識到，任何 人類核苷酸堿基，并且任何其他天然或合成的核苷酸堿基或其衍生物都可以被使用，例如 2_胺基嘌呤、胸腺嘧啶代替尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基次黃嘌呤核苷、5-甲基鳥嘌呤核 苷、二胺基腺嘌呤。本領域技術人員也會認識到有許多寡核苷酸的合成衍生物。因此“寡核 苷酸”包括，但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、二胺基硫代磷酸酯 和H-磷酸酯衍生物。它還包括天然存在的和合成的寡核苷酸衍生物。在這類寡核苷酸中，磷酸二酯主鏈化學還可以被其他修飾取代，例如硫代磷酸酯 或甲基磷酸酯。已存在其他的寡核苷酸修飾，新的寡核苷酸修飾也可能被開發(fā)和用于實踐。 然而，所有這些寡核苷酸具有寡聚體的特征，能夠序列特異結合于RNA。因此，在優(yōu)選實施 方案中，寡核苷酸包含以下或由以下組成有或沒有含有硫代磷酸酯的主鏈的RNA核苷酸、 2’ 0-取代的RNA核苷酸、DNA核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、嗎啡啉 磷酰二胺、乙烯橋核酸(ENA)核苷酸或其混合物。至少部分含有天然存在的DNA核苷酸的寡核苷酸用于在細胞中通過RNA酶H活性 (EC. 3. 1. 26. 4)誘導DNA-RNA雜交分子降解。包含天然存在的RNA核糖核苷酸或類RNA合成的核糖核苷酸的寡核苷酸可以應用 于本發(fā)明的方法中以形成雙鏈RNA-RNA雜交物，其通過RNA干擾或沉默(RNAi/siRNA)途徑 作為酶依賴性反義起作用，包括通過正_反義鏈配對的靶RNA識別，隨后通過RNA誘導的沉 默復合體(RISC)降解靶RNA?？蛇x擇地或另外地，空間位阻的反義寡核苷酸(RNA酶H非依賴反義)干擾基因 表達或其他前體RNA或信使RNA依賴的細胞內過程，具體是但不限于RNA剪接和外顯子遺
11漏，通過結合于RNA轉錄本的靶序列以及阻礙例如翻譯的過程或封閉剪接供體或剪接受體 位點。利用修飾的反義寡核苷酸改變剪接和外顯子遺漏技術有很多文獻記載，是本領域技 術人員已知的，并且例如可以在US6, 210, 892、W09426887、W0041083446和W002124906中找 到。此外，空間位阻可以抑制蛋白質、核因子等的結合并且因此有助于在如DMl的疾病中減 少核積聚或核糖核酸灶。本文定義的可以包含合成的或修飾的核苷酸、與(擴增)重復序列互補的寡核苷 酸用于本發(fā)明的方法中，用于通過siRNA/RNA干擾或沉默途徑減少或失活包含重復的轉錄 本。用于本發(fā)明中方法的單或雙鏈寡核苷酸可以包含以下或由以下組成DNA核酸、 RNA核酸、2’ -0取代的核糖核苷酸(優(yōu)選2’ -0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸)包括烷基 和甲氧基乙基取代(包括本文確定的2’-4’約束的變體)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)和嗎 啡啉(PMO)反義寡核苷酸和乙烯橋核苷酸(ENA)和其組合物，任選地RNA酶H依賴反義的嵌 合體。優(yōu)選的寡核苷酸包含2’-0_取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸，優(yōu)選其中所述2’-0取代 是甲氧基乙基(MOE)和/或甲基(Me)和/或2’0，4’C亞甲基橋(LNA)和/或2’0，4’C約 束的乙基(cEt)和/或2，0，4，C約束的甲氧基乙基(cMOEt)(參考文獻Short Antisense Oligonucleotides with Novel 2' ~4' Conformationaly Restricted Nucleoside Analogues Analogues Show Improved Potency without Increased Toxicityin Animals, Punit P. Seth, Andrew Siwkowski, Charles R. Allerson, Guillermo Vasquez, Sam Lee, Thazha P. Prakash, Edward V. ffancewicz, Donna ffitchell,禾口 Eric E. Swayze, J. Med. Chem.，2009，52 (1)，10-13)。將鎖核酸整合至所述寡核苷酸改變堿基配對后螺旋構象并且 增加雙鏈體穩(wěn)定性。整合LNA堿基至所述寡核苷酸序列可以因此用于增加本發(fā)明的互補 寡核苷酸在體外和體內活化的能力，以增加RNA降解抑制轉錄本積累或增加外顯子遺漏能 力。肽核酸是人工DNA/RNA模擬物，其主鏈是假肽而不是糖，其具有通過增加的結合和較 高解鏈溫度與互補DNA寡聚體形成極穩(wěn)定的復合體的能力。PNA也是本發(fā)明中反義和外 顯子遺漏應用的優(yōu)等試劑。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明中方法的寡核苷酸至少部分或全部地包 含2’ -0-甲氧基硫代磷酸酯RNA核苷酸、2’ -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸和/或鎖核酸 (LNA)。甚至更優(yōu)選地，寡核苷酸包含LNA和2’ -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸或由其組 成。在另一優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸包含LNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸或由其組成。在 另一優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸包含LNA和2’ -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸和硫代磷酸 酯DNA核苷酸或由其組成。在另一優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸包含LNA和2’ -0-甲氧基乙 基硫代磷酸酯RNA核苷酸或由其組成。在另一更優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸由PMO寡核苷酸 組成。在另一優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸由2’-0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸組成。最優(yōu) 選地，這些修飾應用于會通過其他機制而不是RNA酶H使突變mRNA分解或抑制的構型中。 最優(yōu)選用于本發(fā)明中以用于順式元件重復不穩(wěn)定性遺傳病癥的診斷、治療或預防的寡核苷 酸包含與選自(CAG) n、(GCG) η、(CUG) η、(CGG) η、(CCG) η、(GAA) η、(GCC) η 禾Π (CCUG) η 的重 復序列互補的序列或由其組成，長度為9-50，更優(yōu)選為12-40，最優(yōu)選為12-25個核苷酸，以 及包含2’ -0-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸、2’ -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸、LNA 核苷酸或PMO核苷酸?？蛇x擇地或與一個或多個之前定義的優(yōu)選實施方案組合，本發(fā)明還具體地提供了包含只與基因轉錄本的重復序列互補的序列或由其組成的寡核苷酸，以及它制備用于治療 或預防人類順式元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥藥物的用途，并且該寡核苷酸是RNA酶 H基本上非依賴的寡核苷酸。RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸優(yōu)選定義為如下的寡核苷酸結合于靶向的RNA 后基本上不能募集和/或激活RNA酶H。RNA酶H的募集和/或激活可以通過將待測靶向的 RNA和寡核苷酸與優(yōu)選來自大腸桿菌(E coli)的RNA酶H接觸后使用標準RNA酶H消化檢 測評價。這類檢測為本領域技術人員所已知并且可以如Honcharenko D et al或Kurreck J et al (Honcharenko D et al, (2007), Biochemistry,46 :5635_5646，禾口 Kurreck J et al (2002), Nucl. Ac. Res. ,30 :1911_1918)所描述的來實施。在本發(fā)明語境中，寡核苷酸或 指定劑量或濃度的寡核苷酸優(yōu)選所述基本不能募集和/或激活RNA酶H和/或所述基本上 RNA酶H非依賴的寡核苷酸，當在以上定義的兩種試驗中的至少一種時，少于50%的靶向的 RNA被消化。更優(yōu)選地，少于45 %的靶向的RNA被消化，甚至更優(yōu)選少于40 %、35 %、30 %、 25%,20%,15%,10%,5%或更少。最優(yōu)選地，寡核苷酸或指定劑量或濃度的所述寡核苷酸 不能募集和/激活RNA酶H。在優(yōu)選實施方案中，預期當寡核苷酸在濃度范圍中使用時，其 中所述寡核苷酸作為用于本文定義的所述疾病的藥物，所述寡核苷酸基本上不能募集和/ 或激活RNA酶H和/或所述RNA酶H基本上非依賴的。在這種情況下，優(yōu)選在這類試驗中 沒有檢測到靶向的RNA的消化。這類寡核苷酸是RNA酶H非依賴的寡核苷酸。迄今為止反 義的許多形式已被描述包括降解靶mRNA的酶依賴機制例如RNA酶H活性。RNA酶H只裂解 RNA-DNA雙鏈體并且因此為了下調mRNA，反義寡核苷酸應該包含脫氧核糖(DNA)核苷酸。輕 微修飾例如使用硫代磷酸酯脫氧核糖核苷酸是被允許的以保留這種RNA酶H活性。嵌合寡 核苷酸(或寡聚體)由于其穩(wěn)定的性質(提高生理穩(wěn)定性或半衰期)已被使用，例如在寡 核苷酸的3’和5’末端應用2’ 0-烷基和2’ 0-甲氧基乙基修飾。然而，通過寡核苷酸-靶 RNA雙鏈體的RNA酶H募集，仍然需要脫氧核糖核苷酸延伸。這些嵌合寡核苷酸(有或沒有 硫代磷酸酯主鏈修飾)被稱為間斷體(gapmer)(見W02007/089611)。人們相信這類(脫氧 核糖)間斷應該優(yōu)選至少長為6個核苷酸并且更優(yōu)選為長為10個核苷酸以便可以募集和 /或激活RNA酶H。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸被設計為在結合于靶向的RNA后基 本上不募集和/或激活RNA酶H。本發(fā)明優(yōu)選使用寡核苷酸(寡聚體)，其優(yōu)選基本上不能 募集和/或激活RNA酶H。這類寡核苷酸可以包含例如2’ -0主鏈修飾，優(yōu)選2’ 0-烷基或 2’0_甲氧基乙基、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或嗎啡啉反義。這類寡核苷酸可以甚至是包 含脫氧核苷酸的嵌合分子，但優(yōu)選具有少于9個或最優(yōu)選有少于6個脫氧核苷酸彼此相鄰 (連續(xù)脫氧核苷酸)。驚人地，本發(fā)明證明RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸可被用于制備用于治療或 預防人類順式元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的藥物。所述RNA酶H基本上非依賴的寡 核苷酸比相應的經(jīng)典的RNA酶H依賴的寡核苷酸更有吸引力，因為我們能夠合理地預期這 類RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸比相應的RNA酶H依賴的對應物更容易被合成、毒性 更小和更穩(wěn)定。因此，在優(yōu)選實施方案中，提供了寡核苷酸和其用途，其中所述用途如上文所定義 的，并且其中所述寡核苷酸長度為約9至約50個核苷酸，在其5’或3’末端的至少一個被取代并且在其序列的其余部分包含少于9，更優(yōu)選少于6個的連續(xù)脫氧核糖。寡核苷酸的更 優(yōu)選的長度已經(jīng)在本文定義。優(yōu)選的取代包括含硫代磷酸酯的主鏈。優(yōu)選的含硫代磷酸酯 的主鏈包括2’ -0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸。優(yōu)選的2’ -0-取代的RNA硫代磷酸酯 核苷酸包括2’ -0-取代的甲氧基乙基和/或甲基和/或2’ 0，4’ C亞甲基橋(LNA)和/或 2，0，4，C約束的乙基(cEt)和/或2，0，4，C約束的甲氧基乙基(cMOEt)。如本文定義的，寡核苷酸在其5’或3’末端的至少一個被取代并且在其序列的其 余部分包含少于9、更優(yōu)選少于6個的連續(xù)的脫氧核糖。所述序列的其余部分優(yōu)選在序列的 中心。在其5’或3’末端均被取代并且在其序列的中心包含9或更多個連續(xù)脫氧核糖的寡 核苷酸被稱為間斷體(gapmer)。間斷體已在WO 2007/089611被詳細描述。間斷體被設計 為能夠募集和/或激活RNA酶H。不希望被理論限制，相信RNA酶H通過結合于脫氧核糖 形成的間斷體的中心區(qū)域被募集和/或激活。本發(fā)明的RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸 被設計為以便具有基本上不能募集和/或激活RNA酶H的中心區(qū)域。在優(yōu)選實施方案中， 本發(fā)明寡核苷酸的序列的其余部分，更優(yōu)選其中心部分包含少于9、8、7、6、5、4、3、2、1或沒 有脫氧核糖。因此，本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選如上文定義的部分至全部被取代。部分取代的 優(yōu)選意味著寡核苷酸包含其至少50 %的核酸已被取代，至少55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、95%或 100% (即全部)被取代。因此，在優(yōu)選實施方案中，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動 堿基對的堿基的核苷、優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的和用于本發(fā)明的寡核苷酸包含與選自 (CAG) n、(GCG) η、(CUG) η、(CGG) η、(GAA) η、(GCC) η 和(CCUG) η 的重復序列互補的序列或由 其組成，長度為9-50個核苷酸，并且進一步表征為a)包含2’ -0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸例如2’ _0_甲基或2’ _0_甲氧基 乙基或2’ _0，4，C乙烯基(cEt)、2，_0，4，C甲氧基乙烯基(cMOE) RNA硫代磷酸酯核苷酸、 LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以用于任何組合和/或同DNA硫代磷酸酯核苷酸 或RNA核苷酸使用；和/或b)是單鏈寡核苷酸。因此，在另一優(yōu)選實施方案中，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成 擺動堿基對的堿基的核苷、優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的和用于本發(fā)明的寡核苷酸包含與 選自(CAG) n、(GCG) η、(CUG) η、(CGG) η、(GAA) η、(GCC) η 和(CCUG) η 的重復序列互補的序列 或由其組成，長度為9-50個核苷酸，并且進一步表征為a)包含2’ -0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸例如2’ _0_甲基或2’ _0_甲氧基乙 基或2’ _0，4’ C乙烯基(cEt)、2’ _0，4’ C甲氧基乙烯基(cMOEt) RNA硫代磷酸酯核苷酸、 LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以用于任何組合和/或同DNA硫代磷酸酯核苷酸 或RNA核苷酸使用；和/或b)是雙鏈寡核苷酸。在另一優(yōu)選實施方案中，上述優(yōu)選修飾會應用于通過其他機制而不是RNA酶H使 突變mRNA分解的構型中。如果，本發(fā)明涉及具有兩條互補鏈的雙鏈寡核苷酸，其反義鏈，只與人的基因轉錄 本中的重復序列互補，這種雙鏈寡核苷酸優(yōu)選不是應用于培養(yǎng)的猴成纖維細胞(C0S-7)或 人成神經(jīng)細胞瘤(SH-SY5Y)細胞系的具有反義RNA鏈(CUG)7和有義RNA鏈(GCA)7WsiRNA,所述細胞或細胞系有或沒有用融合了 GFP的人亨廷頓基因外顯子1轉染，如Wanzhao Liu et al (Wanzhao Liu et al, (2003) ,Proc. Japan Acad, 79 :293_298)所描述的。更優(yōu)選地, 本發(fā)明即不涉及雙鏈寡核苷酸siRNA(反義鏈為(CUG)7和有意義鏈為(GCA)7),也不涉及其 制備用于治療或預防亨廷頓病、甚至更優(yōu)選用于治療或預防包含亨廷頓病基因外顯子1構 建體的藥物的用途。盡管使用單寡核苷酸可以充分地減少諸如核積累的DMPK或ZNF9轉錄本或其片段 的重復擴增的轉錄本的數(shù)量，或充分地減少重復擴增的HD蛋白質的積累，組合2、3、4、5或 更多寡核苷酸也在本發(fā)明的范圍內。包含與轉錄本重復部分互補的序列或由其組成的寡核 苷酸可以有利地與另一寡核苷酸組合，所述另一寡核苷酸包含與含重復的轉錄本的獨特序 列互補和/或能夠與之雜交的序列或由其組成。如本文前面定義的，本發(fā)明包括含有次黃 嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷和優(yōu)選RNA酶H基本上 非依賴的寡核苷酸的用途。本發(fā)明也包括將含有次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能 形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸與為RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸另一寡核 苷酸組合使用。包含重復特異性寡核苷酸的本發(fā)明的方法和本發(fā)明的藥物也可以與任何其 他針對順式元件重復不穩(wěn)定性遺傳病癥的治療或藥物組合。出于診斷目的，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的 堿基的核苷、優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的和用于本發(fā)明方法中的寡核苷酸可以帶有放 射性標記或熒光標記以允許在樣品、細胞、體內原位細胞、離體或體外檢測轉錄本。對于 強直性肌營養(yǎng)不良，標記的寡核苷酸可被用于診斷目的，用于DMPK或ZNF9RNA轉錄本分 子和相關蛋白質的核聚集體的可視化。熒光標記可以包括CY3、CY5、FITC、TRITC、若丹明 (Rhodamine)、GFP和其他類似物。放射性標記可以包括3H、35S、32Λ3ρ、125I。酶和/或免疫原 性半抗原例如地高辛、生物素和其他分子標簽(HA、Myc、FLAG、VSV、IexA)也可以使用。因 此，在另一方面，本發(fā)明公開了體外或離體檢測和/或診斷方法，其中使用了如上文定義的 包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷以及優(yōu)選RNA 酶H基本上非依賴的寡核苷酸。包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷、優(yōu) 選RNA酶H基本上非依賴的以及按照本發(fā)明使用的寡核苷酸適用于直接給藥至受順式元件 重復不穩(wěn)定性遺傳病癥侵襲或有發(fā)展為該病癥風險的個體體內的細胞、組織和/或器官， 以及可以直接進行體內、離體或體外給藥?？蛇x擇地，所述寡核苷酸可以通過能夠使人的細 胞表達所述寡核苷酸的核酸載體提供，以允許所述寡核苷酸的持續(xù)來源。可以將本發(fā)明的 寡核苷酸分子以表達載體形式提供給待治療的細胞、組織、器官和/或受試者，所述表達載 體能夠使人的細胞表達所述寡核苷酸。優(yōu)選通過基因遞送媒介將載體導入細胞。優(yōu)選用于 遞送的媒介是病毒載體例如逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)，腺病毒載體、賽姆利 基森林病毒載體(Semliki Forest virus vectors) (SFV)、EBV載體等。質粒、人工染色體、 適用于在人的細胞基因組中進行靶向同源重組和整合的質粒也可以適用于遞送寡核苷酸。 優(yōu)選用于本發(fā)明的是那些其中轉錄受polIII啟動子驅動，和/或其中轉錄本是與Ul或U7 轉錄本融合的形式的載體，其在遞送小轉錄本時產(chǎn)生好的效果。在優(yōu)選實施方案中，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基 對的堿基的核苷以及優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸的使用濃度范圍為約0. InM至
15約1 μ M。更優(yōu)選地，使用濃度范圍為約0. 3至約400ηΜ，甚至更優(yōu)選地，約1至約200ηΜ。優(yōu) 選的濃度為0. Inm至1 μ Μ。更優(yōu)選地，使用濃度為0. 3至400ηΜ，甚至更優(yōu)選地1至200ηΜ。 如果使用了數(shù)種寡核苷酸，這一濃度可以指寡核苷酸的總濃度或加入的每種寡核苷酸的濃 度。如上文給出的寡核苷酸的濃度范圍是在體外或離體使用的優(yōu)選濃度。本領域技術人員 會理解取決于使用的寡核苷酸、待治療的靶細胞、靶基因和其表達水平，使用的培養(yǎng)基和轉 染與孵育條件，使用的寡核苷酸的濃度還可以變化并且可能需要進一步優(yōu)化。更優(yōu)選地，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基 的核苷、優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的和用于本發(fā)明以預防、治療或診斷順式元件重復不穩(wěn) 定性病癥的寡核苷酸通過合成制備，并且以藥學上可接受的組合物的制劑形式直接給予細 胞、組織、器官和/或患者或個體或受試者。將所述藥物組合物遞送至受試者優(yōu)選通過一種 或多種腸胃外注射實施，例如靜脈內的和/或皮下的和/或肌肉內的和/或鞘內的和/或 腦室內的給藥，優(yōu)選在人體的一個或多個部位注射。鞘內或腦室內給藥(在腦脊髓流體中) 優(yōu)選通過向受試者體內引入擴散泵實現(xiàn)。數(shù)種擴散泵對于本領域技術人員是已知的。包含與本文定義的重復序列互補的序列或由其組成的用于靶向寡核苷酸分子的 藥物組合物可以包含多種賦形劑例如稀釋劑、填充劑、防腐劑、增溶劑等，這些可以在例如 The Science and Practice of Pharmacy (制藥科學與實踐)，第 20 版· Baltimore，MD : Lippincott Williams & ffilkins,2000 中找到。本發(fā)明的方法特別地優(yōu)選使用可以輔助遞送所述寡核苷酸至細胞和進入細胞的 賦形劑，特別是能夠形成將復合于或捕獲于泡囊或脂質體的物質和/或寡核苷酸遞送通過 細胞膜的復合物、泡囊和/或脂質體的賦形劑。許多這種物質在本領域內是已知的。合適 的物質包括聚乙烯基亞胺(PEI)、ExGen 500、合成的兩性分子(SAINT-18)、lipofectinTM、 DOTAP和/或能自我裝配成微粒的病毒殼體蛋白質，其能夠遞送所述寡核苷酸至細胞。 Lipofectin代表脂質體轉染劑的實例。其由兩種脂質組分組成，陽離子脂質N_[l_(2，3 二 油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯銨(DOTMA) (cp. D0TAP，其為甲基硫酸鹽)和中性脂質二 油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine) (DOPE)。中性組分介導細胞內 釋放。另一組遞送系統(tǒng)是聚合納米粒。眾所周知為DNA轉染試劑的如二乙氨基乙氨基乙基 (DEAE)-葡聚糖(di ethyl amino ethylaminoethyl (DEAE)-dextran)之類的聚陽離子，可 以與氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(hexylcyanoacrylate) (PHCA)結合形成能 夠遞送寡核苷酸透過細胞膜進入細胞的陽離子納米粒。除了這些常用的納米粒之外，陽離 子肽魚精蛋白提供了可選擇的途徑以將寡核苷酸配制成膠體。這種膠體納米粒系統(tǒng)可以形 成所謂的蛋白微粒(proticles)，其可通過簡單的自我裝配過程制備以包裹和介導本文定 義的寡核苷酸在細胞內釋放。本領域技術人員可以選擇和調整任何上述或其他可商購的可 選擇的賦形劑和遞送系統(tǒng)以包裹和遞送用于本發(fā)明的寡核苷酸以遞送用于治療人類順式 元件重復不穩(wěn)定性病癥的這類寡核苷酸。另外，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核 苷和優(yōu)選RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸可以共價或非共價連接于經(jīng)特異設計以促進攝 入細胞、細胞質和/或其核的靶向配體。這類配體可以包括(i)識別細胞、組織或器官特異 元件、促進細胞攝入的化合物(包括但不僅限于肽(樣)(結構)和/或(ii)能夠促進寡 核苷酸攝入至細胞和/或從泡囊例如內體或溶酶體細胞內釋放的化學化合物。這類靶向配體也包括促進寡核苷酸通過血液腦屏障攝入至腦中的分子。因此，在優(yōu)選實施方案中，包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動 堿基對的堿基的核苷以及優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸是藥物的一部分或被視 為藥物并且被提供至少一種賦形劑和/或用于遞送的靶向配體和/或遞送所述寡核苷酸至 細胞和/或增強其細胞內遞送的遞送裝置。因此，本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的寡核苷酸并 且還包含至少一種賦形劑和/或用于遞送的靶向配體和/或遞送所述寡核苷酸至細胞和/ 或增強其細胞內遞送的遞送裝置的藥學上可接受的組合物。本發(fā)明也涉及用于減少細胞內包含重復的基因轉錄本的方法，其包括單鏈或雙鏈 寡核苷酸的給藥，所述寡核苷酸包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿 基對的堿基的核苷、優(yōu)選為RNA酶H基本上非依賴的以及優(yōu)選包含2’ -0-取代的RNA硫代 磷酸酯核苷酸例如2’ -0-甲基或2’ -0-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸或LNA或cET 或cMOE核苷酸或PMO核苷酸，并且具有只與重復序列互補的9-50個核苷酸的長度。所述 核苷酸可以組合和/或與DNA硫代磷酸酯核苷酸一起使用。在本文和其權利要求中，動詞“包含”和其詞形變化以其非限定意義使用，意指包 括該詞之后的項目，但并不排除沒有具體提及的組合和/或項目。另外動詞“組成為(to consist) ”可以被“基本由...組成”替代，意指本文定義 的分子或基于病毒的載體或組合物除具體鑒定的組分還可以包含額外的組分，所述額外的 組分不改變本發(fā)明的獨特特征。優(yōu)選地，單詞“約(about)，，或“大約(approximately)，，與數(shù)值聯(lián)用時(約10)意 指該值可以是比給定值10大或小的值。另外，通過不定冠詞“一個(a)”或“一個(an)”提及的元素并不排除多于一個元 素存在的可能性，除非上下文明確地要求為一個并且只有一個元素。因此不定冠詞“a”或 "an"通常意味著“至少一個”。通過下面的實施例進一步說明本發(fā)明，這些實施例不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。


Sl 顯示以不同濃度的寡核苷酸PS58或PS142處理后DM500肌管中濃度應答曲 線。寡(核糖)核苷酸PS58顯示出全長2’0_甲基硫代磷酸酯修飾的主鏈以及寡(脫氧核 糖)核苷酸PS142顯示全長硫代磷酸酯DNA主鏈。PS58比PS142更有效地抑制突變擴增 的hDMPK轉錄本。PS58，不像PS142，包含通過寡核苷酸防止RNA酶H介導的靶mRNA降解 的2’ OMe修飾。hDMPK的表達通過Northern印跡分析隨后以磷光顯像儀分析定量。所述 信號用GAPDH信號標準化并且相對于模擬(mock)處理后的應答表示。圖 2 對來自患亨廷頓病的男性患者的GM00305成纖維細胞用寡核苷酸PS57 (CUG) 7或 PS261 (CIG) 7在不同濃度處理后進行RT-PCR分析。GM00305的分析顯示了代表突變(擴增 的疾病)等位基因和正常等位基因的轉錄本的兩種RT-PCR產(chǎn)物。PS57和PS261顯示劑量 依賴的對突變轉錄本的抑制。圖 3
對來自患亨廷頓病的男性患者的GM00305成纖維細胞或來自健康志愿者的PAFCl 成纖維細胞用寡核苷酸PS262(UGC)7在不同濃度處理后進行RT-PCR分析。對照處理的 GM00305分析顯示了代表突變(擴增的疾病)等位基因和正常等位基因的轉錄本的兩種 RT-PCR產(chǎn)物，而PAFCl細胞的分析顯示了一種RT-PCR產(chǎn)物，表示兩個正常等位基因的轉錄 本。PS262對GM00305中突變轉錄本比對GM00305或PAFCl中正常轉錄本顯示更有效的抑 制。圖 4.突變轉錄本的RT-PCR產(chǎn)物(來自圖2和圖3也描述的實驗)的水平確定為與正 常轉錄本的比，并且表示為對照處理(設為100%)的百分比。本圖描述在GM00305細胞中 用不同濃度的PS262 (方塊)、PS57 (圓形)和PS261 (三角形)處理后突變比正常等位基因 轉錄本的濃度依賴的減少。圖 5.對來自患亨廷頓病的男性患者的GM00305成纖維細胞用寡核苷酸PS57處理4h后 進行RT-PCR分析。處理開始后的24h(圓形)或48h(菱形)時收集細胞。突變轉錄本的 RT-PCR產(chǎn)物的水平確定為與正常轉錄本的比，并且表示為對照處理(設為100% )的百分 比。本圖描述在PS574h處理時段開始之后的24h(圓形)或48h(菱形)時突變比正常等 位基因轉錄本的濃度依賴的減少。圖 6.對來自患亨廷頓病的男性患者的GM00305成纖維細胞用寡核苷酸PS278或PS277 或對照處理后進行RT-PCR分析。PS278和PS277原則上均是結合于靶mRNA時能夠激活RNA 酶H的間斷體(只在寡核苷酸的3’和5’末端包含2’ 0-甲基取代的嵌合體的)。PS277包 括單個錯配。GM00305的分析顯示了兩種RT-PCR產(chǎn)物，其表示源自突變(擴增的疾病)等 位基因和正常等位基因的轉錄本。圖 7.GM00305中突變轉錄本的RT-PCR產(chǎn)物(來自圖2和圖6也描述的實驗)的水平確 定為與正常轉錄本的比，并且表示為對照處理(設為100%)的百分比。本圖描述在用50nM PS57(封閉柱)、PS278(條點柱)和PS261(條紋柱)處理后突變比正常等位基因轉錄本的 濃度依賴的減少。圖8顯示了用200nM寡核苷酸PS259 (有可選擇的起始核苷酸)或200nM寡核苷 酸PS261(包含替代腺苷(A)的次黃嘌呤核苷(I))處理后DM500肌管中hDMPK mRNA水平 (實心柱)。hDMPK的表達通過Northern印跡分析隨后以磷光圖像儀分析定量。所述信號 用GAPDH信號標準化并且相對于模擬處理后的應答表示。以PS259或PS261處理導致hDMPK mRNA水平減少。實心柱描述hDMPK和空心柱描述m (鼠)DMPK ；mDMPK不包含三聯(lián)核苷酸重 復區(qū)域。H顯示了用PEI (200nM寡核苷酸)或可選擇地用脂質轉染胺 (Iipofectamine) 2000 ( 50nM寡核苷酸)轉染后，用雙鏈siRNA寡核苷酸組合物ΡΙ-01或PI-02 處理后DM500肌管中的hDMPK mRNA水平。圖8顯示的處理后hDMPK信號表明相對于PS58， siRNA寡核苷酸抑制的缺乏。hDMPK的表達通過Northern印跡分析隨后以磷光圖像儀分析 定量。所述信號用GAPDH信號標準化并且相對于模擬處理后的應答表示。PI-Ol或PI-02
18處理均專門針對重復的重復序列，與有效的寡核苷酸PS58相比并不導致hDMPK mRNA水平 的減少。
實施例實施例1.本領域技術人員已知的技術從DM500小鼠取得永生成肌細胞細胞系。DM500小鼠 源自從巴黎的古爾東(de Gourdon)組獲得的小鼠。在DMPK基因中具有約500的不定(CTG) η重復長度的永生成肌細胞細胞系DM500生長至近匯合并且在5% CO2氣體中于33°C下維 持在0. 1 %明膠包被的器皿中。成肌細胞在添加了 20% FCS、50 μ g/mL慶大霉素和20單位 的Y-干擾素/mL的DMEM里近匯合生長。通過在Matrigel (BD Biosciences)包被的器皿 上生長成肌細胞以及將匯合的成肌培養(yǎng)物在37°C置于添加了 5%馬血清和50 μ g/mL慶大 霉素的DMEM中誘導肌管形成。在這種低血清培養(yǎng)基中5天后，收縮的肌管在培養(yǎng)物中產(chǎn) 生并且以所需寡核苷酸轉染。對于轉染，將NaCl (500mM過濾滅菌)、寡核苷酸和轉染試劑 PEI (ExGen 500,Fermentas)以這一特定順序加入并且直接混合。根據(jù)說明書(ExGen 500， Fermentas)，寡核苷酸轉染溶液包含比例為每μ g寡核苷酸5 μ 1的EXGen500。室溫孵育15 分鐘后，將寡核苷酸轉染溶液加入至含有培養(yǎng)的肌管的低血清培養(yǎng)基并且輕輕混合。最終 寡核苷酸濃度范圍為10pM-600nM。模擬對照處理用不含寡核苷酸的轉染溶液實施。在37°C 孵育4小時后，將新鮮培養(yǎng)基加入至培養(yǎng)物(導致約2. 3倍稀釋)并且于37°C延長孵育過 夜。次日，移去含有寡核苷酸的培養(yǎng)基并且將新鮮的低血清培養(yǎng)基加至在37°C再保持培養(yǎng) 一天的肌管。將寡核苷酸加至肌管培養(yǎng)物后48小時(即換為低血清條件以誘導肌管形成 后七天)，用“總RNA微量試劑盒(Total RNA mini kit)” (Bio-Rad)分離和制備RNA用于 Northern印跡和RT-PCR分析。Northern印跡是與放射性人DMPK (hDMPK)探針和鼠GADPH 探針雜交。用于DMPK的探針是由具有全3’ UTR和11個CTG的DMPK開放閱讀框組成的人 DMPK cDNA。人和鼠DMPK信號用磷光圖像儀分析定量并且以GAPDH信號進行標準化。圖1描述寡核苷酸PS58和PS142對hDMPK信號的濃度依賴的抑制作用。PS58為 結合于靶mRNA后不能激活RNA酶H的完全修飾的2’ 0-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，在濃度 低于DNA硫代磷酸酯寡核苷酸PS142約3000倍時有效。實施例2.來自患有亨廷頓病的男性患者的成纖維細胞(GM 00305)獲自Coriell細胞庫 (Coriell Cell Repository) (Camden,New Jersey,US)并且根據(jù)所附的使用說明書和本領 域技術人員已知的標準技術培養(yǎng)。亨廷頓病患者攜帶一個健康的和一個導致疾病的亨廷頓 基因等位基因，分別導致有正常數(shù)量的和擴大數(shù)量的(CAG)重復的兩種mRNA表達。對照成 纖維細胞(PAFCl)獲自在兩個亨廷頓等位基因中有正常重復長度的健康志愿者。以均針對亨廷頓轉錄本的互補三聯(lián)體重復(CAG)的寡核苷酸PS57、PS261、PS262、 PS277和PS278轉染所述成纖維細胞。按生產(chǎn)商的說明，使用PEI以幾種濃度水平進行轉 染。處理開始后4小時，清洗所述細胞并且應用新鮮培養(yǎng)基。轉染開始后24小時或28小 時，收獲所述細胞，分離總RNA并且通過RT-PCR進行分析。在55°C使用隨機六聚物實施逆 轉錄。使用側翼連接于外顯子1中的重復擴增區(qū)的引物(正向5’ATGGCGACCCTGGAAAAGCTG3’和5’ TGAGGCAGCAGCGGCTGT 3')測定亨廷頓轉錄本。這種方法檢測兩種類型的亨延頓 mRNA，正常的和具有額外(CAG)擴增的突變轉錄本，其可以通過2%瓊脂糖電泳分離分析用 于進行定性評價或通過Agilent2100生物分析儀或Caliper LabChip90進行定量。突變轉 錄本的RT-PCR產(chǎn)物的定量結果相對于正常轉錄本的RT-PCR產(chǎn)物表示，并且表示為來自相 同患者成纖維細胞的空載對照處理(沒有寡核苷酸)(設為100% )的百分比。圖2-7示出實驗的結果。圖1-3顯示均特異性針對重復序列的三種不同寡核苷酸， (CUG) 7、(UCG) 7或(CIG) 7，能夠有效地抑制具有擴增(CAG)重復的突變亨廷頓轉錄本。這 些化合物對具有高數(shù)目的致疾病的(CAG)重復的突變亨廷頓轉錄本比對攜帶較低數(shù)目的 (CAG)重復的正常轉錄本更有效。這在源自亨廷頓病患者的GM00305細胞中得到證實，也在 來自健康志愿者(PAFCl)的對照細胞中得以確認。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序確認。圖5顯示上述效 應不但在4小時處理時段后的24小時存在，也在48小時后存在。這一較晚的時間點看起 來比24小時更佳，因為在較低濃度已經(jīng)出現(xiàn)明顯抑制。這些結果表明盡管處理時段短至4 小時，但效應可能會保持長得多的時段。最終，圖7和8顯示了兩種嵌合的寡核苷酸的結果。所述寡核苷酸的3’和5’ 末端的核苷酸，而不是中心的10個核苷酸，以2’ 0-甲基取代修飾，產(chǎn)生了所謂的間斷體 (gapmer)。對本領域技術人員而言，已知2’ 0-甲基取代(或使用包括2’ 0-甲氧基乙基或 鎖核酸的其他修飾)結合于靶mRNA后限制RNA酶H介導的降解。這種RNA酶H介導的降 解機制作為mRNA抑制手段可以通過維持寡核苷酸(“間斷(thegap)”)中(硫代磷酸酯) DNA核苷酸的延伸保持。然而圖7和8中的結果清楚地表明完全修飾的PS57寡核苷酸有效 得多，其應用寡核苷酸PS278或PS277抑制效果不明顯或沒有抑制效果的濃度有效地抑制 了突變HD轉錄本水平。實施例3.根據(jù)實施例1描述的方法，源自DM500細胞的肌管用200nM寡核苷酸PS259 (與 PS58相比具有可選擇的起始核苷酸)或200nM寡核苷酸PS261(包含替代腺苷(A)的次黃 嘌呤核苷(I)核苷酸)處理。圖8顯示的處理后hDMPK信號(實心柱)表明寡核苷酸的有 效抑制。實施例4.根據(jù)實施例1描述的方法，源自DM500細胞的肌管在用PEI (200nM寡核苷酸)或 可選擇地用脂質轉染胺(lipofectamine)2·(根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書，使用50nM寡核苷 酸)轉染后用雙鏈siRNA寡核苷酸組合PI-Ol或PI-02處理。寡核苷酸組合(siRNA)PI-Ol 或PI-02只與重復序列互補。在處理孵育時段，進行兩次轉染操作。圖8顯示的處理后 hDMPK信號表明相對于PS58，siRNA寡核苷酸抑制的缺乏。表1 實施例中應用的寡核苷酸綜覽
重復寡核苷酸重復寡核苷酸
權利要求
包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸用于制備治療或預防人類與順式元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的藥物的用途，所述寡核苷酸包含只與基因轉錄本的重復序列互補的序列或由其組成。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能 形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡核苷酸是單鏈寡核苷酸。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中重復元件存在于所述基因轉錄本的編碼或非編 碼序列。
4.如上述權利要求中任一項所述的用途，其中所述寡核苷酸包含與選自(CAG)n、 (GCG) η、(CUG) η、(CGG) η、(CCG) η、(GAA) η、(GCC) η 和(CCUG) η 的重復元件互補的序列或由其組成。
5.如上述權利要求中任一項所述的用途，其中所述寡核苷酸的長度為約9至約50個核 苷酸，優(yōu)選地為12-40個核苷酸，更優(yōu)選地為15-30個。
6.如上述權利要求中任一項所述的用途，其中所述寡核苷酸包含下列或由下列組成 有或沒有包含硫代磷酸酯的主鏈的RNA核苷酸、DNA核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、肽核酸 (PNA)核苷酸、嗎啡啉磷酰二胺、乙烯橋核酸(ENA)核苷酸或其混合物。
7.如權利要求6所述的用途，其中所述寡核苷酸包含2’-0-取代的RNA硫代磷酸酯 核苷酸，優(yōu)選地，其中所述2’ -0-取代是甲氧基乙基和/或甲基和/或2’ 0，4’ C亞甲基橋 (LNA)和/或2’0，4’C約束的乙烯基(cEt)和/或2’0，4’C約束的甲氧基乙烯基(cMOEt)。
8.如上述權利要求中任一項所述的用途，其中所述寡核苷酸包含只與基因轉錄本的重 復序列互補的序列或由其組成，用于制備治療或預防人類與順式元件重復不穩(wěn)定性相關的 遺傳病癥的藥物，并且其中所述寡核苷酸是RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸，以及優(yōu)選 地，其中所述寡核苷酸的長度為9-50個核苷酸，并在其5’或3’末端的至少一個被如權利 要求6所定義的取代，并且在其序列的其余部分包含少于9個，更優(yōu)選地少于6個連續(xù)的脫 氧核糖。
9.如權利要求8所述的用途，其中所述寡核苷酸不包含脫氧核糖并且所述主鏈被如權 利要求6所定義的完全修飾。
10.如上述權利要求中任一項所述的用途，其中所述藥物中的寡核苷酸通過能夠使所 述寡核苷酸表達的核酸載體提供和/或其中所述藥物中的寡核苷酸被提供有至少一種賦 形劑和/或用于將所述寡核苷酸遞送至細胞和/或增強其細胞內遞送的靶向配體。
11.包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷的寡 核苷酸，其中所述寡核苷酸包含與選自(CAG)n、(GCG) n、(CUG) η、(CGG) η、(CCG) η、(GAA) η、 (GCC)n和(CCUG)n的重復序列互補的序列或由其組成，并且長度為9-50個核苷酸。
12.優(yōu)選如權利要求11所述的寡核苷酸，其包含與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)ru(CGG) η、(CCG)η, (GAA)η, (GCC)n和(CCUG)η的重復序列互補的序列或由其組成，長度為9_50個 核苷酸，以及其中所述寡核苷酸是RNA酶H基本上非依賴的寡核苷酸。
13.如權利要求11或12所述的寡核苷酸，以及還如在權利要求1-10中任一權利要求 所定義的，所述寡核苷酸優(yōu)選被提供有放射性標記或熒光標記。
14.包含如權利要求11-13中任一權利要求定義的寡核苷酸的藥學上可接受的組合 物，其優(yōu)選地還包含至少一種賦形劑和/或用于將所述寡核苷酸遞送至細胞和/或增強其細胞內遞送的靶向配體。
15.核酸載體，優(yōu)選為病毒載體，其能夠使如權利要求11-13中任一權利要求定義的寡 核苷酸在人細胞中表達。
16.減少細胞中包含重復的基因轉錄本的體外方法，其包括給藥如權利要求11-13中 任一權利要求所定義的寡核苷酸或如權利要求14所定義的藥學上可接受的組合物，或如 權利要求15所定義的核酸載體。
17.體外或離體檢測和/或診斷方法，其中使用如權利要求11-13中任一權利要求所述 的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了應用寡核苷酸的方法和藥物，該寡核苷酸包含次黃嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成擺動堿基對的堿基的核苷，所述寡核苷酸優(yōu)選是RNA酶H基本上非依賴的和只與人基因轉錄本的重復序列互補，用于制備用于診斷、治療或預防人類與順式元件重復不穩(wěn)定性相關的遺傳病癥的藥物。因此本發(fā)明提供了與順勢元件重復不穩(wěn)定相關的遺傳病癥的治療方法。本發(fā)明也涉及應用于本發(fā)明的方法中以預防重復擴增轉錄本在細胞中積累和/或翻譯的修飾的寡核苷酸。
文檔編號A61K48/00GK101980726SQ200980111254
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月5日 優(yōu)先權日2008年2月8日
發(fā)明者勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格, 約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼 申請人:普羅森那控股公司