專利名稱：Cenp-e結(jié)合蛋白及其編碼基因在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CENP-E結(jié)合蛋白及其編碼基因在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞精確地自我復(fù)制是其生活史的重要組成部分，復(fù)制的高保真性在生物及物種 的繁衍生息過程中舉足輕重。在細胞復(fù)制的過程中，包含在染色體中的父代遺傳信息 在經(jīng)歷了諸多復(fù)雜的運動之后均等、準確地傳遞給兩個子細胞。細胞周期事件是高度 有序進行的，保證細胞周期有條不紊行進的生化調(diào)控道路被稱為"檢驗點" (checkpoint)。
動點是位于著絲粒上的多組份蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)，它不僅直接維系紡錘體絲與染色 體的銜接，同時要調(diào)控染色體運動及染色體分離的時空序列性及保真性，此信號通路
被稱為"紡錘體檢驗點"(spindle checkpoint)。紡錘體檢驗點失控可導(dǎo)致細胞復(fù) 制過程中非整倍體及染色體不穩(wěn)定性的產(chǎn)生，并可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但迄今 為止，紡錘體檢驗點信號通路的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)及其信息流傳遞的分子機制仍不清 楚。
動點馬達蛋白CENP-E(centromere associated protein E)是一個分子量為312kD 的動點蛋白，包含一個位于N端的與驅(qū)動蛋白類似的馬達域和包含2069個氨基酸殘 基的coiled-coil結(jié)合域。人源CENP-E總長為2701個氨基酸殘基(薛宇等，2006 . 哺乳動物驅(qū)動蛋白的計算基因組學(xué)分析與鑒定.科學(xué)通報，51: 1654-1665) 。 CENP-E 是一個直接負責動點對紡錘體微管捕獲的馬達蛋白，它與其它紡錘體檢查點蛋白一起 協(xié)調(diào)細胞有絲分裂的進行(Yao et al.， 2000. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature cell Biology. NCB. 2:484-491) 。 CENP-E的缺失使紡錘體檢驗點 失活，產(chǎn)生染色體不穩(wěn)定性(Weaver et al. , 2007. Ane叩loidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. C朋cer CeJ丄 11: 25-36.)。 因此， 尋找紡錘體檢驗點調(diào)控蛋白及CENP-E結(jié)合蛋白是一項非常有意義的研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
3本發(fā)明的目的是提供一個調(diào)控染色體運動的動點馬達蛋白CENP-E的結(jié)合蛋白。 本發(fā)明所提供的CENP-E結(jié)合蛋白，名稱為CENP-V，其基因來源于人睪丸細胞， 是下述氨基酸序列之一
1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;
2) 將序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且與CENP-E蛋白結(jié)合對細胞有絲分裂的行進具有調(diào)控功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQIDNO: 1由523個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第64-179 位氨基酸殘基為典型的亮氨酸富集域，自N端第208-342位及第504-517位氨基酸殘 基為coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
編碼上述CENP-E結(jié)合蛋白CENP-V的基因(6EV尸-，是下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;
2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；
3) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90X以上同源性且與CENP-E 蛋白結(jié)合對細胞有絲分裂的行進具有調(diào)控功能的核苷酸序列；
4) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在O. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65。C條 件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO: 2由1572個堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1569 位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5' 端第192-537位堿基編碼亮氨酸富集域，自5'端第624-1026位堿基和第1512-1551 位堿基編碼Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。 擴增6EV尸-K中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制CENP-V基因表達的方法。 本發(fā)明所提供的抑制CENP-V基因表達的方法，是將抑制CENP-V基因表達的小干 擾RNA或其編碼基因?qū)胨拗?，CENP-V基因的表達被抑制。
所述抑制CENP-V基因表達的小干擾RNA，可為正義鏈為序列表中的序列3，反義 鏈為序列表中的序列4的雙鏈RNA序列。
將雙鏈RNA序列命名為CENP-V siRNA。 CENP-V siRNA的反義鏈與6EV尸-K mRNA(GenBank號BC050665.)距離^ cDNA起始密碼子ATG 965-990位置序列 5， -gcaagauugccaaa薦gaggagaa-3，互補，序列表中SEQ ID NO: 3由25個堿基組 成，序列的方向從左至右為5'端一3'端，序列表中SEQIDNO: 4由25個堿基組成， 序列的方向從左至右為5'端一3'端。
上述抑制CENP-V基因表達的小干擾RNA的編碼基因可為有義鏈(正義鏈)(不 做模板的DNA鏈)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中 序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中 序列6的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中序列6限定的DNA序列雜交的核 苷酸序列。
所述高嚴謹條件可為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC) ， 0. 1% SDS的溶液中，在65°C 下雜交并洗膜。
上述具有雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為CENP-V siDNA，編碼CENP-V siRNA。 序列表中序列5由25個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中 序列6由25個堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
本發(fā)明提供了一個與CENP-E相互作用的動點蛋白，它在有絲分裂的早期與 CENP-E共定位于動點，到中期染色體在赤道板上正確排列后離開動點并移往中心體， 末期定位到中體，由于該蛋白和CENP-E直接相互作用于動點，因此將其命名為CENP-V。 CENP-V呈細胞周期依賴性表達，在有絲分裂中期表達量最高，此外，電鏡觀測結(jié)果表 明CENP-V在核膜破裂后，定位到染色體動點的最外層，在染色體被捕獲直到染色體 在赤道板上正確排列的過程中，CENP-V分布于纖維冠狀層上。CENP-V的coiled-coil 區(qū)域后200個氨基酸殘基負責其動點定位及與CENP-E的相互作用。微管共沉降實驗 證實CENP-V是一種與微管直接相作用的蛋白，并通過CENP-V的氨基端(N端)與微 管相互作用。利用RNAi敲除技術(shù)抑制CENP-V基因的表達的實驗結(jié)果表明，敲除CENP-V 基因可以引起染色體的錯誤分離，并降低姐妹染色體的張力。實時活細胞監(jiān)測結(jié)果表 明，敲除CENP-V基因可以引起細胞周期的阻滯。上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的CENP-V 是一個動點蛋白，通過與CENP-E和微管的相互作用參與細胞有絲分裂的紡錘體檢査 點信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以其作為制備抑制腫瘤細胞增殖藥物的藥靶，本發(fā)明的蛋白及其 編碼基因?qū)⒃卺t(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為CENP-V氨基酸序列的同源性比對結(jié)果 圖2為CENP-V氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果圖3A為CENP-V的細胞周期性表達方式的Wester Blot檢測結(jié)果 圖犯為流式細胞儀檢測各個時期細胞所占的比例
圖4A-圖4B為CENP-V全長抗體對內(nèi)源性CENP-V定位的免疫熒光檢測結(jié)果 圖4C為CENP-V抗體對內(nèi)源性CENP-V結(jié)合特異性的Western Blot檢測結(jié)果 圖5A為CENP-V與CENP-E2132—，之間的相互作用的體外pull-down檢測結(jié)果 圖5B-圖5C為CENP-V的9段deletions與GST-CENP-E2132—27(11融合蛋白相互作用 的檢測結(jié)果
圖5D為CENP-V及CENP-E相互作用區(qū)域的鑒定結(jié)果
圖6A-圖6B為CENP-V與微管相互作用及區(qū)域的鑒定結(jié)果
圖7為CENP-V基因siRNA對CENP-V基因在細胞內(nèi)表達的抑制作用的檢測結(jié)果以 及CENP-V敲除后引起細胞周期阻滯的檢測結(jié)果
圖8為敲除CENP-V后對細胞周期影響的活細胞觀察結(jié)果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見
《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。 實施例1、 CENP-E結(jié)合蛋白CENP-V基因的獲得
提取人睪丸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物CENP-VF(上 游引物):5， -ATGAACCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3，和CENP-VR (下游引物):5， -CTAGTCTAGGATGTCGCCACATTCCAG-3，的引導(dǎo)下，PCR擴增野生型人CENP-E結(jié)合蛋白 CENP-V基因。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴增產(chǎn)物連接入載體pMD 18-T(TaKaRa公司)中， 再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡coW) DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒， 得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-CENP-V，對其進行測序，測序結(jié)果表明 野生型人CENP-V基因具有序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO: 2由1572個堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1569位堿基，編碼具有序列 表中SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第192-537位堿基編 碼亮氨酸富集域，自5'端第624-1026位堿基和第1512-1551位堿基編碼Coiled-coil 結(jié)構(gòu)域。對上述來源于人的CENP-E結(jié)合蛋白CENP-V的氨基酸殘基序列分別與來源于 果蠅、小鼠和大鼠的CENP-V的氨基酸殘基序列進行序列比對分析，結(jié)果如圖l所示 (Hs為本發(fā)明的CENP-V序列，Mm為小鼠的CENP-V序歹ij， Rn為的大鼠的CENP-V序列， Dm為果蠅的CENP-V序列)，表明CENP-V是一個高度保守的蛋白質(zhì)。同時，對本發(fā)明CENP-E的結(jié)合蛋白CENP-V的氨基酸殘基序列進行結(jié)構(gòu)域分析，分析結(jié)果如圖2所示， 自氨基端(N端)第64-179位氨基酸殘基為典型的亮氨酸富集域，自N端第208-342 位及第504-517位氨基酸殘基為coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
實施例2、 CENP-V在細胞內(nèi)周期性表達的檢測
一、 野生型CENP-V基因真核表達載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶&oy I和屈o I對含有野生型CENP-V基因的重組質(zhì)粒 pGEM-CENP-V進行雙酶切，回收并純化1572bp的目的基因片段，再將其連入載體 pEGF-Cl (Clontech公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，篩選陽 性克隆，提質(zhì)粒，得到野生型CENP-V基因的真核表達載體，命名為pEGF-CENP-V。
二、 穩(wěn)定表達CENP-V的細胞株的構(gòu)建及其周期性表達檢測
1、 穩(wěn)定表達CENP-V的細胞株的構(gòu)建
將步驟一獲得的野生型CENP-V基因的真核表達質(zhì)粒用Lipofectamine 2000 (Irwitrogen)轉(zhuǎn)染Hela細胞，再將轉(zhuǎn)染細胞在37。C、 5% 0)2下培養(yǎng)于添加10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中，然后加入O. 5mg/mL G418進行篩選，待細胞形成 克隆以后，挑取帶有熒光的單克隆進行培養(yǎng)，從而得到穩(wěn)定表達CENP-V的細胞株。為 收集G1、 S、 G2、 M各個不同時期的細胞，向細胞密度為50X的培養(yǎng)基中加入thymidine (購自Sigina公司)至終濃度為2.5raM， 12小時后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，然后加入 新鮮的培養(yǎng)基，IO小時后，再次向培養(yǎng)基中加入同樣濃度的thymidine，繼續(xù)培養(yǎng)12 小時收集G1/S期細胞。為了收集G1/S釋放后不同時期的細胞，將G1/S期的細胞用PBS 洗3遍，以洗去thymidine,然后加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后收集細胞，得
到處于不同時期的轉(zhuǎn)染細胞。
2、 穩(wěn)定表達CENP-V細胞株的周期性表達檢測
用細胞裂解液(150mMNaCl， 40mMHEPES [pH 7. 4] ， 1% tritonX-100， ImMMgCl" lmM EGTA， lraM PMSF， lO^g/mL亮抑霉肽，胃蛋白酶A，抑肽酶)裂解步驟1獲得的 不同時期的轉(zhuǎn)染細胞，然后用4'C離心機12000rpm離心15分鐘，將不同時期(0、 2、 4、 8、 12小時)的轉(zhuǎn)染細胞的裂解液上清和純化的GST-CENP-E融合蛋白(購自Sigma 公司)在4。C下孵育4小時，然后用細胞裂解液沖洗GST親和樹脂4次后使用加樣緩 沖液(2X加樣緩沖液100mMTris HCl(p服.8)， 200mM二硫蘇糖醇，4MSDS(電泳 級)，0.2%溴酚藍，20%甘油)重懸樹脂，將樣品在10(TC下煮10分鐘后進行10X SDS-PAGE分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后分別使用GFP的單克隆抗體 (BD Bioscience公司)、tubulin單克隆抗體(Sigma公司)禾口CyclinB (Sigma公司)進行Westen Blot檢測，檢測結(jié)果圖3A所示(Iner表示有絲分裂間期，Meta 至Meta+12表示從有絲分裂中期開始O、 2、 4、 8、 12小時不同時期的轉(zhuǎn)染細胞)， 結(jié)果顯示CENP-V在有絲分裂中期表達量最高，表明CENP-V的表達是細胞周期依賴性 的，圖3B (2N代表單倍體細胞，4N代表雙倍體細胞)為用流式細胞儀檢測圖3A 中不同時期所取樣品對應(yīng)的細胞周期分布情況，表明CENP-V蛋白的表達規(guī)律呈細胞 周期依賴性并在有絲分裂中期表達量最高。
實施例3、 CENP-V的細胞周期性定位及CENP-V的抗體檢測
一、 CENP-V抗體的制備
1、 制備抗原
將CENP-V全長氨基酸殘基的編碼序列連接入HIS表達載體pET28a (Invitrogen 公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞接種于含 100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上進行篩選，挑取長出的單克隆，將其接種到5mLLB 液體培養(yǎng)基中，在37"下?lián)u菌12-18小時，然后按l: 100的比例接種于500mLLB液 體培養(yǎng)基中，在37。C、250rpm下振蕩培養(yǎng)，待其600nm的OD值達0. 6時，加入0. 2mg/L IPTG，于37'C誘導(dǎo)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，重懸于PBS后，使用壓力破 碎儀裂解細胞，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF (購自Bio Basic Inc.公司)，然后使 用高速低溫冷凍離心機，12000rpra離心30分鐘，棄沉淀，對上清進行純化，得到CENP-V 的全長蛋白。
2、 CENP-V抗體的制備
使用步驟1表達的CENP-V全長蛋白和含CENP-V末端13個氨基酸殘基(第446-458 位)的多肽分別作為抗原免疫云南昆明小鼠及Balb/C小鼠制備抗體，免疫方案為 每次10Pg，分三次進行免疫，每次間隔21天。
3、 CENP-V抗體的檢測
末次免疫后20天，取上述步驟2中經(jīng)免疫的云南昆明小鼠的血清用Western Blot 法檢測其對實施例2獲得的轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)表達的CENP-V的識別情況，以GFP的單克隆 抗體為對照，檢測結(jié)果如圖4C所示(泳道l:用CENP-V抗體檢測轉(zhuǎn)染的Hela細胞裂 解液；泳道2:用CENP-V抗體檢測CENP-V-GFP轉(zhuǎn)染的Hela細胞裂解液；泳道3:用GFP 抗體檢測Hela細胞裂解液；泳道4:用GFP抗體檢測CENP-V-GFP轉(zhuǎn)染的Hela細胞裂 解液。)，表明免疫血清能特異的識別大約57KD的CENP-V條帶。對血清進行純化， 得到CENP-V多肽抗體和CENP-V重組蛋白抗體血清。
二、 CENP-V抗體對內(nèi)源性CENP-V定位的免疫熒光檢測棄去實施例2培養(yǎng)有穩(wěn)定表達CENP-V細胞株的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖 液洗一遍，棄去溶液，用PHEM緩沖液洗一分鐘。然后用含有O. 1% Triton X-100的 PHEM緩沖液處理一分鐘以使細胞膜穿孔將細胞質(zhì)內(nèi)可溶性的蛋白質(zhì)滲透出來。在有些 情況下，溶液中包含5MM Taxol (Sigma Chemical Co.)以減少在抽提過程中的微管解 聚。PHEM (lOOmM PIPES, 20mMHEPES (pH6.9) ， 5mMEGTA， 2mMMgCl2， 4M glycerol)。 用4%新鮮配制的多聚甲醛(溶解于raEM或PBS中)固定細胞，然后用PBS緩沖液洗 三遍。用1% BSA (溶解于TBST緩沖液)在室溫下封閉蓋玻片30分鐘。用適當稀釋 的一抗(CENP-V重組蛋白抗體血清)在室溫孵育細胞/蓋玻片90分鐘。加200"1 1 % BSA (溶解于TBST緩沖液)至蓋玻片上以洗去非特異性結(jié)合的抗體，每次5分鐘。 將帶有FITC標記的抗鼠抗體作為二抗(購自Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)加在蓋玻片上，室溫孵育45分鐘。滴加200u 1 1% BSA (溶解于TBST緩沖液) 至蓋玻片上以洗去非特異性結(jié)合的第二抗體，每次5分鐘。用DAPI染蓋玻片一分鐘。 用200ul PBS洗滌兩次，每次5分鐘在載玻片上加適量(5wl)的熒光抗淬滅封片劑， 封片。在熒光倒置顯微鏡下觀察，并拍照(Axiovert 200熒光倒置顯微鏡為Zeiss 公司產(chǎn)品；相機為AxioCamCCD相機，采集圖象的軟件為AxioVision 3. 0)。結(jié)果如 圖4A和圖4B所示(圖中，CENP-E表示馬達動點蛋白CENP-E， CENP-V表示用步驟2 所得到的CENP-V抗體染色的CENP-V， DAPI表示細胞的染色體，Merge表示將上述三 種顏色的通道融合結(jié)果)，圖4A說明CENP-V與CENP-E有共定位且定位于動點，表 明CENP-V是一個動點蛋白；圖4B說明到有絲分裂中后期姐妹染色體分離時，CENP-V 從動點上下來。
實施例4、 CENP-V及CENP-E相互作用區(qū)域的鑒定 一、CENP-E2132—，基因的原核表達及表達產(chǎn)物的純化
人工合成野生型CENP-E基因自5，端第2132-2701位堿基序列(簡稱CENP-E2132—■ 基因)，先用限制性內(nèi)切酶^朋WI對CENP-E2132—27(11基因進行單酶切，然后將其連接入 載體pGEX-6P-1 (Amershanm. Biosciences公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21
(DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板上進行 篩選，挑取長出的單克隆，將其接種到5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37'C下?lián)u菌12-24 小時，然后按l: 100的比例接種于500raL LB液體培養(yǎng)基中，在37。C、 250rpm下振 蕩培養(yǎng)，待其560nra的OD值達0.6時，加入0. 2mg/L IPTG，于37。C誘導(dǎo)3小時。培 養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，重懸于PBS (J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，1998， 科學(xué)出版社，p927)后，使用壓力破碎儀裂解細胞，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF (BioBasic Inc.公司)，然后使用高速低溫冷凍離心機，12000rpm離心30分鐘，棄沉淀， 將上清與GST親和樹脂(Novagen公司)在4"C下孵育1小時后，用PBS沖洗樹脂。 取上清，樹脂及沉淀用10% SDS-PAGE檢測表達蛋白的純化效果，檢測結(jié)果表明獲得 了純度較高的約90KD的GST-CENP-E2132—，融合蛋白。
二、 CENP-V基因的原核表達及表達產(chǎn)物的純化
先用限制性內(nèi)切酶^^ I和J力o I對含有野生型CENP-V基因的質(zhì)粒 pGEM-CENP-V進行雙酶切，回收并純化約1572bp的CENP-V基因片段，然后將其連接 入載體pET28a(Novagen公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞， 將轉(zhuǎn)化細胞接種于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上進行篩選，挑取長出的單克 隆，將其接種到5mLLB液體培養(yǎng)基中，在37。C下?lián)u菌12-24小時，然后按1: 100的 比例接種于500mLLB液體培養(yǎng)基中，在37"C、 250rpm下振蕩培養(yǎng)，待其560nm的0D 值達0.6時，加入0.2mg/L IPTG，于37TH秀導(dǎo)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體， 重懸于PBS (J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，1998，科學(xué)出版社，p927)后， 使用壓力破碎儀裂解細胞，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF (Bio Basic Inc.公司)， 然后使用高速低溫冷凍離心機，12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，將上清與與Bio-Rad 柱中的鎳樹脂4X:孵育lh。用5倍體積的Wash buffer I (50mM NaH2P04， pH8. 0; 300mM NaCl; 20mM咪唑)和II (50raM NaH2P04， pH8. 0; 300mM NaCl; 40mM咪唑)分別洗柱子并收集。 用O. 5mL Elution buffer (50mM NaH2P04, pH8. 0; 300mM NaCl; 200rnM咪唑)洗四次并收 集，再重復(fù)四次，得到純度較高的HIS-CENP-V融合蛋白。
三、 體外pull-down檢測CENP-V與CENP-E，-，之間的相互作用
在兩個Eppendorf管中分別加入10u 1結(jié)合GST蛋白GST樹脂和等量的結(jié)合 GST-CENP-E^—，融合蛋白的GST樹脂，再在兩個Eppendorf管中加入等量的步驟二中 純化的HIS-CENP-V融合蛋白，4。C混勻儀2h，然后4。C、 12000rpm離心0. 5min，將 上清轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，待做電泳分析。用lmL冰預(yù)冷的裂解液(50 mM NaH2P04 pH8. 0; 300raMNaCl)懸浮樹脂，4°C、 12000rpm離心0. 5min，重復(fù)三次，加入2X電 泳上樣緩沖液50ul， 10(TC煮樣品3分鐘，進行電泳并用考馬斯亮藍染色，電泳圖譜 如圖5A所示(泳道l:純化的GST-CENP-E2132—27(11 ;泳道2: pull-down前HIS-CENP-V; 泳道3: pull-down后反應(yīng)體系中的HIS-CENP-V;泳道4: pull-down的電泳條帶；泳 道5:用GST蛋白進行pull-down的結(jié)果)，表明CENP-V可以和CENP-E2132—27°在體外 直接相互作用。
四、 CENP-V的9段deletions的真核表達
根據(jù)CENP-V基因，構(gòu)建9段不同長度的缺失突變體基因(deletions)，分別為自5'端第1-900位堿基(編碼自N端第1-300位氨基酸殘基，將該片段命名為Dl)、 第900-1569位堿基(編碼自N端第300-523位氨基酸殘基，命名為D2)、第1-726 位堿基(編碼自N端第1-242位氨基酸殘基，命名為D3)、第624-726位堿基(編碼 自N端第208-242位氨基酸殘基，命名為D4)、第624-1326位堿基(編碼自N端第 208-442位氨基酸殘基，命名為D5)、第726-1326位堿基(編碼自N端第242-442 位氨基酸殘基，命名為D6)、第624-1374位堿基(編碼自N端第208-458位氨基酸 殘基，命名為D7)、第624-1569位堿基(編碼自N端第208-523位氨基酸殘基，命 名為D8)、第l-624位堿基(編碼自N端第1-208位氨基酸殘基，命名為D9)，構(gòu) 建方法為以CENP-V基因為模板，分別在下述引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，得到上 述9個缺失片段。
Dl: 5' - ATGGCCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3，
5， -TGTTTTCCGCTTCTCCTGCTGTTTCAG-3，； D2: 5' -ATGGAGAAGCGGAAAACAGAGCTTGACACC-3'
5， -CTAGTCTAGGATGTCGCCACATTCCAG-3，； D3: 5' - ATGAACCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3, 5' -TTCCACAAACGCAGTCTTGTGCTTCT-3，； D4: 5' -ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3， 5， -TTCCACAAACGCAGTCTTGTGCTTCT-3，； D5: 5' -ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3'
5' -CGCGCGCAGGTCGTTAGG-3'; D6: 5， -ATGCACCTGAATGGCTCCTTCCTG-3，
5' -CGCGCGCAGGTCGTTAGG-3'; D7: 5' -ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3，
5' -GATGTCGTGCGATGCCCCGAC-3，； D8: 5' -ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3， 5 ， -TGTTTTCCGCTTCTCCTGCTGTTTCAG-3' D9: 5' - ATGGCCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3， 5， -GCTGTACTGGTGCTTAGCCTCCGC-3，。 然后將9段deletions分別構(gòu)建到帶有GFP標簽的載體pEGF-Cl (Clontech公司)中， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，篩選陽性單克隆，提質(zhì)粒，將9 種質(zhì)粒分別用Lipofectaraine 2000試劑轉(zhuǎn)染人胚腎成纖維293T細胞，在37。C下培養(yǎng) 于添加10% FCS的DMEM培養(yǎng)基中使缺失基因在細胞內(nèi)表達。五、 表達蛋白的相互作用的檢測
將步驟四的9種轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)細胞，用細胞裂解液在冰上 裂解轉(zhuǎn)染的293T細胞，4°C、 12000rpm離心15分鐘，收集上清。同時將它們分別與 步驟一中表達的GST-CENP-E2132—27(11融合蛋白樹脂在4'C下50rpm振蕩孵育4小時后，用 細胞裂解液洗三次，用預(yù)冷的PBS洗二次，隨后，加入2X電泳上樣緩沖液50ul， IO(TC煮樣品3分鐘，進行10%SDS-PAGE電泳并用考馬斯亮藍染色，電泳圖譜如圖5B (泳道Dl-D9分別代表帶有GFP-tagged的Dl-D9轉(zhuǎn)染Hela細胞以后的細胞裂解液用 GFP的抗體進行檢測的結(jié)果)和圖5C (泳道D1-D9分別為帶有GFP-tagged的D1-D9 轉(zhuǎn)染Hela細胞以后的細胞裂解液用GST-CENP-E2132—，融合蛋白樹脂行pull-down用 GFP抗體進行檢測的結(jié)果)所示，表明D6與GST-CENP-E2132—，相互作用最強，表明D6 即CENP-V的第242-442位氨基酸殘基負責與CENP-E的相互作用。
六、 酵母雙雜交檢測CENP-E與CENP-V作用的最小區(qū)域
根據(jù)CENP-E基因自5，端第2132-2701位堿基(CENP-E2132 27(11 )，構(gòu)建6段不同 長度的缺失突變體基因(deletions)，分別為自5'端第6393-8103位堿基(編碼自 N端第2131-2701位氨基酸殘基，將該片段命名為CENP-E570aa)、第6474-8103位 堿基(編碼自N端第2158-2701位氨基酸殘基，命名為CENP-E534aa)、第7293-8103 位堿基(編碼自N端第2431-2701位氨基酸殘基，命名為CENP-E5270aa)、第7593-8103 位堿基編碼自N端第2531-2701位氨基酸殘基，命名為CENP-E170aa)、第7893-8103 位堿基(編碼自N端第2631-2701位氨基酸殘基，命名為CENP-E70aa)和第6474-7893 位堿基(編碼自N端第2158-2631位氨基酸殘基，命名為CENP-E2158—2631aa)，構(gòu)建方法 為以CENP-E基因為模板，分別在下述引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，得到上述6個 缺失片段。
CENP-E570aa :
5' -ATGAAAGAGCTTTCAATGAGAGTTAAA-3' 5， -CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3，； CENP-E534aa :
5' -ATGAGAATCATGAAGAAACTGAAG-3' 5' -CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3，； CENP-E270aa :
5' -ATGATTCAAGTACTTCAGGACAAAGTT-3' 5， -CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3，； CENP—E170aa:5" -ATGGGTGGCAGCGGCATTGTACAAAAC-3'
5' -CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3'; CENP-E70aa:
5' -ATGTCAAAGTCTTTACCATCACCT-3'
5' -CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3，； CENP—E2158—2631aa ■
5' -ATGAGAATCATGAAGAAACTGAAG-3' 5' -TCGGCTATCAAAAAAACAAGATT-3，。 然后將上述缺失片段分別連接入酵母表達載體pGBKT7(Clontech公司)中，得到含有 上述CENP-E2132—271)1不同缺失片段的重組酵母表達載體，同時，將CENP-V基因也連接入 載體pGAKT7中，得到含有CENP-V基因的重組酵母表達載體，再將上述CENP-E2132—■ 不同缺失片段的重組酵母表達載體分別與含有CENP-V基因的重組酵母表達載體共同 轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，在30。C下培養(yǎng)于Leu7Trp7His7Ade—培養(yǎng)基(購自Sigma公司) 上，結(jié)果如圖5D所示(1為CENP-E570aa-pGBKT7與CENP-V-pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母菌株 AH109， 2為CENP-E534aa-pGBKT7與CENP-V-pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母菌株AH109， 3為 CENP-E5270aa-pGBKT7與CENP-V-pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母菌株AH109， 4為CENP-E170aa-pGBKT7與CENP-V-pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母菌株AH109， 5為CENP-E70aa-pGBKT7與CENP-V-pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母菌株AH109， 6為CENP-E2'58—2631aa-pGBKT7與CENP-V- pGAKT7共轉(zhuǎn)酵母 菌株AH109)，轉(zhuǎn)化有CENP-E基因自5，端第2131-2701位和第2158-2701位堿基的 缺失突變體基因的重組酵母可以生長，且Lac Z Pheno染色結(jié)果為藍色，表明CENP-E 與CENP-V相互作用的具體區(qū)域為CENP-V的coiled-coil區(qū)域后200個氨基酸殘基， 該區(qū)域負責其動點定位及與CENP-E的相互作用。
實施例6、 CENP-V與微管相互作用及區(qū)域鑒定
一、CENP-E結(jié)合蛋白CENP-V及其三段deletions的原核表達載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶I和J力o I對含有野生型人CENP-V基因的重組質(zhì)粒 pGEM-CENP-V進行雙酶切，回收并純化1572bp的目的基因片段，再將其連入載體 pGEX-6P-1 (Amershanm. Biosciences公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài) 細胞，將轉(zhuǎn)化細胞接種于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上進行篩選，挑取長出 的陽性單克隆，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明得到了序列及插入位置均正確的野生型 CENP-V基因的原核表達載體，命名為pGEX-CENP-V。同時，將CENP-V基因的3段不 同長度的缺失突變體基因(deletions)，分別為自5'端第1-900位堿基(編碼自N端第1-300位氨基酸殘基)、第900-1569位堿基(編碼自N端第300-523位氨基酸 殘基)和第624-900位堿基(編碼自N端第208-300位氨基酸殘基)也連入載體體 pGEX-6P-1中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞接種于含 100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上進行篩選，挑取長出的陽性單克隆，提質(zhì)粒，測序， 測序結(jié)果表明得到了序列及插入位置均正確的含有三個不同CENP-V缺失突變體基因 的原核表達載體，分別命名為N0-300、 C301-523和M208-300。
二、 CENP-E結(jié)合蛋白CENP-V及其三段deletions的原核表達及表達產(chǎn)物的純化 將步驟一獲得的分別轉(zhuǎn)化有CENP-V基因及其三段deletions基因的重組菌接種 到5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37。C下?lián)u菌12-18小時，然后按1: 100的比例接種于 500mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 250rpm下振蕩培養(yǎng)，待其560咖的OD值達0. 6時， 加入0.2mg/L IPTG，于37'C誘導(dǎo)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，重懸于PBS
(J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，1998，科學(xué)出版社，p927)后，使用壓力破 碎儀裂解細胞，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF (Bio Basic Inc.公司)，然后使用高 速低溫冷凍離心機，12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，將上清與與Bio-Rad柱中的鎳 樹脂4。C孵育lh，再用5倍體積的Washbuffer I(50raMNaH2P04，pH8. 0; 300 raM NaCl; 20 mM咪唑)和II (50函NaH2P04， pH8. 0; 300mM NaCl; 40raM咪唑)分別洗柱子并收集，最后 用O. 5mL Elution buffer (50raM NaH2P04， pH8. 0;300raM NaCl; 200mM咪唑)洗四次并收 集，重復(fù)四次，得到純化的CENP-V蛋白及其三段deletions重組蛋白。 二、體外微管共沉淀試驗
取出凍存在-80。C的微管蛋白tubulin，冰上融化，4。C、90Krpm (Beckraan， TLA-100) 超高速離心5min，以去除聚集、變性的Tubulin，再將2ug Tubulin融解在10ul PEMG buffer (80mM Pipes, l慮EGTA， lraMMgCl2， 20% Glycerol)中并加入GTP、 DTT 使終濃度均為lmM，然后37'C水浴孵育15min，再在以上聚合好的微管體系中分別加入 待分析的步驟一獲得的CENP-V蛋白(以用帶有His-tagged的prcl蛋白和帶有 His-tagged的GFP蛋白為對照)及其三段deletions重組蛋白，在32。C下水浴15min， 然后32。C、 90Krpm(Beckman， TLA-100)超高速離心5min，分別取出上清以及沉淀進行 電泳檢測，電泳圖譜如圖6A (His-Prc表示帶有His-tagged的prcl蛋白，His-CENP-V 表示帶有His-tagged的CENP-V蛋白，His-GFP表示帶有His-tagged的GFP蛋白；S表示 微管共沉淀反應(yīng)的上清，P表示微管共沉淀反應(yīng)的沉淀)和圖6B (N1-300表示CENP-V 的l-300aa的一段缺失突變體，C301-523表示CENP-V的301-523aa的一段缺失突變體， M208-300表示CENP-V的208-300aa的一段缺失突變體；S表示微管共沉淀反應(yīng)的上清， P表示微管共沉淀反應(yīng)的沉淀；"+"號表示反應(yīng)體系中加入微管，"一"號表示反應(yīng)體系中不加微管)所示，CENP-V與陽性對照prcl—樣可以被微管共沉淀；而陰性對 照His-GFP不能被微管共沉淀下來，并且負責與微管直接相互作用的區(qū)域是CENP-V的 l-300aa，表明CENP-V是一個直接與微管相互作用的蛋白。
實施例7、 CENP-V基因siRNA的合成及其對CENP-V基因在細胞內(nèi)表達的抑制作 用的檢測
一、 抑制CENP-V基因表達的siRNA及其編碼基因的設(shè)計及合成
根據(jù)CENP-V基因的mRNA序列，借助Ambion公司在網(wǎng)上提供的siRNA工具軟件 設(shè)計其siRNA序列，得到一條雙鏈RNA序列，命名為CENP-VsiRNA，再設(shè)計一條作為 陰性對照的雙鏈RNA序列，命名為Control siRNA，序列如下 CENP-V s週A:
正義鏈5， -gcaagauugccaaauucgaggagaa-3， (序列表中SEQ ID NO: 3) 反義鏈5， -uucuccucgaauuuggcaaucuugc-3， (序列表中SEQ ID NO: 4); Control si靈
正義鏈5， -aauccuuaggcaacagccaccug-3' 反義鏈5， -cagguggcuguugccuaaggauu-3，。
然后根據(jù)上述siRNA序列再人工合成其編碼基因siDNA序列，序列如下 CENP-V siDNA:
正義鏈5， -gcaagattgccaaattcgaggagaa-3，(序歹據(jù)中SEQ ID NO: 5) 反義鏈3， -cgttctaacggtttaagctcctctt-5，(序歹接中SEQ ID NO: 6); Control siDNA:
正義鏈5' -aatccttaggcaacagccacctg-3' 反義鏈3， -ttaggaatccgttgtcggtggac-5，。
二、 檢測CENP-V基因的siRNA對C基因在細胞內(nèi)表達的抑制作用
用美國Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000試劑盒并參照試劑盒操作指南 將化學(xué)合成的CENP-V siRNA和Control siRNA分別轉(zhuǎn)染24孔板內(nèi)的Hela細胞中，轉(zhuǎn) 染36小時后收集轉(zhuǎn)染細胞，使用裂解緩沖液裂解細胞，4°C、 12000rpm離心15分鐘， 收集上清，加入加樣緩沖液(2X加樣緩沖液100mmol/LTris 'HC1 (pH6. 8) ， 200mmol/L 二硫蘇糖醇，4%SDS (電泳級)，0.2%溴酚藍，20%甘油)后在IO(TC下煮10分鐘， 然后進行10% SDS-PAGE分離細胞中的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后分 別使用實施例3制備的CENP-V抗體血清、a-tubulin (Sigma公司，對照)與膜在 25'C下孵育1小時，再分別與辣根過氧化酶標記的二抗羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體在25。C下孵育l小時。使用膠片進行顯影，檢測CENP-V在分別轉(zhuǎn)染CENP-V siRNA和 Control siRNA條件下蛋白的表達水平差異，檢測結(jié)果如圖7中的圖A所示(l表示 陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞，2表示CENP-V siRNA轉(zhuǎn)染細胞)，與陰性對照相比，表明 本發(fā)明的CENP-V siRNA能特異地抑制CENP-V基因在細胞內(nèi)的表達。
此外，還將步驟一合成的CENP-VsiDNA和陰性對照Control siDNA用上述相同方 法分別轉(zhuǎn)染Hela細胞，結(jié)果與陰性對照siDNA相比，表明本發(fā)明的CENP-V siRNA的 編碼基因CENP-V siDNA也能特異地抑制CENP-V基因在細胞內(nèi)的表達。
三、 CENP-V敲除后引起細胞周期阻滯的檢測
用美國Irwitrogen公司的LipofectamineTM 2000試劑盒并參照試劑盒操作指南 將化學(xué)合成的CENP-V siRNA和Control siRNA分別轉(zhuǎn)染24孔板內(nèi)的Hela細胞中， 轉(zhuǎn)染18小時和20小時在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖7中的圖B所示，發(fā)現(xiàn)CENP-V基 因的表達被抑制后，有絲分裂期細胞明顯增多(圓形的細胞代表有絲分裂期的Hela 細胞)，表明CENP-V缺失可以引起細胞周期的阻滯。
四、 活細胞觀察敲除CENP-V后對細胞周期的影響
將CENP-V siRNA和Control siRNA分別轉(zhuǎn)染24孔板內(nèi)的穩(wěn)定表達H2B-GFP的Hela 細胞，使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測CENP-V敲除后的穩(wěn)定表達H2B-GFP的Hela穩(wěn) 定細胞株，以核膜破裂記為有絲分裂開始到染色體分離作為后期的開始，結(jié)果如圖8 所示(Prometaphase為前中期，Metaphase為中期，Anaphase為后期)，轉(zhuǎn)染Control siRNA的細胞一般需要50-60分鐘就可完成有絲分裂，而轉(zhuǎn)染CENP-V siRNA的細胞完 成有絲分裂的時間大大增加，從2小時到4小時不等，活細胞觀察統(tǒng)計結(jié)果表明，約 有80%轉(zhuǎn)染有CENP-V siRNA的細胞出現(xiàn)染色體排列滯后的現(xiàn)象，表明CENP-V對細胞 有絲分裂的行進具有重要的調(diào)控作用，可用于制備抑制腫瘤增殖的藥物。序列表
〈160〉 6
<210> 1
<211〉 523
<212〉 PRT
<213〉 人屬人(j7cwo sa/ ie/350
〈400〉 1 Met Asn Gin 1
Met Leu
Gin Leu
Gin Leu
50 Glu Asn 65
Glu Gly
Lys
Ala
35
Asp
Leu
Leu
Asp Leu
Ala Leu 130 Asn Met 145
Leu Ser
Ser 115 Val
Pro
Leu
20
Lys
Cys Asn 5
Ala Val Gin Glu
Ser Met Glu Pro Arg Val Met Asp 10
Phe Arg Asn Arg
Asn Asn lie
Glu
Glu 100 Leu
Lys Leu
70 Asn Leu 85
Thr lie
Gly
Gly
lie
55
Gin
Asp
lie 40 Leu
Phe Asn Asn
Lys Leu Gin
Met Asn
Leu Ser
lie lie 150 Arg Asn 165
Val 135 Tyr
Arg 120 Leu
Gin
25
Leu
Ala His Leu
Glu Gly
Leu 105 lie
Gly
Phe
lie
Arg Leu Asp Asn
Ser Leu
Pro lie Ser
Glu 170
Pro Gin Glu
Val
90
Asp
Ser
Lys
Asp
Asn
75
Trp
Asp
Asn
60
lie
Leu
Thr Leu
Leu Arg Arg
Lys
Gly
Phe 155 Ala
Val 45 Leu
lie
Asn 140 Lys
Glu
Glu 30
Leu
Asp Asp 15
Ala Gly Ser Leu
Trp Gin Phe lie Glu
Asp
Val
Asp 125 Asn
Cys
Asp
Leu
Asn 110
Ser
Arg Leu Tyr
Lys lie
80 Ser Phe 95
Leu Glu
Leu Asp
lie Asp
Arg Thr 160 Lys Met 175Phe lie Cys Ala Tyr Leu Pro Asp Leu Met Tyr Leu Asp Tyr
190 Gin
Ala 180
His Thr Lys Lys
lie Asp Asp 195
Glu Leu Lys His
Leu 185
Ala Glu Ala Lys
lie Asp 210
Asp Glu Gin Ala Gin 225
Val Glu His Leu
Leu 200
Glu Asn Leu Met
Arg Arg Tyr Ser
Gin 215
Glu Glu Leu Glu
His 205
Ala Gin Leu Glu
Arg 230
Gly Ser Phe Leu
Asp Ser
Leu Glu
Glu Tyr 290 Phe Ser 305
Lys Arg
Glu
Thr 275 Gly
Gly 260 Tyr
Asn 245
Asn Asn Leu Ser
Lys Lys Glu Cys Val
Tyr 265 Val
Phe 250 Leu
Lys 235 Asp
Pro Gly Val
Gly
lie lie Cys
Gin 220
His Lys Thr Ala Phe 240
Ser Met Tyr Ala Glu 255
Glu Leu
Leu Lys Gin
Asp Lys Phe 280
Glu Lys Arg Lys
Gly 270 Asn
lie Phe
Lys Ala lie Arg
Arg 310 Lys
Gin 295
Glu Ala lie Gin
Val 285
Glu Leu Asp Thr
lie Ala 325
Glu Leu Glu Leu
Glu 340
Ala Asp lie Ser
Phe Glu Glu Lys 330 Asn
Glu 315 His
Glu Cys Ser 355
Gin Leu Val Glu
Pro 345
Leu Phe Asp Ala
Thr 300
Asn Gin Glu Gin Gly 320
Leu Ser Ser Leu Ser 335
lie Leu
Glu Met 370
Arg Asn lie Val Asp 385
Leu Met Ala Gin
Glu 360
Leu Glu Glu Thr
lie Glu Lys Met 350
Met Thr Leu
Gin 375
Val Gly Leu Phe
Leu 365
Asn Met Phe Glu
Met 390
Arg Asp Leu Glu
lie 380
Glu Asn Val
Leu Glu lie Ser 420
Cys 405
lie Ser Thr Leu
Glu 425
Asn 410 Lys
lie 395
His His His
Gin Ser 400
Glu Lys Leu 415
lie Val Glu Gly Asp Leu 430
18Asp Glu Asp 435
Thr lie Val
450 lie Asp Asn 465
Thr Arg Leu
Lys Arg Val
Leu Asp Asn 515
Leu
Asn
Arg
lie
Lys 500 Leu
Pro Asn Asp Leu 440
Ala Val Gly Ala 455
Glu Asp Glu Leu 470
Asp Arg lie His 485
Glu lie Asn Gin
Glu Cys Gly Asp 520
Arg Ala Leu
Ser His Asp
Val Thr Arg 475
Lys Asp Glu
490 Tyr lie Asp 505
lie Leu Asp
Phe Val Asp Lys Asp 445
lie His Leu Leu Lys 460
lie Asn Ser Trp Cys 480
lie Met Arg Asn Arg 495
His Met Gin Ser Glu 510
<210> 2
<211> 1572
〈212〉 醒
<213> 人屬人(〃冊o sap/e"50
〈400> 2
atgaaxxagccgtgcaactcgatggagccg已gggtg已tgggctcaagctg60
gccgtcggggaccagggcccccaggaggaggccgggcagctggccaagca ggagggcatc120
ctcttcaaggatgtcctgtccctgcagctggactttcggaacatcctccgcatagacaac180
ctctggcagtttgagaacttg鄉(xiāng)aagctgcagc"tggacaat犯catc3ttgaga^gatc240
g鄉(xiāng)gcctggagaacctcgcacacctggtctggctggatctgtctttcaacaacattgag300
accatcgaggggctggacac￡LCtggtg^Cctggaggacctgagcttgttcaacaaccgg360
atctccaagatcgactccctggscgccctcgtcaagctgcagg"tgttgtcgctgggcaac420
肌ccggattggaacatcatctaccttcggcggttc犯gtgcctgcggacg■
ctcagcctctctaggaaccctatctctg已ggc卿ggattac犯gatgttcatctgtgcc540
taccttcctgacctcatgtacctggactactggcgcattgatgaccacacaaaaaagctt600
gcggaggctaagcaccagtacagcatcgacgagctgaagcaccaggagaa cctgatgcag660
gcccagctgg鄉(xiāng)acgagcaggcgcagcgggaggagctagagaagca^a^gactgcgttt720
gtggaacacctgaatggctccttcctgtttgacagcatgtacgctgagga ct:c卿gggc780aac犯tctgtcctacctgcctggtgtcggtgagctccttg agacctacaaggacaagttt840
gtcatcatctgcgtgaatatttttgagtatggcctgaaac agcaggagaagcggaaaaca900
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〈211〉 25
<212> DNA <213〉人工序列
<220〉 〈223〉
<400〉 6
cgttctaacg gtttaagctc ctctt 2權(quán)利要求
1、CENP-E結(jié)合蛋白在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應(yīng)用，所述CENP-E結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示。
2、 CENP-E結(jié)合蛋白基因在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應(yīng)用，所述CENP-E結(jié)合蛋 白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了CENP-E結(jié)合蛋白及其編碼基因在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應(yīng)用。實驗證明，CENP-E結(jié)合蛋白通過與CENP-E和微管的相互作用參與細胞有絲分裂的紡錘體檢查點信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以作為抑制腫瘤細胞增殖藥物的藥靶，CENP-E結(jié)合蛋白及其編碼基因?qū)⒃卺t(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61K48/00GK101543625SQ200910132678
公開日2009年9月30日 申請日期2007年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日
發(fā)明者霞 丁, 丹 劉, 姚雪彪, 王峰松, 花沙沙, 欣 蔡, 凱 袁, 建 都, 金長江 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)