專利名稱：一根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Asp與兩根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物、它們的合成及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，尤其涉及一根Arg-Gly-Asp-Val鏈 通過(guò)Asp與兩根脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，及其制備方法和該偶聯(lián)物作為抗血栓劑、藥物載體或 制劑材料的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病是危害我國(guó)人民身體健康的三大疾病之一，血管栓塞性疾病是危害人 們生命健康的重要疾病。血小板在血栓形成過(guò)程中舉足輕重。血小板被誘導(dǎo)劑激活時(shí)，表面膜糖蛋白 GPIIb/IIIa受體暴露，與纖維蛋白原結(jié)合，形成血栓。文獻(xiàn)報(bào)道纖維蛋白α和Y鏈中的 Arg-Gly-Asp-Ser, Arg-Gly-Asp-Phe 和隱義的 Arg-Gly-Asp-Val 序列是識(shí)別血小板表面 GPIIb/IIIa受體的關(guān)鍵序列。多肽類藥物作為一類高效低毒的化合物已經(jīng)引起研究者們廣泛的關(guān)注，但此類藥 物存在易被酶解、生物半衰期短、易代謝、口服給藥活性很低等問(wèn)題。外源Arg-Gly-Asp肽可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制纖維蛋白原等黏附蛋白與血小板的結(jié)合，從 而達(dá)到抑制血小板聚集和抗血栓的作用。含Arg-Gly-Asp序列的化合物可以向血栓、炎癥、 癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的患病部位富集。國(guó)內(nèi)外及發(fā)明人前期工作曾研究過(guò)含有Arg-Gly-Asp 的線性肽是一種優(yōu)秀的抗血栓多肽，Arg-Gly-Asp序列常作為研究新型抗(溶)血栓藥的 靶頭。然而Arg-Gly-Asp肽雖具有免疫原性低，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，但其具有半衰期短等缺 點(diǎn)ο在將含Arg-Gly-Asp序列的寡肽與各種不同的長(zhǎng)鏈脂肪鏈以及各種不同長(zhǎng) 度的長(zhǎng)鏈脂肪鏈進(jìn)行偶聯(lián)后，發(fā)現(xiàn)這些脂肪鏈修飾的Arg-Gly-Asp偽肽不僅保留著 Arg-Gly-Asp肽的強(qiáng)的抗血栓活性，克服了寡肽易被體內(nèi)酶降解、不穩(wěn)定的缺點(diǎn)即穩(wěn)定性得 到增強(qiáng)，可以采用口服給藥的方式，給藥劑量在IOnM仍具有理想的抗血栓活性。在這樣一個(gè)前提下，把一根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Asp與兩根脂肪醇鏈偶聯(lián)物， 便可以獲得偶聯(lián)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一類具有抗血栓作用的肽鏈與雙脂肪醇的偶聯(lián)物。本發(fā)明的目的之一是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，是將一根Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Asp與兩根 脂肪醇鏈偶聯(lián)的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的通式為Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2)nCHJ2，其中 η = 6，8，10 或 12。本發(fā)明結(jié)合了下述認(rèn)識(shí)或依據(jù)完成了上述技術(shù)方案以天冬氨酸為連接臂，將兩 條飽和脂肪醇鏈連接到一個(gè)Arg-Gly-Asp-Val-Asp五肽上，使制得的分子獲得四種性能，即依賴于飽和脂肪鏈的疏水性、依賴于Arg-Gly-Asp肽的胍基和α -氨基質(zhì)子化形成的陽(yáng) 離子性、親水性和依賴于Arg-Gly-Asp肽對(duì)GP Ilb/IIIa受體特異親和作用獲得的靶向性。 這樣一來(lái)，以天冬氨酸為連接臂，將兩條飽和脂肪醇鏈連接到一個(gè)Arg-Gly-Asp-Val-Asp 五肽上而得到含一個(gè)陽(yáng)離子頭兩條疏水鏈尾的偶聯(lián)物。本發(fā)明的目的之二是提供一種制備上述具有抗血栓活性的肽鏈與雙脂肪醇鏈偶 聯(lián)物的方法。本發(fā)明的目的之二是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種制備所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物的方法，包括如下步驟按照常規(guī)液相接肽技術(shù)分別合成保護(hù)基保護(hù)的Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 6CH3] 2、Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 8CH3] 2、Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 10CH3] 2、Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 12CH3]2，脫去保護(hù)基，即得。具體的，包括如下步驟(1)將N端保護(hù)基保護(hù)的天冬氨酸與兩個(gè)脂肪醇縮合，所述脂肪醇為CH3(CH2) nCH20H, η = 6、8、10 或 12 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到雙脂肪醇天冬氨酸酯；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將雙脂肪醇天冬氨酸酯依次與纈氨酸的保護(hù)中間體、 天冬氨酸的保護(hù)中間體、甘氨酸的保護(hù)中間體和精氨酸的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基 保護(hù)的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯(lián)物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯(lián)物的C端保護(hù)基和N端保護(hù)基 得到目標(biāo)化合物。其中所述N端保護(hù)基是對(duì)多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時(shí)常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保護(hù)基是對(duì)多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時(shí)常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是 甲氧基(OMe)；所述側(cè)鏈保護(hù)基是對(duì)多肽側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)時(shí)常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是芐 氧基(OBzl)、硝基(NO2)；所述液相合成技術(shù)及所述保護(hù)、縮合、脫保護(hù)的過(guò)程是本領(lǐng)域的常 規(guī)并公知的技術(shù)。該制備方法可以用圖1的路線概括，具體的，所述方法包括(1)在DCC、HOBt, NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護(hù)的天冬氨酸分別與 CH3 (CH2) 70H、CH3 (CH2) 90H、CH3 (CH2) η0Η 以及 CH3 (CH2) 130Η 偶聯(lián)；(2)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(1)所得的偶聯(lián)物，脫去叔丁氧羰基；(3)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下將叔丁氧羰基保護(hù)的纈氨酸與步驟(2)所得 產(chǎn)物偶聯(lián)；(4)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(3)所得的偶聯(lián)物，脫去叔丁氧羰基；(5)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基、保護(hù)側(cè)鏈芐氧基保護(hù)的天 冬氨酸與步驟(4)所得產(chǎn)物偶聯(lián)；(6)在氯化氫/乙酸乙酯溶液中加入步驟(5)所得的偶聯(lián)物，脫去叔丁氧羰基；(7)在DCC、H0Bt、NMM和THF存在下將N端叔丁氧羰基保護(hù)、側(cè)鏈硝基保護(hù)的精氨 酸與甲氧基保護(hù)的甘氨酸偶聯(lián)；
(8)在2NNa0H存在下將(7)所得產(chǎn)物脫除C端保護(hù)基；(9)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下將(6)與(8)所得產(chǎn)物偶聯(lián)；(10)將(9)所得產(chǎn)物脫除保護(hù)基得到通式所示化合物。在大鼠血栓形成模型上的評(píng)價(jià)表明，本發(fā)明偶聯(lián)物具有優(yōu)秀的口服抗血栓活性， 可作為抗血栓劑應(yīng)用；在水相和生物相檢測(cè)了這4種偶聯(lián)物自組裝成為納米顆粒的性能， 試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明偶聯(lián)物具有優(yōu)秀的自組裝性能，可作為制備微乳、脂質(zhì)體等的制劑材 料。


圖1為本發(fā)明肽鏈與雙脂肪醇鏈偶聯(lián)物的合成路線；i)H0BT/DCC，NMM/THF ；ii) HCl/EtOAc ；iii)Pd/C，H2 ；iiii)2N Na0H/CH30H ；其中 9a η = 6,9b η = 8,9c η = 10，9d η =12。圖2為本發(fā)明化合物9a_9d在水相中自組裝的粒徑隨時(shí)間變化的折線圖。圖3為本發(fā)明的化合物9a_9d在水相組裝的納米球的透射電鏡圖；9a (放大2. 5萬(wàn) 倍，標(biāo)尺1 μ m) ；9b (放大5萬(wàn)倍，標(biāo)尺0. 2 μ m) ；9c (放大10萬(wàn)倍，標(biāo)尺0. 2 μ m) ；9d(放大 10萬(wàn)倍，標(biāo)尺Iym)。圖4為本發(fā)明的化合物9a_9d在固相中的形態(tài)的掃描電鏡圖；9a(放大180倍，標(biāo) 尺100 μ m) ；9b (放大65倍，標(biāo)尺200 μ m) ；9c (放大140倍，標(biāo)尺100 μ m) ；9d (放大140倍， 標(biāo)尺 100 μ m)。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例IArg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 6CH3] 2 的制備(9a)1) Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 將1. 600g (5. Ommo 1) Boc-Arg (NO2)溶于20ml無(wú)水THF成白色乳濁液，冰浴下加入 0. 745g(5. 5mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，10分鐘后加入1. 23g(6mmol) 二環(huán)己基羰二亞 胺(DCC)，得到反應(yīng)液A，待用。冰浴下把1. 61g (5. 25mmol) TOSH 'Gly-OBzl懸浮于20ml無(wú)水 THF中，然后加N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)pH為8_9。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液B，待用。冰浴下 把反應(yīng)液A加入反應(yīng)液B中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?2h，TLC(氯仿/甲醇，10 1) 顯示Boc-Arg (NO2)消失。濾除二環(huán)己基脲(D⑶)，濾液減壓濃縮得黃色油狀物，50ml乙酸 乙酯溶解，再次過(guò)濾濾出析出的D⑶，濾液依次用5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、5% KHSO4水溶液、飽和NaCl水溶液、5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯 層用無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，氯仿重結(jié)晶得到2. 2g(94% )標(biāo)題化合物， 為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :467[M+H] +。2) Boc-Arg (NO2) -Gly將0. 466g(l. Ommol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 溶于 IOml 甲醇。冰浴下將得到的 溶液用2N NaOH水溶液調(diào)pH至12，冰浴維持反應(yīng)液溫度在0°C，2h后TLC (氯仿/甲醇， 10 1)顯示B0c-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反應(yīng)混合物用飽和KHSO4水溶液調(diào)pH7，減壓濃縮除甲醇。殘留物再用飽和KHSO4水溶液酸化至pH2，乙酸乙酯萃取(30mlX3)。合并的 乙酸乙酯相用飽和NaCl水溶液洗至中性，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，柱層 析分離(CHCl3 CH3OH, 10 1)得0. 32g(85%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESF-MS(m/z) 375. 3[M-H]+,[a]o°=-2.16(c=l, CH3OH).3) Boc-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (la)將1. 165g (5. Ommo 1) Boc-Asp 溶于 20ml 無(wú)水 THF 中，冰浴下加入 0. 675g (5. Ommo 1) N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，10分鐘后加入1. 23g (6mmol) DCC，得到反應(yīng)液C，待用。冰浴下 把1. 43g(ll. OmmoDCH3-(CH2)6CH2-OH溶于20ml無(wú)水THF中，得到反應(yīng)液D，待用。冰浴下 把反應(yīng)液D加入反應(yīng)液C中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?2h，TLC(石油醚/乙酸乙酯， 2 1)顯示Boc-Asp消失。濾除二環(huán)己基脲(D⑶)，濾液減壓濃縮得黃色油狀物，50ml乙酸 乙酯溶解，再次過(guò)濾濾出析出的D⑶，濾液依次用5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、5% KHSO4水溶液、飽和NaCl水溶液、5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯 層用無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干得2. 27g(99%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體。 ESI-MS (m/z) :459[M+H]+. 4) HCl · H-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (2a)將0. 458g(l. Ommo 1) la用2ml乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10ml4N HCl/乙酸 乙酯溶液反應(yīng)，2h后，TLC(石油醚/乙酸乙酯，2 1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙 酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量石油醚將殘留 物研磨得0.354g(99%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色類固體，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z) 359 [M+H]+.5) Boc-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (3a)將0. 228g (1. 05mmol) Boc-Val 溶于 20ml 無(wú)水 THF，冰浴下加入 0. 149g (1. Immo 1) N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，10分鐘后加入0. 247g(l. 2mmol) 二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，得 到反應(yīng)液E，待用。冰浴下把0. 394g (Immol) 2a懸浮于20ml無(wú)水THF中，然后加N-甲基嗎 啉(NMM)調(diào)pH為8-9。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液F，待用。冰浴下把反應(yīng)液E加入反應(yīng)液F 中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?2h，TLC (石油醚丙酮，5 1)顯示2a消失。濾除二環(huán) 己基脲(DCU)，濾液減壓濃縮得黃色油狀物，50ml乙酸乙酯溶解，再次過(guò)濾濾出析出的DCU， 濾液依次用5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、5% KHSO4水溶液、飽和NaCl水溶液、5% NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾、濾液減壓 濃縮至干，柱層析分離(石油醚丙酮，15 1)得到0.53g(95.0%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色 油狀物。ESI-MS(m/z) 558[M+H]+.6) HCl · H-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (4a)用與制備2a相同的方法，以0. 558g(l. Ommol) 3a為原料，得到0. 452g(99% )標(biāo)題 化合物。ESI-MS(m/z) 458[M+H]+.7) Boc-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (5a)按照3a 的制備方法，以 0. 323g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl)和 0. 493g(l. Ommol) 4a 為原料，經(jīng)柱層析分離(石油醚丙酮，4 1)得到0.65g(85.4%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS(m/z) :762[Μ+Η]+,[α]^°= 6.82 (c=1.25, CHCl3),Mp 60-62°C ·8) HCl · H-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (6a)
用與制備2a相同的方法，以0. 761g(l. Ommol) 5a為原料，得到0. 6g(91%)標(biāo)題化 合物。ESI-MS (m/z) :662[M+H]+. 9) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (7a)將1. 88g(5. Ommol) Boc-Arg (NO2)-Gly 溶于 30ml 無(wú)水 THF 中，冰浴下加入 0. 675g(5mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，10分鐘后加入1. 112g(5. 24mmol) 二環(huán)己基羰二 亞胺(DCC)，得到反應(yīng)液G，待用。冰浴下把3. 17g (4. 54mmol) 6a溶于40ml無(wú)水THF中，得 到反應(yīng)液H，待用。冰浴下把反應(yīng)液H加入反應(yīng)液G中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?2h， TLC(氯仿/甲醇，15 1)顯示6a消失。布氏漏斗濾除二環(huán)己基脲(D⑶)，濾液減壓濃縮 得黃色油狀物，150ml 二氯甲烷溶解，濾液依次用5% NaHCOyK溶液、5% KHSO4水溶液、飽和 NaCl水溶液各洗3次。二氯甲烷層直接減壓濃縮至干，干法拌樣后柱層析分離(氯仿甲 醇，15 1)，再經(jīng)板層析分離(氯仿甲醇，15 1)即得2.73g(58.9%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :1021[Μ+Η]+，[α]蕓=-19.49 (c=0.85, CH3OH),Mp :128_130°C ·10) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (8a)將0. 102g (0. Immo 1) 7a 置于 50ml 茄形瓶中，用甲醇溶解，加 10mgPd/C (10 % )，通 H2 (0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用乙醚研 磨，制得0.083g(90. 3% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體粉末。ESI_-MS(m/Z) :919[Μ_Η]+.11) HCl · Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 6CH3] -OCH2 (CH2) 6CH3 (9a)按照2a的制備方法，以0. 920g(l. Ommol) 8a為原料，得到0. 78g(95% )目標(biāo) 化合物，無(wú)色固體粉末。ESI-MS(m/z) :821[M+H]+, [af°= -20.16 (c=0.8, CH3OH), Mp 125-127°C .實(shí)施例2Arg-Gly-Asp-Val_Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 的制備(9b)1) Boc-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (lb)按照l(shuí)a 的制備方法，由 1. 165g(5mmol) Boc-Asp 和 1. 659g (10. 5mmol) CH3-(CH2)9-OH 制得 2. 565g(99. 9 % )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) 536[M+Na]+，[o^。= -14.80 (c=l, CH3OH).2) HCl · Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (2b)用與制備2a相同的方法，以0. 513g(lmm0l)lb為原料制得0.449g(99.9% )目標(biāo) 化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z) :414[M+H]+.3) Boc-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (3b)按照3a 的制備方法由 1. 139g(5. 25mmol)Boc-Val 和 2. 247g(5. Ommol) 2b 制得 3. 06g(99. 9% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) :635[M+Na]+.4) HCl · Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (4b)用與制備2a相同的方法，以0. 612g(1.0mmol)3b為原料制得0. 549g(99. 9% )標(biāo) 題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) :514[M+H]+.5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (5b)按照5a 的制備方法由 0.678g(2. lmmol)Boc-Asp (OBzl)和 1. 097g(2. Ommol)4b 制得1.471g(90 % )標(biāo)題化合物，為白色類固體。ESI-MS(m/z) :840[M+Na]+，
=-28.00 (c=l, CH3OH),Mp 65 67°C ·6) HCl · Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (6b)
用與制備2a相同的方法，以0.817g(1.0mmOl)5b為原料制得0. 754g(99.9% )標(biāo) 題化合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) :719[M+H]+.7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (7b)按照7a的制備方法，由0. 79g(2. Immo 1)實(shí)施例1中制備的Boc-Arg(NO2)-Gly和 1.5078(2.0讓01)613經(jīng)柱層析(氯仿:甲醇，15 1)制得1. 204g(56% )標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/z) 1098[M+Na][af° =-22ΛO (c=l, CH3OH),Mp 118 119°C ·8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (8b)用與制備8a相同的方法以0. 215g(0. 2mmol)7b為原料制得0. 182g(97%)標(biāo)題化 合物，為無(wú)色固體。ESr-MS(m/z) :939[M-H]+.9) HCl · Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 8CH3] -OCH2 (CH2) 8CH3 (9b)按照2a的制備方法，從0. 188g(0. 2mmol)8b制得0. 160g(95% )標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/z) :841[M+H]+，[c^。=-22.50 (C=1, CH3OH ),Mp 201 203°C ·實(shí)施例3Arg-Gly-Asp-Val_Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 的制備(9c)1) Boc-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (Ic)按照l(shuí)a 的制備方法，由 1. 165g(5mmol) Boc-Asp 和 1. 953g (10. 5mmol) CH3-(CH2) 10CH2-OH 制得 2. 854g(99. 9 % )目標(biāo)化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS (m/z) 593[M+Na]-8.93 (c=l, CH3OH).2) HCl · H-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (2c)用與制備2a相同的方法，以0. 569g(lmmol)lc為原料制得0. 506g(99. 9% )目標(biāo) 化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) :471[M+H]+. 3) Boc-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (3c)按照3a 的制備方法由 1. 139g (5. 25mmol) Boc-Val 和 1. 07g (5. Ommo 1) 2c 制得 3. 34g(99. 9% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) :692[M+Na]+.4) HCl · Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (4c)用與制備2a相同的方法，以0. 668g(1.0mmol)3c為原料制得0. 554g(99. 9% )標(biāo) 題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) :569[M+H]+.5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (5c)按照5a 的制備方法由 0.678g(2. lmmol)Boc-Asp (OBzl)和 1. 209g(2. Ommol)4c 制得1. 514g(90 % )標(biāo)題化合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) 896 [M+Na][ ]蕓= -29.20(c=l, CH3OH),Mp 76 780C ·6) HCl · Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (6c)用與制備2a相同的方法，以0. 873g(l. Ommol) 5c為原料制得0. 81g(99% )標(biāo)題化 合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) :774[M+H]+.7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (7c)按照7a的制備方法，由0. 79g(2. lmmol)實(shí)施例1中制備的Boc-Arg(NO2)-Gly和 1.6198(2.0讓01)6(經(jīng)柱層析(氯仿甲醇，15 1)制得1. 131g(50% )標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/z) 1154[M+Na][af° =-23.17(c= 1, CH3OH),Mp 97 99°C · 8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (8c)
用與制備8a相同的方法以0. 226g(0. 2mmol)7C為原料制得0. 195g(98%)標(biāo)題化 合物，為無(wú)色固體。ESr-MS(m/z) :996[M-H]+.9) HCl · Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 10CH3] -OCH2 (CH2) 10CH3 (9c)按照2a的制備方法，從0. 2g(0. 2mmol)8C制得0. 172g(96% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色 固體。ESI-MS(m/z) :897[Μ+Η]+,[α]ο = -16.8667(c=l, CH3OH),Mp 220 221°C ·實(shí)施例4Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 的制備(9d)1) Boc-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (Id)按照l(shuí)a 的制備方法，由 1. 165g(5mmol) Boc-Asp 和 2. 247g(10. 5mmol) CH3- (CH2) 12CH2-0H 制得 3. 125g (99. 9 % )目標(biāo)化合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) 648 [M+Na]+,[a]o°- -5.67 (c=l, CH3OH), Mp 28-30°C ·2) HCl · H-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (2d)用與制備2a相同的方法，以0.625g(lmmol)ld為原料制得0. 562g(99.9% )目標(biāo) 化合物，為無(wú)色油狀物，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z) :526[M+H]+.3) Boc-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (3d)按照3a 的制備方法由 1. 139g (5. 25mmol) Boc-Val 和 1. 21g (5. Ommol) 2d 制得 3. 625g(99. 9% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) :748_a]+·4) HCl · Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (4d)用與制備2a相同的方法，以0. 725g(1.0mmol)3d為原料制得0. 628g(99. 9% )標(biāo) 題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS (m/z) :626[M+H]+.5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (5d)按照5a 的制備方法由 0. 678g(2. lmmol)Boc-Asp (OBzl)和 1. 321g(2. Ommol)4d 制得1. 558g(83. 9 % )標(biāo)題化合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) :952[M+Na]+， [a]2^= -27.10(c=l, CH3OH), Mp :60 62°C .6) HCl · Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (6d)用與制備2a相同的方法，以0. 929g(l. Ommol) 5d為原料制得0. 84g(97% )標(biāo)題化 合物，為白色類固體。ESI-MS (m/z) :804[M+H]+.7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (7d)按照7a的制備方法，由0. 79g(2. lmmol)實(shí)施例1中制備的Boc-Arg(NO2)-Gly和 1.73^(2.0讓01)6(1經(jīng)柱層析(氯仿甲醇，15 1)制得1. 092g(46% )標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/z) 1210[M+Na][a]2^ =-25.17(c=l, CH3OH),Mp 86 87°C ·8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (8d)用與制備8a相同的方法以0. 237g(0. 2mmol)7d為原料制得0. 189g(90%)標(biāo)題化 合物，為無(wú)色固體。ESr-MS(m/z) :1054[M-H]+.9) HCl · Arg-Gly-Asp-Val-Asp [-OCH2 (CH2) 12CH3] -OCH2 (CH2) 12CH3 (9d)按照2a的制備方法，從0. 21g(0. 2mmol)8d制得0. 185g(97% )標(biāo)題化合物，為無(wú) 色固體。ESI-MS(m/z) :954[Μ+Η]+，[α]蕓=-15.23(c=l, CH3OH),Mp 204 2060C ·試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物口服給藥的抗血栓活性試驗(yàn)1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與手術(shù)器械健康wistar雄性大鼠，體重190_210g，軍事醫(yī)學(xué)科院醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
器械灌胃針，剪刀，眼科剪，動(dòng)脈夾，止血鉗，彎鑷等2)實(shí)驗(yàn)方法2.1 原理建立頸總動(dòng)靜脈體外循環(huán)旁路，絲線法形成血小板血栓，觀察藥物對(duì)大鼠體內(nèi)血 栓形成的影響。動(dòng)脈血流中的血小板，當(dāng)接觸到絲線時(shí)粘附于線上，當(dāng)血小板聚集受到影響 時(shí)，形成血栓的重量就發(fā)生改變，因此，可以用來(lái)評(píng)價(jià)化合物的抗栓活性。2. 2 插管插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠，長(zhǎng)60. Omm,內(nèi)徑3. 5mm ； 兩端為相同的聚乙烯管，管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑1. 0mm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管(用于 插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為1.0mm。將編好號(hào)的5ml離心管中分別裝入6cm長(zhǎng)的黑色 手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。2. 3 口服給藥抗血栓活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法將購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科院醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心的Wistar雄性大鼠(190-210g)，隨機(jī)分組，每組12只，靜悉飼養(yǎng)一天。將大鼠用臨時(shí) 配置的本發(fā)明化合物的生理鹽水溶液(劑量為l.Onmol/kg)灌胃給藥，30分鐘后用20% (^OOmg-kg-1)劑量烏來(lái)糖溶液麻醉，分離右頸動(dòng)脈和左頸靜脈。將插管充滿肝素鈉的生 理鹽水溶液后，一端插入左側(cè)靜脈，另一端用注射器加入定量肝素鈉抗凝后再插入右側(cè)動(dòng) 脈。血流即從右側(cè)動(dòng)脈流經(jīng)聚乙烯管流入左側(cè)靜脈循環(huán)，即時(shí)間監(jiān)測(cè)血流循環(huán)狀況，15分 鐘后取出附有血栓的絲線并記錄重量，以生理鹽水(NS，3ml/kg)做空白對(duì)照，以阿司匹林 (60mg/15ml，3ml/kg)作陽(yáng)性對(duì)照。3)結(jié)果經(jīng)口服給藥，本發(fā)明的化合物都具有很好的抗栓活性。結(jié)果見(jiàn)表1。表1本發(fā)明化合物的抗栓活性結(jié)果_ 口服給藥 a與生理鹽水比，P < 0. 01 ；b與阿司匹林比，P > 0. 05 ；c與阿司匹林比，P < 0. 05試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物在水相中組裝成為納米球試驗(yàn)1)本發(fā)明的4種偶聯(lián)物按照10_3mOl/l的濃度配置成為水溶液，在激光納米粒度儀 上連續(xù)測(cè)定8天，觀察粒徑分布情況，結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。得到的數(shù)據(jù)表明，這4種偶聯(lián)物在 水相中可以自組裝成為穩(wěn)定的納米粒，因而可以是優(yōu)秀的微乳和脂質(zhì)體藥物的制備材料。表2本發(fā)明的化合物的粒徑隨時(shí)間變化的測(cè)定結(jié)果(η = 3，單位nm) 2)按照透射電鏡的測(cè)定要求，配置4種偶聯(lián)物的(10-3mol/l)水溶液，置于銅網(wǎng)上 揮發(fā)干后觀察本發(fā)明的化合物在水相組裝的納米球的形態(tài)和粒徑。結(jié)果表明，這4種偶聯(lián) 物組裝的納米球在透射電鏡下可以看到粒子狀態(tài)，如圖3所示。3)按照掃描電鏡的樣品準(zhǔn)備方法，將10_3mOl/l的4種偶聯(lián)物水溶液冷凍干燥，取 少量固體與銅片上，在觀察本發(fā)明化合物在固體狀態(tài)下的形態(tài)，如圖4所示。
權(quán)利要求
一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物，是Arg Gly Asp Val肽鏈通過(guò)Asp與兩根脂肪醇鏈偶聯(lián)的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的通式Arg Gly Asp Val Asp[OCH2(CH2)nCH3]2，其中n＝6，8，10或12。
2.一種制備權(quán)利要求1所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物的方法，其步驟包括包括 按照常規(guī)液相接肽技術(shù)分別合成保護(hù)基保護(hù)的Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 6CH3]2> Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 8CH3]2> Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 10CH3]2> Arg-Gly-Asp-Val-Asp [OCH2 (CH2) 12CH3]2，脫去保護(hù)基，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物的制備方法，其包括如下步驟(1)將N端保護(hù)基保護(hù)的天冬氨酸與兩個(gè)脂肪醇縮合，所述脂肪醇為CH3(CH2)nCH2OHj =6、8、10 或 12 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到雙脂肪醇天冬氨酸酯；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將雙脂肪醇天冬氨酸酯依次與纈氨酸的保護(hù)中間體、天冬 氨酸的保護(hù)中間體、甘氨酸的保護(hù)中間體和精氨酸的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基保護(hù) 的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯(lián)物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的肽鏈和雙脂肪鏈醇偶聯(lián)物的C端保護(hù)基和N端保護(hù)基得到 目標(biāo)化合物。
4.權(quán)利要求1所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物在制備抗血栓藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1所述肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物在制備微乳或脂質(zhì)體藥物載體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類肽鏈與雙脂肪醇鏈的偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用，是將一條Arg-Gly-Asp-Val鏈通過(guò)Asp與兩條脂肪醇鏈偶聯(lián)，所得偶聯(lián)物的通式為Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH2(CH2)nCH3]2，其中n＝6，8，10或12。本發(fā)明的偶聯(lián)物除具有優(yōu)秀口服抗血栓活性外，還具有優(yōu)秀的自組裝性能，可作為制備微乳、脂質(zhì)體等藥物載體的制劑材料。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101906144SQ20091008519
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者姜文花, 彭師奇, 趙明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)