專利名稱：一種戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法，特別涉及一種戊型肝炎長爪沙鼠 感染模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
目前為止，在戊型肝炎的研究中，還缺少成功培養(yǎng)戊型肝炎病毒(HEV)的細(xì)胞系， HEV研究主要還是依賴試驗(yàn)動物。靈長類動物如獼猴、黑猩猩等模型的應(yīng)用，使HEV研究在 病毒復(fù)制位點(diǎn)、排毒和病毒血癥持續(xù)時間、抗體消長規(guī)律、基因型、亞型致病性差異和越種 傳播機(jī)機(jī)制等方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。然而，靈長類動物存在價格昂貴、來源有限、實(shí) 驗(yàn)條件要求高、難以大批量使用等缺點(diǎn)。長期以來，各國科學(xué)家都嘗試建立一種嚙齒動物感 染模型，但一直未獲得成功。目前使用的非人靈長類動物感染模型價格昂貴、來源有限、實(shí)驗(yàn)要求條件高、繁殖 周期長、試驗(yàn)操作復(fù)雜、飼養(yǎng)不方便，使其應(yīng)用受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法，是用戊型肝炎病毒攻毒長爪沙 鼠，得到感染戊型肝炎的模型。所述攻毒方法為口服。所述攻毒的劑量為IO5-IO8病毒拷貝(基因組劑量，Genomic doses)，以IO6病毒 拷貝為最佳感染劑量。所述攻毒用病毒為基因4型戊型肝炎病毒。本發(fā)明用基因4型HEV毒株建立長爪沙鼠試驗(yàn)感染模型，并從比較病理學(xué)的角度， 證實(shí)HEV感染沙鼠組織病理學(xué)病變與人、豬感染HEV相似，建立HEV感染的長爪沙鼠模型。 長爪沙鼠感染模型具有試驗(yàn)操作簡便易行，飼養(yǎng)管理方便。尤其是價格低廉，1只長爪沙鼠 僅僅是一只靈長類動物費(fèi)用的千分之一至四百分之一。因此，用長爪沙鼠作為HEV感染模 型，所取得的研究結(jié)果將更加系統(tǒng)、全面、可靠，更具有說服力。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的方法構(gòu)建戊型肝炎感染模型，感染后1周可出現(xiàn)病毒血癥， 血液、糞便中HEV可持續(xù)4周左右；肝臟中持續(xù)7周以上；小腸中也能檢測到HEV RNA。HEV 免疫組織化學(xué)檢測可發(fā)現(xiàn)感染組沙鼠的肝組織中成片的肝細(xì)胞呈HEV免疫組化陽性反應(yīng)， 小腸、腎臟、腎上腺、睪丸等組織中也可見有明顯的陽性信號。臨床觀察試驗(yàn)鼠未見明顯異 常表現(xiàn)，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟有淤血，肝細(xì)胞普遍見有程度不同的變性，肝小葉匯管區(qū) 或肝細(xì)胞間淋巴細(xì)胞局灶狀浸潤等病變。腸道、腎臟、心肌、睪丸等組織也見有明顯的組織 病理學(xué)變化。本發(fā)明的方法價格低廉，使用飼養(yǎng)、試驗(yàn)操作方便的長爪沙鼠感染模型，避免了目 前使用的非人靈長類動物價格昂貴、來源有限、實(shí)驗(yàn)要求條件高、繁殖周期長等不足。為HEV致病機(jī)理、疫苗研制、越種傳播機(jī)制等研究提供了一種理想的感染模型。


圖1為HEV感染長爪沙鼠的糞便、血清樣品中HEV RT-PCR檢測電泳結(jié)果圖2為HEV攻毒沙鼠的組織病理學(xué)及肝臟、腸道中HEV抗原免疫組化定位結(jié)果的 照片
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說 明，均為常規(guī)方法。下述百分含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、戊型肝炎感染模型的構(gòu)建及其效果驗(yàn)證1、戊型肝炎感染模型的構(gòu)建(1)試驗(yàn)長爪沙鼠(購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部)選用SPF級或清潔級， 50-80g長爪沙鼠。經(jīng)抗體檢測后，選擇HEV IgG陰性鼠，選出28只平均分為兩組，每組14 只，隔離系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)。(2)攻毒選擇HEV基因4型病毒(其基因組的序列為GENBANK中編號為FJ409465 所示的序列)拷貝數(shù)在IO5以上的豬肝臟病料，制備肝臟懸液，每只長爪沙鼠經(jīng)口腔灌服 IO5-IO8個病毒拷貝(基因組劑量)，以IO6個病毒拷貝為最佳感染劑量，本實(shí)施例中，每毫升 懸液中HEV含量為IO6個拷貝時，灌服1毫升上述肝臟懸液。對照組灌服1毫升生理鹽水。2、戊型肝炎感染模型的構(gòu)建效果驗(yàn)證(1)樣品收集將步驟1攻毒后戊型肝炎長爪沙鼠感染模型和對照組沙鼠糞便樣 品每天收集一次；血液樣品每周采集一次，眼眶采血，分離血清；糞便和血清于-70°C保存 備用。每周各組處死2只沙鼠，剖檢、觀察各器官、組織的病變情況，采集二份心、肝、脾、肺、 腎、淋巴結(jié)、小腸樣品，一份-70°C凍存用于HEV RNA檢測；另一份用2. 5%戊二醛-多聚甲 醛混合固定液固定用于組織病理學(xué)觀察和免疫組化定位。(2)感染確認(rèn)及組織器官中HEV分布為了確認(rèn)感染、測定病毒血癥的持續(xù)時間， 并了解HEV在各組織器官中的分布情況，采用HEV特異引物(見HEV巢氏PCR特異引物序 列表)，逆轉(zhuǎn)錄巢氏PCR方法對試驗(yàn)組的血清、糞便、肝、脾、腎、大腸、小腸進(jìn)行HEV RNA的 RT-PCR檢測。對照組沙鼠僅對肝臟進(jìn)行檢測。用常規(guī)的Trizol法提取待檢樣品中的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板進(jìn)行巢式PCR檢測。設(shè)立陰性、陽性對照(陽性對照以HEV 陽性材料的cDNA為模板，陰性對照為缺少模板的反應(yīng)體系)以防止擴(kuò)增失敗帶來假陰性及 污染所致的假陽性。HEV巢氏PCR特異引物序列表第一輪PCR引物(模板為由待檢樣品cDNA)HE164F1 :5，-GCR GTG GTT TCT GGG GTG AC-3HE164R1 :5’ -CTG GGM YTG GTC DCG CCA AG-3第二輪PCR引物(模板為第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物)HE137F2 :5’ -GYT GAT TCT CAG CCC TTC GC-3
，(R = A 或 G) ，(Y = C 或 T)
，(Y = C 或 T)
HE137R25，-GMY TGG TCD CGC CAA GHG GA-3，(] =八或(；!1 =八或(或11;0 = A或G或T)逆轉(zhuǎn)錄巢氏PCR擴(kuò)增程序?yàn)棰倌孓D(zhuǎn)錄程序:42°C30min,99°C 5min,4°C 5min。②第一輪PCR -MV 2min ； [94°C 30s ；58°C 30S ；72°C 30 ；30cycles] ；72°C 7min。③第二輪PCR 同第一輪。如果第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物大小為137bp，則結(jié)果為檢測到病毒，即為陽性結(jié)果。(3)組織病理學(xué)觀察制作石蠟切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察。切片制作按常規(guī)方法進(jìn)行(上海科學(xué)技術(shù)出版社1978年出版的《病理檢驗(yàn)技術(shù)》)。(4) HEV免疫組化定位1.常規(guī)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，然后用PBS (0. 2M，pH7. 2)沖洗3次，5min/ 次；然后將切片放入3% H2O2室溫孵育lOmin，用蒸餾水沖洗后，然后用PBS (0. 2M，pH7. 2) 沖洗3次，5min/次。然后將切片用正常小牛血清白蛋白工作液封閉，室溫孵育15min，傾去 血清，加兔抗人HEV抗體(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育1. 5h，PBS(0. 2M, ρΗ7· 2)沖洗，5min/次，3次；滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37 °C孵育30min, PBS (0. 2M， pH7. 2)沖洗5min/次，3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(購自北京博奧 森生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育30min, PBS (0. 2M，ρΗ7· 2)沖洗5min/次，3次，DAB顯色 5-10min ；蒸餾水終止，用蘇木素襯染2min，脫水，封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果如下所述(I)RT-PCR 檢測戊型肝炎長爪沙鼠感染模型糞便中從第二周開始可以檢測到病毒，排毒時間持續(xù) 到第6周。感染后第4天血液中即可檢測到病毒，病毒血癥時間持續(xù)3周。感染一至七周 的沙鼠肝臟中可穩(wěn)定地檢測到病毒，小腸中可檢測到3周。對照組肝臟檢測結(jié)果均呈陰性。 部分結(jié)果如圖1所示，1-13泳道為攻毒后沙鼠糞便樣品(1-10)和肝臟樣品(11-13)，均擴(kuò) 增得到137bp(箭頭所指條帶)；M =DNA marker DL2000 ；NC為陰性對照。(2)組織病理學(xué)變化戊型肝炎長爪沙鼠感染模型攻毒后7周的試驗(yàn)期間，臨床觀察試驗(yàn)鼠的采食、體 溫、增重等方面與對照鼠無明顯差異。定期進(jìn)行的剖檢觀察過程中，試驗(yàn)組肝臟多有色澤變 暗、體積稍腫大的變化，其它器官未觀察到明顯的眼觀病變。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組 沙鼠的肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，而感染沙鼠的肝臟可觀察到不同程度的病變。攻 毒后2周，以匯管區(qū)有輕度炎性細(xì)胞浸潤、膽管增生為主，肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞索排列紊亂， 部分中央靜脈有淤血；攻毒后4 7周，表現(xiàn)為多發(fā)性、局灶性淋巴細(xì)胞浸潤。后期肝細(xì)胞 有顆粒變性、空泡變性甚至壞死，枯否氏細(xì)胞增多。腎間質(zhì)明顯淤血并可見局灶性出血，腎 小管上皮變性，有的發(fā)生凝固性壞死，腎球囊擴(kuò)張，腎小管內(nèi)有蛋白管型，堵塞管腔；遠(yuǎn)曲小 管空泡變性，近曲小管細(xì)胞核固縮或溶解消失。小腸粘膜固有層水腫，炎性細(xì)胞浸潤，黏膜 上皮脫落，腸絨毛斷裂等病變。(3) HEV免疫組化定位用免疫組化檢測戊型肝炎長爪沙鼠感染模型各組織器官中病毒相關(guān)抗原結(jié)果，不 同時期感染的沙鼠肝臟和小腸中都有陽性物質(zhì)分布，呈強(qiáng)陽性。大腸、脾、腎、腎上腺、睪丸組織中也能檢測到陽性信號。在肝臟中，陽性物質(zhì)見于胞漿、胞核，但主要分布于肝細(xì)胞漿， 呈漿彌漫型分布?？捎^察到HEV抗原陽性的雙核肝細(xì)胞，陽性肝細(xì)胞常比正常肝細(xì)胞要大。 枯否氏細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)也可見陽性顆粒。部分結(jié)果如圖2所示，圖2中，A 戊 型肝炎長爪沙鼠感染模型肝組織中淋巴細(xì)胞團(tuán)塊狀浸潤，(蘇木素染色切片40倍顯微鏡下 觀察結(jié)果)；B 戊型肝炎長爪沙鼠感染模型肝小葉間血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，(蘇木素染色 切片20倍顯微鏡下觀察結(jié)果)；C 戊型肝炎長爪沙鼠感染模型肝組織中多數(shù)肝細(xì)胞核呈 HEV免疫組化陽性反應(yīng)，(免疫組化染色切片40倍顯微鏡下觀察結(jié)果)；D 戊型肝炎長爪沙 鼠感染模型小腸組織中也有明顯的HEV陽性反應(yīng)信號(免疫組化染色切片40倍顯微鏡下 觀察結(jié)果)。
權(quán)利要求
一種戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法，是用戊型肝炎病毒攻毒長爪沙鼠，得到感染戊型肝炎的模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述攻毒方法為口服。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述攻毒的劑量為IO5-IO8病毒拷貝。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述攻毒的劑量為IO6病毒拷貝
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述攻毒病毒為基因4型 戊型肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種戊型肝炎感染模型的構(gòu)建方法。該方法，是用戊型肝炎病毒攻毒長爪沙鼠，得到感染戊型肝炎的模型。所述攻毒方法為口服。本發(fā)明的方法價格低廉，使用飼養(yǎng)、試驗(yàn)操作方便的長爪沙鼠感染模型，避免了目前使用的非人靈長類動物價格昂貴、來源有限、實(shí)驗(yàn)要求條件高、繁殖周期長等不足。為HEV致病機(jī)理、疫苗研制、越種傳播機(jī)制等研究提供了一種理想的感染模型。
文檔編號A61P1/16GK101991610SQ200910090498
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者丁葉, 佘銳萍, 夏抗抗, 尤華, 尹君, 李文貴, 李睿文, 毛晶晶 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)