專利名稱：：葛根素的提取方法及葛根在制備保護(hù)肝臟藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種葛根素的提取方法及葛根在制備保護(hù)肝臟藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：肝臟作為人體內(nèi)最大的"化工廠"，肩負(fù)著分解進(jìn)入人體一切物質(zhì)的重任，特別是對(duì)人體有害物質(zhì)的分解(包括酒精、化學(xué)藥物、食物的農(nóng)藥殘留等)，當(dāng)人體有害物質(zhì)長(zhǎng)期大量攝入時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致肝臟自身中毒，肝細(xì)胞受到損傷，臨床上常見的脂肪肝、酒精肝及轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)肽酶增高的主要原因在肝細(xì)胞受損肝臟中毒所致。葛根又叫粉葛、葛藤，生長(zhǎng)于地面上的為藤狀植物，地下部分為根塊狀，葛根生于山坡草叢、路旁、疏林中較陰濕處，在我國分布廣泛，盛產(chǎn)廣西、廣東、湖南等地。葛根全身是寶，在我國有悠久的應(yīng)用歷史，連葛藤、葛葉、葛花都有應(yīng)用之法。經(jīng)歷代醫(yī)藥家不斷總結(jié)和試驗(yàn)，得出葛根具有性涼、氣平、味甘，具清熱、降火、排毒諸功效。用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法進(jìn)一步分析表明，葛根中富含多達(dá)13種異黃酮類物質(zhì)，包括葛根素、葛雌素、葛根素木糖甙、大豆黃酮等，葛根素對(duì)高血壓、高血脂、高血糖和心腦血管疾病有療效。而現(xiàn)有提取葛根素的方法很多，但是其提取的純度不高，并且由于葛根的產(chǎn)量大，人們對(duì)葛根的用途還有待進(jìn)一步發(fā)掘。
發(fā)明內(nèi)容因此人類對(duì)葛根的用途仍存在需求，.至今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)任何有關(guān)本發(fā)明藥物的報(bào)道，本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究，終于找到了葛根提取物葛根素的另一提取方法及其用途。'本發(fā)明的目的是提供一種葛根素的提取方法。本發(fā)明的另一目的是提供葛根在制備保護(hù)肝臟中的用途。本發(fā)明所述葛根提取物葛根素在保護(hù)肝臟功能方面有較好的療效，可以從葛根中提取葛根素；其主要步驟如下①粉碎、提取將葛根粉碎后過io目篩，稱取定量葛根粉，置于提取罐中，先用其質(zhì)量4倍體積的蒸鎦水或濃度為95%乙醇或甲醇作溶劑回流提取l1.5h，過濾，濾渣再用2倍體積的上述溶劑回流提取lh，再次過濾，收集、合并兩次濾液，獲得葛根素粗提液；②濃縮將醇提取液置于真空濃縮器中，控制真空度為-0.10.08MPa，濃縮溫度為8590。C，回收甲醇或乙醇；③上柱取定量活化DIOI大孔吸附樹脂裝柱，按照其對(duì)葛根素的吸附容量計(jì)算出應(yīng)吸附的提取液體積，將提取液泵入樹脂柱中，控制流出液速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，使葛根素吸附于DIOI吸附樹脂上；④洗脫當(dāng)上柱液流完后，先用蒸餾水洗滌，洗去糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)水溶性雜質(zhì)，直至洗脫液近無色時(shí)止，然后用70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，控制洗脫液流出速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，用12倍樹脂體積的洗脫液即可洗脫被樹脂吸附的85%以上的葛根素；濃縮將洗脫液置于真空濃縮機(jī)中，控制真空度為-0.10.08MPa，濃縮溫度為859(TC，回收乙醇直至濃縮液相對(duì)密度為1.2時(shí)止；⑥萃取、濃縮、干燥將濃縮液置于萃取器中，加入等體積正丁醇，反復(fù)萃取4次，收集正丁醇相，再次進(jìn)行真空減壓濃縮至干，濃縮條件同提取液，獲得葛根素粗提取物。本發(fā)明是發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期大量摸索總結(jié)得來的，發(fā)現(xiàn)所述葛根提取物葛根素在保護(hù)肝臟功能方面有較好的療效。經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，葛根具有很好的解毒護(hù)肝之功效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有提取的葛根素純度高、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述葛根提取物葛根素在保護(hù)肝臟功能方面有較好的療效，可以從葛根中提取葛根素；其主要步驟如下①粉碎、提取將葛根粉碎后過IO目篩，稱取定量葛根粉，'置于提取罐中，先用其質(zhì)量4倍體積的蒸餾水或濃度為95%乙醇或甲醇作溶劑回流提取l1.5h，過濾，濾渣再用2倍體積的上述溶劑回流提取lh，再次過濾，收集、合并兩次濾液，獲得葛根素粗提液；②濃縮將醇提取液置于真空濃縮器中，控制真空度為-0.10.08MPa，濃縮溫度為859(TC，回收甲醇或乙醇；◎上柱取定量活化DIOI大孔吸附樹脂裝柱，按照其對(duì)葛根素的吸附容量計(jì)算出應(yīng)吸附的提取液體積，將提取液泵入樹脂柱中，控制流出液速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，使葛根素吸附于DIOI吸附樹脂上；洗脫當(dāng)上柱液流完后，先用蒸餾水洗滌，洗去糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)水溶性雜質(zhì)，直至洗脫液近無色時(shí)止，然后用70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，控制洗脫液流出速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，用12倍樹脂體積的洗脫液即可洗脫被樹脂吸附的85。％以上的葛根素；⑤濃縮將洗脫液置于真空濃縮機(jī)中，控制真空度為-O.10.08MPa，濃縮溫度為8590°C，回收乙醇直至濃縮液相對(duì)密度為1.2時(shí)止；⑥萃取、濃縮、干燥將濃縮液置于萃取器中，加入等體積正丁醇，反復(fù)萃取4次，收集正丁醇相，再次進(jìn)行真空減壓濃縮至干，濃縮條件同提取液，獲得葛根素粗提取物。葛根素粗操取物為淺褐色粉末。將獲得的葛根素粗提取物再次用有機(jī)溶劑溶解，進(jìn)行重結(jié)晶，.可獲得高純反廣叩。觀察葛根素(葛根素)對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。方法首先建立大鼠肝硬化動(dòng)物模型，在此模型基礎(chǔ)上建立大鼠全肝缺血再灌注模型，比較用葛根素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后，肝組織光鏡下的形態(tài)學(xué)改變；血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和氧化亞氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，及肝組織中NO、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、MDA含量、SOD活性變化。結(jié)果葛根素預(yù)處理可使大鼠血清NO含量、肝組織NO含量及SOD活性明顯增高；而血清ALT、AST、MDA含量及肝組織TNF-a、MDA含量明顯降低；肝組織形態(tài)損傷也有所減輕。結(jié)論葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用，其主要是減少NO的降低、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)；清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過氧化。本試驗(yàn)通過葛根素預(yù)處理及缺血預(yù)處理對(duì)肝硬化大鼠肝臟I/R損傷保護(hù)作用的對(duì)比，探討葛根素是否對(duì)肝硬化大鼠肝臟的I/R損傷具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其作川機(jī)制。1材料與方法1.1動(dòng)物Wastar大鼠200只，體重200220g，雌雄各半。1.2儀器與試劑奧林巴斯2700全自動(dòng)生化分析儀、DY89-1全自動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、ArthosHTII酶標(biāo)儀、SANYOMDF-330型-70。C低溫冰箱、HH21-600型恒溫水浴箱、722分光光度計(jì)。CC14，瀘州市鑫達(dá)化工有限公司提供，批號(hào)2008713;食用酒，瀘州市食品廠提供；葛根素注射液哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)09102B;SOD測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，批號(hào)20080716;MDA測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；TBA法測(cè)定，批號(hào)20080716;NO測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，亞硝酸鹽法測(cè)定，批號(hào)20080719;TNF-a測(cè)定試劑盒，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，雙抗休夾心ABC-ELISA法測(cè)定，批號(hào)20080719。1.3模型制備及試驗(yàn)方法1.3.1大鼠肝硬化模型制備經(jīng)大鼠腹部皮下注射CCL大豆油溶液，前4次劑量為0.5m丄/100g體重60%CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，第4次后間隔7天注射第5次(可減少大鼠死亡率)，第5次起劑量改為0.3ml/100g體重40。/。CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，共13次；除注射CCl4當(dāng)日外，每日1次60%食用酒灌胃，乙醇劑量0.4g/100g體重；給予正常飲水；以高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)。上述操作第6周末停止，繼續(xù)觀察至8周末大鼠肝硬化模型制備成功并趨于穩(wěn)定。第2周起每周末行B超定位肝穿刺病理檢査，8周末挑選肝硬化程度趨于同--水平大鼠128只，繼續(xù)進(jìn)行下面試驗(yàn)。1.3.2動(dòng)物分組按隨機(jī)數(shù)字表法，將128只大鼠隨機(jī)分為4組，組再分為4個(gè)時(shí)間亞組，每亞組8只大鼠。4組分別為A組假手術(shù)組；B組單純?nèi)毖俟嘧⒔M；C組缺血預(yù)處理組；D組葛根素預(yù)處理組。4個(gè)時(shí)間亞組分別為a亞組缺血前時(shí)間亞組；b亞組缺血再灌注后lh時(shí)間亞組；C亞組缺血再灌注2h吋間亞組；d亞組缺血再灌注6h時(shí)間亞組。1.3.3缺血再灌注模型的制備術(shù)前禁食12h，自由飲水。以戊巴比妥鈉3mg/100g體重腹腔注射麻醉后開腹并充分顯露肝門，游離門靜脈及肝固有動(dòng)脈，用無損傷動(dòng)脈鉗給予鉗夾，30min后移去動(dòng)脈鉗復(fù)灌60min，形成全肝I/R模型。C組于缺血前反復(fù)3次缺血5min再灌注5min形成缺血預(yù)處理模型及術(shù)前D組12h、lh分別2次分別給予葛根素10mg/100g體重，其他各組給予等量生理鹽水，再行缺血30min，再灌注60min，D組形成葛根素預(yù)處理模型。1.3.4標(biāo)木采集B、C、D組動(dòng)物在再灌注Oh(即缺血前)、再灌注lh、2h、6h后分別從各時(shí)間亞組大鼠心內(nèi)取血5.0ml，不加抗凝劑靜置2h，并標(biāo)明分組及動(dòng)物編號(hào)，用自動(dòng)平衡離心機(jī)離心，取部分血清測(cè)定ALT、AST的含量，其余的置入-7(rC冰箱內(nèi)待測(cè)定N0、SOD、MDA。取血后快速取右肝組織進(jìn)行HE染色光鏡觀察；其他肝組織取0.5g制備10%組織勻漿，檢測(cè)其中NO、SOD、MDA及TNF-a。A組亦在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取血及肝組織行上述檢查。在實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)處死動(dòng)物。2結(jié)果2.1病理結(jié)果各組低倍鏡下均可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉重建，可見纖維再分隔現(xiàn)象，肝內(nèi)假小葉廣泛形成，同時(shí)伴有明顯的肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生等肝硬化病理表現(xiàn)。A組除上述表現(xiàn)外未見其他異常。B組高倍鏡下可見肝細(xì)胞核邊聚、濃縮及溶解，胞漿疏松化，并可見嗜酸性浸潤(rùn)；肝竇明顯狹窄，可見大量的紅細(xì)胞淤積其內(nèi)并有微血栓形成、中性粒細(xì)胞貼壁等。C組高倍鏡下可見肝細(xì)胞核邊聚、濃縮及溶解，胞漿疏松化，但較B組顯著減輕；肝竇狹窄較輕，但仍有紅細(xì)胞淤積及微血栓形成現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。D組高倍鏡下僅偶見核邊聚，胞漿疏松化；肝竇無明顯狹窄，內(nèi)無明顯紅細(xì)胞淤積，及其微血栓形成等，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。2.2血清及肝臟組織勻漿檢驗(yàn)結(jié)果2.2.1各組大鼠肝功酶學(xué)指標(biāo)變化D組肝功酶學(xué)檢驗(yàn)缺血前與其他各組無明顯差異(&0.05)，再灌注后各時(shí)間點(diǎn)明顯降低B組(代0.05)，與C組無顯著差異(/7〉0.05)，C、D組再灌注6h時(shí)較B組ALT、AST顯著降低(K0.05)，但與A組相比未完全恢復(fù)正常(代O.05)，見表l。表14組大鼠灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST的變化(義±&u/L)組別Ohlh,ALTASTALTASTA組69.4±10.8355.9±32,572.6±8.3362.5±37.6B組64.1±8.5362.1±32.91660.6±35.22886.9±324.C組65.2±8.4352.5±37.2919.4±74.61228.l士UO.1D組67.6±9.1359.9±43.7783.1±85.31043.5±118.89<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，▲/<().05;與同組灌注缺血前即Oh時(shí)相比，△/<().05;與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*/<0.052.2.2各組大鼠血清NO含量變化C、D組血清NO與再灌注lh、2h含量較缺血前有所降低，但較B組下降幅度小(K0.05)。再灌注6h時(shí)C、D組恢復(fù)正常與A組差異無顯著性(/>0.05);而B組含量明顯升高，且高于A組(代O.05)，見表2。表24組大鼠灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清N0的變化(義±&umol/L)組別Ohlh2hA組9.27±0.439.32±0.299.25±0.53B組9.26±0.365.67±0.406.86±0.38c組9.24±0.367.83±0.568.95±0.52D組9.29±0.407.78±0.538.75±0.55注與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，▲/<().05，與同組灌注缺血前即Oh時(shí)相比，△/<().05，與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*代0.05103討論3.1葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注的保護(hù)作用葛根素進(jìn)入體內(nèi)后主要分布于血漿、腎、肝和心。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示光鏡下，與對(duì)照組相比葛根素預(yù)處理組，肝細(xì)胞水腫及肝竇狹窄明顯減輕，內(nèi)無紅細(xì)胞淤積及微血栓形成等，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。血液中ALT、AST及肝組織中TNF-a等反映肝損害的指標(biāo)較對(duì)照組顯著減少，表明葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝臟有明確的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葛根素可通過調(diào)節(jié)NO含量、改善微循環(huán)、清除自由基等途徑對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中D組短期使用葛根素，缺血前轉(zhuǎn)氨酶較其他組差異無顯著性(/^0.05)，且全過程中無一只大鼠出現(xiàn)出血傾向，可證明短期應(yīng)用葛根素不會(huì)增加肝臟功能的損害及凝血機(jī)制障礙的發(fā)生率，所以認(rèn)為葛根素是對(duì)肝硬化肝臟缺血再灌注保護(hù)有研究前景的藥物之一。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種葛根素的提取方法，其主要步驟如下①粉碎、提取將葛根粉碎后過10目篩，稱取定量葛根粉，置于提取罐中，先用其質(zhì)量4倍體積的蒸餾水或濃度為95％乙醇或甲醇作溶劑回流提取1～1.5h，過濾，濾渣再用2倍體積的上述溶劑回流提取1h，再次過濾，收集、合并兩次濾液，獲得葛根素粗提液；②濃縮將醇提取液置于真空濃縮器中，控制真空度為-0.1～0.08MPa，濃縮溫度為85～90℃，回收甲醇或乙醇；③上柱取定量活化D101大孔吸附樹脂裝柱，按照其對(duì)葛根素的吸附容量計(jì)算出應(yīng)吸附的提取液體積，將提取液泵入樹脂柱中，控制流出液速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，使葛根素吸附于D101吸附樹脂上；④洗脫當(dāng)上柱液流完后，先用蒸餾水洗滌，洗去糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)水溶性雜質(zhì)，直至洗脫液近無色時(shí)止，然后用70％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，控制洗脫液流出速度為1-1.5倍樹脂柱體積/h，用12倍樹脂體積的洗脫液即可洗脫被樹脂吸附的85％以上的葛根素；⑤濃縮將洗脫液置于真空濃縮機(jī)中，控制真空度為-0.1～0.08MPa，濃縮溫度為85～90℃，回收乙醇直至濃縮液相對(duì)密度為1.2時(shí)止；⑥萃取、濃縮、干燥將濃縮液置于萃取器中，加入等體積正丁醇，反復(fù)萃取4次，收集正丁醇相，再次進(jìn)行真空減壓濃縮至干，濃縮條件同提取液，獲得葛根素粗提取物。2、葛根在制備保護(hù)肝臟藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種葛根素的提取方法及葛根在制備保護(hù)肝臟中的用途，從葛根中提取葛根素；其主要步驟如下①粉碎、提?。虎跐饪s；③上柱；④洗脫；⑤濃縮；⑥萃取、濃縮，獲得葛根素粗提取物。經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，葛根素具有很好的解毒護(hù)肝之功效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有提取的葛根素純度高、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A61P1/16GK101550133SQ20091006495公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日發(fā)明者葉道群申請(qǐng)人:南陽市海達(dá)生物技術(shù)有限公司