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紅芪和紅芪多糖在制備改善學習記憶及治療阿爾茨海默病藥物的應用的制作方法

文檔序號:1152884閱讀:206來源:國知局
專利名稱:紅芪和紅芪多糖在制備改善學習記憶及治療阿爾茨海默病藥物的應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及紅芪及紅芪多糖在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用,屬于中藥 領域。技術背景
“人口老齡化”問題,在21世紀是世界上每一個國家都將面臨的巨大挑戰(zhàn)。世 界現有老人超過6億(60歲及以上,除注明外下同),到21世紀的頭半個世紀末,即2050 年,世界老年人口將明顯增加到20%,即每5個人中就有一位是老年人?!袄匣?,的 確是21世紀面臨的一項挑戰(zhàn)。當前,人口老齡化成為經濟社會發(fā)展過程中的一個重要人 口現象。截止到2006年底,北京市老年人口達到236萬人,占全市總人口的14.9%。
阿爾茨海默病(Alzeimer,s disease, AD)是老年人常見的一種神經退行性疾 病,俗稱老年性癡呆或早老性癡呆。臨床特征是進行性認知功能障礙,至疾病后期,患 者生活不能自理。目前全球大約有兩千多萬老年人患有老年癡呆病,嚴重危害中老年人 身心健康,但是給患者及其家屬所帶來的痛苦和負擔要遠高于上述兩種疾病,成為現代 化社會、經濟、醫(yī)學、家庭亟待解決的問題之一。全世界有MOO萬病患,60歲以上人群 的患病率是5.1%,85歲以上者患老年癡呆癥的比例是30%。中國目前有5百萬患病人 口,相關的醫(yī)護開支每年達1千億元人民幣。目前,人們對于AD的病理特征和臨床表現 已經有一定了解。發(fā)現在AD患者腦內老年斑沉積,神經元纖維纏結和神經元喪失是AD 重要的神經病理特征。并且從老年斑中提取出一種主要成分,淀粉樣蛋白(amyloid β -protein, Αβ),同時證明Αβ對神經細胞有毒性作用,可能在AD發(fā)病中起重要作 用,但對于AD的病因仍無定論。當前研究對于AD的病因和發(fā)病機制眾說紛紜,無統(tǒng) 一認識,同時造成臨床上對AD的治療沒有突破性進展。如果人類不能找到有效的治療 方法,25年后全球預計有2200萬人患上阿爾茨海默病,到2050年患此疾病的人數將達 4500萬人,阿爾茨海默病將成為人類社會的流行病。有人稱其為21世紀家庭的災難。 這將是十分緊迫的社會和醫(yī)學問題。也是醫(yī)學界最棘手的難題。
AD的特征病理產物——構成老年斑核心成分的Αβ和引起神經原纖維纏結的異 常磷酸化tau蛋白一直被作為AD研究的重點,并且是目前設計和研發(fā)治療AD相關藥物 的重要靶點。其中,Αβ對神經細胞的毒性作用在AD發(fā)病過程中起著關鍵性的作用, 因此,尋找有效抑制Αβ毒性作用的藥物是治療AD的一個重點研究方向。
中醫(yī)認為癡呆多屬腎陰虧虛、痰瘀阻竅等虛實夾雜之證,治療時多以滋陰補腎 治其本,活血化瘀、豁痰開竅治其標。因此臨床多選擇滋陰補腎藥、活血化瘀藥和豁 痰開竅藥進行組方配伍治療癡呆,而且具有一定的療效。然而從現代醫(yī)藥理論的角度 來看,這些中藥治療老年性癡呆的作用機理仍不清楚,它們的中醫(yī)功效用現代醫(yī)學闡釋 是否恰當準確,或者還有更豐富的內涵,都需要我們利用現有的醫(yī)學技術進行驗證和探 索。這種驗證或者探索既豐富了中醫(yī)理論,也有可能與現代醫(yī)學碰擦出新的火花,擴大現代醫(yī)學的認知領域。
活血化瘀藥、豁痰開竅藥和滋陰補腎藥一般用于臨床癡呆治療,也是實驗室研 究AD治療的常用中藥。紅芪是重要的補益抗衰老中藥,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、耐缺氧、免 疫調節(jié)等作用,其主要提取物紅芪多糖在免疫調節(jié)方面更是有突出的功效,能明顯減少 體內的氧自由基、抑制腫瘤生長,并能較好的保護心、肝等重要臟器。
對于紅芪及其提取物對大腦作用的研究較少,通過實驗我們發(fā)現紅芪和紅芪多 糖能明顯提高Αβ誘導的SH-SY5Y(人神經母細胞瘤)細胞的存活率;改善快速腦老化 小鼠及海馬注射Αβ的AD大鼠認知功能障礙,提高快速老化小鼠腦內中樞單胺類神經遞 質5-ΗΤ (五羥色胺)、5-ΗΙΑΑ(5-羥吲哚乙酸)、ΝΕ(去甲腎上腺素)、DA(多巴胺)的 水平。由于至今仍無紅芪和紅芪多糖治療老年性癡呆的報道,因此研究它們保護腦神經 細胞,調節(jié)腦神經遞質分泌,防治老年性癡呆的作用機制極具價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供紅芪在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
本發(fā)明目的在于提供紅芪在制備改善學習記憶能力藥物中的應用。
本發(fā)明目的在于提供紅芪多糖在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
本發(fā)明目的在于提供紅芪多糖在制備改善學習記憶能力藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪在制備改善認知功能障礙藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪在制備保護SH-SY5Y細胞藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪在制備提高腦內單胺類神經遞質含量藥物中的應用;所述腦內 單胺類神經遞質為5-HT、5-HIAA、NE、DA。
本發(fā)明提供紅芪多糖在制備改善認知功能障礙藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪多糖在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪多糖在制備保護SH-SY5Y細胞藥物中的應用。
本發(fā)明提供紅芪多糖在制備提高腦內單胺類神經遞質含量藥物中的應 用;所述腦內單胺類神經遞質為五羥色胺(5-Ser0tadn,5-HT)、5-羥吲哚乙酸 (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、DA 多巴胺 (dihydroxyphenyl ethylamine,DA)。
紅芪、紅芪多糖的上述應用,可以理解為紅芪、紅芪多糖單獨用于改善認知功 能障礙、治療阿爾茨海默病、保護SH-SY5Y細胞、提高腦內單胺類神經遞質含量或者是 在與其他藥物配伍時其發(fā)揮上述的作用。
為臨床服用方便,上述紅芪可以按照中藥制劑的一般工藝如直接粉碎,或者 經常規(guī)的溶媒提取后濃縮制成提取物,也包括常規(guī)溶媒提取后再進一步精制的方法,如 過大孔樹脂柱。
所述紅芪多糖優(yōu)選如下方法制備紅芪根粉碎,加入10倍量的水,并加入纖維 素酶(1%量),調節(jié)PH到5,煎煮兩次,每次2小時,過濾,收集濾液。濾液調PH至 中性,濃縮至相對密度1.20以上(60°C測定),加入乙醇,使含醇量達道60%,靜置M 小時,傾棄上清液,離心收集沉淀,沉淀用乙醇洗滌兩次,冷凍干燥,即得。
上述紅芪、紅芪多糖可以制備成膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液、緩 釋、速釋制劑或注射劑等臨床可接受的劑型,為使上述劑型能夠實現,需在制備這些劑 型時加入藥學可接受的輔料,例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味 劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括淀粉、預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼 素、微晶纖維素、蔗糖等;崩解劑包括淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉 鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等;潤滑劑包括 硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等;助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、 微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等;粘合劑包括,淀粉漿、聚乙烯吡咯烷 酮、羥丙基甲基纖維素等。
本發(fā)明體外細胞實驗部分以SH-SY5Y細胞作為研究的靶細胞,來源于一種神經 脊源的惡性胚胎瘤,其形態(tài)、生理和生化功能與正常神經細胞相似,可用于神經退行性 疾病的體外細胞模型的研究。通過Αβ 誘導SH-SY5Y細胞損傷的老年性癡呆細胞模 型被廣泛應用于國內外老年性癡呆的研究。
A β 25_35是整個A β肽鏈從第25位至第35位氨基酸順序所組成的一個氨基酸肽 段,其序列為GSNKGAIIGLM。盡管Αβ 2Μ5存在缺乏與金屬結合位點的缺點,但是 它具有聚集的特性,并保留了 Αβ肽段的毒性作用,它被認為是Αβ的有效部位。
體內整體實驗中采用的SAM-P/8小鼠是日本竹田俊男教授通過對AKR/J自然變 異小鼠進行近交延代培養(yǎng)得到一種自然快速老化小鼠,該家族諸多品系中的SAM-P/8表 現出明顯的學習記憶功能減退,處于一種低緊張、低恐怖的癡呆狀態(tài),具備AD的許多特 征,諸如皮質萎縮、皮質和海馬錐體神經細胞數目下降、Αβ樣顆粒(β-CIGS)廣泛沉 著、腦干網狀結構大細胞群背側部出現海綿狀變化、星狀膠質細胞反應等,是目前國際 上公認的研究認知功能障礙、學習記憶能力以及老年癡呆的最佳模型之一。
本發(fā)明以國內外公認的實驗模型為基礎,采用MTT比色法和乳酸脫氫酶(LDH) 漏出量為評價指標,證實了紅芪和紅芪多糖能保護人^^5_35對3^¥5¥細胞的損傷,增 加SH-SY5Y細胞的存活;通過Morris水迷宮實驗,顯示紅芪和紅芪多糖能改善快速腦老 化小鼠及海馬注射Αβ的AD大鼠認知功能障礙;進一步的組織學檢測發(fā)現,紅芪和紅 芪多糖可以提高快速老化小鼠腦內中樞單胺類神經遞質5-HT、5-HIAA、NE、DA的水 平,這是它們治療老年癡呆病的作用機制之一。
下述實驗用于進一步說明本發(fā)明,但是對本發(fā)明范圍的限制。
實驗例1 SH-SY5Y細胞損傷模型的建立
1.材料
1.1細胞來源
人神經母細胞瘤株系SH-SY5Y細胞是由宣武醫(yī)院神經藥理實驗室惠贈。
1.2主要試劑
低限基本培養(yǎng)基(MEM)和F-12營養(yǎng)混合物培養(yǎng)基(F12)培養(yǎng)基購于Gibco公 司,胎牛血清和青、鏈霉素購自于PAA公司,非必需氨基酸購自于Hyclone公司,胰蛋 白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Amresco公司,Αβ25_35、十二烷基硫酸鈉6DS)購 于^igma公司,乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成試劑公司,其他試劑皆為國產分 析純。
1.3試驗儀器
酶標儀(美國Thermo Labsystems Multiskan MK3型),倒置相差顯微鏡(德 國Leica DMIRB型),數碼相機(德國Leica DC300型),紫外分光光度計(日本島津 UV-2450)。
2.方法
2.1培養(yǎng)基的配制
基礎培養(yǎng)基MEM和F12培養(yǎng)基按照公司說明書分別以三蒸水配制而成,用 HEPES調整pH值為7.4,經0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,4°C下保存。
完全培養(yǎng)基的配置90%基礎培養(yǎng)基(MEM和F12的比例為1 1),10%胎牛 血清,同時還含有0.1%非必需氨基酸和青、鏈霉素各10萬u/L。
2.2Αβ25_Μ溶液的配制
用無菌的三蒸水溶解Αβ25_35,配成lmmol/L濃度的母液,保存于_20°C冰箱。 實驗時取出融解后,用不含血清和雙抗的基礎培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,至C02培養(yǎng)箱內 37°C孵育4Sh后使用。
2.3 SH-SY5Y 細胞的培養(yǎng)
SH-SY5Y細胞按照美國模式培養(yǎng)集存庫(ATCC)的方法進行培養(yǎng),即細胞以完 全培養(yǎng)基置于37°C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育,2天換液,3-4天傳代。
2.4 MTT比色測定方法
方法按照文獻操作,但略有改動。具體操作為取對數生長期的SH-SY5Y 細胞,使用0.25%的胰酶消化液消化細胞后,用完全培養(yǎng)基將細胞懸液濃度調整至 2.5 X 104個/ml,接種于96孔板內,每孔200ul。置于CO2培養(yǎng)箱內孵育3 后,更換含 一定濃度A β 2M5的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后吸取并保存細胞培養(yǎng)液以備LDH測定, 迅速加入含MTT (終濃度為50 μ g/ml)的培養(yǎng)基100 μ 1,置CO2培養(yǎng)箱內孵育4h,加入裂 解液(5%異丙醇(ν/ν),10% SDS (十二烷基硫酸鈉)(m/v),0.01mol/L HCl) 100 μ 1,在 C02培養(yǎng)箱內過夜培養(yǎng),酶標儀(雙波長檢測570-630nm)讀取OD值。所收集的數據 以細胞的存活率(公式細胞存活率=所測細胞的OD值/空白組細胞的OD值X 100 % ) 表不。
2.5 LDH活性測定方法
取細胞培養(yǎng)液,按照LDH試劑盒的說明進行操作。
2.6統(tǒng)計方法
實驗數據以平均值士標準差(i ±s)表示,采用SPSS13.0軟件做統(tǒng)計分析, ANOVA檢驗進行統(tǒng)計。
3.結果
3.1不同濃度的Αβ m_35對SH-SY5Y細胞影響的形態(tài)觀察
光鏡下可見隨濃度的增加SH-SY5Y細胞活力降低,胞漿混濁,細胞突 起明顯減少。人^^5_35濃度達到4(^11101/1^時大部分細胞萎縮壞死,細胞貼壁不充分,有 脫落(見附

圖1)。
3.2不同濃度的Aβ 25_35對SH-SY5Y細胞影響的活性檢測
選取不同濃度的ΑβΜ_35作用于SH-SY5Y細胞,通過MTT比色法檢測SH-SY5Y細胞的存活率,選擇較為合適者作為老年性癡呆細胞模型的Αβ2Μ5濃度(附圖2、表 1)。SH-SY5Y細胞的存活率隨著Αβ25_35的濃度增高而呈下降趨勢。同時,測定經處理 后的細胞外液的LDH含量,發(fā)現LDH的漏出量也隨著Αβ2Μ5的濃度增高而上升,說明 了細胞的受損程度在加重(附圖3)。
表1不同濃度A β 25_35對SH-SY5Y細胞活性的影響A β濃度 η MTT的細胞存活率(%) LDH漏出量(U/L) ((imol/L)114.43 ±4.75 230.48+2.21** 472.26 ±2.39** 630.70±1.76**
注與Αβ 濃度 0 μ mol/L 組相比,> < 0.05,**P < 0.0
實驗例2紅芪和紅芪多糖對A β致SH-SY5Y細胞損傷模型的影響
1.材料
1.1細胞來源
同實驗例1。
1.2藥品與試劑
紅芪和紅芪多糖由蘭州大學中西醫(yī)結合研究所提供。
1.3試驗儀器
同實驗例1。
2.方法
2.1藥物溶液的配制
紅芪水煎液的制備步驟
稱取300g紅芪飲片,加蒸餾水至800ml,浸泡3小時,微火煮沸30η ι,提取濾 液后再將殘渣加水至800ml,微火煮沸30η ι,合并兩次濾液,蒸餾濃縮至200ml,制成 667g/ml的紅芪水煎劑,過濾除菌,4°C冰箱貯存。
紅芪粗多糖的提取及純化
取紅芪飲片4000g,粉碎后,加入20L的蒸餾水,68°C共浸提3h,合并過濾液, 置旋轉蒸發(fā)器于45°C濃縮至過濾液原體積的30%,將濃縮液3000Γ/η ι離心15η ι,取上 清液,加入2倍體積的95%乙醇沉淀粗多糖,收集沉淀,加入適量蒸餾水,充分復溶, 透析,Seviig法按5 1的氯仿-正丁醇溶液脫去蛋白質,離心去蛋白質沉淀,重復8次, 上清液用蒸餾水透析48h,除去小分子雜質及色素,透析后濃縮至適當體積,加乙醇,醇 析多糖,水溶解后再醇析,重復3次,至觀此!!!紫外檢測無明顯蛋白吸收峰,再以2倍體 積的95%乙醇沉淀多糖,最后經無水乙醇脫水,丙酮,乙醚洗滌,干燥,得淡黃色紅芪 粗多糖193g,得率為4.8%。
將紅芪粗多糖充分復溶于蒸餾水中,先后加入95%乙醇至乙醇終濃度分別為 40%, 60%, 80%,分別在4°C件下靜置4h,3000r/mte離心15η ι,收集沉淀,乙醇終 濃度為40%時無沉淀,60%時沉淀較多,80%時有少量沉淀,沉淀均為白色粉末。將權利要求
1.紅芪或包含紅芪的藥物組合物在制備改善認知功能障礙藥物中的應用。
2.紅芪或包含紅芪的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
3.紅芪或包含紅芪的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病中保護SH-SY5Y細胞藥物 中的應用。
4.紅芪或包含紅芪的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病中提高腦內單胺類神經遞 質含量藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用,其中腦內單胺類神經遞質為5-HT、5-HIAA、NE、DA0
6.紅芪多糖或包含紅芪多糖的藥物組合物在制備改善認知功能障礙藥物中的應用。
7.紅芪多糖或包含紅芪多糖的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
8.紅芪多糖或包含紅芪多糖的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病中保護SH-SY5Y 細胞藥物中的應用。
9.紅芪多糖或包含紅芪多糖的藥物組合物在制備治療阿爾茨海默病中提高腦內單胺 類神經遞質含量藥物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用,其中腦內單胺類神經遞質為5-HT、5-HIAA、NE、DA0
全文摘要
本發(fā)明公開了紅芪及紅芪多糖在制備治療老年性癡呆藥物中的新用途,本發(fā)明中紅芪及紅芪多糖能保護Aβ25-35對SH-SY5Y細胞的損傷,增加SH-SY5Y細胞的存活;通過Morris水迷宮實驗,顯示紅芪和紅芪多糖能改善快速腦老化小鼠及海馬注射Aβ的AD大鼠認知功能障礙;進一步的組織學檢測發(fā)現,紅芪和紅芪多糖可以提高快速老化小鼠腦內中樞單胺類神經遞質5-HT、5-HIAA、NE、DA的水平。
文檔編號A61P25/28GK102018747SQ20091017641
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月14日 優(yōu)先權日2009年9月14日
發(fā)明者張占軍, 朱海燕, 王永炎, 程衛(wèi)東 申請人:張占軍
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