專(zhuān)利名稱(chēng)：紫杉醇在制備防治特發(fā)性肺纖維化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫杉醇在制備防治特發(fā)性肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis簡(jiǎn)稱(chēng)IPF)是慢性間質(zhì)性肺病原因不明類(lèi)中的一種，也是以普通型間質(zhì)性肺炎為特征性病理改變的慢性炎癥性肺疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。2000年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)、歐洲呼吸病學(xué)會(huì)共同發(fā)表了國(guó)際共同聲明對(duì)IPF作了明確界定，認(rèn)為IPF是一個(gè)獨(dú)立的疾病，它的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)即是尋常性間質(zhì)性肺炎(UIP)有別于其它特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，如脫屑型間質(zhì)性肺炎(DIP)、急性間質(zhì)性肺炎(AIP)、非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)等。根據(jù)現(xiàn)有的資料，可以將IPF的發(fā)病機(jī)制歸納為肺泡炎，肺實(shí)質(zhì)損傷，過(guò)度的修復(fù)和纖維化幾個(gè)階段。IPF的流行病學(xué)資料尚不完整，但其發(fā)病率日益增高，已成為常見(jiàn)病，確診后平均存活3～5年。到目前為止，對(duì)于肺纖維化的治療糖皮質(zhì)激素仍為首選，但它僅對(duì)20％的IPF患者有效，并且常常為一過(guò)性反應(yīng)。免疫抑制劑不僅存在潛在的嚴(yán)重副作用，而且對(duì)IPF治療基本無(wú)效。因此，尋找治療IPF的其它有效方法是當(dāng)務(wù)之急。
我國(guó)歷代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中對(duì)紅豆杉(或名扁柏、紫柏)多有記載，如《本草綱目》、《本草推陳》等。1971年美國(guó)科學(xué)家首先從紅豆杉中分離出紫杉醇后，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始了紅豆杉活性成分的深入研究的熱潮。紅豆杉具有幾十種生物活性物質(zhì)，其中紫杉醇、紫杉酚、巴卡亭III等成份具有抗癌作用，迄今為止，從紅豆杉屬植物中已分離鑒定出紫杉烷二萜類(lèi)化合物等約300余種。紫杉醇是一種衍生的二萜類(lèi)化合物，能特異性的與細(xì)胞中微管和微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微蛋白裝配成微管，而又抑制微管蛋白的解聚，使大量微管非正常的聚合，從而改變細(xì)胞骨架的平衡狀態(tài)，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的畸形，導(dǎo)致其失去正常的功能，造成細(xì)胞發(fā)育停止于G0/G1期和G1/M期，細(xì)胞的有絲分裂阻止于絲狀分裂期，從而抑制血管平滑肌的分裂、增殖，減少再狹窄的發(fā)生。近年來(lái)，研究表明紫杉醇藥物洗脫支架可以明顯降低以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)及支架置入為基礎(chǔ)的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后冠脈再狹窄率，以紫杉醇為代表的抗增殖藥物已經(jīng)成為預(yù)防支架內(nèi)再狹窄研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以紅豆杉中的二萜類(lèi)物質(zhì)紫杉醇脂質(zhì)體為個(gè)例，對(duì)紫杉醇脂質(zhì)體高、中、低三個(gè)劑量作了藥效對(duì)比研究，明確了紫杉醇脂質(zhì)體抑制大鼠特發(fā)性肺纖維化的作用及給藥的最佳劑量。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 紫杉醇在制備防治特發(fā)性肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。
具體的，所述紫杉醇用于制備減輕博萊霉素A5導(dǎo)致的特發(fā)性肺纖維化早期肺泡炎癥細(xì)胞滲出的藥物，或用于制備改善肺組織ECM過(guò)度沉積狀態(tài)的藥物，或者用于制備抑制ERK1信號(hào)通路激活的藥物。
目前，針對(duì)特發(fā)性肺纖維化機(jī)制的研究大多集中在對(duì)效應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子及其相關(guān)基因調(diào)控的研究，其前提是學(xué)術(shù)界對(duì)肺纖維化的形成過(guò)程是涉及到細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等因素的復(fù)雜過(guò)程已經(jīng)具有共識(shí)。肺纖維化形成過(guò)程涉及到的眾多細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜，本發(fā)明從紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)參與肺纖維化形成過(guò)程中的代表性細(xì)胞因子及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響入手，首先建立博萊霉素A5誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，通過(guò)對(duì)給予紫杉醇脂質(zhì)體后的大鼠血清LN含量、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinasel，ERK1)信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化與分布情況的測(cè)定以及大鼠肺臟病理組織學(xué)檢查，觀察大鼠出現(xiàn)肺泡炎、肺實(shí)質(zhì)的損傷、肺組織的修復(fù)與增生等病變的嚴(yán)重程度，并通過(guò)與空白組、模型組和強(qiáng)的松組比較來(lái)研究紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)大鼠特發(fā)性肺纖維化的防治作用，探討紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)肺纖維化轉(zhuǎn)規(guī)機(jī)制的影響，表明紫杉醇脂質(zhì)體可通過(guò)調(diào)節(jié)LN的釋放以及抑制ERK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)抑制肺組織彈性纖維鈣化，從而為進(jìn)一步尋找治療特發(fā)性肺纖維化的有效途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
國(guó)內(nèi)外從上世紀(jì)90年代初開(kāi)始進(jìn)行紫杉醇脂質(zhì)體研究，已取得具有應(yīng)用價(jià)值的結(jié)果，主要表現(xiàn)為制成脂質(zhì)體后明顯降低了藥物的毒性，提高了機(jī)體耐受性，保持了紫杉醇的抗腫瘤活性，提高了治療效果。紫杉醇脂質(zhì)體的溶解性為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究提供了必要的條件。
120只SD大鼠隨機(jī)抽取90只采用氣管內(nèi)一次性注射博萊霉素A5的方法建立大鼠肺纖維化模型，造模后分為模型組、強(qiáng)的松組、紫杉醇組，剩余大鼠設(shè)為空白組，模型組每日尾靜脈注射生理鹽水、對(duì)照組隔日尾靜脈注射強(qiáng)的松龍、試驗(yàn)組尾靜脈注射紫杉醇脂質(zhì)體(d1、d21)，實(shí)驗(yàn)的第7、14、28天各組大鼠隨機(jī)處死10只，觀察各組大鼠肺部病理組織學(xué)改變，比較各組大鼠血清LN、肺組織ERK1信號(hào)傳導(dǎo)通路活化參數(shù)。
結(jié)論 (1)紫杉醇脂質(zhì)體可以減輕博萊霉素A5所致的大鼠特發(fā)性肺纖維化早期肺泡炎癥細(xì)胞的滲出，抑制肺泡炎癥反應(yīng)。
(2)紫杉醇脂質(zhì)體能通過(guò)調(diào)節(jié)特發(fā)性肺纖維化模型大鼠血清LN含量，改善肺組織ECM過(guò)度沉積狀態(tài)，從而防止纖維化的形成。
(3)紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生過(guò)程中ERK1信號(hào)通路有一定的阻斷作用，對(duì)該信號(hào)通路的激活起到了一定的抑制作用。
(4)紫杉醇脂質(zhì)體通過(guò)以上幾種途徑干預(yù)大鼠肺纖維化進(jìn)程，從而達(dá)到抑制大鼠特發(fā)性肺纖維化的作用。
本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在明確了紫杉醇脂質(zhì)體抑制大鼠特發(fā)性肺纖維化的作用機(jī)制，并確定了藥物的最佳劑量，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。


圖1為模型組第7天病理切片(HE×20)； 圖2為紫杉醇組第7天病理切片(HE×20)； 圖3為空白組第7天病理切片(DAB×400)； 圖4為模型組第7天病理切片(DAB×400)； 圖5為紫杉醇組第7天病理切片(DAB×400)； 圖6為模型組第14天病理切片(DAB×400)； 圖7為紫杉醇組第14天病理切片(DAB×400)； 圖8為模型組第28天病理切片(DAB×400)； 圖9為紫杉醇組第28天病理切片(DAB×400)。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性3～4周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200g)SPF級(jí)浙江中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
實(shí)驗(yàn)藥品 博萊霉素A5(博萊霉素A5)天津太河制藥有限公司批號(hào)060201注射用紫杉醇脂質(zhì)體南京思科藥業(yè)有限公司批號(hào)051104 主要試劑 ELLISA試劑盒(大鼠Laminin) 丹麥DAKO公司 免疫組化檢測(cè)試劑盒EnVisionTM丹麥DAKO公司 EKR1單克隆抗體 美國(guó)Santacruz公司 DAB顯色液 丹麥DAKO公司 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 石蠟切片機(jī) 德國(guó)MICROW公司 顯微鏡攝像機(jī)日本OLYMPUS公司 BMJ-III型包埋機(jī)及冷凍臺(tái) 中國(guó)常州中威電子儀器有限公司 GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 APESSIGMA公司 電熱恒溫水溫箱 上海醫(yī)療器械七廠(chǎng) 超凈工作臺(tái) 美國(guó)Thermo Life Sciences公司 萊卡圖像分析系統(tǒng)德國(guó)Leica公司 溶液配制 博萊霉素A5溶液博萊霉素A58mg，0.9％氯化鈉注射液4mL注射用紫杉醇脂質(zhì)體溶液紫杉醇脂質(zhì)體30mg，5％葡萄糖注射液30mL強(qiáng)的松溶液強(qiáng)的松注射液10mg/2mL，0.9％氯化鈉注射液8mL 1.動(dòng)物模型建立 ①麻醉按40mg/kg計(jì)算，用1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉。
②頸前皮膚75％酒精消毒，沿頸前正中切開(kāi)約2cm大小的切口，逐層鈍性分離暴露氣管，然后用1mL注射器抽取博萊霉素A5溶液，沿氣管軟骨之間斜向下刺入迅速注射博萊霉素A5溶液(按5mg/kg體重)，立即將大鼠直立，緩慢搖動(dòng)數(shù)十秒鐘，立即消毒，縫合。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 120只SD大鼠隨機(jī)抽取90只進(jìn)行模型建立，造模后隨機(jī)分為3組模型組、強(qiáng)的松組、紫杉醇組，每組30只，余30只未造模SD大鼠設(shè)為空白組。分別稱(chēng)重。
3.給藥方法 第一組(空白組)正常飼養(yǎng)； 第二組(模型組)24h后每天尾靜脈注射生理鹽水(4mL/kg體重)； 第三組(強(qiáng)的松組)24h后隔天尾靜脈射強(qiáng)的松溶液(20mg/kg體重)； 第四組(紫杉醇組)24h后第1、21天尾靜脈注射紫杉醇溶液(2mg/kg體重)。
4.標(biāo)本采取 實(shí)驗(yàn)第7天、14天、第28天各組隨機(jī)抽取10只大鼠摘眼球取血，后行頸椎脫臼處死，分離出肺，取左肺和右肺下葉，左肺拍照后置于10％中性福爾馬林溶液中浸泡固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋切片，按常規(guī)行HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)分析。右肺下葉行免疫組化ERK1測(cè)定。
5.指標(biāo)測(cè)定方法 (1)大鼠肺組織病理組織學(xué)檢查 肺部形態(tài)學(xué)觀察肉眼觀察肺部病變情況，取左肺標(biāo)本進(jìn)行HE染色。在光鏡下(4×10)評(píng)估每張切片上肺泡炎和肺纖維化的面積，分成0、I、II、III級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)，肺組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)肺泡炎和肺纖維化累及肺組織；I級(jí)，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＜25％；II級(jí)，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織25％～50％；III級(jí)，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＞50％。
(2)血清層粘連蛋白(LN)含量將采集的全血標(biāo)本離心(500r/min×30)后分離血清，將試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋(1000，500，250，125，62.5，0ng/mL)備用。取出所需板條，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品、100μL待測(cè)血清于相應(yīng)孔中。37℃30min。洗板甩盡板內(nèi)液體，每孔加入350mL洗滌液，靜止30sec后甩盡液體，在厚疊吸水紙上拍干，反復(fù)洗滌5次。每孔加入Incubation Solution 75μL，37℃30min。洗板甩盡板內(nèi)液體，用每孔加入350mL洗滌液，靜止30sec后甩盡液體，在厚疊吸水紙上拍干，反復(fù)洗滌5次。每孔加入顯色液75μL，15±5min。每孔加入終止液50μL，混勻，即刻在450nm處讀數(shù)。各孔(包括零孔)OD值應(yīng)減去零孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得其含量。
(3)ERK1的表達(dá)與分布的測(cè)定右肺下葉組織標(biāo)本在中性緩沖福爾馬林液(pH＝7.4)固定8～12h后，自來(lái)水洗30min，70％乙醇30min，95％乙醇1h×2次，100％乙醇1h×2次，二甲苯透明20min×2次，浸蠟58～60℃3h，包埋組織，連續(xù)切片，厚4μm，撈至預(yù)先以APES處理的載玻片上，于60～62℃烘箱(隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9160)烤片6～8h，做免疫組織化學(xué)ERK1染色。二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇、95％、80％、70％乙醇脫水，蒸餾水洗，抗原修復(fù)采用高溫高壓修復(fù)(Tris/EDTA緩沖溶液，PH＝9.0)，蒸餾水洗，PBS洗5min×3次，3％H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min，PBS洗5min×3次，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。PBS沖洗，5min×3次，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40min。PBS沖洗，5min×3次，DAB顯色液顯色1～3min，顯微鏡下控制反應(yīng)，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核1min，95％、100％乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。
結(jié)果判定方法光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，以細(xì)胞漿或(和)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞平均百分率被認(rèn)為是陽(yáng)性細(xì)胞百分率。沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞賦值為0，＜30％為1，31％～70％為2，＞70％為3。染色程度標(biāo)注據(jù)每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色特征決定。細(xì)胞內(nèi)無(wú)著色賦值為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕色為3。最終結(jié)果由染色的總數(shù)和染色強(qiáng)度共同決定。總值0，為陰性(-)，1～2之間為弱陽(yáng)性(+)，3～4之間為陽(yáng)性(++)，5～6之間為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。2以下為低表達(dá)，＞3為高表達(dá)。
6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理 多組間比較及兩兩之間比較采用方差分析以及LSD-t檢驗(yàn)。病理及免疫組化半定量結(jié)果組間比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較Mann-Whitney U檢驗(yàn)，此時(shí)校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′為0.01，即P＜0.01認(rèn)為兩兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 7.1大鼠肺組織病理組織學(xué)檢查結(jié)果 7.1.1整體形態(tài)觀察空白組肺外觀無(wú)明顯異常，呈粉紅色，表面光滑；模型組兩肺呈暗紅色，部分肺葉呈灰白色，彈性明顯降低，可見(jiàn)散在的大小不等的點(diǎn)片狀灰白色斑塊，大部分動(dòng)物肺臟體積縮小，硬度增加；紫杉醇組和強(qiáng)的松組兩肺外觀病變明顯好于模型組，兩肺顏色略暗紅，大部分動(dòng)物肺臟彈性尚可，部分肺葉偶爾可見(jiàn)散在的點(diǎn)狀灰白色斑塊。
7.1.2光學(xué)顯微鏡觀察空白組肺組織正常，無(wú)炎性細(xì)胞，無(wú)間質(zhì)纖維組織增生(見(jiàn)圖3)。模型組大鼠的肺纖維化比較明顯，肺泡間隔增寬明顯，間質(zhì)中大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)積聚，出現(xiàn)大量膠原纖維和成纖維細(xì)胞，肺泡壁破壞，部分肺泡實(shí)變，肺泡腔內(nèi)有多少不等的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多呈II、III級(jí)纖維化和I級(jí)肺泡炎改變。第7d表現(xiàn)為肺泡炎(見(jiàn)圖1、圖4)，第14d肺泡炎加重，成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖，膠原纖維沉積，肺泡變形(見(jiàn)圖6)；第28d廣泛纖維化，玻璃樣變，細(xì)胞成分少，肺泡大部分消失(見(jiàn)圖8)。紫杉醇組和強(qiáng)的松組大鼠的肺纖維化程度均較模型組大鼠明顯減輕，大多只有輕度肺纖維化形成，肺泡間隔輕度增寬，部分有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多呈I級(jí)纖維化改變，肺泡炎不明顯(見(jiàn)圖2、圖5、圖7、圖9)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示模型組肺泡炎及肺纖維化程度顯著高于空白組(P＜0.01)，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功；紫杉醇組和強(qiáng)的松組肺泡炎程度分別與模型組比較第7d、14d差異有顯著意義(P＜0.01)，第28d比較無(wú)意義(P＞0.01)。紫杉醇組與強(qiáng)的松組肺纖維化程度分別與模型組比較第7d、14d差異無(wú)意義(P＞0.01)，第28天差異有意義(P＜0.01)。紫杉醇組與強(qiáng)的松組肺泡炎和肺纖維化程度比較第7d、14d、28天均無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1、表2、表3。
表1第7天各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(jí)結(jié)果的比較
與空白組比較*P＜0.01，與模型組比較★P＜0.01，▲P＞0.01，與強(qiáng)的松組比較△P＞0.01. 表2第14天各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(jí)結(jié)果的比較
與空白組比較*P＜0.01，與模型組比較★P＜0.01，▲P＞0.01，與強(qiáng)的松組比較△P＞0.01 表3第28天各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(jí)結(jié)果的比較
與空白組比較*P＜0.01，與模型組比較★P＞0.01，▲P＜0.01，與強(qiáng)的松組比較△P＞0.01 7.2血清LN測(cè)定結(jié)果 第7、14、28天模型組與空白組血清LN比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，第7、14、28天紫杉醇組與模型組血清LN比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與強(qiáng)的松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表4。
表4各組大鼠血清LN含量(pg/mL)比較(x±s)
與空白組比較*P＜0.01，與模型組比較★P＜0.01，與強(qiáng)的松組比較△P＞0.05 7.3ERK1表達(dá)與分布測(cè)定結(jié)果 ERK1在模型組較為廣泛表達(dá)，主要表達(dá)在肺泡和或間質(zhì)內(nèi)的組織細(xì)胞(吞噬細(xì)胞)、纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞及血管的內(nèi)皮細(xì)胞和少量的平滑肌上，氣管上皮表達(dá)較少；在空白組主要表達(dá)在肺泡或和間質(zhì)內(nèi)的組織細(xì)胞(吞噬細(xì)胞)且表達(dá)強(qiáng)度也較弱。在陽(yáng)性組和試驗(yàn)組有減弱部分不表達(dá)，以陽(yáng)性組較明顯。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示模型組中ERK1表達(dá)與強(qiáng)的松組比較有顯著差異(P＜0.01)，模型組與紫杉醇組比較有顯著差異(P＜0.01)，強(qiáng)的松組與紫杉醇組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表5。
表5大鼠肺組織ERK1表達(dá)
實(shí)施例2紅豆杉中的二萜類(lèi)物質(zhì)的提取 1、紅豆杉中的二萜類(lèi)物質(zhì)的粗提 南方紅豆杉枝葉→60℃12～24hr烘干(至原料水分低于18％)→原料粉碎60目以下→采用95∶5(v∶v)的甲醇和水混合物，按溶劑和原料10∶1(v∶v)的比例在常溫條件下萃取48hr→過(guò)濾，取上清液，減壓濃縮得到固體→按溶劑(氯仿∶水＝3∶1，v∶v)和濃縮固體物20∶1(v∶v)進(jìn)行分相→取有機(jī)相，50℃真空干燥，得到紅豆杉中的二萜類(lèi)物質(zhì)的粗提物浸膏粉。
2、紫杉醇脂質(zhì)體的精制 粗提物浸膏粉→按石油醚和水50∶1(v∶m，mL/g)的比例萃取→真空干燥，得到浸膏粉→乙酸乙酯(按溶劑∶原料(v∶m，mL/g)＝90∶1)溶解，過(guò)濾→乙酸乙酯溶液→用100倍(溶液體積原料浸膏重量)1M氫氧化鈉溶液和去離子水分別淋洗2次→有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉脫水干燥，減壓濃縮→拌入硅藻土，陰干→上樣，進(jìn)行正相層析(硅膠用量為原料浸膏50倍重量)，洗脫劑為3BV(3倍柱體積)的體積比65∶35的正己烷、丙酮混合液→目標(biāo)產(chǎn)物餾分減壓干燥，在甲醇-水體系中結(jié)晶→結(jié)晶物以結(jié)晶∶氯仿1∶33(g/mL)的比例溶解，加入少量溴，常溫反應(yīng)5min(溴采用10％的亞硫酸鈉中和)，再用去離子水淋洗2次，無(wú)水硫酸鈉脫水后減壓干燥，得樣品→按樣品和硅膠1∶30質(zhì)量比干法裝柱，3BV(3倍柱體積)的體積比60∶40正己烷、乙酸乙酯混合液洗脫→目標(biāo)產(chǎn)物餾分減壓干燥，在甲醇-水體系中再次結(jié)晶，得紫杉醇脂質(zhì)體純品，產(chǎn)品純度99％，收率70％。
權(quán)利要求
1.紫杉醇在制備防治特發(fā)性肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫杉醇用于制備減輕博萊霉素A5導(dǎo)致的特發(fā)性肺纖維化早期肺泡炎癥細(xì)胞滲出的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫杉醇用于制備改善肺組織ECM過(guò)度沉積狀態(tài)的藥物。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫杉醇用于制備抑制ERK1信號(hào)通路激活的藥物。
5.如權(quán)利要求1～4之一所述的應(yīng)用，其特征在于以紫杉醇脂質(zhì)體制備所述的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了紫杉醇在制備防治特發(fā)性肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。具體的，所述紫杉醇用于制備減輕博萊霉素A5導(dǎo)致的特發(fā)性肺纖維化早期肺泡炎癥細(xì)胞滲出的藥物，或用于制備改善肺組織ECM過(guò)度沉積狀態(tài)的藥物，或者用于制備抑制ERK1信號(hào)通路激活的藥物。本發(fā)明明確了紫杉醇脂質(zhì)體抑制大鼠特發(fā)性肺纖維化的作用機(jī)制，并確定了藥物的最佳劑量，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K31/337GK101491515SQ20091009655
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者孔繁智, 朱婉萍, 樊錦秀, 王紅崗 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院