專利名稱：柯楠因在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及鉤藤生物堿提取物柯楠因在制備靶器官保護(hù)藥物中的用途，具體涉及柯楠因在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
缺血缺氧心肌損傷，是近幾十年來在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家導(dǎo)致死亡的首要原因。降低此類疾病的發(fā)病率和死亡率非常重要。心臟的
內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S0D)、過氧化氫酶(catalase， CAT )、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx )和其它抗氧化劑。體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, R0S)產(chǎn)生增加，超過了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可加速人體的衰老、增加腫瘤的發(fā)生率，也可引起心血管系統(tǒng)的損傷，加重心肌破壞的程度。動脈粥樣硬化、糖尿病、中風(fēng)等疾病過程中，氧化應(yīng)激的機(jī)制也不容忽視。
鉤藤是茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝。已知鉤藤性甘、涼。歸肝、心包經(jīng)。具有清熱、平肝，息風(fēng)定驚的功效?，F(xiàn)有技術(shù)公開了鉤藤具有持久、明確的降壓作用。
柯楠因(Corynantheine)屬吲哚類生物堿，是鉤藤中的天然有機(jī)化合物，是中藥鉤藤生物堿提取物中的主要有效成分。文獻(xiàn)報道柯楠因(Corynantheine)具有抑制利什曼原蟲等活性。但至今未見有關(guān)Corynantheine對缺血缺氧損傷心肌細(xì)胞以及心肌損傷的作用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鉤藤生物堿提取物柯楠因在制藥中的新用途，具體涉及柯楠因在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途。尤其是在制備治療缺血缺氧心肌損傷性心臟病藥物中的用途。本發(fā)明通過下述方法制備鉤藤醇提取物柯楠因(堿)，
1) 取正品鉤藤，粉碎后加濃度大于70%的乙醇，加熱提取數(shù)次,
過濾，合并濾液；
2) 濾液減壓濃縮成稠浸膏，加0. 1-10%鹽酸溶解、洗滌，取濾
液；
3) 堿性條件下，濾液加氯仿數(shù)次萃取后合并氯仿液；
4) 將氯仿液減壓濃縮后得鉤藤醇提取物；
5) 經(jīng)高壓液相色譜儀檢測，鑒定得式(I )結(jié)構(gòu)的鉤藤醇提取
本發(fā)明所述的柯楠因(堿)分子式(:2211260具3=366，結(jié)構(gòu)如下述:<formula>formula see original document page 4</formula>
corynanth6in6柯楠因(堿)
M=366
C I )
本發(fā)明進(jìn)行了缺氧心肌細(xì)胞實驗，檢測了經(jīng)柯楠因處理的缺氧心肌細(xì)胞的上清液，結(jié)果顯示NO的濃度明顯提高，表明柯楠因能促進(jìn)體內(nèi)N0的生成。
本發(fā)明通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗，結(jié)果證實柯楠因能提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)N0生成；能降低缺氧損傷心肌細(xì)胞的 的漏出率；能提高SOD的活性；可以抑制脂質(zhì)過氧化以及具有抑制心肌細(xì)胞凋亡 的作用。
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明鉤藤醇提取物柯楠因可作為藥物制劑的原 料。進(jìn)一步制備治療心肌損傷的藥物。具體涉及制備缺氧缺糖心肌損 傷心臟病的藥物。


圖.1是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞的存活率的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，/K0.05; *:柯楠因各濃度處理組與模型組相比，
;KO. 05。
圖2是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞的N0釋放量的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組，a:模型組與正
常對照組相比，,0.05; *:柯楠因毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相
比，；KO. 05。
圖3是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞LDH漏出率的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，,0.05; *:柯楠因各濃度處理組與模型組相比，
;KO. 05。
圖4是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞總SOD活力的影響。 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，/K0. 05; *:柯楠因各濃度處理組與模型組相比，
;KO. 05。
圖5是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞MDA的影響，
其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，,0.05; *:柯楠因各濃度處理組與模型組相比，
;KO. 05。
圖6是柯楠因?qū)θ毖跞碧? h損傷心肌細(xì)胞Bcl-2、 Bax蛋白表 達(dá)的影響，其中，1:正常對照組(Control); 2:模型組(Vehicle); 3:柯 楠因10—W/l; 4:柯楠因l(T6 mol/l; 5:柯楠因10-7 mol/l。
具體實施例方式
實施例l柯楠因提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)N0生成實驗
原代培養(yǎng)3日齡SD乳鼠，無菌條件下取心臟于PBS中清洗，剪 碎，移入含有0.08%胰酶的三角燒瓶中37。C消化10分鐘，持續(xù)磁力 攪拌下共消化8次。每次消化后收集上清液，血清中止消化，2000 轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀調(diào)細(xì)胞密度為10 —6，培養(yǎng)在含10%小牛 血清的DMEM中，第三天用于實驗。分為正常對照組(不給于藥物干 預(yù)，不缺氧缺糖)、模型組(不給于藥物干預(yù)，缺氧缺糖6 h復(fù)糖)、 柯楠因藥物組(分別給予藥物10 —5mol/L、 10_6mol/L、 10—7mol/L缺 氧缺糖6h)。 MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖l所示，模型組存活 率明顯低于正常對照組，柯楠因各濃度均能明顯提高細(xì)胞存活率(單 因素方差分析,O. 05 )。
取細(xì)胞上清液100jul，按NO試劑盒測定方法檢測NO。如圖2所 示，模型組較正常對照組相比NO濃度明顯下降(單因素方差分析 /KO. 05),而柯楠因各濃度均能明顯提高上清液中H2S濃度(；KO. 05)。
實施例2.柯楠因降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞的LDH的漏出實驗
每組(n = 6)每個樣本取106個細(xì)胞，充分裂解，丙酮酸法檢測 細(xì)胞內(nèi)LDH的含量，正常對照組細(xì)胞內(nèi)LDH為100%，各濃度用藥組 與模型組細(xì)胞內(nèi)LDH與正常對照組的差值為LDH漏出率，在反應(yīng)體系 中產(chǎn)生l ymol丙酮酸為l單位，計算每單位/mg蛋白。結(jié)果如圖.3 所示，各濃度用藥組的LDH漏出率較模型組均明顯降低。
實施例3.柯楠因提高SOD活性實驗
羥胺法檢測SOD,每亳克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá) 50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。結(jié)果顯示總SOD如
6圖4所示，柯楠因各濃度用藥組均能夠明顯提高總SOD的活力，較模 型組顯著升高(,0.05)。
實施例4.柯楠因抑制脂質(zhì)過氧化實驗
氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作 用，并因此產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)。 MDA可與硫代巴比妥酸 (TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 mn處有最大吸收峰。如圖5所 示，模型組MDA含量顯著增高(/K0.05與正常對照組相比)?？麻?各濃度處理組較模型組均明顯降低，證實柯楠因可抑制活性氧誘導(dǎo)的 脂質(zhì)過氧化。
實施例5.柯楠因可提高Bcl-2和降低Bax蛋白水平的表達(dá)
模型組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低、Bax蛋白水平顯著增加 (/K0.05與正常對照組相比)，柯楠因各濃度處理組較模型組均明顯 增加Bcl-2蛋白表達(dá)水平和降低Bax蛋白水平的表達(dá)?？麻蛟诘鞍?水平降低了凋亡相關(guān)因子Bax，提高抗凋亡因和子Bcl-2 (圖6)
權(quán)利要求
1、式(I)的柯楠因在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途，
2、 按權(quán)利要求l所述的用途，其特征是所述心肌損傷性心臟病是 缺血缺氧心肌損傷心臟病。
3、 按權(quán)利要求l所述的用途，其特征是所述柯楠因通過提高細(xì)胞 存活率，促進(jìn)N0生成、降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞LDH的漏出率、 提高SOD活性、抑制脂質(zhì)過氧化和/或抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用治療 心肌損傷性心臟病。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及鉤藤生物堿提取物柯楠因在制備心肌損傷藥物中的用途，尤其是在制備治療缺血缺氧心肌損傷藥物中的用途。本發(fā)明通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗，結(jié)果表明柯楠因可以提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)NO生成；可降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞的LDH的漏出率；可提高SOD活性；可以抑制脂質(zhì)過氧化以及具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。所述的柯楠因可作為治療藥物應(yīng)用于治療心肌損傷尤其是缺血缺氧心肌損傷心臟病。
文檔編號A61P9/00GK101683337SQ20091015093
公開日2010年3月31日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者吳利新, 朱依純, 朱依諄 申請人:復(fù)旦大學(xué)