專利名稱：：Ltb-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥工程的藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種LTB(大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位)-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，該制劑用于鼻腔免疫，提高了LTB佐劑的活性，增強(qiáng)了流感疫苗的免疫效果。
背景技術(shù)：
：流感是一種常見(jiàn)的高發(fā)性傳染病，每年都會(huì)直接或作為原發(fā)疾病引起人的死亡。目前國(guó)內(nèi)外普遍使用的流感疫苗多為流感注射疫苗，但注射疫苗存在很多缺點(diǎn)，疫苗通過(guò)注射免疫后能夠產(chǎn)生高水平的體液抗體，但不能有效阻止流感病毒經(jīng)呼吸道粘膜侵入體內(nèi)，另外注射方式存在患者順應(yīng)性差、注射器和針頭導(dǎo)致感染、疫苗需多次接種、減活疫苗在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中易失活等缺點(diǎn)。LTB是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌分泌的一種熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞單位，它具有很強(qiáng)的黏膜免疫原性和黏膜佐劑活性，能有效地啟動(dòng)機(jī)體局部和全身的體液免疫和細(xì)胞免疫，已成為黏膜疫苗研究的重要佐劑。LTB作為疫苗佐劑，為了提高佐劑效應(yīng)，與流感疫苗結(jié)合大多采用簡(jiǎn)單混合或融合蛋白的方式。LTB與流感疫苗簡(jiǎn)單混合免疫的方法比較簡(jiǎn)單，使用比較方便，但LTB作為佐劑抗原提呈性低，提高小鼠血清及黏膜的抗體水平有限，體液免疫和細(xì)胞免疫水平相對(duì)較低。采用蛋白融合的技術(shù)將LTB和流感疫苗形成融合蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，但此方法專屬性較強(qiáng)，操作復(fù)雜，純化的表達(dá)產(chǎn)物中可能會(huì)有不完整的目的蛋白，整個(gè)后處理過(guò)藝復(fù)雜，工藝量大；流感疫苗易受到酶的破壞而降解，制備工藝復(fù)雜且不具有普遍性，融合蛋白可能引入無(wú)關(guān)抗原，有免疫原性，不能多次給藥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一種LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，使LTB佐劑活性得到進(jìn)一步增強(qiáng)，提高流感疫苗的免疫水平，既能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫抗體又能產(chǎn)生高效的局部粘膜免疫，且可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低成本。本發(fā)明使用一種化學(xué)性質(zhì)非常活躍的雙功能試劑碳化二亞胺類(lèi)化合物，利用它既可與羧甲基殼聚糖的羧基又可與LTB的氨基縮合的性質(zhì)，合成LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物，以交聯(lián)物和流感裂解疫苗為原料，表面活性劑為輔料，通過(guò)單乳化法制備微球，反應(yīng)過(guò)程為羧甲基殼聚糖-COOH+NH2—LTBR-NH-CH-R'>羧甲基殼聚糖—CO—NH—LTB+R-NH-CO-NH-R'為了達(dá)到本發(fā)明的目的所采取的具體技術(shù)方案是1、取羧甲基殼聚糖溶液和氯化鈉溶液混合得混合水溶液，碳化二亞胺類(lèi)化合物溶解于二甲基亞砜溶劑中，向混合水溶液中加入含有碳化二亞胺類(lèi)化合物的二甲基亞砜溶液，攪拌3060分鐘，48'C反應(yīng)18小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入LTB的PBS緩沖液，pH6.58.0，48'C反應(yīng)18小時(shí)，加入甘氨酸反應(yīng)14小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為h13:48，收集產(chǎn)物；用流動(dòng)去離子水透析2448小時(shí)，收集透析液的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物，LTB、甘氨酸、碳化二亞胺類(lèi)化合物、氯化鈉、羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為1:110:1~10:1~10:50~訓(xùn)；2、取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液中，pH6.58.0，將流感裂解疫苗和表面活性劑溶解在LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，流感裂解疫苗、表面活性劑與交聯(lián)物的質(zhì)量比為1:1050:畫(huà)500;3、將第二步的水相加入到油相中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；其中水相與油相的體積比為h5~20，攪拌4590分鐘，轉(zhuǎn)速為500~4000轉(zhuǎn)/分鐘；4、向第三步制得的乳液中加入濃度為130。/。(w/v)的固化劑，乳液與固化劑溶液的體積比l:12，繼續(xù)攪拌13小時(shí)后停止；5、離心分離第四步制得的分散體系，分出下層的微球，洗滌，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。上述的碳化二亞胺類(lèi)化合物是二乙基碳化二亞胺、二苯基碳化二亞胺、乙丙基碳化二亞胺或l-乙基-3(3，-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺。上述的表面活性劑是Span20、Span40、Span60、Span80、吐溫20、吐溫40、吐溫60或吐溫80。上述的油相是液體石蠟、花生油、玉米油、大豆油或橄欖油。上述的固化劑是甲醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。上述的離心分離時(shí)分別用石油醚和蒸餾水依次充分洗滌，并在室溫下真空干燥。本發(fā)明的有益效果是通過(guò)本發(fā)明得到的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的球形度好，不僅具有優(yōu)良的生物相容性和生物粘附性，采用LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球?qū)ALB/c小鼠進(jìn)行鼻腔黏膜免疫試驗(yàn)，結(jié)果顯示LTB能有效地啟動(dòng)機(jī)體局部和全身的體液免疫和細(xì)胞免疫，相比于其他免疫組，以LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物為材料制備的流感疫苗鼻腔免疫微球，大大提高了LTB的佐劑作用，極大增強(qiáng)了機(jī)體局部和全身的體液免疫和細(xì)胞免疫效果。另外解決了注射方式存在患者順應(yīng)性差、注射器和針頭導(dǎo)致感染、疫苗需多次接種、減活疫苗在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中易失活等缺點(diǎn)，該LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法條件溫和，工藝簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)成本較低。BALB/c小鼠鼻腔黏膜免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表；BALB/c小鼠鼻腔黏膜免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注A:流感疫苗滴鼻免疫組，B:LTB+流感疫苗混合組分滴鼻免疫組，C:LTB+羧甲基殼聚糖流感疫苗微球混合組分滴鼻免疫組，D:LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球PBS緩沖液滴鼻免疫組，E:滴鼻PBS緩沖液對(duì)照組；LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球掃描電鏡照片如圖1所示。圖1是LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球掃描電鏡照片。具體實(shí)施例方式以下實(shí)例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)方案的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段作出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)例1取20y。(w/v)羧甲基殼聚糖溶液25mL和5%~/力氯化鈉溶液2mL混合得混合水溶液，將l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶解于二甲基亞砜溶劑配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的濃度為5。/。(w/v)的二甲基亞砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的二甲基亞砜溶液2mL，攪拌30分鐘，4°C反應(yīng)1小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入l%(w/v)LTB的PBS緩沖液10mL，pH6.5，4。C反應(yīng)3小時(shí)，加入l%(w/v)甘氨酸溶液10mL反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為h1:4，收集產(chǎn)物。用流動(dòng)去離子水透析24小時(shí)，收集透析液得LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物。取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液配制成濃度為5。/。(w/v)的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液，pH6.5，取10mg流感裂解疫苗和100mg吐溫80溶解在20mLLTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，將水相加入到100mL液體石蠟中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；攪拌45分鐘，轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)/分鐘；向制得的乳液中加入5。/。(w/v)的三聚磷酸鈉溶液130mL，繼續(xù)攪拌1小時(shí)后停止；離心分離制得的分散體系，分出下層的微球，然后用石油醚洗滌3次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。實(shí)例2取10M(w/v)羧甲基殼聚糖溶液40mL和10"/。(w/v)氯化鈉溶液5mL混合得混合水溶液，將l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶解于二甲基亞砜溶劑配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的濃度為5M(w/v)的二甲基亞砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的二甲基亞砜溶液7.5mL，攪拌40分鐘，6°C反應(yīng)3小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入l%(w/v)LTB的PBS緩沖液5mL，pH7.0，5"C反應(yīng)5小時(shí)，加入2%(w/v)甘氨酸溶液10mL反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，乙酸-水-丁醇，摩爾比為1:1.5:5，收集產(chǎn)物。用流動(dòng)去離子水透析30小時(shí)，收集透析液得LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物。取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液配制成濃度為10。/。(w/v)的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液，pH7.0，將流感裂解疫苗5mg和100mg的吐溫80溶解在15mLLTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，將水相加入到200mL液體石蠟中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；攪拌50分鐘，轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘；向制得的乳液中加入濃度為10%(w/v)的三聚磷酸鈉溶液300mL，繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)后停止；離心分離制得的分散體系，分出下層的微球，然后用石油醚洗滌3次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。實(shí)例3取10。/。(w/v)羧甲基殼聚糖溶液30mL和2。/。(w/v)氯化鈉溶液5mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶解于二甲基亞砜溶劑配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的濃度為5。/。(w/v)的二甲基亞砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的二甲基亞砜溶液5mL，攪拌60分鐘，8°C反應(yīng)，6小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入l%(w/v)LTB的PBS緩沖液5mL,pH7.5，8"C反應(yīng)7小時(shí)，加入5%(w/v)甘氨酸溶液5mL反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為l:2.5:6，收集產(chǎn)物。用流動(dòng)去離子水透析36小時(shí)，收集透析液得LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物。取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液配制成濃度為12.5M(wA0的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液，pH7.5，將流感裂解疫苗5mg和200mg的吐溫80溶解在10mLLTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，將水相加入到100mL液體石蠟中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；攪拌70分鐘，轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分鐘；向制得的乳液中加入濃度為10。/。(w/v)的三聚磷酸鈉溶液180mL，繼續(xù)攪拌2.5小時(shí)后停止；離心分離制得的分散體系，分出下層的微球，然后用石油醚洗滌3次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。實(shí)例4取15。/。(w/v)羧甲基殼聚糖溶液50mL和10。/。(w/v)氯化鈉溶液5mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶解于二甲基亞砜溶劑配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的濃度為10。/。(w/v)的二甲基亞砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的二甲基亞砜溶液2mL，攪拌50分鐘，6°C反應(yīng)5小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入l%(w/v)LTB的PBS緩沖液10mL，pH8.0，4t:反應(yīng)1小時(shí)，加入2%(w/v)甘氨酸溶液10mL反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為1:1:8，收集產(chǎn)物。用流動(dòng)去離子水透析24小時(shí)，收集透析液得LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物。取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液配制成濃度為10y。(w/v)的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液，pH7.5，將流感裂解疫苗10mg和300mg的吐溫80溶解在40mLLTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，將水相加入到400mL液體石蠟中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；攪拌45分鐘，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘；向制得的乳液中加入濃度為5%(w/v)的三聚磷酸鈉溶液600mL，繼續(xù)攪拌1小時(shí)后停止；離心分離制得的分散體系，分出下層的微球，然后用石油醚洗滌3次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。實(shí)例5取20M(w/v)羧甲基殼聚糖溶液50mL和10。/。(w/v)氯化鈉溶液10mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶解于二甲基亞砜溶劑配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的濃度為10。/。(w/v)的二甲基亞砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的二甲基亞砜溶液10mL，攪拌60分鐘，8°C反應(yīng)8小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入l%(w/v)LTB的PBS緩沖液10mL，pH8.0，8'C反應(yīng)8小時(shí)，5%(w/v)甘氨酸溶液20rnL反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為1:3:8，收集產(chǎn)物。用流動(dòng)去離子水透析48小時(shí)，收集透析液得LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物。取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液配制成濃度為20M(w/v)的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液，pH8.0，將流感裂解疫苗1Omg和500mg的吐溫80溶解在25mLLTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，將水相加入到500mL液體石蠟中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；攪拌90分鐘，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘；向制得的乳液中加入濃度為5%(w/v)的三聚磷酸鈉溶液1000mL，繼續(xù)攪拌3小時(shí)后停止；離心分離制得的分散體系，分出下層的微球，然后用石油醚洗滌3次，無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。實(shí)例1到實(shí)例5中所述的l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺可以用二乙基碳化二亞胺、二苯基碳化二亞胺或乙丙基碳化二亞胺代替；實(shí)例1到實(shí)例5所述的吐溫80可以用Span20、Span40、Span60、Span80、吐溫20、吐溫40或吐溫60代替；實(shí)例1到實(shí)例5所述的液體石蠟可以用花生油、玉米油、大豆油或橄欖油代替；實(shí)例1到實(shí)例5所述的三聚磷酸鈉可以用甲醛、戊二醛、香草醛、硫酸鈉或檸檬酸鈉代替(權(quán)利要求1、一種LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是1.1、取羧甲基殼聚糖溶液和氯化鈉溶液混合得混合水溶液，碳化二亞胺類(lèi)化合物溶解于二甲基亞砜溶劑中，向混合水溶液中加入含有碳化二亞胺類(lèi)化合物的二甲基亞砜溶液，攪拌30～60分鐘，4～8℃反應(yīng)1～8小時(shí)，最終得混懸液，向混懸液中加入LTB的PBS緩沖液，pH6.5～.0，4～8℃反應(yīng)1～8小時(shí)，加入甘氨酸反應(yīng)1～4小時(shí)，反應(yīng)液過(guò)硅膠柱，洗脫液乙酸-水-丁醇，摩爾比為1∶1～3∶4～8，收集產(chǎn)物；用流動(dòng)去離子水透析24～48小時(shí)，收集透析液的LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物，LTB、甘氨酸、碳化二亞胺類(lèi)化合物、氯化鈉、羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為1∶1～10∶1～10∶1～10∶50～100；1.2、取LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶解于PBS緩沖液中，pH6.5～8.0，將流感裂解疫苗和表面活性劑溶解在LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物PBS緩沖液中作為水相，流感裂解疫苗、表面活性劑與交聯(lián)物的質(zhì)量比為1∶10～50∶100～500；1.3、將第二步的水相加入到油相中，攪拌形成穩(wěn)定的乳液；其中水相與油相的體積比為1∶5～20，攪拌45～90分鐘，轉(zhuǎn)速為500～4000轉(zhuǎn)/分鐘；1.4、向第三步制得的乳液中加入濃度為1～30％(w/v)的固化劑，乳液與固化劑溶液的體積比1∶1～2，繼續(xù)攪拌1～3小時(shí)后停止；1.5、離心分離第四步制得的分散體系，分出下層的微球，洗滌，真空干燥得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗微球。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是所述的碳化二亞胺類(lèi)化合物是二乙基碳化二亞胺、二苯基碳化二亞胺、乙丙基碳化二亞胺或l-乙基-3(3，-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是所述的表面活性劑是Span20、Span40、Span60、Span80、吐溫20、吐溫40、吐溫60或吐溫80。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是所述的油相是液體石蠟、花生油、玉米油、大豆油或橄欖油。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是所述的固化劑是甲醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制備方法，其特征是離心分離時(shí)分別用石油醚和蒸餾水依次充分洗滌，并在室溫下真空干燥。全文摘要一種LTB-羧甲基殼聚糖鼻腔免疫微球的制備方法，是以碳化二亞胺類(lèi)化合物為交聯(lián)劑，以LTB和羧甲基殼聚糖為主要原料合成LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物；將流感裂解疫苗和表面活性劑溶解于LTB-羧甲基殼聚糖交聯(lián)物溶液中，與油相物質(zhì)混合，經(jīng)攪拌形成穩(wěn)定的乳液后加入固化劑水溶液，攪拌沉淀后分離洗滌，真空干燥后即得到LTB-羧甲基殼聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球。該微球生物相容性和生物黏附性好，經(jīng)鼻腔免疫大大提高了LTB的佐劑活性，增強(qiáng)了流感疫苗的機(jī)體局部和全身的體液免疫及細(xì)胞免疫效果；同時(shí)克服了傳統(tǒng)注射流感疫苗造成的患者順應(yīng)性差、注射器和針頭導(dǎo)致感染、減活疫苗在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中易失活等缺點(diǎn)，且制備方法簡(jiǎn)單易行，條件溫和，生產(chǎn)成本較低。文檔編號(hào)A61K47/36GK101530395SQ20091001050公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年2月25日優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日發(fā)明者暢蘇,亮趙,馬洪林申請(qǐng)人:亮趙