利用兩種或更多種肝細胞生長因子同工型來治療或預防心臟病癥的制作方法

文檔序號：1175628閱讀：295來源：國知局

專利名稱：利用兩種或更多種肝細胞生長因子同工型來治療或預防心臟病癥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療或預防受試者中心臟病癥的方法，其包括向所述受試者施用兩種或更多種肝細胞生長因子(HGF)同工型(isoform)。本發(fā)明還涉及促進血管中內(nèi)皮細胞生長的方法，其包括向所述血管施用兩種或更多種肝細胞生長因子(HGF)同工型。在一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型作為一種或多種編碼所述同工型的多核苷酸施用。
背景技術：
HGF是與肝素結合的糖蛋白，也稱為擴散因子或肝細胞生長素A(h印atopoietin A)。HGF最初被鑒定為強效的肝營養(yǎng)性生長因子(h印atotrophic growth factor) (Nakamura等，Nature 342 :440 (1989))，是來自間充質細胞的肝素結合蛋白，對多種細胞類型具有多種生物作用，例如促有絲分裂、動力發(fā)生(motogenesis)和形態(tài)發(fā)生 (morphogenesis)。編碼HGF的基因位于染色體7q21. 1上，包含18個外顯子和17個內(nèi)含子，具有 SEQ ID N0:1 的核苷酸序列(Seki T.等，Gene 102:213-219(1991))。從 HGF 基因轉錄約6kb的轉錄本，然后由其合成由728個氨基酸組成的全長多肽HGF前體(flHGF)，其包含以下結構域N端發(fā)夾環(huán)-kringle 1-kringle 2-kringle 3-kringle 4-失活的絲氨酸蛋白酶結構域。同時，通過HGF基因的選擇性剪接來合成幾種其他的HGF多肽同工型。已知的同工型包括缺失變體HGF (全長HGF，但在kringle 1中缺失5個殘基)、NK1 (N端發(fā) 夾環(huán)-kringle 1)、NK2 (N 端發(fā)夾環(huán)-kringle 1-kringle 2)和 NK4 (N 端發(fā)夾環(huán)-kringle l-kringle2-kringle 3-kringle 4)。此外，每種同工型均存在等位基因變體。無生物活性的前體可由血清中的蛋白酶轉變成活性形式的以二硫鍵連接的異二聚體。在所述異二聚體中，具有高分子量的a鏈形成4個kringle結構域以及N端發(fā)夾環(huán)，像纖維蛋白溶酶原的活化前的肽區(qū)域一樣。由約80個氨基酸組成的三個以二硫鍵鍵合的環(huán)結構的kringle結構域可在蛋白質與蛋白質的相互作用中起到重要的作用。低分子量的0鏈形成無活性的絲氨酸蛋白酶樣結構域。由723個氨基酸組成的dHGF是由于外顯子4和外顯子5之間的選擇性剪接而在a鏈的第一個kringle結構域中缺失5個氨基酸(即F、L、P、S和S)的多肽。在體內(nèi)，通過外顯子4和外顯子5之間的選擇性剪接產(chǎn)生兩種HGF同工型(具有 728個氨基酸的flHGF和具有723個氨基酸的dHGF)。盡管flHGF和dHGF共同具有幾種生物功能，但是它們在免疫學和幾種生物學特性方面存在差異。已經(jīng)表明HGF通過調節(jié)內(nèi)皮細胞生長和血管平滑肌細胞遷移來刺激血管生成。因為其血管發(fā)生活性，HGF被認為是治療性血管發(fā)生的有前景候選之一?！爸委熜匝馨l(fā) 生”指利用血管發(fā)生因子(作為重組蛋白或基因)治療缺血性疾病(比如冠狀動脈疾病 (CAD)或外周動脈疾病(PAD))的介入。還已知HGF不但刺激內(nèi)皮細胞的生長而且還刺激其遷移(Bussolino 等，J Cell Biol. 119 629(1992) ；Nakamura 等，JHypertens 14 1067(1996))，并且已經(jīng)測試了 HGF作為再內(nèi)皮化刺激劑的作用(Yasuda等，Circulation 101 2546(2000) ；Hayashi 等，Gene Ther7 1664 (2000))。HGF已用作治療性血管發(fā)生的藥劑。Morishita和同事已使用HGF基因用于治療 PAD和CAD。他們施用HGF基因后觀察到了對PAD的一些治療反應，但是不清楚HGF基因轉移是否能有效治療CAD。迄今為止，已在針對CAD的各種動物模型中測試了 HGF基因轉移(Miyagawa 等，Circulation 105 2556(2002) ；Azuma 等，Gene Ther. 13 1206 (2006)； Aoki 等，Gene Ther. 7 417 (2000) ；Funatsu 等，J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 124 1099(2002))。然而，HGF基因轉移是否對CAD產(chǎn)生有益效果仍然是有爭議的。例如， Miyagawa及其同事表明，在大鼠心肌梗死模型中處理后8周，人HGF轉移不能增加梗塞心臟的左心室射血分數(shù)(LVEF) (Miyagawa 等，Circulation 105 =2556(2002)，圖 2)。而且，在相同模型中處理后8周，HGF基因轉移對分數(shù)縮短百分比和左心室前壁厚度幾乎沒有影響 (Miyagawa 等，Circulationl05 2556 (2002)，圖 3 和 5)。HGF還已用作抑制再狹窄的藥劑。冠狀動脈血管成形術(例如球囊和支架)是廣泛使用的治療阻塞血管的方法。然而，在采用血管成形術時，內(nèi)膜增厚(例如冠狀動脈再狹窄)是一個嚴重的問題。再狹窄的原因之一是血管平滑肌細胞的過度增殖和遷移并且伴隨細胞外基質的合成，這是對血管損傷的應答造成的。有跡象表明，快速的內(nèi)皮表面重建可抑制平滑肌細胞增殖，從而抑制再狹窄(例如Bauters等，ProgCardiovasc Dis. 40 107(1997))。作為預防再狹窄的一種方法，嘗試了向受損血管局部遞送內(nèi)皮生長因子(例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或肝細胞生長因子(HGF))并且顯示了減弱再狹窄的效果 (Asahara 等，Circulation 94:3291(1996) ；Yasuda 等，Circulation 101 2546(2000)； Hayashi 等，Gene Ther 7 1664 (2000) ；Walter 等，Circulation 110:36(2004))。所有上述對HGF基因治療的研究均使用編碼728個氨基酸的f 1HGF cDNA進行，而不是編碼 723 個氨基酸的 dHGF cDNA (Miyagawa 等；Azuma 等；Aoki 等；Funatsu 等；Yasuda 等和Hayashi等)。與之前的大多數(shù)報道中測試的flHGF cDNA相比，本發(fā)明首次證明，表達多種HGF同工型(例如flHGF和dHGF)的核苷酸序列的轉移可有效治療動物和人的CAD。本發(fā)明還首次證明，表達多種HGF同工型的核苷酸序列的轉移加速了血管的再內(nèi)皮化過程。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供包含兩種或更多種HGF同工型的組合物的用途。本發(fā)明的一個方面涉及包含兩種或更多種HGF同工型或者一種或多種編碼所述同工型的多核苷酸的組合物在制備用于治療或預防受試者中心臟病癥的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個方面涉及包含兩種或更多種HGF同工型或者一種或多種編碼所述同工型的多核苷酸的組合物在制備用于促進血管中內(nèi)皮細胞生長的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供通過施用兩種或更多種HGF同工型來治療或預防心臟病癥的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及增加受試者中缺血心臟組織的灌注或者心肌膜中血管密度的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的另一個方面涉及治療受試者中心臟病癥的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的又一個方面涉及在受試者中增強內(nèi)皮修復或為血管損傷或病變血管部
5位提供治療的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的又一個方面涉及促進血管中內(nèi)皮細胞生長的方法，其包括向所述血管施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。在一個實施方案中，所述血管是受損的。在又一個實施方案中，所述血管的再內(nèi)皮化(re-endothelialization)被促進。在一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型包含全長HGF (下文稱為f 1HGF) 和缺失變體HGF (下文稱為dHGF)。在另一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型還包含NK1。在又一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型以編碼所述同工型的多核苷酸形式施用。在本發(fā)明的一個方面中，所述組合物通過注射施用。在本發(fā)明的另一個方面中，所述組合物通過遞送裝置施用。在一個實施方案中，所述遞送裝置是支架。在又一個實施方案中，所述支架選自不基于聚合物的不銹鋼支架、基于聚合物的不銹鋼支架、不基于聚合物的鈷鉻支架和基于聚合物的鈷鉻支架。在本發(fā)明的一個方面中，所述兩種或更多種HGF同工型直接施用到受試者的缺血性心臟組織。本發(fā)明的又一個方面涉及包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。在一個實施方案中，所述組合物包含編碼所述兩種或更多種HGF同工型的多核苷酸。本發(fā)明的又一個方面涉及用于增加受試者中缺血心臟組織的灌注的組合物，其包含兩種或更多種HGF同工型。本發(fā)明的又一個方面涉及用于促進受試者血管中內(nèi)皮細胞生長的組合物，其包含兩種或更多種HGF同工型。在一個實施方案中，向受試者的血管施用所述組合物來促進所述血管內(nèi)皮化。在另一個實施方案中，向受試者的血管施用所述組合物來促進和/或加速所述血管再內(nèi)皮化。在又一個實施方案中，所述受試者需要預防或治療再狹窄。

通過下文對本發(fā)明的描述并結合附圖，本發(fā)明的上述和其他目的與特征將是很明顯的。圖1顯示HGF同工型對HUVEC遷移的影響。圖2顯示HGF同工型對C2C12細胞遷移的影響。圖3顯示HGF同工型對H9C2細胞遷移的影響。圖4顯示HGF同工型對HUVEC增殖的影響。圖5顯示在大鼠缺血性心臟病模型中評價HGF藥效的實驗步驟示意圖。圖6顯示HGF對左心室射血分數(shù)之功能的影響。圖7顯示HGF對收縮期的室間隔之功能的影響。圖8顯示將HGF注射到缺血心肌中對毛細血管密度的影響。圖9顯示將HGF注射到缺血心肌中對心肌纖維化的影響。
圖10顯示MIBI-SPECT的20節(jié)段模型上的冠狀動脈圖。圖11顯示用于pCK-HGF-X7注射的心肌區(qū)的選擇。通過心肌內(nèi)注射將pCK_HGF_X7 施用到通過MIBI-SPECT評價為灌注減少的心肌區(qū)域內(nèi)的冠狀動脈兩側。圖12顯示在MIBI-SPECT下pCK_HGF_X7對心肌灌注的影響。圖13顯示通過心肌造影應激超聲心動圖評價的心肌灌注⑷。圖14在OCT上顯示通過HGF質粒洗脫支架來加速再內(nèi)皮化。圖15在SEM上顯示通過HGF質粒洗脫支架來加速再內(nèi)皮化。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，即向患有心臟病癥(例如CAD)的受試者施用兩種或更多種HGF同工型能有效增加缺血心臟組織的灌注并因此治療或預防心臟病癥。本發(fā)明的另一些方面涉及以下發(fā)現(xiàn)，即施用兩種HGF同工型能促進血管內(nèi)皮化(例如通過血管的快速再內(nèi)皮化來抑制再狹窄)。因此，本發(fā)明的一個目的是提供通過施用兩種或更多種HGF同工型來治療或預防心臟病癥(例如CAD或冠狀動脈再狹窄)的方法。本發(fā)明的另一個方面是提供用于促進血管(例如其中所述血管是受損的)中內(nèi)皮細胞生長的方法。本發(fā)明的一個方面涉及包含兩種或更多種HGF同工型或者一種或多種編碼所述同工型之多核苷酸的組合物在制備用于治療或預防受試者中心臟病癥的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個方面涉及包含兩種或更多種HGF同工型或者一種或多種編碼所述同工型之多核苷酸的組合物在制備用于促進血管中內(nèi)皮細胞生長的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個方面涉及在受試者中增加缺血心臟組織的灌注或者增加心肌膜中血管密度的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的另一個方面涉及治療或預防受試者中心臟病癥的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的又一個方面涉及在受試者中增強內(nèi)皮修復或為血管損傷或病變血管部位提供治療的方法，其包括向所述受試者施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物。本發(fā)明的另一個目的涉及促進血管中內(nèi)皮細胞生長的方法，其包括向所述血管施用包含兩種或更多種HGF同工型的組合物，其中所述血管的內(nèi)皮細胞生長被促進。在一個實施方案中，所述方法包括施用包含三種或更多種HGF同工型(例如四種或更多種HGF同工型)的組合物。在一個實施方案中，所述組合物包含選自flHGF、dHGF、 NK1、NK2和NK4的兩種或更多種HGF同工型。在另一個實施方案中，所述組合物包含選自 flHGF、dHGF、NKl和NK2的兩種或更多種HGF同工型。在又一個實施方案中，所述組合物包含選自flHGF、dHGF和NK1的兩種或更多種HGF同工型。在又一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型包含flHGF和dHGF。在又一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型由flHGF和dHGF組成。在另一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型包含flHGF、 dHGF和NK1。在另一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型以編碼所述同工型之多核苷酸的形式施用。在本發(fā)明中，待治療或預防的心臟病癥是與心臟、主動脈或冠狀動脈或心臟缺血組織中血流減少相關的任何病癥。心臟病癥的實例包括但不限于冠狀動脈阻塞(例如由脂質/膽固醇沉積、巨噬細胞/炎性細胞募集、斑塊破裂、血栓、血小板沉積或新生內(nèi)膜增殖引起或與之相關)、缺血綜合征(例如由心肌梗死、穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、冠狀動脈再狹窄或再灌注損傷引起或與之相關)、心肌病(例如由缺血綜合征、心臟毒素、感染、高血壓、代謝疾病(例如尿毒癥、腳氣病或糖原貯積病)、輻射、神經(jīng)肌肉疾病、浸潤性疾病(例如結節(jié)病、血色素沉著病、淀粉樣變性、法布里病或胡爾勒氏綜合征)、外傷或先天性原因引起或與之相關)、心律失?；蚬?jié)律障礙(例如由缺血綜合征、心臟毒素、阿霉素、感染、高血壓、代謝疾病、輻射、神經(jīng)肌肉疾病、浸潤性疾病、外傷或先天性原因引起或與之相關)、感染 (例如由病原體比如細菌、病毒、真菌或寄生蟲引起)和炎性病癥(例如與心肌炎、心包炎、心內(nèi)膜炎、心臟免疫排斥相關，或者由特發(fā)性疾病、自身免疫病或結締組織疾病之一引起的炎性病癥)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療或預防動脈粥樣硬化(例如主動脈或冠狀動脈中的)、預防與動脈粥樣硬化相關的并發(fā)癥(例如心絞痛、心肌梗死、心律失常、心力衰竭、腎衰竭、肝硬化、兒童股骨頭缺血性壞死(Legg-Calve-Perthes Disease)、缺血性中風、外周動脈阻塞、動脈瘤、栓塞)或減少動脈粥樣硬化的早期癥狀和體征(例如血液不能流向需求增加(例如在心絞痛、排泄或間歇性跛行中)的受侵襲組織)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療或預防由血管手術介入引起的心臟病癥，包括但不限于血管成形術(例如經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術、頸動脈經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)血管成形術，或者植入支架的冠狀動脈血管成形術)、植入支架、粥樣斑切除術或移植 (例如冠狀動脈旁路移植)。在該實施方案中，本發(fā)明的方法可在手術介入之前、之中和/ 或之后進行。在某些實施方案中，所述心臟病癥是冠狀動脈再狹窄。在本發(fā)明的一個方面中，向患有冠狀動脈疾病的受試者施用兩種或更多種HGF同工型。在一個實施方案中，所述受試者的一條或更多條冠狀動脈被部分或全部阻塞。在另一個實施方案中，所述受試者已患過、正在患有心肌梗死或具有心肌梗死風險。在又一個實施方案中，所述受試者被確定為曾經(jīng)或現(xiàn)在被懷疑患有缺血性心臟病，例如基于血管造影片、心電圖、超聲心動圖或其他方法確定。在一個實施方案中，所述受試者是冠狀動脈旁路移植 (CABG)的候選者。在另一個實施方案中，所述受試者的一條或更多條冠狀動脈被部分或全部阻塞，但是不適于CABG。在又一個實施方案中，所述受試者已進行CABG但是心肌膜的血運重建不完全。在本發(fā)明的一個方面中，向血管施用兩種或更多種HGF同工型以促進內(nèi)皮細胞生長。在一個實施方案中，所述血管受阻或受損。在某些實施方案中，受阻血管可包括這樣的動脈或靜脈，其中血管腔已經(jīng)變窄并且流向血管的血液減少。在一個實施方案中，施用兩種或更多種HGF同工型以促進血管再內(nèi)皮化，例如在血管壁損傷之后，例如在血管成形術過程中。在某些實施方案中，再內(nèi)皮化可被促進和/或加速，例如與不存在兩種或更多種HGF 同工型的內(nèi)皮細胞生長相比較而言，內(nèi)皮細胞生長速度提高。在另一個實施方案中，向需要預防或治療再狹窄的受試者施用兩種或更多種HGF同工型來抑制血管中平滑肌細胞的增殖。本文所用的術語“治療”病癥(例如心臟病癥或者血管受阻或受損)指以足以導致改善病癥的一個或多個癥狀、或者防止病癥進展、或者引起病癥減退(例如由于促進血管生成或內(nèi)皮細胞生長引起的)的量施用因子。例如，就改善心臟病癥的癥狀而言，治療導致癥狀可測量地降低至少5 %，優(yōu)選至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至
8少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %。可進行檢測和測量以確定治療的與治療心臟病癥相關的生理效應包括但不限于心臟效率(如通過至少一種心臟功能的臨床指標來衡量，例如心輸出量、肺動脈壓和中心靜脈壓，或者心室射血分數(shù))，靜息或應激條件下心肌中的跨壁血流，心肌組織的再生，側枝血管的形成、成熟和/或生長(例如局部新血管發(fā)生、毛細血管密度增加、動脈發(fā)生、淋巴管生成、血管生成)、心肌發(fā)生(例如橫紋肌細胞、平滑肌細胞或肌上皮細胞)、心肌組織的血管化、心臟收縮功能、左心室射血分數(shù)或室間隔的增加；或者心肌纖維化、內(nèi)膜增厚(新生內(nèi)膜增殖/增生)、內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞增殖、胸痛或呼吸短促的減少。本文所用的術語“預防”指動物中病癥的一個或多個癥狀(例如由于血管受阻或受損而導致心臟功能改變或血流減少)的發(fā)生率降低。所述預防可以是完全的，例如受試者中完全沒有癥狀。所述預防也可以是部分的，使得受試者中癥狀的發(fā)生率低于不使用本發(fā)明時的發(fā)生率。在一個實施方案中，將HGF同工型或編碼HGF同工型的多核苷酸施用給受試者的血管或心臟，例如受損血管、部分或全部阻塞的冠狀動脈、缺血性心肌組織、心包腔或冠狀竇?？衫帽绢I域公知的任何方法將HGF同工型或編碼HGF同工型的多核苷酸遞送至所期望的部位?？墒褂玫倪f送裝置的實例包括但不限于導管(例如球囊導管、輸注導管、管心針(Stiletto catheter)、針、無針注射器、支架、輸注套管、網(wǎng)、心臟縛具(cardiac harness)、分流器、心臟起搏器、植入式除顫器、縫合線、釘、血管周圍套(perivascular wrap)、可與創(chuàng)傷部位的輪廓基本上一致的柔軟薄片或膜、管道裝置、移植物和泵。遞送HGF 同工型的方法的具體實例包括但不限于通過置于流入冠狀竇(例如心大靜脈、心中靜脈、左心室后靜脈、前室間靜脈或任何其他分枝)的靜脈中的球囊導管；通過通往一條或更多條冠狀動脈(例如右冠狀動脈或左冠狀動脈)的腔的導管，其中HGF同工型被包被在在該部位膨脹的球囊上或者從導管尖端注射；在心內(nèi)直視手術或心臟移植過程中通過針遞送(例如遞送至左心房或右心房或者左心室或右心室中)；通過心內(nèi)直視手術或微介入手術利用內(nèi)部入口通過左心房、右心室或左心室遞送至心包腔或者利用外部入口遞送至心包區(qū)，或者通過注射、導管插入、用激光引起形成灌注通道、套管插入、利用粒子槍或利用泵形成的經(jīng)皮入口遞送至心包區(qū)；從置于將血液遞送至組織的管道內(nèi)的導管通過順行灌注進行遞送，或者從置于從組織接收血液的管道中的導管通過逆行灌注來遞送；或者通過用于維持血管通暢性的腔內(nèi)裝置或血管內(nèi)假體(例如支架、移植物、支架_移植物、腔靜脈濾器) 來遞送。在一個實施方案中，所述裝置是可生物降解的，因此，無需在不再需要后將其移出。在某些實施方案中，利用支架遞送所述兩種HGF同工型。在又一個實施方案中，所述支架選自不基于聚合物的不銹鋼支架、基于聚合物的不銹鋼支架、不基于聚合物的鈷鉻支架和基于聚合物的鈷鉻支架。在一個實施方案中，編碼HGF同工型的多核苷酸以包含多核苷酸并表達HGF多肽的細胞的形式遞送。所述細胞可以是自體或非自體(例如同種異體或異種異體)細胞。可使用在移植后能存活的任何細胞，包括例如成纖維細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞或干細胞(例如胚胎干細胞、造血干細胞、間充質干細胞)。可以作為可注射液體混懸劑的形式引入包含多核苷酸的細胞，例如注射到受損心肌中或靜脈內(nèi)注射?？蓪⒓毎氲焦Ｈ麉^(qū)中以降低疤痕形成程度并增強心室功能。當希望離體將多核苷酸引入細胞中時，可以通過本領域公知的任何技術從受試者獲得所述細胞，包括但不限于活組織檢查、刮擦和手術組織摘除?？?將分離的細胞培養(yǎng)足夠的時間以使多核苷酸引入細胞中，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、 48小時或更長時間。用于短期培養(yǎng)原代細胞的方法是本領域眾所周知的。例如，可將細胞貼壁或懸浮培養(yǎng)在平板(例如微孔板)中。在一個實施方案中，在將細胞引回到受試者中之前確定細胞中所述多核苷酸的存在情況。在另一個實施方案中，選擇含有所述多核苷酸的細胞(例如基于所述多核苷酸中選擇標記的存在情況)，并僅將含有所述多核苷酸的那些細胞重新引入受試者中。當通過注射遞送HGF同工型或編碼HGF同工型的多核苷酸時，所述注射可以是心內(nèi)注射，例如心房內(nèi)(左和/或右)或心室內(nèi)(左和/或右)。所述注射還可以是心肌內(nèi)注射。所述注射部位可以是缺血/低氧區(qū)或其附近、正常組織與缺血/低氧區(qū)的交界處或者正常組織中。所述注射部位可以在一條或更多條冠狀動脈處，例如受阻的動脈。注射可以是經(jīng)心外膜注射或經(jīng)心內(nèi)膜注射。遞送可以由一個或多個部位的一次注射或更多次注射組成。遞送可以通過經(jīng)心外膜注射進行。遞送至血管部位可以通過血管內(nèi)注射(例如靜脈內(nèi) 或動脈內(nèi)(冠狀動脈內(nèi)、主動脈內(nèi)))來實施?？蛇f送至至少兩條冠狀動脈(例如至少一條左冠狀動脈和一條右冠狀動脈)中，例如在冠狀動脈腔內(nèi)至少約Icm的部位。血管注射可以在例如缺血或病變組織附近部位、血管損傷部位或再狹窄部位來實施。HGF同工型的施用可重復一次以上，例如間隔0. 5、1、2、3、4、5、6、7天或更多天之后，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更多周之后。在一個實施方案中，在每次施用HGF 同工型之后監(jiān)測受試者的心臟灌注狀態(tài)或血管健康狀態(tài)，例如通過血管造影片、心電圖、超聲心動圖或其他方法，必要時提供額外的施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，將兩種或更多種HGF同工型施用給當前正在經(jīng)歷缺血事件的受試者。在另一個實施方案中，在發(fā)生缺血事件后盡可能快地施用兩種或更多種 HGF同工型，例如在缺血事件后0. 5、1、2、3、4、5、6、12、18、24、36、48或72小時之內(nèi)。所述兩種或更多種HGF同工型以治療有效劑量施用，例如導致受試者心臟和/或血管病癥的可測量改善的劑量，例如缺血心臟組織的灌注增加、缺血心臟組織中毛細血管密度增加、缺血心臟組織中纖維化降低、血管損傷程度降低、內(nèi)皮化增加等。所述有效劑量將因受試者而異，取決于病癥程度和/或對內(nèi)皮化的需求、所選給藥途徑、個體受試者的年齡、性別和體重、受試者的健康狀況以及受試者癥狀的嚴重程度，并且可以單劑量或分開的劑量施用。因此，日劑量不應對本發(fā)明的范圍產(chǎn)生任何限制。例如，當以蛋白質形式施用兩種或更多種HGF同工型時，每種蛋白質的治療有效劑量范圍可以是約1 μ g至約lOOmg，例如約10μ g至約10mg。當以多核苷酸形式施用兩種或更多種HGF同工型時，治療有效劑量范圍可以是約1μ g至約10mg，例如約5μ g至約5mg，例如約10 μ g至約2mg，例如約100 μ g 至約lmg。當重復施用HGF同工型多于一次時，每次施用的劑量可以相同或不同。在一個實施方案中，所述方法還包括向所述受試者施用已知能有效治療心臟和/ 或血管病癥的其他治療劑或操作(例如血管成形術)。治療劑的實例包括但不限于血管發(fā) 生促進劑(例如血管內(nèi)皮生長因子、一氧化氮釋放劑或生成劑、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、白細胞介素_6、單核細胞趨化蛋白-1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、轉化生長因子-β)、抗血栓劑(例如阿司匹林、肝素、PPACK、依諾肝素(enoxaprin)、水蛭素)、抗凝血劑、抗生素、抗血小板劑、溶栓劑(例如組織纖溶酶原激活劑)、抗增殖劑、抗炎劑、抑制增生的藥劑、抑制再狹窄的藥劑、平滑肌細胞抑制劑、生長因子、生長因子抑制劑、細胞粘附抑制劑、化療劑及其組合。提供下述定義，其將有助于理解本發(fā)明的范圍和實施。術語“分離的”為了本發(fā)明目的指從其原始環(huán)境(其天然存在的環(huán)境)中分離出的生物材料(細胞、核酸或蛋白質)。例如，以天然狀態(tài)存在于植物或動物中的核苷酸不是分離的，然而，從其天然存在的相鄰核酸中分離出的同一多核苷酸就被認為是“分離的”?！昂怂帷薄ⅰ昂怂岱肿印?、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧尿苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式或其任何磷酸酯類似物(例如硫代磷酸酯和硫酯)，其是單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術語“核酸分子”(尤其是DNA或RNA分子)僅涉及分子的一級和二級結構，而不限于任何特定的三級形式。因此，該術語包括可見于線性或環(huán)狀DNA分子(例如限制性片段)、質粒、超螺旋DNA 和染色體中的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子的結構時，本文中可根據(jù)僅以DNA非轉錄鏈鏈(即具有與mRNA同源的序列的鏈)的5’至3’方向給出序列的常規(guī)慣例來描述序列?！爸亟MDNA分子”是進行了分子生物學操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA、質粒DNA、合成DNA和半合成DNA。當用于多核苷酸序列時，術語“片段”指這樣的核苷酸序列，其相比于參照核酸而言長度縮短并且在共同部分上包含與參照核酸相同的核苷酸序列。適當時，本發(fā)明的這些核酸片段可作為一個組分包含在更大的多核苷酸中。這些片段包含本發(fā)明核酸的長度為至少 6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、 70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、 4000,5000或更多個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，或由其組成?！盎颉敝负芯幋a功能性分子的核苷酸的多核苷酸，所述功能性分子包括僅通過轉錄產(chǎn)生的功能性分子(例如生物活性RNA物質)或通過轉錄和翻譯產(chǎn)生的功能性分子 (例如多肽)。術語“基因”包括cDNA和基因組DNA核酸。“基因”還指表達特定RNA、蛋白質或多肽的核酸片段，包括編碼序列的上游(5’非編碼序列)和下游(3’非編碼序列)的調控序列?！疤烊换颉敝柑烊淮嬖诘木哂衅渥陨碚{控序列的基因?！扒逗匣颉敝覆皇翘?然基因的任何基因，其包含在自然界中不在一起的調控序列和/或編碼序列。因此，嵌合基因可包含來自不同來源的調控序列和編碼序列，或者來源于相同來源但是以不同于天然的方式排列的調控序列和編碼序列。嵌合基因可包含來源于不同來源的編碼序列和/或來源于不同來源的調控序列?！皟?nèi)源基因”指天然存在于生物基因組中的天然基因?！巴庠础被?因或“異源”基因指正常情況下不存在于宿主生物中，而是通過基因轉移引入所述宿主生物中的基因。外源基因可包括插入非天然生物中的天然基因，或者嵌合基因?！稗D基因”是通過基因轉移操作引入細胞中的基因?！爱愒碊NA”指不是天然存在于細胞或細胞染色體位點中的DNA。所述異源DNA可包括細胞外的基因。術語“基因組”包括染色體以及線粒體、葉綠體和病毒的DNA或RNA。當單鏈形式的核酸分子可在合適溫度和溶液離子強度的條件下與另一核酸分子(例如cDNA、基因組DNA或RNA)退火時，則所述核酸分子與所述另一核酸分子“可雜交”。雜交和洗滌條件是眾所周知的并且示例于Sambrook等的Molecular Cloning中，實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989),特別是其中第11章表11. 1 (通過引用并入本文)。溫度和離子強度的條件決定了雜交的“嚴格
/又 O可調整嚴格條件來篩選中等相似的片段(例如來自遠親生物的同源序列)至高度相似的片段(例如與來自近親生物的產(chǎn)生相同的功能酶的基因)。就同源核酸的初步篩選而言，可使用低嚴格度的雜交條件，對應于55°C的解鏈溫度(Tm)，例如5X SSC、0. 1% SDS、 0. 25%乳并且無甲酰胺；或者30%甲酰胺、5X SSC、0. 5% SDS。中等嚴格度的雜交條件對應于更高的Tm，例如40%甲酰胺、5X或6X SSC0高嚴格度的雜交條件對應于最高的Tm，例如 50%甲酰胺、5X或6X SSC0雜交需要兩種核酸包含互補序列，盡管取決于雜交的嚴格度，堿基之間錯配也是可能的。術語“互補”用于描述能彼此雜交的核苷酸堿基之間的關系。例如，就DNA而言，腺苷與胸苷互補，胞苷與鳥苷互補。因此，本發(fā)明還包括與本文所公開或所用的完整序列互補的分離核酸片段以及那些基本上相似的核酸序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用包括Tm為55°C的雜交步驟和上述條件的雜交條件來檢測多核苷酸。在另一些實施方案中，Tm是60°C、63°C或65°C。雜交后的洗滌也決定了嚴格條件。一組條件使用以下系列的洗滌從6X SSC、 0. 5% SDS、室溫15分鐘(min)開始，然后以2X SSC、0. 5% SDS,45°C 30min進行重復，然后以0. 2X SSC、0. 5% SDS,50°C 30min重復兩次。優(yōu)選的一組嚴格條件使用更高的溫度，其中除了在0. 2X SSC、0. 5% SDS中的最后兩次30min洗滌的溫度提高到60°C之外，其他洗滌與上述相同。另一組優(yōu)選的嚴格條件利用在0. IX SSC、0. SDS中的65°C的兩次最后洗滌。用于雜交核酸的合適嚴格度取決于核酸長度和互補程度，這些變量是本領域中眾所周知的。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，含有這些序列的核酸的雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應于更高的Tm)按下列順序降低RNA:RNA、 DNA:RNA, DNA:DNA。對于長度大于100個核苷酸的雜交體而言，已經(jīng)推導出計算Tm的方程 (參見Sambrook等，supra，9. 50-0. 51)。對于較短核酸即寡核苷酸的雜交而言，錯配位置變得更重要，寡核苷酸的長度決定了其特異性(參見Sambrook等，同上，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用以下雜交條件檢測多核苷酸，所述雜交條件包括在小于500mM鹽和至少37°C下的雜交步驟和于2XSSPE中在至少63°C的溫度下的洗滌步驟。在另一個實施方案中，所述雜交條件包括在小于200mM鹽和至少37°C下的雜交步驟。在又一個實施方案中，所述雜交條件在雜交和洗滌步驟中均包括2X SSPE和63 °C。在另一個實施方案中，可雜交核酸的長度為至少約10個核苷酸。優(yōu)選地，可雜交核酸的最小長度為至少約15個核苷酸，例如至少約20個核苷酸；例如至少30個核苷酸。此外，本領域技術人員會認識到，必要時可根據(jù)諸如探針長度等因素調整溫度和洗滌溶液鹽濃度。術語“探針”指可與互補的單鏈靶核酸進行堿基配對以形成雙鏈分子的單鏈核酸分子。本文所用的術語“寡核苷酸”指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質粒DNA或mRNA分子雜交的短核酸。寡核苷酸可用例如32P-核苷酸或共價綴合有標記物(例如生物素)的核苷酸進行標記。經(jīng)標記的寡核苷酸可用作探針來檢測核酸的存在。寡核苷酸(其中一個或兩個核苷酸可被標記)可用作PCR引物，用于克隆全長核酸或核酸片段、用于DNA測序或者檢測核酸的存在。寡核苷酸還可用于與DNA分子形成三螺旋。通常，寡核苷酸是合成制得的，優(yōu)選在核酸合成儀上制備。因此，寡核苷酸可用非天然存在的磷酸酯類似鍵(例如硫酯鍵等)來制備。“引物”指與靶核酸序列雜交以形成雙鏈核酸區(qū)的寡核苷酸，在合適條件下，所述雙鏈核酸區(qū)可用作DNA合成的起始點。這些引物可用在聚合酶鏈反應中或用于DNA測序?！熬酆厦告準椒磻笨s寫為PCR，指酶促擴增特定核酸序列的體外方法。PCR包括一系列重復的溫度循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟使模板核酸變性以分開靶分子的鏈、使單鏈 PCR寡核苷酸引物與模板核酸退火，以及通過DNA聚合酶擴增所退火的引物。PCR提供了檢測靶分子存在的方法，并且在定量或半定量條件下測定起始核酸混合物內(nèi)的靶分子的相對量?！澳孓D錄聚合酶鏈式反應”縮寫為RT-PCR，指這樣的體外方法，酶促產(chǎn)生靶cDNA分子或來自RNA分子的分子，然后如上述酶促擴增靶cDNA分子內(nèi)的特定核酸序列。RT-PCR還提供檢測靶分子存在的方法，并在定量或半定量條件下測定起始核酸混合物內(nèi)的靶分子的相對量。DNA “編碼序列”指這樣的雙鏈DNA序列，其編碼多肽并且當置于合適的調控序列控制下時可在細胞外或細胞內(nèi)轉錄和翻譯出多肽?！昂线m的調控序列”指位于編碼序列上游 (5’非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調控序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內(nèi)含子、多聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點和莖環(huán)結構。編碼序列的邊界由5’(氨基) 端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于原核序列、來自mRNA的cDNA、基因組DNA序列以及甚至合成的DNA序列。如果希望編碼序列在真核細胞中表達，多聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’?！伴_放閱讀框”縮寫為0RF，指一定長度的核酸序列(DNA、cDNA或RNA)，其包含翻譯起始信號或起始密碼子(例如ATG或AUG)和終止密碼子，并且可被翻譯成多肽序列。術語“下游”指位于參照核苷酸序列3’的核苷酸序列。特別地，下游核苷酸序列通常指位于轉錄起點下游的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉錄起始位點的下游。術語“上游”指指位于參照核苷酸序列5’的核苷酸序列。特別地，上游核苷酸序列通常指位于編碼序列或轉錄起始點5’端的序列。例如，大多數(shù)啟動子位于轉錄起始位點的上游?！巴粗亟M”指將外源DNA序列插入另一 DNA分子中，例如將載體插入染色體中。優(yōu)選地，所述載體靶向用于同源重組的特定染色體位點。就特異性染色體重組而言，所述載體將包含足夠長的與染色體序列同源的區(qū)域，以使載體與染色體互補結合并引入染色體中。更長的同源區(qū)和更高程度的序列相似性可提高同源重組的效率?！拜d體”指將核酸克隆和/或轉移到宿主細胞內(nèi)的任何運載體。載體可以是復制子，其可與另一 DNA節(jié)段連接以進行所連接節(jié)段的復制?！皬椭谱印敝冈隗w內(nèi)作為DNA自主復制單元(即能在自身控制下復制)的任何遺傳元件(例如質粒、噬菌體、粘粒、染色體、病
13毒)。術語“載體”包括用于體外、離體(ex vivo)或體內(nèi)將核酸引入細胞中的病毒載體和非病毒載體。本領域公知的許多載體可用于操縱核酸、將應答元件和啟動子引入基因等。可能的載體包括例如質?；蚪?jīng)修飾病毒(包括例如腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒、皰疹病毒)或者質粒(例如PBR322或pUC質粒衍生物)或者Bluescript載體。例如，將對應于應答元件和啟動子的DNA片段插入合適的載體中，這可通過將合適的DNA片段連接到所選的具有互補粘末端的載體中來實現(xiàn)?；蛘撸蓪NA分子末端進行酶修飾，或者可將核苷酸序列(連接子)連接到DNA末端中來產(chǎn)生任何位點?？蓪@些載體進行改造以包含選擇標記基因，用于選擇已將標記引入細胞基因組的細胞。這些標記可允許鑒定和/或選擇引入和表達該標記所編碼蛋白質的宿主細胞。病毒載體已經(jīng)在細胞以及活動物受試者中用于多種基因遞送應用中。可使用的病毒載體包括但不限于腺病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、慢病毒、桿狀病毒、仙臺病毒、麻疹病毒、猴病毒40和EB病毒載體。非病毒載體包括質粒、脂復合物(lipoplex)(陽離子脂質體-DNA復合物)、聚合復合物(polyplex)(陰離子聚合物-DNA復合物)和蛋白質-DNA復合物。除了核酸之外，載體還可包含一個或多個調節(jié)區(qū)和 /或選擇標記，用于選擇、測量和監(jiān)測核酸轉移結果(轉移到哪個組織、表達持續(xù)時間等)。術語“質?！敝高@樣的染色體外元件，其通常攜帶不作為細胞中心代謝一部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子形式。這些元件可以是來源于任何來源的自主復制序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，直鏈、環(huán)狀或超螺旋的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中多個核苷酸序列已經(jīng)連接或重組成獨特的結構，其能將所選基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA 序列與合適的3’非翻譯序列一起引入細胞中。“克隆載體”指這樣的“復制子”，其是單位長度的核酸，優(yōu)選DNA，其連續(xù)復制并包含復制起點(例如質粒、噬菌體或柯斯質粒)，其可與另一核酸節(jié)段連接以復制所連接的節(jié) 段?？寺≥d體可以能在一種細胞類型中復制并在另一種細胞類型中表達(“穿梭載體”)。克隆載體可包含一個或多個可用于選擇含有所述載體之細胞的序列和/或一個或多個用于插入目的序列的多克隆位點。術語“表達載體”指被設計成能在轉化進宿主后表達插入的核酸序列的載體、質粒或運載體?？寺』?即插入的核酸序列)通常受控于控制元件(例如啟動子、最小啟動子、增強子等)。用于驅動核酸在期望的宿主細胞中進行表達的起始控制區(qū)或啟動子有很多，并且是本領域技術人員熟悉的?；旧?，能驅動這些基因表達的任何啟動子均可用在表達載體中，包括但不限于病毒啟動子、細菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、病原性或疾病相關啟動子、發(fā)育特異性啟動子、誘導型啟動子、光調節(jié)啟動子，包括但不限于SV40早期(SV40)啟動子區(qū)，包含在勞氏肉瘤病毒 (RSV)的3’長末端重復(LTR)中的啟動子，腺病毒(Ad)的ElA或主要晚期啟動子(MLP)，人巨細胞病毒(HCMV)立即早期啟動子，單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子，桿狀病毒IEl啟動子，延伸因子la (EFl)啟動子，甘油醛3_磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子，泛素C(Ubc)啟動子，白蛋白啟動子，小鼠金屬硫蛋白-L啟動子的調控序列和轉錄控制區(qū)，遍在啟動子(HPRT、vimentin、β -肌動蛋白、微管蛋白等)，中間絲 (desmin、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP等)的啟動子，(MDR、CFTR或VIII因子等的)治療基因的啟動子，病原性或疾病相關啟動子，以及表現(xiàn)出組織特異性并已在轉基因動物中使用的啟動子(例如在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū))；在胰腺β-細胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)、在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)；白蛋白基因，在肝臟中有活性的Apo AI和Apo AII控制區(qū)，在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)，在肝臟中有活性的α -抗胰蛋白酶基因控制區(qū)，在髓樣細胞中有活性的珠蛋白基因控制區(qū)，在腦的少突膠質細胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈_2基因控制區(qū)，以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)，丙酮酸激酶啟動子，絨毛蛋白啟動子，腸脂肪酸結合蛋白啟動子，平滑肌細胞肌動蛋白啟動子等。此外，這些表達序列可通過加入增強子或調控序列等來修飾。然后將上文構建的表達載體以藥物組合物形式施用給受試者。兩種或更多種HGF 同工型可單獨施用(依次施用或同時施用，即共施用)；可施用或共施用針對兩種或更多種 HGF同工型的單獨的質粒，或者可施用包含針對兩種或更多種HGF同工型基因并能表達所述兩種或更多種HGF同工型基因的單一表達質粒。例如，可利用兩個單獨的質粒施用兩種同工型flHGF和dHGF。或者，可共施用包含flHGF和dHGF基因的兩個單獨的質粒。最后，可施用包含flHGF和dHGF 二者的基因的單一表達質粒。在本發(fā)明的某些方面中，單一表達質粒上的fIHGF和dHGF由同一多核苷酸編碼或由單獨的多核苷酸編碼。有許多方法可將能表達HGF同工型的一種以上多核苷酸包含在單一質粒上。這些方法包括例如使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列、雙啟動子/表達盒以及融合蛋白。由同一質粒或兩個單獨的質粒表達的兩種或更多種同工型(如上文所述)選自flHGF、dHGF、NKl和NK2，或者選自SEQ IDN0:2-5和11-12。所述兩種或更多種同工型還可包括本領域一般技術人員公知的其他 HGF同工型?？赏ㄟ^本領域公知的方法將載體引入期望的宿主細胞中，所述方法例如注射、轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、脂質體轉染、利用基因槍或DNA載體轉運體(參見例如 Wu 等，J. Biol. Chem. 267 963(1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem. 263 14621 (1988)；以及 Hartmut等，加拿大專利申請No. 2，012, 311)。還可通過脂質體轉染在體內(nèi)引入本發(fā)明的多核苷酸。在過去的十年中，已經(jīng) 越來越多地利用脂質體在體外進行核酸的包封和轉染?？梢允褂迷O計成限制利用脂質體介導轉染所遇到的困難和危險的合成陽離子脂質來制備用于體內(nèi)基因轉染的脂質體 (Feigner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 8027(1988)；以及 Ulmer 等，Science 259:1745(1993))。使用陽離子脂質可促進帶負電荷核酸的包封，并且還促進與帶負電荷的細胞膜的融合(Feigner等，Science 337 =387(1989)) 0用于核酸轉移的特別有用的脂質化合物和組合物描述于W095/18863、 W096/17823和U. S. 5，459，127中。利用脂質體轉染在體內(nèi)將外源基因引入特定器官具有某些實際優(yōu)點。將脂質體通過分子靶向至特定細胞代表了另一個益處。清楚的是，直接轉染至特定細胞類型在具有細胞異質性的組織(例如胰腺、肝、腎和腦)中將是特別優(yōu)選的。為了靶向目的，可將脂質通過化學方法偶聯(lián)至另一分子上(Mackey等，1988，同上)。被靶向的肽(例如激素或神經(jīng)遞質)和蛋白質(例如抗體)或非肽分子可通過化學方法偶聯(lián)至脂質體上。其他分子也可用于促進核酸體內(nèi)轉染，例如陽離子寡肽(例如W095/21931)、來源于DNA結合蛋白的肽(例如Μ^θΛδδΟδ)或陽離子聚合物(例如1095/^1931)。還可體內(nèi)引入載體，如裸DNA質粒(參見美國專利5，693，622、5，589，466和 5，580，859)。還可使用受體介導的 DNA 遞送方法(Curiel 等，Hum. Gene Ther. 3 =147(1992) 以及 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。術語“轉染”指細胞攝入外源或異源RNA或DNA。當外源或異源RNA或DNA已引入細胞內(nèi)時，則所述細胞已被這種RNA或DNA “轉染”。當所轉染的RNA或DNA影響表型變化時，則所述細胞已被該外源或異源RNA或DNA “轉化”。轉化RNA或DNA可被整合(共價連接)到構成細胞基因組的染色體DNA中。“轉化”指將核酸片段轉移到宿主生物中，形成遺傳穩(wěn)定的遺傳特征。包含經(jīng)轉化的核酸片段的宿主生物稱為“轉基因”或“重組”或“轉化”生物。此外，包含多核苷酸的重組載體可包含一種或多種用于在需要擴增或表達的細胞宿主中的復制起點、標記或選擇標記。術語“選擇標記”指這樣的識別因子(通常為抗生素或化學品抗性基因)，其能基于標記基因的作用而被選擇，即對抗生素的抗性、對除草劑的抗性、比色標記、酶、熒光標記等，其中所述作用用于追蹤目的核酸遺傳性，和/或鑒定具有所遺傳的目的核酸的細胞或生物。本領域已知和使用的選擇標記基因的實例包括對氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨膦除草劑、磺胺等有抗性的基因；以及用作表型標記的基因，即花青素調控基因、異戊烷基轉移酶基因等。術語“報告基因”指編碼鑒定因子的核酸，所述鑒定因子能基于所述報告基因的作用而被鑒定，其中所述作用用于追蹤目的核酸遺傳性、鑒定遺傳了目的核酸的細胞或生物，和/或測量基因表達誘導或轉錄。本領域已知和使用的報告基因的實例包括螢光素酶 (Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙?；D移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡萄糖醛酸酶(Gus)等。選擇標記基因也可認為是報告基因。“啟動子”和“啟動子序列”可互換使用，指能控制編碼序列或功能RNA表達的DNA 序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子可整體來源于天然基因，或者由來自天然中存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA節(jié)段。本領域技術人員應當理解的是，不同啟動子可指導基因在不同組織或細胞類型中表達，或者在不同的發(fā)育階段表達，或者應答于不同環(huán)境或生理條件而表達。導致基因在大多數(shù)細胞類型中在多數(shù)情況下表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。導致基因在特定細胞類型中表達的啟動子通常稱為“細胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。導致基因在特定發(fā)育階段或細胞分化中表達的啟動子通常稱為“發(fā)育特異性啟動子”或“細胞分化特異性啟動子”。在細胞暴露于試劑、生物分子、化學品、配體、光等或者用其處理后被誘導并導致基因表達的啟動子通常稱為“誘導型啟動子”或“調控型啟動子”。還應當認識到，由于在大多數(shù)情形下還沒有完全定義調控序列的準確邊界，所以不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。啟動子序列通常以其3’端的轉錄起始位點為界，并且向上游(5’方向)延伸至包括以高于背景的可檢測水平起始轉錄所需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)將發(fā) 現(xiàn)轉錄起始位點(例如通過核酸酶Sl進行圖譜分析來方便地定義)以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合結構域(共有序列)。當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成mRNA，然后對RNA進行反式剪接(trans-RNAsplice)(如果所述編碼序列包含內(nèi)含子的話)并翻譯成由所述編碼序列編碼的蛋白質時，則所述編碼序列“受控于”細胞中的轉錄和翻譯控制序列?！稗D錄和翻譯控制序列”指使編碼序列在宿主細胞中表達的DNA調控序列，例如啟動子、增強子、終止子等。在真核細胞中，多聚腺苷酸化信號是控制序列。術語“應答元件”指一種或多種順式作用DNA元件，其通過介導與轉錄因子的DNA 結合結構域之間的相互作用而賦予啟動子反應性。此DNA元件的序列可以是回文的(完全的或不完全的)或者由通過可變數(shù)量的核苷酸分開的序列基序或半位點組成。半位點可是相似或相同的，并且排列成正向或反向重復，或者單個半位點或者相鄰半位點的串聯(lián)多聚體。應答元件可包含從不同生物分離的最小啟動子，這取決于將引入該應答元件的細胞或生物的性質。轉錄因子的DNA結合結構域在存在或不存在配體的情況下與應答元件的DNA 序列結合，以在此應答元件調控下啟動或抑制下游基因的轉錄。術語“有效連接”指核酸序列連接到單個核酸片段上，以使序列之一的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能影響編碼序列(即編碼序列在所述啟動子的轉錄控制下) 的表達時，其與所述編碼序列有效連接。編碼序列可以有義或反義方向與調控序列有效連接。本文所用的術語“表達”指來源于核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩(wěn)定累積。表達還可指mRNA翻譯成蛋白質或多肽。術語“盒”、“表達盒”和“基因表達盒”指可在特定限制性位點或者通過同源重組而插入到核酸或多核苷酸中的DNA節(jié)段。DNA節(jié)段包含編碼目的多肽的多核苷酸，所述盒和限制性位點被設計成保證將盒插入到合適閱讀框中進行轉錄和翻譯?！稗D化盒”指這樣的特定載體，其包含編碼目的多肽的多核苷酸，并且除了多核苷酸之外還包含促進特定宿主細胞的轉化的元件。盒、表達盒、基因表達盒和轉化盒還可包含允許增強編碼目的多肽的多核苷酸在宿主細胞中表達的元件。這些元件可包括但不限于啟動子、最小啟動子、增強子、應答元件、終止子序列、多聚腺苷酸化序列等。術語“基因開關”指應答元件與啟動子以及基于配體依賴性轉錄因子的系統(tǒng)的組合，所述系統(tǒng)在一種或多種配體存在下調節(jié)引入了該應答元件和啟動子的基因的表達。術語“調控”指誘導、減少或抑制核酸或基因表達，分別導致誘導、減少或抑制蛋白質或多肽的產(chǎn)生?？捎迷诒景l(fā)明實施方案中的增強子包括但不限于SV40增強子、巨細胞病毒(CMV) 增強子、延伸因子I(EFl)增強子、酵母增強子、病毒基因增強子等。終止控制區(qū)(即終止子或多聚腺苷酸化序列)也可來自于優(yōu)選宿主所固有的各種基因。任選地，終止位點可以是不必需的，但是，優(yōu)選將其包含在內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述終止控制區(qū)可包含或來自于合成序列、合成的多聚腺苷酸化信號、SV40晚期多聚腺苷酸化信號、SV40多聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸化信號、病毒終止子序列等。術語“3’非編碼序列”或“3’非翻譯區(qū)(UTR) ”指這樣的DNA序列，其位于編碼序列的下游(3’)并且可包含多聚腺苷酸化[poly(A)]識別序列和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達的調控信號的序列。多聚腺苷酸化信號的特征通常在于能將多聚腺苷酸添加到 mRNA前體的3’端上。
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“調控區(qū)”指調節(jié)另一核酸序列表達的核酸序列。調控區(qū)可包含天然負責表達特定核酸的序列(同源區(qū))，或者可包含負責表達不同蛋白質或甚至合成蛋白質的不同來源的序列(異源區(qū))。特別地，所述序列可以是原核、真核或病毒基因的序列或者衍生序列，其以特異性或非特異性方式以及誘導型或非誘導型方式刺激或抑制基因轉錄。調控區(qū)包括復制起點、RNA剪接位點、啟動子、增強子、轉錄終止序列和指導多肽進入靶細胞分泌途徑的信號序列。來自“異源來源”的調控區(qū)指不是天然與所表達核酸相關的調控區(qū)。異源調控區(qū) 包括來自不同物種的調控區(qū)、來自不同基因的調控區(qū)、雜合調控序列以及自然界中不存在而是由本領域普通技術人員設計出來的調控序列。"RNA轉錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當所述RNA轉錄物是DNA序列的完全互補的拷貝時，其被稱為原始轉錄物，或者其可以是來源于對所述原始轉錄物進行翻譯后加工的RNA序列，稱為成熟RNA?！靶攀筊NA(mRNA) ”指不含有內(nèi)含子并且可被細胞翻譯成蛋白質的RNA?！癱DNA”指與mRNA互補并來源于mRNA的雙鏈DNA?！坝?義”RNA指包含mRNA并因此可被細胞翻譯成蛋白質的RNA轉錄物。“反義RNA”指與全部或部分的靶標原始轉錄物或mRNA互補并阻斷靶基因表達的RNA轉錄物。反義RNA可與特定基因轉錄物的任何部分即5’非編碼序列、3’非編碼序列或編碼序列互補。“功能性RNAl^ 反義RNA、核酶RNA或其他RNA，其不被翻譯，但能影響細胞過程。“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，指由共價鍵連接的氨基酸殘基組成的多聚體化合物?！胺蛛x的多肽”、“分離的肽”或“分離的蛋白質”指基本上不含通常在天然狀態(tài)下與其相關的那些化合物(例如其他蛋白質或多肽、核酸、碳水化合物、脂質)的多肽或蛋白質。 “分離的”不表示排除與其他化合物的人工或合成混合物或者不干擾生物活性的雜質的存在，它們可例如因為不完全純化、穩(wěn)定劑的添加或混合到可藥用制劑中而存在。突變可利用本領域公知的任何突變技術進行，包括但不限于體外定點突變 (Hutchinson 等，J. Biol. Chem. 253 6551 (1978) ；Zoller 等，DNA 3 479 (1984) ；Oliphant 等，Gene 44 177 (1986) ；Hutchinson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710(1986))、利用TAB 接頭(Pharmacia)、限制性核酸內(nèi)切酶消化/片段缺失和替換、PCR介導的/寡核
苷酸指導的突變等?；赑CR的技術優(yōu)選用于定點突變(參見Higuchi，1989，“ Using PCR to Engineer DNA “ , PCR Technology Principles andApplications for DNA Amplification, H. Erlich 編輯，Stockton Press,第 6 章，第 61-70 頁)。多肽或蛋白質的“變體”指來源于多肽或蛋白質并且保留所述多肽或蛋白質的至少一種生物特性的任何類似物、片段、衍生物或突變體。多肽或蛋白質的不同變體可天然存在。這些變體可以是等位基因變異，其特征在于編碼蛋白質的結構基因的核苷酸序列不同，或者可包括差異性剪接或翻譯后修飾。本技術人員可制備具有單個或多個氨基酸替換、缺失、添加或置換的變體。這些變體可包括(a) —個或多個氨基酸殘基被替換為保守或非保守氨基酸的變體，(b)向多肽或蛋白質中添加了一個或多個氨基酸的變體，(c) 一個或多個氨基酸包含取代基的變體以及⑷多肽或蛋白質與另一多肽(例如血清白蛋白)融合的變體，等等。用于獲得這些變體的技術(包括基因技術(抑制、缺失、突變等)、化學技術和酶技術)是本領域普通技術人員公知的。
術語“同源性”指兩個多核苷酸或者兩個多肽部分之間的同一性百分比。一個部分與另一個部分的序列之間的對應性可通過本領域公知的技術來測定。例如，可通過比對序列信息并利用容易利用的計算機程序來直接對比兩種多肽分子之間的序列信息，以測定同源性?；蛘?，可在同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下進行多核苷酸的雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化并測定所消化片段大小來測定同源性。本文所用的術語“同源”的所有其語法形式和拼寫變化指具有“共同的進化起源，，的蛋白質(包括來自超家族(例如免疫球蛋白超家族)的蛋白質和來自不同物種的同源蛋白質(例如肌球蛋白輕鏈等))之間的關系(Reeck等，Cell 50:667(1987))。這些蛋白質 (及其編碼基因)具有序列同源性，如其高度序列相似性所反映的。然而，在常用意義和本申請中，術語“同源”在用副詞比如“高”進行修飾時，可指序列相似性，而不是共同的進化起源。因此，術語“序列相似性”的所有其語法形式指可具有或不具有共同進化起源的核酸或蛋白質氨基酸序列之間的同一性或對應性的程度(參見Reeck等，Cell 50: 667 (1987))。在一個實施方案中，當DNA序列的確定長度中至少約50% (例如至少約75%、 90%或95% )的核苷酸相匹配時，則兩種DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。基本上同源的序列可通過使用序列數(shù)據(jù)庫中可用的標準軟件對比序列或者在例如特定系統(tǒng)所限定的嚴格條件下進行Southern雜交實驗來鑒定。限定合適的雜交條件在本領域技術范圍內(nèi)(參見例如Sambrook等，1989，同上)。本文所用的“基本上相似”指這樣的核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的變化導致一個或多個氨基酸被替換，但是不影響該DNA序列所編碼蛋白質的功能特性。“基本上相似的”還指這樣的核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的變化不影響該核酸片段通過反義或共抑制技術介導基因表達改變的能力?！盎旧舷嗨频摹边€涉及對本發(fā)明核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個或多個核苷酸堿基)，其基本上不影響所得轉錄物的功能特性。因此，應當理解的是，本發(fā)明涵蓋了多于特定示例性序列的序列。每一種所提出的修飾均在本領域的常規(guī)技術內(nèi)，測定編碼產(chǎn)物的生物活性保留也是這樣。然而，技術人員會認識到，本發(fā)明涵蓋的基本上相似的序列還可通過其在嚴格條件(0. IX SSC、0. SDS、65°C 并用 2X SSC、0. 1 % SDS 洗滌，然后用 0. IX SSC、0.1%SDS 洗滌)下與本文所示例序列雜交的能力來定義。本發(fā)明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列與本文所報道的核酸片段至少約70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。當多于約40%的氨基酸相同或者多于60%的氨基酸相似(功能上相同)時，兩種氨基酸序列是“基本上同源的”或者“基本上相似的”。優(yōu)選地，通過比對利用例如 GCG(Genetics Computer Group，GCG 包第 7 版的程序手冊，Madison，Wisconsin)pileup 程序來鑒定相似或同源序列。本文所用的術語“對應于”指相似或同源序列，而不管準確位置與所檢測的具有相似性或同源性的分子相同還是不同。核酸或氨基酸序列比對可包括間隙。因此，術語“對應于”指序列相似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。氨基酸或核苷酸序列的“顯著部分”包含足以推定性地鑒定該多肽或基因的多肽氨基酸序列或者基因核苷酸序列，所述鑒定是通過本領域技術人員對序列進行人工評價，或者通過計算機自動化序列對比并使用算法(例如BLAST (Basic Local Alignment Search
19Tool ；Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403 (1993))；以 ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 獲得))進行鑒定。一般而言，為了推定性鑒定與已知蛋白質或基因同源的多肽或核酸序列，10個或更多個連續(xù)的氨基酸或者30個或更多個核苷酸的序列是必需的。此外，就核苷酸序列而言，包含20-30個連續(xù)核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針可用在序列依賴性基因鑒定(例如 Southern雜交)和分離(例如細菌克隆或者噬菌體斑的原位雜交)方法中。此外，12-15 個堿基的短寡核苷酸可用作PCR中的擴增引物，以獲得包含所述引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“顯著部分”包含足以特異性鑒定和/或分離包含該序列之核酸片段的序列。如本領域所公知的，術語“同一性百分比”是通過比較序列測定的兩個或更多個多肽序列或者兩個或更多個多核苷酸序列之間的關系。在本領域中，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，根據(jù)具體情況而定，如通過這些序列串之間的匹配所測定的?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨赏ㄟ^已知的方法容易地計算，所述方法包括但不限于以下描述的 β些Computational Molecular Biology (Lesk, Α. Μ.編輯)Oxford University Press, New York(1988) ；Biocomputing :Informatics and Genome Projects(Smith, D. W.編輯)Academic Press, New York (1993) ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A. M.和 Griffin，H. G.編輯)Humana Press, New Jersey(1994)； SequenceAnalysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編輯)Academic Press (1987)；以及 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M.禾口 Devereux, J.編輯)Stockton Press, New York(1991) 0測定同一性的優(yōu)選方法被設計成給出所測序列之間的最佳匹配。測定同一性和相似性的方法被編寫成了公共可利用的計算機程序。序列比對和同一性百分比計算可利用序列分析軟件(例如LASERGENE生物信息學計算套件(DNASTAR Inc. ,Madison,WI) 的Megalign程序)來進行。多重序列比對可利用Clustal比對法(Higgins等，CABI0S. 5 151(1989))以及默認參數(shù)(空位罰分=10，空位長度罰分=10)?？蛇x擇利用Clustal法的配對比對的默認參數(shù)KTUPLE 1、空位罰分=3,WINDOW = 5以及DIAGONALS SAVED = 5。術語“序列分析軟件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計算機算法或軟件程序?！靶蛄蟹治鲕浖笨梢再徺I或自行開發(fā)。典型的序列分析軟件包括但不限于 GCG 禾呈序(Wisconsin Package Version 9. O, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403(1990))以及 DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)。在本申請上下文中，應當理解的是，當使用序列分析軟件進行分析時，分析的結果會基于所參照程序的“默認值”，除非另有說明。本文所用的“默認值”將指在軟件初始化時首先加載的任何值或參數(shù)組。當與DNA序列相關時，“化學合成的”指在體外組裝組分核苷酸。可利用成熟的方法來實現(xiàn)DNA的手動化學合成，或者可利用多種可商購儀器之一進行自動化學合成。因此，可基于反映宿主細胞密碼子偏好的核苷酸序列優(yōu)化對基因進行調整，以優(yōu)化基因表達。技術人員了解，如果根據(jù)宿主偏好的密碼子對密碼子使用進行調整，則基因表達很可能成功。可基于對來源于序列信息可用之宿主細胞的基因進行的研究來確定優(yōu)選的密碼子。術語“外源基因”指受試者之外的基因，也就是說，通過轉化過程引入受試者內(nèi)的基因，其為內(nèi)源突變基因的非突變形式或內(nèi)源非突變基因的突變形式。轉化方法對于本發(fā) 明而言不是關鍵性的，并且可以是本領域技術人員公知的適用于受試者的任何方法。外源基因可以是以DNA或RNA形式引入受試者的天然或合成基因，RNA可通過DNA中間體(例如通過逆轉錄酶)起作用。這些基因可被引入靶細胞中、直接引入受試者中或者通過轉化細胞的轉移間接引入受試者中。術語“受試者”指完整的動物，優(yōu)選脊椎動物，最優(yōu)選哺乳動物。術語“HGF同工型”指氨基酸序列與動物中天然產(chǎn)生的HGF氨基酸序列至少80%相同(例如至少90%或95%相同)的任何HGF多肽，包括所有等位基因變體。在一個實施方案中，所述術語指已知具有細胞增殖活性的同工型。HGF同工型包括但不限于flHGF、dHGF、 NK1、NK2 禾口 NK4。術語“flHGF”指動物(例如哺乳動物)的全長HGF蛋白，例如人HGF的1-728位
氨基酸。術語“dHGF”指通過對動物(例如哺乳動物)中HGF基因進行選擇性剪接而產(chǎn)生的HGF蛋白的缺失變體，例如由723個氨基酸組成的人HGF，其中全長HGF序列α鏈的第一個kringle結構域缺失5個氨基酸(F、L、P、S和S)。術語“NK1”指由N端發(fā)夾環(huán)和kringle 1結構域組成的來自動物(例如哺乳動物，例如人)的HGF同工型。術語“NK2”指由N端發(fā)夾環(huán)、kringle 1和kringle 2結構域組成的來自動物(例如哺乳動物，例如人)的HGF同工型。術語“NK4” 指由 N 端發(fā)夾環(huán)、kringle 1、kringle 2、kringle 3 和 kringle 4 結構域組成的來自動物(例如哺乳動物，例如人)的HGF同工型。本發(fā)明的方法包括向患有心臟和/或血管病癥的受試者施用包含兩種或更多種 HGF同工型的組合物。在一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型是哺乳動物HGF (例如人HGF)的同工型。來自各種物種的HGF的氨基酸序列是本領域眾所周知的，并且可見于序列數(shù)據(jù)庫例如GenBank中(登錄號BAA14348的人HGF的氨基酸序列，在此通過引用并入本文)。在一個實施方案中，HGF同工型之一是人fIHGF(SEQ ID NO :2)。在另一個實施方案中，HGF同工型之一是人dHGF (SEQ ID NO 3)。在另一個實施方案中，HGF同工型之一是人NKl (SEQ ID NO :4)。在另一個實施方案中，HGF同工型之一是人NK2 (SEQ ID NO :5)。在另一個實施方案中，HGF同工型之一是人NK4 (SEQ ID NO 6)。在又一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型包含f IHGF和dHGF。在又一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF 同工型由flHGF和dHGF組成。在一個實施方案中，所述HGF同工型是人野生型HGF同工型的變體。例如，所述同工型可以是與野生型人 f IHGF (SEQ ID NO 2)、dHGF (SEQ ID NO 3), NKl (SEQ ID NO :4)、 NK2 (SEQ ID NO :5)或NK4(SEQ ID NO :6)序列至少80%序列相同(例如至少85、90、95、96、 97、98或99%序列相同)的人flHGF、dHGF、NKl、NK2或NK4序列的變體。所述變體可包括野生型人HGF同工型氨基酸序列的添加、缺失、替換或其組合。添加或替換可包括使用非天然氨基酸，并且可出現(xiàn)在其內(nèi)部、N端和/或C端的任何位置上。優(yōu)選地，任何替換是保守性氨基酸替換?！氨Ｊ匦园被崽鎿Q”是指其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族已在本領域中定義。這些家族包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。序列同一性是通過以下步驟計算的比較兩個在比較區(qū)中最佳比對的序列，測定兩種序列中存在相同氨基酸殘基的位置數(shù)，以得出匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較區(qū) 中總位置數(shù)(即窗口大小)，并將結果乘以100得到序列同一性百分比。在一個方面中，同一性百分比計算為在被比序列中以相同氨基酸殘基匹配的兩個序列中較小一個的氨基酸殘基的百分比(Dayhoff， in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5,124 頁，National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C. (1972),通過弓 | 用并入本文)，其中在100個氨基酸長度中可引入4個缺口以進行最佳比對。同一性的確定通常通過本領域公知的計算機同源性程序進行。示例性程序是利用默認設置的Gap程序 (WisconsinSequence Analysis Package,Version 8 for UNIX,Genetics ComputerGroup, University Research Park, Madison, WI),其利用 Smith 禾口 Waterman (Adv. App 1. Math. 2 482(1981))的算法，其通過引用整體并入本文。在一個實施方案中，HGF同工型變體保留了野生型HGF同工型蛋白質的任何一種或更種生物活性的基本全部。本文所用的術語“野生型HGF的基本全部活性”指保留HGF 同工型變體的任何一種或多種生物活性(例如刺激血管發(fā)生或促進細胞增殖的能力)的至少70%的HGF同工型變體。在一些實施方案中，保留HGF同工型的一種或多種生物活性的至少75、80、85、90或95%。HGF活性可通過本領域眾所周知的常規(guī)體外和體內(nèi)測定(例如體內(nèi)的Matrigel塞和角膜新生血管形成測定、體內(nèi)/體外的雞胚尿囊膜(CAM)測定、體外的細胞(增殖、遷移、管形成)和器官型(動脈環(huán))測定)來檢測。已經(jīng)廣泛地研究了 HGF的結構和功能，本領域技術人員知道HGF序列中的氨基酸對保留蛋白質的基本全部生物活性是重要的，并且優(yōu)選在任何HGF變體中不改變或僅發(fā)生保守性改變。參見例如 Hartmann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11574(1992) ；Lokker 等，EMBO J. 11 2503(1992), Zhou 等，Structure 6 109 (1998)，Ultsch 等，Structure 6 1383(1998)，Shimizu 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 189 1329 (1992)，Yoshiyama 等， Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 :660 (1991)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。例如，N端發(fā)夾環(huán)和kringle 1結構域可能是細胞增殖活性所必需的。對生物活性不是關鍵性的其他氨基酸可更為自由地進行缺失和/或替換。本領域技術人員可利用常規(guī)誘變技術(例如上文引用的參考文獻中所述那些)制備HGF同工型變體，并鑒定保留HGF同工型的基本全部生物活性的變體。在本發(fā)明的一個方面中，以編碼同工型的多核苷酸形式向受試者施用兩種或更多種HGF同工型。在一個實施方案中，所述多核苷酸編碼哺乳動物同工型，例如人HGF。來自各種物種的HGF基因的多核苷酸序列是本領域眾所周知的，并且可見于序列數(shù)據(jù)庫例如 GenBank中(登錄號NM000601的人HGF基因的多核苷酸序列，通過引用并入本文)。在一個實施方案中，所述多核苷酸編碼flHGF。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼dHGF。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼NK1。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼 NK2。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼NK4。在又一個實施方案中，所述多核苷酸編碼flHGF和dHGF 二者。在又一個實施方案中，所述多核苷酸編碼flHGF、dHGF和NKl。
在一個實施方案中，編碼兩種或更多種HGF同工型的一種或多種多核苷酸包含野生型人HGF基因序列。在另一個實施方案中，所述多核苷酸包含野生型HGF基因的序列變體，但是由于密碼子簡并性而仍編碼HGF同工型的野生型氨基酸序列。在又一個實施方案中，所述多核苷酸編碼如上文所述的HGF同工型蛋白質序列變體。在一個實施方案中，人 HGF同工型基因序列的多核苷酸序列變體與野生型人HGF同工型基因序列具有至少80%序列同一性，例如至少85、90、95、96、97、98或99%同一性。在本發(fā)明的一個方面中，所述兩種或更多種HGF同工型由同時表達兩種或更多種同工型(例如fIHGF和dHGF)的雜合HGF基因編碼。US 2005/0079581 Al (其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文)中所述的雜合HGF基因包含對應于HGF內(nèi)含子1-18的cDNA，以及所述cDNA的外顯子4和5之間插入的固有或外源內(nèi)含子，其中除了外顯子4和5之間的內(nèi)含子之外，雜交基因的外顯子之間不含其他內(nèi)含子。所述內(nèi)含子包括固有內(nèi)含子的片段或重組序列。包含固有內(nèi)含子的雜合HGF基因的一個實施方案為7113bp長度，并且具有SEQ ID NO 7的核苷酸序列。所述雜合HGF基因同時表達f IHGF和dHGF，并且具有比f IHGF cDNA 更高的表達效率。密碼子簡并性使得雜合HGF基因可在編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)中被修飾或改變，而不改變蛋白質的氨基酸序列和基因的表達。因此，與SEQ ID NO :7的雜合HGF基因基本相同的多核苷酸及其片段落在本發(fā)明范圍內(nèi)。“基本相同”指序列同一性不低于80%，例如不低于90%，例如不低于95%。雜合HGF基因可包含固有內(nèi)含子的片段，其任選地含有在HGFcDNA外顯子4和5 之間插入的小的重組序列。本文中，這些包含固有內(nèi)含子片段的雜合HGF基因被命名為 “HGF-X”。實例包括分別具有SEQ ID NO :8至10的核苷酸序列的HGF-X6、HGF_X7和HGF-X8。待施用的兩種或更多種HGF同工型可由獨立的多核苷酸或單個多核苷酸編碼。所述多核苷酸可以與控制HGF同工型表達的一個或多個調控區(qū)(例如啟動子或增強子)有效連接。所述啟動子可以是組成型啟動子(例如人巨細胞病毒啟動子)或誘導型啟動子。調控序列可以是通過添加或除去特異性配體來調節(jié)HGF同工型表達的基因開關的一部分?？?用在本發(fā)明基因開關中的配體依賴性轉錄因子的實例包括但不限于通過各自配體(例如糖皮質激素、雌激素、黃體酮、類視黃醇、蛻皮激素，及其類似物和模擬物)激活的核受體超家族成員和通過四環(huán)素激活的rTTA。在又一個實施方案中，所述啟動子是心肌細胞特異性啟動子(例如心錨蛋白重復蛋白，MYBPC3)。當兩種或更多種HGF同工型由獨立的多核苷酸編碼時，每一多核苷酸可與其自身的調控序列有效連接。在另一個實施方案中，兩種或更多種多核苷酸可作為串聯(lián)盒的一部分受控于單個調控序列，其任選地在所述兩種或更多種多核苷酸之間插入序列(例如內(nèi)部核糖體結合位點)以促進所有同工型的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼兩種或更多種HGF同工型的一種或多種多核苷酸是載體(例如表達載體)的一部分。所述載體可以是例如質粒載體(例如Lee等， Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 230 (2000)、W0 2000/040737 中公開的 pCK 載體)或者單鏈或雙鏈的RNA或DNA病毒載體?？赏ㄟ^將DNA和RNA引入細胞中的公知技術將這些載體引入細胞中。病毒載體可以是有復制能力的或是復制缺陷型的。在后一種情形下，病毒增殖通常將僅僅在回補性宿主細胞中發(fā)生。本文所用的術語“宿主細胞”或“宿主”用于指攜帶本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的本發(fā)明細胞。因此，所述載體必須至少包含本發(fā)明的多核苷酸。載體的其他組分可包括但不限于選擇標記、染色質修飾結構域、驅動也可存在于載體上的其他多肽(例如致死性多肽)表達的其他啟動子、基因組整合位點、重組位點和分子插入位點。所述載體可包含任意數(shù)量的這些其他元件，無論是否在所述多核苷酸內(nèi)，以使所述載體可適用于所期望的治療方法的特定目的。在本發(fā)明的一個實施方案中，引入細胞中的載體還包含“選擇標記基因”，當表達時，其指示所述載體已經(jīng)被引入宿主細胞中。這樣，選擇基因可以是載體存在的陽性標記。雖然對于本發(fā)明的方法而言不是關鍵性的，但是選擇標記基因的存在允許技術人員選擇已將載體構建體引入細胞中的活細胞群體。因此，本發(fā)明的某些實施方案包括選擇已成功引入了載體的細胞。當與細胞聯(lián)用時，本文所用的術語“選擇”或其變化形式旨在表示用于選擇含有特定基因組成或表型的細胞的標準公知方法。典型的方法包括但不限于在抗生素例如G418、嘌呤霉素和氨芐青霉素存在下培養(yǎng)細胞。選擇標記基因的其他實例包括但不限于賦予氨甲蝶呤、潮霉素或霉酚酸抗性的基因。那么，包含含有抗生素抗性基因的載體構建體的細胞將能耐受培養(yǎng)物中的抗生素。同樣，不包含含有抗生素抗性基因的載體構建體的細胞將不能耐受培養(yǎng)物中的抗生素。本文所用的“染色質修飾結構域”(CMD)指與多種維持和/或改變?nèi)旧|結構相關的蛋白質發(fā)生相互作用的核苷酸序列，例如但不限于DNA絕緣子。參見Ciavatta等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 :9958 (2006)，其在此通過引用并入本文。CMD的實例包括但不限于雞β-球蛋白絕緣子和雞高敏位點4(cHS4)。在一個或多個基因序列(即啟動子、編碼序列和3’調控區(qū))之間使用不同的CMD序列例如可有利于使用不同的CMD DNA序列作為 “微同源臂(mini homology arm) ”與多種微生物或體外重組技術相組合，以“交換”現(xiàn)有的多基因及單基因穿梭載體之間的基因序列。染色質修飾結構域的其他實例是本領域公知的或可容易地鑒定?？捎糜诒景l(fā)明的具體載體是編碼蛋白質或多核苷酸的表達載體。一般而言，這些載體包含與待表達多核苷酸有效連接的順式作用控制區(qū)，用于在宿主中有效表達。合適的反式作用因子由宿主提供、由回補載體提供或在引入宿主后由載體本身提供。許多表達載體可用于表達蛋白質或多核苷酸。這些載體包括染色體、附加體或病毒來源的載體，例如來源于細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(例如腺相關病毒、慢病毒、桿狀病毒、乳多空病毒、SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉錄病毒)的載體以及來源于其組合的載體，例如來源于質粒和噬菌體基因元件的載體，例如粘粒和噬粒。所有均可用于本發(fā)明此方面的表達。一般而言，適于在宿主中維持、增殖或表達多核苷酸或蛋白質的任何載體均可用于此方面的表達。表達載體中的多核苷酸序列可與合適的表達控制序列(包括例如啟動子)有效連接，以指導mRNA轉錄。代表性的額外啟動子包括但不限于組成型啟動子和組織特異性或誘導型啟動子。組成型真核啟動子的實例包括但不限于小鼠金屬硫蛋白I基因啟動子 (Hamer 等，J. Mol. Appl. Gen. 1 :273 (1982))、皰疹病毒的 TK 啟動子(McKnight，Cell31 355(1982))、SV40早期啟動子(Benoist等，Nature 290 =304(1981))以及痘苗病毒啟動子。上文列舉的所有參考文獻均通過引用并入本文?？捎糜隍寗拥鞍踪|或多核苷酸表達的啟動
24子的其他實例包括但不限于組織特異性啟動子和針對特定蛋白質的其他內(nèi)源啟動子，例如白蛋白啟動子(干細胞)、胰島素原啟動子(胰腺β細胞)等。一般而言，表達構建體將包含用于轉錄、起始和終止的位點，并且在所轉錄的區(qū)域中包含用于翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的成熟轉錄物的編碼部分包括位于待翻譯多肽的起點的翻譯起始AUG和正確地置于終點的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。此外，構建體可包含調節(jié)和啟動表達的控制區(qū)。一般而言，這些區(qū)域將通過控制轉錄(例如阻遏蛋白結合位點和增強子等)來操縱。真核載體的實例包括但不限于可獲得自Stratagene的pW_LNE0、pSV2CAT、p0G44、 pXTl 和 pSG ；獲得自 Amersham Pharmacia Biotech 的 pSVK3、pBPV、pMSG 禾口 pSVL ；以及獲得自 Clontech 的 pCMVDsRed2_express、pIRES2_DsRed2、pDsRed2_Mito 和 pCMV-EGFP。許多其他載體是眾所周知的并且是市售的。用于在宿主細胞中表達的合適載體和啟動子的選擇是眾所周知的方法，用于載體構建和引入宿主中以及在宿主中表達的必需技術是本領域的常規(guī)技術。多核苷酸向細胞中的引入可以是載體的瞬時轉染或穩(wěn)定轉染。將載體瞬時轉染到宿主細胞中可通過直接注射、磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法來實現(xiàn)。這些方法描述于許多標準實驗室手冊(例如 Davis 等，BasicMethods in Molecular Biology (1986) ；Keown 等，Meth. Enzymol. 185 527 (1990) ；Sambrook^, 2001,Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，N. Y.，它們在此通過引用并入本文)中。所述兩種或更多種HGF同工型或一種或多種編碼HGF同工型的多核苷酸可以藥物組合物形式施用給受試者。在一個實施方案中，所述組合物配制成用于注射。所述藥物組合物還可包含可藥用載體。藥學領域中任何常用方法均可用于制備口服制劑，例如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑和溶液劑；注射制劑，例如溶液劑、混懸劑或可在注射前與蒸餾水混合的干粉；局部施用的制劑，例如膏劑、霜劑和洗劑；以及其他制劑。藥學領域中常用的載體可用在本發(fā)明組合物中。例如，口服施用的制劑可包含粘合劑、乳化劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、助懸劑、著色劑或香料。注射制劑可包含防腐劑、除痛苦劑(imagonizing agent)、增溶劑或穩(wěn)定劑。用于局部施用的制劑可包含基質、賦形劑、潤滑劑或防腐劑。本領域公知的任何合適的制劑(Remington’ s Pharmaceutical Science (18th edition) ,Mack PublishingCompany,Eaton PA)肖可用$ 本發(fā)明中。所述藥物組合物可在臨床上以各種經(jīng)口和胃腸外制劑形式施用。合適的制劑可利用諸如添加劑、促進劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑和表面活性劑或稀釋劑的賦形劑來制備。用于經(jīng)口施用的固體制劑包括丸劑、片劑、散粉劑、顆粒劑和膠囊劑。這些固體制劑可通過混合一種或多種賦形劑(例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠和二芐基丁內(nèi)酯型木脂素 (dibenzylbuthyllacton lignan)衍生物)來制備。而且，潤滑劑例如硬脂酸鎂和滑石也可包含在所述制劑中。用于經(jīng)口施用的液體制劑包括混懸劑、溶液、乳劑和糖漿劑。除了常用的簡單稀釋劑例如水和液體石蠟之外，這些制劑可包含潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。用于胃腸外施用的制劑包括無菌水溶液、混懸劑、乳劑、凍干替代療法和栓劑。不溶于水的賦形劑和助懸劑包括植物脂肪，例如丙二醇、乙二醇和橄欖油以及注射用酯(例如油酸乙酯)。Wit印sol 、Macrogol 、Tween 61、可可脂、月桂酸酯(laurin fat)和甘油明膠可用作栓劑基質。下面的實施例僅僅是為了舉例說明目的給出的，不應當視為限制本發(fā)明的范圍。實施例1:質粒的構建pCK載體可利用人巨細胞病毒(HCMV)啟動子驅動基因表達，并且之前已進行了描述(Lee 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 230(2000) ；WO 2000/040737)。pCK-VEGF165是通過將VEGF165 cDNA插入到pCK載體中來構建的，并且之前已進行了描述(Lee 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 230(2000) ；WO 2000/040737)。pCK-cHGF包含在HCMV啟動子控制下的編碼HGF728的cDNA，并且之前已進行了描述(US 2005/0079581)。pCK-dHGF包含在HCMV啟動子控制下的編碼HGF723的cDNA，并且之前已進行了描述(PCT/KR03/00548)。pCK-HGF-X7包含雜合HGF cDNA(SEQ ID NO :9)，其被設計成表達兩種同時插入到 pCK載體中的HGF同工型，并且之前已進行了描述(US 2005/0079581)。實施例2 =HGF對細胞遷移和增殖的影響本研究的目的是在體外評價HGF對細胞遷移和增殖的影響。1.材料和方法(I)HGF蛋白的制備利用FuGENE6 (Roche Diagnostics, Germany)將 pCK_HGF_X7 轉染到 293T 細胞中。pCK、pCK-cHGF和pCK-dHGF用作對照。轉染后2天，獲得含有HGF蛋白的培養(yǎng)上清液，根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，通過人HGF ELISA(R&D Systems, MN, USA)來測量HGF的量。(2)細胞遷移測定在改進的Boyden室測定中評價HGF對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC，Agiolab Co.， Ltd.，AL01-0122S)、小鼠骨骼肌成肌細胞(C2C12，ATCC No. CRL-1772)和大鼠心臟成肌細胞 (H9C2, ATCCNo. CRL-1446)遷移的影響。用在PBS中的1 %明膠包被具有多孔聚碳酸酯濾膜 (孔大小為8 μ m)的24孔transwell細胞培養(yǎng)室(Corning, NY, US)的插片。將懸浮在補充FBS的M199培養(yǎng)基中的HUVEC (η = 15)、分別懸浮在補充3% FBS的DMEM培養(yǎng)基中的C2C12(n = 10)或H9C2 (η = 10)細胞以1 X IO4個細胞/孔加到所述插片中。將測試物質(來自用pCK、pCK-cHGF、pCK-dHGF或pCK-HGF_X7轉染的293T細胞的上清液)分別在補充1 %或3%的FBS的M199或DMEM中稀釋成50ng/ml的HGF終濃度，將600 μ 1所稀釋的測試物質置于下部的室中。使細胞在CO2培養(yǎng)箱中于37°C下遷移3小時，然后提起插片，用 PBS洗滌，用4%甲醛固定10分鐘，并用0. 2%結晶紫染色。通過對位于所述插片對側上的細胞進行計數(shù)來定量細胞遷移。對每一個插片中5個高倍視野(X200)的細胞進行計數(shù)。利用 Image-Pro plus (MediaCybernetics，US)分析圖像。(3)細胞增殖測定利用[3H]胸苷摻入測定來評價HGF對HUVEC細胞增殖的影響。將懸浮在補充1 % FBS的M199培養(yǎng)基中的HUVEC細胞(η = 10)以5 X IO3個細胞/孔鋪在96孔板中。將IOng HGF蛋白(來自用pCK、pCK-cHGF、pCK-dHGF或pCK-HGF_X7轉染的293T細胞的上清液)加
26到所述細胞中。使細胞在CO2培養(yǎng)箱中于37°C下增殖48小時。然后，將IyCU3H]胸腺嘧啶脫氧核苷加到每一個孔中，并在37°C下再孵育細胞16小時。收獲細胞并用液體閃爍計數(shù) 器(Wallac，Turku, Finland)測量[3H]胸苷摻入。2.結果和討論為了研究兩種HGF蛋白同工型的生物學結果，考察了其對細胞遷移和增殖的影響。這些測定是利用來自用各表達載體轉染的293T細胞的上清液進行的，如材料和方法中所述。在所有實驗中，使用等量的HGF蛋白。如圖1、2和3所示，與僅存在一種同工型相比，由pCK-HGF-X7產(chǎn)生的兩種HGF同工型的存在分別更有效地誘導HUVEC、C2C12和H9C2細胞的遷移。兩種HGF同工型的存在還促進HUVEC細胞的有效增殖(圖4)。由pCK-HGF-X7轉染細胞產(chǎn)生的上清液比由pCK_dHGF 產(chǎn)生的上清液更有效地誘導HUVEC細胞增殖。這些結果表明，兩種HGF同工型的聯(lián)合作用導致內(nèi)皮細胞中更強的遷移和增殖活性以及骨骼和心臟成肌細胞中更強的遷移活性。血管內(nèi)皮細胞遷移與血管發(fā)生具有強相關性，心肌和骨骼肌前體細胞的遷移是肌肉發(fā)育和損傷后肌肉再生的關鍵步驟。因此，這些結果表明，施用兩種HGF同工型可提供更有效地誘導新生血管形成和缺血性組織再生的方法。血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖還是與血管壁形成相關的天然過程。因此，這些結果還表明，施用兩種HGF同工型可促進血管壁再內(nèi)皮化。實施例3 =HGF在大鼠缺血性心臟病模型中的效力評價本研究的目的是在大鼠缺血性心臟病模型中評價心肌內(nèi)注射HGF的心臟保護作用。實驗步驟顯示在圖5中。1.材料和方法(1)動物到達后，給38只Sprague-Dawley大鼠(雄性，12周齡，350_400g，SLC)隨意提供飼料和水，并在進行手術前使它們休息7天。(2)心肌梗死模型為了在本研究中分析HGF的藥效，使用了大鼠缺血性心臟病模型，其是廣泛使用的CAD病理模型之一。通過肌內(nèi)注射甲苯噻嗪(5mg/kg)然后注射氯胺酮(50mg/kg)，使大鼠麻醉。用95%酒精和碘酒消毒后，用無菌的外科用紗布覆蓋胸部，僅暴露出切口區(qū)域，從而為手術提供完全無菌的條件。通過氣管插管途徑進行氣管內(nèi)插管。在手術過程中，維持正壓通氣。連續(xù)監(jiān)測心電圖和氧飽和度。進行正中開胸術(mid thoracotomy) 0打開心包膜然后檢查左心室前壁之后，用由小片Nelaton (5Fr)支撐的6-0聚丙烯縫合線結扎冠狀動脈左前降支(LAD)的近端三分之一處。證實所監(jiān)測的心電圖上的ST段升高。LAD結扎60 分鐘后，再灌注的大鼠缺血性心肌。閉合心包膜和開胸術傷口。重新開始足夠的自主呼吸后除去連接中壁吸氣機(mid wall suction)的單根胸管，并除去氣管內(nèi)管。然后，檢查切口中出血的存在情況?？刂瞥鲅?，縫合所切開的肌肉、筋膜和皮膚。手術后，肌內(nèi)施用慶大霉素(3mg/kg/天)3天來預防感染。手術后28天，進行經(jīng)胸超聲心動圖以確認在大鼠中誘導了心肌梗死。(3)效力評價研究設計將含有HGF基因的質粒直接注射到缺血心肌中并在生理學和解剖學方面觀察心臟保護作用，以測試HGF的效力。誘導缺血后(第0天)立即施用含有HGF基因的質粒。給每只動物心肌內(nèi)注射總劑量為250 μ g的pCK-cHGF(n = 12)或pCK-HGF_X7 (η = 10)。就陰性和陽性對照而言，注射等量的不含HGF編碼序列的pCK載體(η = 7)以及pCK_VEGF165 (η =9)。注射DNA后第1、14、28和56天通過經(jīng)胸超聲心動圖評價心臟生理功能的改善。尸檢后測量血管生成和抗纖維化水平。(4)心臟生理分析第1天，利用經(jīng)胸超聲心動圖測量左心室射血分數(shù)和收縮期的室間隔。將第1天獲得的值設定為基線值。第14、28和56天，再次測量超聲心動圖。pCK、pCK-HGF-X7、pCK-cHGF 和pCK-VEGF165組之間比較在第14、28和56天獲得的值。此外，從缺血心臟獲取組織切片，以分析左心室中毛細血管密度和纖維化的變化。(5)毛細血管密度分析第56天，從缺血心臟獲得心肌組織并在10%福爾馬林溶液中固定2天，然后包埋在石蠟中。從每一個樣本制備數(shù)個連續(xù)切片。在組織切片上，用⑶31抗體染色來鑒定毛細血管的內(nèi)皮細胞。在400X放大的顯微鏡下定量分析毛細血管密度，并表示為每0. 15mm2的毛細血管數(shù)(Image-Pro plus, Version 4. 1, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA)。然后比較處理組之間的值。(6)抗纖維化分析第56天，從缺血心臟獲得心肌組織并在10%福爾馬林溶液中固定2天，然后包埋在石蠟中。從每一個樣本制備數(shù)個連續(xù)切片并進行Trichrom染色來評價膠原蛋白含量。在 8X放大的顯微鏡下定量分析左心室中纖維化面積。然后比較處理組之間的值。(7)統(tǒng)計結果表示為平均值士SEM 并用 SPSS (10. 0 版，SPSS. Inc, Chicago, IL, USA)分析。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析均是利用單因素ANOVA并隨后進行LSD檢驗或Tukey檢驗進行的，以測定多重比較中差異的顯著性。P值小于0. 05認為是顯著的。2.結果(1)大鼠中左心室心肌梗死的誘導誘導心肌梗死后28天，測量經(jīng)胸超聲心動圖以確認動物疾病模型。觀察到手術誘導心肌梗死后左心室的生理功能顯著降低。而且，在左心室前側壁中觀察到心肌纖維化。(2) HGF對左心室功能的影響比較了處理組之間在注射DNA后左心室射血分數(shù)(LVEF)的變化。第1和14天，組與組之間的LVEF沒有統(tǒng)計學顯著性差異。然而，在心肌內(nèi)DNA處理后28天，pCK-HGF_X7 處理組的 LVEF 值(40. 77 士 2. 92% )與 pCK 組(31. 24士 3. 58 %，ρ = 0.028)或 pCK-cHGF 組(33. 99士2. 26 %，ρ = 0. 069)相比統(tǒng)計學顯著地更高。pCK_VEGF165組的LVEF值 (39. 63 士 2.44% )似乎比 pCK 組(ρ = 0. 056)或 pCK-cHGF 組(ρ = 0. 138)更高，但是沒有統(tǒng)計學顯著性差異。在處理后第56天也觀察到類似情形(圖6)。還比較了 DNA處理后收縮期室間隔(IVS)的變化。僅在pCK-HGF_X7處理組中收縮期IVS顯著增加；在第56天，PCK-HGF-X7處理組的IVS明顯高于pCK處理組(ρ = 0. 061)、 PCK-VEGF165 處理組(ρ = 0. 012)或 pCK-cHGF (ρ = 0. 011)處理組(圖 7)。(3) HGF對毛細血管密度的影響
第56天，pCK-HGF-X7處理組的缺血邊界區(qū)域心肌組織中的毛細血管密度為 300. 00士 14. 71/0. 15mm2。此毛細血管密度顯著高于 pCK 組的 227. 54士6. 16/0. 15mm2(ρ < 0. 001)、pCK-VEGF165 組的 247. 38 士 7. 52/0. 15mm2 (ρ = 0.001)或 pCK-cHGF 組的 231. 35 士 5. 55/0. 15mm2 (ρ < 0. 001)(圖 8)。(4) HGF對心肌纖維化的影響第56天，pCK-HGF-X7處理組的左心室中纖維化程度為18. 88士 1. 81%。這一纖維化百分比顯著低于PCK組的30. 20士2. 35% (ρ = 0. 009)。pCK_VEGF165組的纖維化程度(20. 96士2. 25%)也顯著低于pCK組(ρ = 0. 049)，但是此差異的統(tǒng)計學顯著性低于 PCK-HGF-X7組。而pCK-cHGF組的纖維化程度(25. 02士2. 49% )并不明顯低于pCK處理組 (P = 0.411)(圖 9)。3.討論在大鼠缺血性心臟病模型中評價了 HGF的治療潛能，所述模型是眾所周知的CAD 動物模型。第0天，通過手術造成心臟缺血，并將總量為250 μ g的包含HGF基因或對照 DNA的質粒注射到缺血心肌中。通過超聲心動圖和/或組織學分析來評價HGF的作用。 PCK-HGF-X7組的缺血心臟的功能顯著改善。盡管pCK-cHGF表達一種HGF蛋白同工型，但是 pCK-cHGF組的心臟功能未顯示任何顯著改善。實施例4 在人臨床試驗中評價pCK-HGF-X7的效力在人臨床試驗中評價了 PCK-HGF-X7的效力。給兩名進行冠狀動脈旁路移植 (CABG)的受試者注射 0. 5mg pCK-HGF_X7。1.方法(1)受試者當受試者滿足下述標準時將其納入試驗中1)年齡在19至75歲；2)通過 MIBI-SPECT評價具有可逆的灌注缺損(靜息和應激灌注之間的差異大于7%) ；3)估計在 CABG后仍然具有不完全的血管再生區(qū)域或估計具有不適于CABG的心肌灌注區(qū)域。如果受試者具有以下病史或現(xiàn)有跡象則將其排除1)惡性腫瘤；2)未受控的室性心律失常；3)晚期心力衰竭或Killip分級大于II級的左心室功能障礙跡象并且通過經(jīng)胸 2D超聲心動圖測得的左心室射血分數(shù)< 25% ；4)嚴重的傳染病；5)未受控的血液疾?。?) 心臟瓣膜病并需要左心室大塊切除術；6)增殖性視網(wǎng)膜??；7)中風；8)未受控的被評價為 JNC II級的原發(fā)性高血壓；9)嚴重的肝病和腎??；或者10)之前的CABG。方案獲得了首爾國立大學醫(yī)院機構審查委員會以及韓國食品藥品監(jiān)督管理局的批準。 (2) MIBI-SPECT 心肌灌注研究在pCK-HGF-X7處理之前和pCK-HGF_X7處理后3個月和6個月，對所有患者進行靜息時和利用腺嘌呤核苷進行藥理學應激后的99mTc-MIBI門控SPECT(Vertex EPIC, ADAC Labs, CA.，USA)。通過心電描記門控來構建SPECT圖，并用半定量20節(jié)段模型和自動定量程序(AutoQUANT，ADAC Labs, CA.，USA)進行分析。在SPECT下靜息和應激灌注分數(shù)之間7%差異是心肌缺血中可逆灌注缺損的底線。因此靜息和應激灌注之間> 7%差異表示心肌具有可逆灌注缺損，< 7%差異表示心肌具有正常灌注。
由SPECT同心圓圖的第10和16節(jié)段數(shù)獲得靜息和應激灌注分數(shù)，并在篩選期間、注射pCK-HGF-X7后3和6個月評價分數(shù)差異(圖10)。(3) CABG 下的心肌內(nèi) pCK-HGF_X7 注射通過標準正中胸骨切開術完成左前降支冠狀動脈和回旋支冠狀動脈的冠狀動脈旁路移植。通過心肌內(nèi)注射將0. 5mg pCK-HGF-X7 (0. 125mg/0. 25mL/注射；4個部位/患者) 施用到后降支動脈的兩側，所述后降支動脈雖然具有減少的灌注，但是通過MIBI-SPECT評價不適用于CABG。施用pCK-HGF-X7的節(jié)段數(shù)是由MIBI-SPECT獲得的同心圓圖的第10和 16節(jié)段(圖11)。2.結果和討論(1)在MIBI-SPECT下pCK-HGF_X7對心肌灌注的影響比較了注射pCK-HGF-X7前后在SPECT下的靜息和應激灌注分數(shù)之間的差異。在第一名受試者中，注射PCK-HGF-X7之前靜息和應激灌注分數(shù)之間的平均差異是16%。注射pCK-HGF-X7之后3和6個月，注射面積(節(jié)段數(shù)10和16)中靜息和應激灌注分數(shù)之間的平均差異是3. 5%和0. 5%，與基線值有顯著差異。在第二名受試者中，注射PCK-HGF-X7 之前靜息和應激灌注分數(shù)之間的平均差異是9%。注射pCK-HGF-X7之后3和6個月，注射面積(節(jié)段數(shù)10和16)中靜息和應激灌注分數(shù)之間的平均差異是4%和3.5%，與基線值有顯著差異(圖12)?？傊?，將pCK-HGF-X7心肌內(nèi)注射給受疾病侵襲受試者可將心肌灌注狀態(tài)從可逆缺損變?yōu)檎?。這些結果表明施用PCK-HGF-X7可顯著提高心肌灌注。實施例5 :pCK-HGF-X7在豬ameroid缺血模型中的效力評價本研究的目的是在豬ameroid缺血模型中評價在心臟成像系統(tǒng)指導下利用導管經(jīng)皮心內(nèi)注射PCK-HGF-X7的心臟保護作用。1.材料和方法(1)動物到達后，給約克郡去勢家豬(η = 9，雄性，20_40kg)隨意提供飼料和水，并在進行手術前使它們休息7天。(2)豬 ameroid 缺血模型通過ameroid縮窄建立的豬慢性心肌缺血模型是測試新血管生成治療中成熟的與臨床相關并廣為接受的臨床前慢性心肌缺血模型。該模型模擬人冠狀解剖情況以及響應于人缺血的血管形成程度。此外，該豬模型是測試心血管醫(yī)療裝置的成熟模型，因為其大小和解剖學情況與人心血管系統(tǒng)相似。通過手術將ameroid縮窄器植入豬的左回旋支近端以造成慢性缺血。通過肌肉內(nèi) 注射TelaZ0l 4-6mg/kg和硫酸阿托品0. 02-0. 05mg/kg使豬鎮(zhèn)靜。然后通過面罩施用異氟烷以誘導全身麻醉用于手術介入。給豬進行插管并適當準備手術。使豬保持右側臥姿勢。整個手術過程中通過靜脈內(nèi)滴注血漿補充物(plasmalyte)和利多卡因來維持水化作用并控制任何心律失常。將洗滌液(scrub solution)施用于無菌的準備手術部位，用無菌布簾覆蓋胸部，并用蓋布覆蓋整只動物。深層麻醉后，靜脈內(nèi)施用泮庫溴銨用于肌肉松弛。在左胸第五肋間隙中切開20cm的切口。內(nèi)縮肋骨，然后內(nèi)縮肺，用浸漬鹽水的紗布海綿包裹。通過水平切割在緊靠膈神經(jīng)末梢處打開心包，并將心臟懸吊在心包床中。在緊靠第一個邊緣支約0. 5cm的距離切開回旋支冠狀動脈(LCX)并在其周圍放置大小適合所述動脈的 ameroid縮窄器。所有會影響LCX床的附屬物質均被永久性結扎。如果需要控制心律失常，則施用利多卡因推注。心包膜不通過常規(guī)縫合閉合，而是用作輔助物ameroid在動脈上的定位。以連續(xù)方式使用Chromic gut (PDS II)縫合線來閉合肌肉層。在皮下使用Dexon 編織縫合線。使用手術釘(Surgical staple)閉合皮膚。然后，所有豬肌肉內(nèi)接受恩諾沙星(5. Omg/kg/天)3天以防止感染。(3)效力評價研究設計Ameroid移植后4周，使豬隨機接受Img pCK-HGF_X7[低級量組lmg/2ml (η = 3) ]、4mg pCK-HGF-X7 [高級量組4mg/8ml (η = 3)]或者由與 pCK-HGF_X7 一起使用的相同賦形劑緩沖液組成的對照[載體對照組8ml (η = 3)]。利用N0GA MyoStar遞送導管 (Biosense Webster,USA)將所述物質施用到經(jīng)心內(nèi)途徑中。每只動物接受8次(低級量組 0. 125mg/0. 25ml/ 注射部位)或 16 次(高級量組0. 25mg/0. 5ml/ 注射部位)pCK-HGF_X7 或對照品(載體對照組0. 5ml/注射部位)，注射到側壁和上的存活心肌和缺血心肌的邊界區(qū)中。為了評價PCK-HGF-X7處理的功能結局，測定DNA處理前后峰值應激下的心肌灌注(κ )，如通過心肌造影應激超聲心動圖所測量的。2.結果比較處理組之間在質粒DNA注射前后于峰值應激下心肌灌注的變化。在載體對照組中，第30天與第O天相比顯示出灌注減少的趨勢。但是兩個PCK-HGF-X7組在第30 天與第O天相比顯示出維持灌注的趨勢(圖13)。這些結果表明，pCK-HGF-X7的經(jīng)心內(nèi) (transendocardial)轉移可防止由心肌缺血誘導的心肌灌注的減少。這些結果顯示HGF可利用導管遞送。經(jīng)皮經(jīng)心內(nèi)注射導管已經(jīng)在臨床試驗中用于在電機心臟導航系統(tǒng)指導下心內(nèi)注射各種藥物，例如干細胞、腺病毒和裸DNA。這些結果表明，可在電機指導下利用導管通過經(jīng)皮經(jīng)心內(nèi)注射將PCK-HGF-X7質粒DNA安全地施用到患有灌注疾病的心肌中。因此，將PCK-HGF-X7轉移到心臟中的導管注射系統(tǒng)可用在有缺血心臟組織(例如穩(wěn)定型、不穩(wěn)定型心絞痛或者急性、慢性心肌梗死)的患者中。實施例6 =HGF表達細胞的遞送HGF可以包含pCK-HGF-X7的細胞的形式遞送。間充質干細胞是從受試者收集的。間充質干細胞的來源可以是骨髓抽取液或流動的外周血。培養(yǎng)所收獲的間充質干細胞并通過脂質體轉染PCK-HGF-X7。然后收獲細胞，用鹽水洗滌，重新混懸在輸注溶液中，并輸注給受試者?？蓪⑥D染有PCK-HGF-X7的間充質干細胞施用到缺血和梗塞的心臟組織中i)利用注射器進行心肌內(nèi)注射，或者ii)利用導管在電機指導下經(jīng)皮經(jīng)心內(nèi)注射。實施例7 洗脫出pCK-HGF-X7的支架本實施例展示質粒洗脫支架的制備。A.制備洗脫出質粒的不銹鋼支架1.材料和方法(1)不銹鋼支架不銹鋼支架(SS支架，Libert6 ，3. 0mmX20mm)購自 BostonScientif ic (USA)。(2)產(chǎn)生洗脫pCK-HGF-X7的SS支架a.產(chǎn)生不基于聚合物的PCK-HGF-X7洗脫SS支架
為了洗滌SS支架支柱的表面，將所述支架在乙醇中超聲處理3次，每次3分鐘 (Vibra-Cel 1TM, Sonics & Materials INC. , Switzland)并在 37°C下干燥 30 分鐘。然后，將所述支架在5mg/ml pCK-HGF-X7中浸漬1次5分鐘并在37°C下干燥30分鐘。b.產(chǎn)生基于聚合物的PCK-HGF-X7洗脫SS支架為了制備基于聚合物的SS支架，將所述支架在乙醇中的5mg/ml磷脂酰膽堿(PC) 聚合物(CM5208, Vertellus Specilities INC.，UK)中浸漬1次。然后，將所述基于PC聚合物的支架在5mg/ml pCK-HGF-X7中浸漬1次5分鐘并在37°C下干燥20分鐘。(3)定量從SS支架洗脫出的pCK-HGF-X7為了分析負載到SS支架上的pCK-HGF-X7的量，選擇移出并再補足的大體積溶液 (從Iml中移出0. 8ml)以快速且高效的方式定量pCK-HGF_X7洗脫。將包被有pCK-HGF-X7的SS支架分別浸漬在含有Iml生理鹽水的凍存管中。將含有支架的管在40轉/分鐘的條件下于滾軸混合器(HIP-RMF40，Hyunil LAB-MATE,Korea)上放置60分鐘。于1、5、10、20和40分鐘采集pCK-HGF_X7洗脫液。在每個時間點，抽取0. 8ml 溶液用于UV分析，并向凍存管中添加0. 8ml新鮮生理鹽水以維持溶液的總體積。然后將凍存管置于滾軸混合器上繼續(xù)實驗。利用Ultraspec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech., Sweden)于260nm處測量每個時間點獲得的pCK-HGF_X7抽取洗脫液的濃度。作為陰性對照，還利用上述定量方法測試了不含PCK-HGF-X7的SS支架。2.結果結果見表1和2。在1分鐘時近78 μ g pCK-HGF_X7從不基于聚合物的SS支架中洗脫出來，在40分鐘時115 μ g洗脫出來。同樣，在60分鐘時近43 μ g pCK-HGF_X7從基于聚合物的SS支架中洗脫出來。這些結果表明，所述質?？杀话辉诓换诰酆衔锖突诰?合物的SS支架上，并且所包被的質?？蓮腟S支架中洗脫出來。因此，結論是，成功地制備了質粒洗脫SS支架。表1 從不基于聚合物的SS支架中洗脫出來的PCK-HGF-X7的定量
32 表2 從基于聚合物的SS支架中洗脫出來的PCK-HGF-X7的定量 B.產(chǎn)生洗脫出質粒的鈷鉻支架1.材料和方法(1)鈷鉻支架鈷鉻支架(Co-Crstent, ARTHOSPi co, 2. 75mm X 12mm)購自 AMGinternational(Germany)。(2)產(chǎn)生洗脫出pCK-HGF-X7的Co-Cr支架
33
a.產(chǎn)生不基于聚合物的PCK-HGF-X7洗脫Co-Cr支架為了洗滌SS支架支柱的表面，將所述支架在乙醇中超聲處理3次，每次3分鐘，并在37°C下干燥30分鐘。然后將所述支架在5mg/mlpCK-HGF-X7中浸漬1次5分鐘，并在 37 °C下干燥30分鐘。b.產(chǎn)生聚合物的PCK-HGF-X7洗脫Co-Cr支架為了制備基于聚合物的Co-Cr支架，將所述支架在乙醇中的5mg/ml磷脂酰膽堿 (PC)聚合物(CM5208，Vertellus Specilities INC.，UK)中浸漬 1 次。然后，將所述基于 PC聚合物的支架在5mg/mlpCK-HGF-X7中浸漬1次5分鐘并在37°C下干燥10分鐘。(3)定量從Co-Cr支架洗脫出的pCK-HGF_X7為了分析負載到Co-Cr支架上的pCK-HGF-X7的量，選擇移出并再補足大體積溶液 (從Iml中移出0. 8ml)來以快速且高效的方式定量pCK-HGF_X7洗脫液。將包被有pCK-HGF-X7的Co-Cr支架分別浸漬在含有Iml生理鹽水的凍存管中。將含有支架的管在40轉/分鐘的條件下于滾軸混合器(HIP-RMF40，Hyunil LAB-MATE,Korea) 上放置60分鐘。于10、20、30、40、50和60分鐘收集？0(-! 17洗脫液。在每個時間點，抽取0. 8ml溶液用于UV分析，并向凍存管中添加0. 8ml新鮮生理鹽水以維持溶液的總體積。然后將凍存管置于滾軸混合器上繼續(xù)實驗。利用UltraSpeC3000于260nm處測量每個時間點獲得的PCK-HGF-X7抽取洗脫液的濃度。作為陰性對照，還利用上述定量方法測試了不含 PCK-HGF-X7 的 Co-Cr 支架。2.結果結果見表3禾口 4。在1分鐘和20分鐘時近60 μ g禾口 85 μ g pCK-HGF_X7分別從不基于聚合物的Co-Cr支架中洗脫出來，同樣，在60分鐘時近43 μ gpCK-HGF_X7從基于聚合物的Co-Cr支架中洗脫出來。這些結果表明所述質?？杀话辉谖椿诰酆衔锖突诰酆?物的Co-Cr支架上，并且所包被的質?？蓮腃o-Cr支架中洗脫出來，盡管從Co-Cr支架中洗脫出來的質粒的量比SS支架的少。因此，結論是成功地制備了質粒洗脫Co-Cr支架。表3 從不基于聚合物的Co-Cr支架中洗脫出來的pCK-HGF_X7的定量表4 從基于聚合物的Co-Cr支架中洗脫出來的pCK-HGF_X7的定量實施例8 :HGF-X7洗脫支架在兔球囊剝脫模型中的效力評價本研究的目的是在兔球囊剝脫模型中評價HGF-X7洗脫支架對再內(nèi)皮化的加速作用。1.材料和方法(1)動物到達后，給十只新西蘭白兔(雄性，3. 5-4. Okg，Doo-Yeol Biotech,Korea)隨意提供飼料和水，并在進行支架植入前使它們休息7天。(2)兔球囊剝脫模型和支架植入通過肌肉內(nèi)注射甲苯噻嗪(5mg/kg)，然后注射氯胺酮(50mg/kg)使兔麻醉。用 95 %酒精和碘酒消毒后，用無菌的外科用紗布覆蓋頸部，僅露出切口區(qū)域，從而為手術提供完全無菌的條件。通過手術暴露頸外動脈之后，將5F導引套管(Cordis，USA)插入頸外動脈。利用標準熒光檢查法將1.4F導線(Terumo ,Japan)插入股動脈后，將2. 8F微導管插入髂外動脈的近端部分。施用1000U肝素和0. Img硝酸甘油。如下進行髂外動脈的球囊剝脫通過導線將2. 5 X 8mm球囊導管(GoodMan，Japan)插入髂外動脈，然后從兔中除去微導管。在球囊導管充氣(IOatm)后，通過連續(xù)抽出10次來中斷剝脫距離為約1.0cm的髂外動脈內(nèi)皮。從兔中除去用于髂動脈剝脫的球囊導管，將用PCK-HGF-X7洗脫SS支架(PES)或裸金屬支架(BMS)固定的新球囊導管插入已剝脫的髂外動脈中。在12atm的球囊充氣下進行支架植入15秒。雙側植入PES (η = 10)和BMS (η =10)。(3)光學相干斷層掃描(OCT)分析就光學相干斷層掃描(OCT)分析而言，通過導線將Helios阻斷球囊導管 (LightLab5USA)插入髂外動脈的近端部分中，然后從兔中除去所述導線。然后在所植入支架的遠端1. 5cm距離處放置OCT圖象線(LightLab，USA)。利用IOml生理鹽水沖洗來獲得 OCT圖象。從兔中除去所有裝置后，用3-0絲縫線結扎所述髂外動脈。然后檢查切口中出血的存在?？刂瞥鲅螅p合所切開的肌肉、筋膜和皮膚。肌肉內(nèi)施用慶大霉素(3mg/kg/ 天)3天來預防感染。而且，每天施用32. 5mg氯吡格雷(Sanofi-Aventis，F(xiàn)rance)和25mg 阿司匹林(Bayer, Germany)。(4)掃描電子顯微鏡(SEM)植入支架后第14和28天，處死動物，收獲血管并用2. 5%戊二醛溶液固定2小時。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌所固定的血管3次，用OsO4溶液進行后固定。用PBS洗滌后固定的血管3次，用60% -95%乙醇連續(xù)進行脫水操作。最后，對所脫水的血管鍍金。(5)統(tǒng)計結果表示為平均值士SEM 并用 SPSS(10. 0 版，SPSS Inc.，Chicago, IL，USA)分析。利用Student t檢驗進行所述數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。P值小于0.05認為是顯著的。2.結果和討論為了評價pCK-HGF-X7洗脫支架是否能加速再內(nèi)皮化過程，分別通過OCT和SEM考察了內(nèi)膜尺寸和覆蓋支架的細胞之性質的變化。植入支架后第0、14和28天獲得OCT圖象。從每一個支架獲得9個橫切圖象。OCT 的基線數(shù)據(jù)和隨后數(shù)據(jù)顯示在圖14中。兩組的介入后結果相似(圖14A ；第0天)。然而，植入支架后第14天，與BMS組相比較而言，PES組的內(nèi)膜尺寸的橫切面積(ID-CSA，mm2)顯著增大(圖 14B ；PES 對比 BMS，0. 23士0. 05mm2 對比 0. 48士0. 09mm2, ρ = 0. 03)。植入支架后第 28 天，兩組之間的 ID-CSA 相似(圖 14Β ；PES 對比 BMS，0. 91 士0. 08mm2 對比 0. 98士0. 09mm2, P = 0. 76)。這些結果表明pCK-HGF-X7洗脫支架相比于裸金屬支架而言促進支架表面上細胞的生長。接下來，通過SEM分析測定了在支架上增殖的細胞類型。在第14和28天進行SEM。圖15顯示在PES組中內(nèi)皮細胞(參見黑色箭頭)均勻地覆蓋支架表面，而在BMS組中觀察到由平滑肌細胞(參見白色箭頭)和內(nèi)皮細胞組成的新內(nèi)膜混合物。這些結果表明pCK-HGF-X7洗脫支架可加速再內(nèi)皮化，因此是治療受阻血管的有
用工具。上述結果表明HGF的兩種同工型(HGF和dHGF)的存在相比于單獨的HGF或dHGF 而言可在體外更有效地誘導內(nèi)皮細胞的生長和遷移，在體內(nèi)轉移表達HGF的兩種同工型 (HGF和dHGF)的核苷酸序列可加速血管的再內(nèi)皮化過程。這些結果表明HGF的兩種同工型相比于一種HGF同工型而言可通過快速再內(nèi)皮化活性更有效地抑制再狹窄。
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權利要求
包含兩種或更多種HGF同工型或者編碼所述同工型的一種或多種多核苷酸的組合物在制備用于治療或預防受試者中心臟病癥的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述治療或預防所述心臟病癥是通過增加所述受試者中心臟組織的灌注或毛細血管密度來進行的。
3.權利要求2的用途，其中所述心臟組織是缺血的心臟組織。
4.權利要求1的用途，其中所述治療或預防所述心臟病癥是通過增強受試者中血管損傷或病變血管部位的內(nèi)皮修復來進行的。
5.包含兩種或更多種HGF同工型或者編碼所述同工型的一種或多種多核苷酸的組合物在制備用于促進血管中內(nèi)皮細胞生長的藥物中的用途。
6.權利要求5的用途，其中所述血管是受損的。
7.權利要求6的用途，其中所述血管的再內(nèi)皮化被促進或加速。
8.權利要求5的用途，其中所述血管是需要預防或治療再狹窄的受試者中的血管。
9.權利要求1至8中任一項的用途，其中所述兩種或更多種HGF同工型作為編碼所述同工型的多核苷酸來施用。
10.權利要求1至4中任一項的用途，其中所述藥物是通過注射施用的。
11.權利要求1至8中任一項的用途，其中所述組合物是通過使用遞送裝置來施用的。
12.權利要求11的用途，其中所述遞送裝置是支架。
13.權利要求12的用途，其中所述支架選自不基于聚合物的不銹鋼支架、基于聚合物的不銹鋼支架、不基于聚合物的鈷鉻支架和基于聚合物的鈷鉻支架。
14.權利要求12的用途，其中所述組合物從所述支架中洗脫出來。
15.權利要求1的用途，其中所述兩種或更多種HGF同工型包含全長HGF(flHGF)和缺失變體 HGF (dHGF)。
16.權利要求15的用途，其中所述兩種或更多種HGF同工型還包含NK1。
17.權利要求15的用途，其中所述兩種或更多種HGF同工型由flHGF和dHGF組成。
18.權利要求15的用途，其中所述flHGF和dHGF各自與人flHGF和人dHGF的野生型序列具有至少80%同一性。
19.權利要求18的用途，其中所述flHGF和dHGF各自與人flHGF和人dHGF的野生型序列具有至少90%同一性。
20.權利要求19的用途，其中所述flHGF和dHGF各自與人flHGF和人dHGF的野生型序列具有至少95%同一性。
21.權利要求20的用途，其中所述flHGF和dHGF是人flHGF和人dHGF。
22.權利要求15的用途，其中所述flHGF和所述dHGF由分開的多核苷酸編碼。
23.權利要求15的用途，其中所述flHGF和所述dHGF由同一多核苷酸編碼。
24.權利要求1的用途，其中所述一種或多種多核苷酸與啟動子有效連接。
25.權利要求24的用途，其中所述啟動子是組成型啟動子。
26.權利要求1的用途，其中所述一種或多種多核苷酸在不同的載體上。
27.權利要求1的用途，其中所述一種或多種多核苷酸在同一載體上。
28.權利要求27的用途，其中所述載體是質粒載體。
29.權利要求28的用途，其中所述質粒載體是pCK載體。
30.權利要求27的用途，其中所述載體是病毒載體。
31.權利要求15的用途，其中所述f1HGF和所述dHGF由雜合HGF構建體編碼，所述構建體包含HGF的外顯子1-18或其不改變所編碼氨基酸序列的簡并物，并且還包含外顯子4 和5之間的內(nèi)含子，其中除了外顯子4和5之間的所述內(nèi)含子之外，所述構建體不包含外顯子之間的其他內(nèi)含子。
32.權利要求31的用途，其中所述內(nèi)含子是固有的內(nèi)含子。
33.權利要求32的用途，其中所述雜合HGF構建體包含SEQIDN0 :7的核苷酸序列。
34.權利要求31的用途，其中所述內(nèi)含子是固有內(nèi)含子的片段。
35.權利要求34的用途，其中所述雜合HGF構建體包含SEQIDN0 :8、9或10的核苷酸序列。
36.權利要求1的用途，其中所述受試者是人，并且所述HGF同工型以各約1y g至約 lOOmg的劑量施用。
37.權利要求1的用途，其中所述受試者是人，并且所述多核苷酸以各約1P g至約 10mg的劑量施用。
38.用于治療或預防受試者中心臟病癥的組合物，其包含兩種或更多種HGF同工型或者編碼所述同工型的一種或多種多核苷酸作為活性成分。
39.權利要求38的組合物，其中所述治療或預防所述心臟病癥是通過增加所述受試者中缺血心臟組織的灌注來進行的。
40.用于促進受試者血管中內(nèi)皮細胞生長的組合物，其包含兩種或更多種HGF同工型或者編碼所述同工型的一種或多種多核苷酸作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預防受試者中心臟病癥的方法，其包括向所述受試者施用兩種或更多種肝細胞生長因子(HGF)同工型。本發(fā)明還涉及促進血管中內(nèi)皮細胞生長的方法，其包括向所述血管施用兩種或更多種肝細胞生長因子(HGF)同工型。在一個實施方案中，所述兩種或更多種HGF同工型作為一種或多種編碼所述同工型的多核苷酸施用。
文檔編號A61P9/10GK101925362SQ200980103077
公開日2010年12月22日申請日期2009年1月28日優(yōu)先權日2008年1月25日
發(fā)明者金水晶, 金鍾默, 韓熊申請人:百療醫(yī)株式會社

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