專利名稱：一種改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部位及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以六味地黃丸的中藥復(fù)方 為基礎(chǔ)的復(fù)合中藥有效部位及其制備方法，該有效部位可應(yīng)用于制備 治療亞健康人群紅細(xì)胞形態(tài)改變的藥物或保健品。
背景技術(shù)：
六味地黃丸自錢乙創(chuàng)制以來，歷代醫(yī)家十分推崇此方，廣泛應(yīng)用
于臨床。此方收載于《中華人民共和國藥典》2005年版，其組成為 熟地黃160g、山茱萸(炙)80g、牡丹皮60g、山藥80g、茯苓60g、 澤瀉60g六味中藥。本方功效為滋陰補(bǔ)腎，用于腎陰虧損，頭暈耳鳴， 腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴。此方配伍的特點(diǎn)是三補(bǔ)三 瀉。熟地黃、山茱萸、山藥為三味補(bǔ)藥，牡丹皮、茯苓、澤瀉為三味 瀉藥。其中，熟地黃是君藥，滋補(bǔ)腎陰為主；輔以山茱萸養(yǎng)肝腎，山 藥補(bǔ)益脾胃，二者同為臣藥；又配以茯苓淡滲脾濕以助山藥之益脾； 澤瀉清泄腎火，并放熟地黃之滋膩；牡丹皮清泄肝腎虛火，并制山茱 萸之溫?zé)?。本方配伍用藥?yán)謹(jǐn)，是為通補(bǔ)開合之代表方藥。
六味地黃丸的中藥復(fù)方為傳統(tǒng)配方，現(xiàn)己有多種劑型用于臨床， 如濃縮丸[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[Z].北京化 學(xué)工業(yè)出版社，2005: 402)、(國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生 部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑，第11冊)[S]， 1996)]、顆粒劑[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[Z].北京化學(xué)工業(yè)出版社，
2005: 402)]、軟膠囊[國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品 標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑，第13冊)[S]， 1998) ]、 口服液[張立慶，張 春風(fēng).影響六味地黃丸口服液澄明度因素初探.[J]中草藥，1999， 30 (12): 912]。雖然，近年來對六味地黃丸的制劑、質(zhì)量控制方面的 研究有了很多進(jìn)展，但是對此方的其它方面如化學(xué)成分、藥效學(xué)等的 研究還不夠深入，比如該方的多種藥理作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)、活性成 分或活性部位仍不清楚。再則，有關(guān)六味地黃丸的藥效學(xué)研究主要集 中在增強(qiáng)免疫功能、抗衰老、抗腫瘤及抗化療藥物毒副作用、降血糖、 調(diào)解血脂、降血壓等方面[周京燕、韓立新.六味地黃丸的現(xiàn)代研究與 進(jìn)展[J].中國藥師，2008， 11 (6): 710]，而其對紅細(xì)胞變形性的影響 及其活性部位的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部 位及其制備方法，其以六味地黃丸的中藥復(fù)方為基礎(chǔ)、采用醇提取法 從熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉中提取得到的有效部 位，該有效部位經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)證明可改善紅細(xì)胞變形性，將該有效部 位用于改善紅細(xì)胞變形性的藥物或保健品的應(yīng)用。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部位的制備方法，其具體
步驟如下(1) 取復(fù)方中藥粉碎混合，放入超聲提取罐中，用75% 95% 的乙醇浸泡30min解吸，料液比1: 1.5 2.0倍。將6 12倍體積60 IO(TC蒸餾水加入超聲波提取罐中，超聲提取二次，每次2min，過濾， 超聲功率為100 5400W。合并提取液，減壓回收乙醇，提取液備用； 所述復(fù)方中藥中按重量比計(jì)各組分為熟地黃8 32、山茱萸4 16、 牡丹皮3 12、山藥4 16、茯苓3 12、澤瀉3 16。
(2) 取備用提取液，用乙酸乙酯溶液進(jìn)行多級逆流萃取，合并 萃取液，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥后得到有效部位。所述乙酸乙酯溶 液是指經(jīng)過和水兩相平衡后的溶液。
所述的制備方法，乙醇濃度優(yōu)選為85%，提取時(shí)的料液比優(yōu)選為 為1: 2。
所述的制備方法，萃取時(shí)的萃取條件優(yōu)選為相比=1: 1，萃取時(shí)間 5min，萃取pH值3，萃取溫度為室溫。
所述萃取步驟如下①取6個分液漏斗，分別編號l、 2、 3、 4、 5、 6;向l號分液漏斗中加入所得的提取液和乙酸乙酯溶液，搖勻， 萃取5min后分相。萃取相為一級逆流萃取液，萃余相移至2號分液 漏斗中。②向2號分液漏斗中加入新的乙酸乙酯溶液，萃取5min后 分相。萃取相移至4號分液漏斗中，萃余相移至3號分液漏斗中。③ 再向3號分液漏斗中加入新的乙酸乙酯溶液和4號分液漏斗中加入新 提取液。3號分液漏斗中分相后的萃取液移至5號分液漏斗中，萃余 相為三級逆流萃取的萃余液。4號分液漏斗中分相后的萃取液為二級 逆流萃取液，萃余相移至5號分液漏斗中。④5號分液漏斗中萃取相后的萃取相移至6號分液漏斗中，萃余相為二級逆流萃余液。再向 6號分液漏斗中加入新的提取液進(jìn)行萃取，5min分相后萃取相為三級 逆流萃取液，萃余相為一級逆流萃余液。合并上述各級萃取液，用無 水硫酸鈉干燥脫水，回收乙酸乙酯后得到有效部位。
本發(fā)明所提供的有效部位的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)①實(shí)驗(yàn)動物為健康 Wistar系雄性大鼠，21月齡，體重480 620g， 6月齡，體重220 280g。②紅細(xì)胞變形性實(shí)驗(yàn)受試藥(六味地黃丸有效部位)溶于 5%吐溫80中。各組大鼠經(jīng)口給予不同濃度的受試溶液，每天1次， 給藥7天，每組10只大鼠。對照組經(jīng)口給予5%吐溫80。末次給藥 lh后，戊巴比妥麻醉，頸動脈取血，抗凝處理后離心，用pH值7.35 的PBS緩沖液洗滌3次，收集紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞變形性。在DXC-400 核孔濾膜紅細(xì)胞變形能力測定儀上測定紅細(xì)胞變形能力。結(jié)果，六味 地黃丸有效部位可增強(qiáng)大鼠紅細(xì)胞變形活性。
本發(fā)明工藝簡單，成本低，易于獲得有效部位，適用于工業(yè)化生 產(chǎn)，可用于制備成治療亞健康人群紅細(xì)胞形態(tài)改變的藥物和保健品。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例
1、 有效部位的制備
取熟地黃320g、山茱萸160g、牡丹皮120g、山藥160g、茯苓 120g、澤瀉120g，共lkg組成復(fù)方藥材，粉碎(40目)，放入超聲提 取罐中，用85。/。的乙醇浸泡30min解吸，料液比1: 2。加入6倍體積8(TC蒸餾水，超聲提取二次，每次2min，過濾，超聲功率為100W。 合并兩次提取液，減壓回收乙醇，濃縮至500ml，調(diào)節(jié)pH值至3。 將濃縮液用萃取劑已預(yù)處理的乙酸乙酯進(jìn)行多級逆流萃取，操作過程 如下①取6個500ml分液漏斗，分別編號l、 2、 3、 4、 5、 6;② 向1號分液漏斗中加入250ml濃縮液和萃取劑乙酸乙酯，搖勻，萃取 5min后分相。收集乙酸乙酯層，水層移至2號分液漏斗中。③向2 號分液漏斗中加入新的乙酸乙酯，萃取5min后分相。乙酸乙酯相移 至4號分液漏斗中，水層移至3號分液漏斗中。@再向3號分液漏斗 中加入新的乙酸乙酯和4號分液漏斗中加入新濃縮液250ml，萃取 5min后分相。3號分液漏斗中乙酸乙酯層移至5號分液漏斗中，水層 為三級逆流萃取的萃余液，待檢。4號分液漏斗中乙酸乙酯層收集， 水層移至5號分液漏斗中。⑤5號分液漏斗中萃取5min分相后，收 集乙酸乙酯層，水層移至6號分液漏斗中。再向6號分液漏斗中加入 新的萃取液進(jìn)行萃取，5min分相后，收集乙酸乙酯層，水層為三級 逆流萃余液，待檢。
合并上述收集的乙酸乙酯層，用無水硫酸鈉脫水干燥，回收乙 酸乙酯，得六味地黃丸有效部位1.15g。水層濃縮、烘干，得水層提 取物148g。
2、有效部位的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
2. 1、材料與方法
2. 1. 1實(shí)驗(yàn)動物健康Wistar系雄性大鼠，21月齡，體重480 620g，隨機(jī)分為5組，每組10只；6月齡組大鼠10只，體重220 280g，均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
2.1.2實(shí)驗(yàn)藥物六味地黃丸的有效部位，經(jīng)由上述實(shí)例1制 得。臨用時(shí)按動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表配成適當(dāng)?shù)臐?度，溶于5%吐溫80中。水層提取物，同上。
2. 1. 3實(shí)驗(yàn)方法
2. 1. 3. 1給藥方法大鼠按體重灌胃給藥，六味地黃丸有效部位 高、低劑量組分別給予藥物1.92mg/kg、 0.48mg/kg (分別相當(dāng)于成人 臨床丸劑日用量的2.0、 0.5倍)，水層提取物組給予藥物123.3mg/kg (與成人臨床丸劑日用量相當(dāng))，對照組分別給予等量的生理鹽水和 5%吐溫80溶液，每天1次。第8天在給藥后lh后，用戊巴比妥麻 醉，頸動脈取血，肝素20IU/ml抗凝，離心，進(jìn)行紅細(xì)胞制備。
2. 1. 3. 2紅細(xì)胞懸浮液的配制取抗凝血1.5ml， 3000r/min離心 10min,吸出血槳和白細(xì)胞，用pH 7.35的PBS緩沖液洗滌3次，均 離心去除上層液體。以上述緩沖液制備10%紅細(xì)胞懸濁液。
2. 1. 3. 3紅細(xì)胞變形能力測定用DXC-400核孔濾膜紅細(xì)胞變 形能力測定儀(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)測定紅細(xì)胞變形能力。
2. 1. 3. 4濾過時(shí)間的測定紅細(xì)胞懸浮液在37t孵育條件下，取 lml紅細(xì)胞懸浮液和PBS緩沖液分別置入紅細(xì)胞變性能力測定儀中，
測定濾過膜的時(shí)間tB， ts。
2. 1. 3. 5計(jì)算紅細(xì)胞濾過指數(shù)紅細(xì)胞濾過指數(shù)(IF)定義為， IF=^XJ_，紅細(xì)胞變形性越差，通過濾孔越困難，其懸浮液濾過
時(shí)間tB越長，故濾過指數(shù)IF越大，表示紅細(xì)胞變形能力越差。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
21月齡鹽水組大鼠紅細(xì)胞變性指數(shù)明顯高于6月齡鹽水組大 鼠，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者具有顯著差異(戶O.Ol)。六味地黃丸有效 部位高、低劑量組紅細(xì)胞變性指數(shù)與21月齡鹽水組大鼠比較具有顯 著性差異(戶<0.01)。水層提取物組和21月齡吐溫組紅細(xì)胞變形指數(shù) 與21月齡鹽水組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。
表l六味地黃丸有效部位對大鼠紅細(xì)胞變性指數(shù)的影響
組別劑量(mg/kg)動物(只)紅細(xì)胞變形指數(shù)(x士s)
6月齡鹽水組100.139±0.027
21月齡鹽水組100.194±0.033AA
21月齡吐溫80組100,189士0.045
21月齡有效部位(高劑量)組1.92100.112士0.016"
21月齡有效部位(低劑量)組0.48100.140士0.036"
21月齡水層提取物組123.30100.191±0.037
注與21月齡鹽水組比較，*尸<0.05， **尸<0.01;與6月齡鹽水組比較， <0.05， ,<0,01;
4、結(jié)論
21月齡大鼠與6月齡大鼠比較紅細(xì)胞變形能力顯著下降。六味 地黃丸有效部位高低劑量組對21月齡大鼠能夠顯著提高紅細(xì)胞的變 形能力。
10
權(quán)利要求
1、一種改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部位的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)取復(fù)方中藥粉碎混合，放入超聲提取罐中，用75％～95％的乙醇浸泡30min解吸，料液比1∶1.5～2.0倍；將6～12倍體積60～100℃蒸餾水加入超聲波提取罐中，超聲提取二次，每次2min，過濾，超聲功率為100～5400W；合并提取液，減壓回收乙醇，提取液備用；所述復(fù)方中藥中按重量比計(jì)各組分為熟地黃8～32、山茱萸4～16、牡丹皮3～12、山藥4～16、茯苓3～12、澤瀉3～16；(2)取備用提取液，用乙酸乙酯溶液進(jìn)行多級逆流萃取，合并萃取液，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥后得到有效部位；所述乙酸乙酯溶液是指經(jīng)過和水兩相平衡后的溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部 位的制備方法，其特征在于乙醇濃度優(yōu)選為85%，提取時(shí)的料液比 優(yōu)選為為l: 2。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部位的制備方法，其特征在于萃取時(shí)的萃取條件優(yōu)選為相比=1: 1,萃取時(shí)間5min，萃取pH值3，萃取溫度為室溫。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部 位的制備方法，其特征在于所述萃取步驟如下①取6個分液漏斗， 分別編號1、 2、 3、 4、 5、 6;向1號分液漏斗中加入所得的提取液 和乙酸乙酯溶液，搖勻，萃取5min后分相。萃取相為一級逆流萃取液，萃余相移至2號分液漏斗中。②向2號分液漏斗中加入新的乙酸 乙酯溶液，萃取5min后分相。萃取相移至4號分液漏斗中，萃余相 移至3號分液漏斗中。③再向3號分液漏斗中加入新的乙酸乙酯溶液 和4號分液漏斗中加入新提取液。3號分液漏斗中分相后的萃取液移 至5號分液漏斗中，萃余相為三級逆流萃取的萃余液。4號分液漏斗 中分相后的萃取液為二級逆流萃取液，萃余相移至5號分液漏斗中。 ④5號分液漏斗中萃取分相后的萃取相移至6號分液漏斗中，萃余相 為二級逆流萃余液。再向6號分液漏斗中加入新的提取液進(jìn)行萃取， 5min分相后萃取相為三級逆流萃取液，萃余相為一級逆流萃余液。 合并上述各級萃取液，用無水硫酸鈉干燥脫水，回收乙酸乙酯后得到 有效部位。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部 位的制備方法制備得到的有效部位，其特征在于將該有效部位用于 改善紅細(xì)胞變形性的藥物或保健品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改善紅細(xì)胞變形性的復(fù)方中藥有效部位及其制備方法，其以六味地黃丸的中藥復(fù)方為基礎(chǔ)，采用醇提取法從熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉中提取得到的有效部位，該有效部位經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)證明可改善紅細(xì)胞變形性。將該有效部位用于改善紅細(xì)胞變形性的藥物或保健品的應(yīng)用。本發(fā)明工藝簡單，成本低，易于獲得有效部位，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，可用于制備成治療亞健康人群紅細(xì)胞形態(tài)改變的藥物和保健品。
文檔編號A61P7/00GK101507786SQ20091012977
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者張永春, 董志超, 金宏波 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所