專利名稱：一種治療皮膚缺損的注射劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織填充劑及其制備方法，更具體地說，是一種治療皮膚缺損的注射劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
人體軟組織填充是作為修復(fù)軟組織在損傷后的主要治療方法。十九世紀(jì)就已經(jīng)開 始使用石蠟、硅氧烷進(jìn)行填充。上個(gè)世紀(jì)八十年代之后又出現(xiàn)了明膠粉末材料，但其均有療 效不確定，毒副作用大等問題。1997年之后，Isolagen采用自體成纖維細(xì)胞作為團(tuán)組織填充材料，有了一定的療 效，但存在顯效慢，療效不顯著等問題。中國專利03155833. X中公開了一種除皺祛疤的注射劑，應(yīng)用了自體皮膚，經(jīng)體外 分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，制成于葡萄糖液中的一種注射劑，治療疤痕和祛除皺紋。由于該技術(shù)使 用的生物材料取自患者自體，無排斥反應(yīng)，效果持久，但該技術(shù)的不足之處是，注射劑中能 立即發(fā)揮人體軟組織的填充和修復(fù)功能的膠原蛋白含量較低，導(dǎo)致注射到疤痕和皺紋處后 見效較慢，一般要4-6個(gè)月；另外，使用動物血清作為培養(yǎng)液的成分也可能存在安全性方面 的問題。我們在2006年發(fā)明了采用自體的成纖維前體細(xì)胞和透明質(zhì)酸構(gòu)成的新的填充材 料，有效的改善了單純成纖維細(xì)胞治療出現(xiàn)效果慢的缺陷，但是透明質(zhì)酸最主要的作用是 保水，對細(xì)胞的擴(kuò)增和存活作用較弱。應(yīng)用治療者自體富含血小板的血漿作為注射材料的一部分，自體血漿中的血小板 能有效的提高自體細(xì)胞的成活率，注射后其產(chǎn)生的細(xì)胞因子能促進(jìn)自體細(xì)胞的擴(kuò)增和產(chǎn)生 較多的膠原蛋白，同時(shí)自體血漿中的血小板成分與凝血因子構(gòu)成一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使自體 細(xì)胞更大量的擴(kuò)增并擴(kuò)大了細(xì)胞分泌膠原蛋白的空間。本專利應(yīng)用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒包皮做為細(xì)胞培養(yǎng)來源，細(xì)胞活性好，并且治 療者可得到即時(shí)治療，優(yōu)于以往的自體細(xì)胞培養(yǎng)需要等待兩個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間才能得到治療。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述注射用人體軟組織填充劑的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種立即 見效、療效持久、受術(shù)者滿意度更高的注射用人體軟組織填充劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種注射用填充劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種治療皮膚缺損的注射劑，該填充劑主要由細(xì)胞成分與富含血小板血漿組成， 每毫升注射用填充劑中細(xì)胞成分的含量為1000-5000萬個(gè)，血小板的含量為100-700X106 個(gè)；所述細(xì)胞成分是用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮的皮膚經(jīng)過體外低血清或無血清 培養(yǎng)和擴(kuò)增，收集得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種。
優(yōu)選地，在本發(fā)明所述填充劑中，所述的經(jīng)培養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的真皮成纖維干 細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的數(shù)量之比為10-20 50-70 20-30。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述填充劑中，血漿中的血小板含量為100-700X IO6個(gè)/ml注 射用填充劑，進(jìn)一步優(yōu)選200-300X IO6個(gè)/ml注射用填充劑。本發(fā)明所述的填充劑除了細(xì)胞成分和富含血小板血漿、還可以含有一些輔助成 分，所述輔助成分可以是本領(lǐng)域常見的能夠加入到填充劑中的任何一種或多種成分，如自 體膠原蛋白、維生素、葡萄糖、等滲生理鹽水等等。本發(fā)明使用的低血清培養(yǎng)基僅需添加3% 5%胎牛血清，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基通常加 入約10%的新生牛血清，低血清培養(yǎng)基對于細(xì)胞生長、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有不良影 響，甚至有所改善。此外，本發(fā)明還提供了一種所述注射用人體軟組織填充劑的制備方法，該方法包 括下列步驟(1)采用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮的皮膚進(jìn)行體外低血清或無血清培養(yǎng) 和擴(kuò)增，對所得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行收集；(2)將收集到的細(xì)胞成分與自體富含血小板的血漿配成注射用人體軟組織填充 劑。本發(fā)明所采集的皮膚組織是流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮的皮膚，同時(shí)包括 表皮和真皮。在本發(fā)明所提供的填充劑制備方法中，將來源于流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包 皮皮膚，例如，1-30平方毫米的皮膚，在加入了生長因子和活性材料的低血清或無血清培養(yǎng) 液中進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，得到真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增中，所述培養(yǎng)液的組成可以是本領(lǐng)域常用的 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，例如，可以參見《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》中的有關(guān)介紹(2001年，科學(xué)出版社出版，主 編D. L.斯佩克特，黃培唐翻譯)。優(yōu)選地，在體外全程無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增過程中，使用的培 養(yǎng)液中還包括生長因子和活性材料。所述生長因子為選自上皮生長因子、成纖維生長因子 中的一種或多種；所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。所述上皮生長因 子在培養(yǎng)液中的含量可以為1至5納克/毫升，優(yōu)選為3納克/毫升；所述成纖維生長因子 在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20納克/毫升，優(yōu)選為10納克/毫升；所述氫化可的松在培 養(yǎng)液中的含量可以為0. 2至2微克/毫升，優(yōu)選為1微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含 量可以為2至20微克/毫升，優(yōu)選為10微克/毫升。上述的培養(yǎng)液和生長因子及活性材 料可以是選自一個(gè)公司或者多個(gè)公司(如美國的Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司 等)的市售產(chǎn)品。在本發(fā)明所提供的填充劑制備方法中，所述體外培養(yǎng)和擴(kuò)增可采用本領(lǐng)域常見的 任何用于為獲得自體細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方法，如組織消化培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法等，優(yōu) 選采用組織塊培養(yǎng)法。下面進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所提供的填充劑制備方法，但本發(fā)明并不因此而受到 任何限制。1、皮膚取材用酒精消毒流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮。用手術(shù)剪刀將表皮和真皮組織取下，放入組織保存液中。2、皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位，然后去除皮下組織和脂肪，將皮膚組織剪碎為0. 1-0. 5平方毫米的皮膚碎片，最后將皮膚碎片平鋪于培養(yǎng)皿的底面。也可首 先將皮膚組織塊用胰酶液消化一段時(shí)間，再將消化后的組織塊剪碎平鋪于培養(yǎng)皿的底面。3、細(xì)胞體外培養(yǎng)包括原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)步驟。原代培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和低血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使 細(xì)胞擴(kuò)增到50% -90%的培養(yǎng)皿底面即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入生長因子(如上皮生長因子、成纖維生長因 子等)和活性材料(如氫化可的松、肝素等)，培養(yǎng)2-8周，大約培養(yǎng)擴(kuò)增至1500萬-2億個(gè) 細(xì)胞。上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為1至5納克/毫升，優(yōu)選為3納克/毫升； 所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20納克/毫升，優(yōu)選為10納克/毫升； 所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量可以為0. 2至2微克/毫升，優(yōu)選為1微克/毫升；所述 肝素在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20微克/毫升，優(yōu)選為10微克/毫升。采用本領(lǐng)域常用的細(xì)胞培養(yǎng)條件即可，如可將從組織塊培養(yǎng)出的真皮細(xì)胞(含成 纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)用上述的低血清或無血清培養(yǎng)液在溫度為 37°C，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天換上述培養(yǎng)液一次，直至得到所需的細(xì)胞成分 的含量。在醫(yī)院或診所由醫(yī)護(hù)人員抽取治療者5-30毫升血液。在潔凈的實(shí)驗(yàn)室或化驗(yàn)室 條件下將此血液置入裝有細(xì)胞分離液的離心管中，以500-2500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心25分鐘， 優(yōu)選轉(zhuǎn)速1500轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選離心時(shí)間為15分鐘，提取上部的富含血小板的血漿作為自體 注射用的血漿。4、填充劑配制將培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到要求的細(xì)胞首先使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，使其脫離培養(yǎng)皿底 面，在使用無外源性蛋白的DMEM清洗數(shù)次，去除外源性生長因子和活性物質(zhì)。再將收集到 的細(xì)胞與少量膠原蛋白直接加入富含血小板的血漿中，混勻，配成注射填充劑，每毫升注射 用填充劑中細(xì)胞成分的總個(gè)數(shù)為1000-5000萬個(gè)，血小板的含量為100-700 X IO6個(gè)。治療步驟將含有細(xì)胞和血漿的溶液注射到治療部位，使填充部位出現(xiàn)發(fā)白和輕 微的隆起為止，注射到稍感硬度、發(fā)白，注射過程完成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的注射用人體的皮膚更具有細(xì)胞活性、擴(kuò)增性，在注射部 位能快速產(chǎn)生填充除皺和修復(fù)效果；隨后，在大量的血小板中產(chǎn)生的自體生長因子的作用 下，注射填充劑中含有的細(xì)胞成分能不斷地分泌出膠原蛋白，保持填充和修復(fù)的效果。該注 射用人體軟組織填充劑在注射后可快速出現(xiàn)明顯的填充和修復(fù)效果，且療效持久。因此，本發(fā)明的注射用人體軟組織填充劑可廣泛用于美容、改善皮膚彈性和光澤 以及其它部位和類型的填充和修復(fù)中，包括處理由于真皮缺損而導(dǎo)致的各種癥狀，例如面 部皺紋、凹陷性疤痕、妊娠紋、手背皺紋等，還可用于豐唇、增強(qiáng)真皮厚度和改善皮膚基質(zhì)寸。


圖1是培養(yǎng)成功的真皮細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片；圖2是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例的注射用人體軟組織填充劑在包裝瓶中照片。圖3和圖4是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例治療皺紋前后的對比照片， 其中圖3為受 術(shù)者鼻唇溝治療前照片，圖4為受術(shù)者鼻唇溝治療后照片；
具體實(shí)施例方式下面進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所提供的注射用人體軟組織填充劑及其制備方法，但 本發(fā)明并不因此而受到任何限制。實(shí)施例人體軟組織填充劑的制備一.自體健康皮膚樣品的提取用70%的酒精消毒流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮標(biāo)本，放入組織保存液 (DMEM細(xì)胞保存液，購自美國Hyclone公司)中，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、培養(yǎng)。二 .細(xì)胞懸液的制備1.皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位，然后去除 皮下組織和脂肪，將皮膚組織剪碎為0. 1-0. 5平方毫米的皮膚碎片，最后將皮膚碎片平鋪 于培養(yǎng)皿的底面。2.原代細(xì)胞培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和3%的胎牛血清，放 入Forma CO2 3131型培養(yǎng)箱中，在37°C，5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 3天換上述 培養(yǎng)液一次，當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到80%匯集后傳代。3.傳代細(xì)胞培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入上皮生長因子為3納克/毫升、成纖 維生長因子10納克/毫升、氫化可的松1微克/毫升、肝素10微克/毫升，每3-4天換上 述培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)4周，大約培養(yǎng)擴(kuò)增至1500萬個(gè)細(xì)胞。4.配制注射劑將培養(yǎng)數(shù)量達(dá)到要求的細(xì)胞首先使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，使 其脫離培養(yǎng)皿底面，再使用無外源性蛋白的DMEM清洗3次。將收集到的細(xì)胞與少量膠原蛋 白直接加入富含血小板的血漿中，混勻，配成注射填充劑，每毫升注射用填充劑中細(xì)胞成分 的總個(gè)數(shù)為1000-5000萬個(gè)，血小板的含量為100-700X 106個(gè)。病毒檢測皮膚組織和培養(yǎng)4周后的細(xì)胞進(jìn)行HIV和肝炎病毒的檢驗(yàn)，確定此為無 病毒細(xì)胞。免疫反應(yīng)測試第4周將0. Iml細(xì)胞與血小板注射液對受術(shù)者進(jìn)行皮試(同青霉 素皮試方法)，無免疫反應(yīng)。成品檢測1)外觀細(xì)胞與血小板注射液為黃色混懸液。2)本品中細(xì)胞分類檢定成纖維干細(xì)胞采用Brdu抗體測定(黃暉，賴西南，王正國，王麗麗，“創(chuàng)傷愈合中 物質(zhì)對表皮干細(xì)胞遷移及受體表達(dá)的作用”;《中華創(chuàng)傷雜志》2004年；20 (3) 142-145。利用 核標(biāo)記物)，產(chǎn)品中有10%的成纖維干細(xì)胞。成纖維前體細(xì)胞采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法觀察(在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀察，其標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為細(xì)小長索狀)，產(chǎn)品中有70%的成纖維前體細(xì)胞。成纖維細(xì)胞采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法觀察(在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀察，其 標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為呈多觸突的長索形細(xì)胞)，產(chǎn)品中有20%的成纖維細(xì)胞。3)無菌試驗(yàn)按《中國生物制品規(guī)程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》 A/B項(xiàng)進(jìn)行，結(jié)果符合無菌要求。三.治療用于額頭皺紋，眼角魚尾紋，脖頸皺紋，妊娠紋等所有面部及其它身體部位的皺紋 和細(xì)小皺紋；治療5例。1.治療者術(shù)前檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均正常，包括血尿便常規(guī)、心電圖、肝腎功能、HIV, HbsAg02.將注射部位用70%的酒精消毒，局部注射的利多卡因麻醉。3.將Iml填充劑吸入Iml的注射器中備用。4.取2. 2cm長的4. 5號針頭，采用多點(diǎn)斜面(針頭與皮膚的角度20° 45° )， 在注射部位注射時(shí)，將注射部位表皮拉緊注射細(xì)胞，使其發(fā)白，注射時(shí)使注射部位留有彌散 空間。將含有細(xì)胞和血漿的溶液注射到治療部位，使填充部位出現(xiàn)發(fā)白和輕微的隆起為止， 注射到稍感硬度，發(fā)白度更加明顯，注射過程完成。療程注射部位共注射1次。四、術(shù)后觀察、調(diào)護(hù)1.手術(shù)后，用冰袋敷注射處2小時(shí)。2.觀察局部及全身的情況一切正常。 3.每天二次口服維生素C (每次200mg，每天共400mg)，服用6個(gè)月。4.術(shù)后3天內(nèi)防曝曬及慎用刺激性化妝品。五、效果描述皺紋在注射后基本消失或明顯變淺，效果良好。注射前后的效果對比見圖3至圖 4。
權(quán)利要求
一種治療皮膚缺損的注射劑，該填充劑主要由細(xì)胞成分與富含血小板血漿組成，每毫升注射用填充劑中細(xì)胞成分的含量為1000-5000萬個(gè)，血小板的含量為100-700×106個(gè)；所述細(xì)胞成分是用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮的皮膚經(jīng)體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述富含血小板的 血漿是從治療者血液中提取，且所述血小板的含量范圍為100-700 X IO6個(gè)/ml注射用填充 劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述的經(jīng)培 養(yǎng)和擴(kuò)增后收集到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的數(shù)量之比為 10-20 50-70 20-30。
4.一種制備權(quán)利要求1至2中任意一項(xiàng)所述的注射用人體軟組織填充劑的方法，包括 以下步驟(1)采用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮的皮膚進(jìn)行體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò) 增，收集所得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞；(2)富含血小板血漿，是從治療者臂部抽全血5-30毫升，在體外分離所得富含血小板 的血漿。(3)將收集到的細(xì)胞成分或與富含血小板的血漿構(gòu)成注射用人體軟組織填充劑；每毫 升該填充劑中細(xì)胞成分的含量為1000-5000萬個(gè)，，若加入富含血小板血漿，則血小板的含 量為 100-700 X IO6 個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述低血清或無血清體外培養(yǎng)和擴(kuò) 增采用組織塊培養(yǎng)法。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò) 增中加入了生長因子和活性材料；所述生長因子選自上皮生長因子、成纖維生長因子中的 一種或多種，所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含 量為1至5納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為2至20納克/毫升；所 述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量為0. 2至2微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為2 至20微克/毫升。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中為3 納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為10納克/毫升；所述氫化可的松在 培養(yǎng)液中的含量為1微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為10微克/毫升。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于從治療者抽取5-30毫升全血， 進(jìn)行500-2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘離心得到富含血小板的治療者自體的血漿，其含量為 100-700X IO6 個(gè)/ml。
10.用培養(yǎng)的細(xì)胞與富含自體血小板的血漿與制備成注射液。注射過程為將培養(yǎng)好 的細(xì)胞與富含血小板的血漿制備的注射液注射到需要填充的部位。
全文摘要
一種治療皮膚缺損的注射劑，主要由細(xì)胞成分與富含血小板血漿組成，每毫升注射用填充劑中細(xì)胞成分的含量為1000-5000萬個(gè)，血小板的含量為100-700×106個(gè)；所述細(xì)胞成分是用流產(chǎn)胎兒皮膚或新生兒切除的包皮經(jīng)過體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增，收集得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種。血小板也是從治療者的自體血液中提取。本發(fā)明還提供了所述注射用人體軟組織填充劑的制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是注射后可立即出現(xiàn)明顯的填充和修復(fù)效果，且療效持久，治療程序簡便。
文檔編號A61K35/16GK101804071SQ20091000907
公開日2010年8月18日 申請日期2009年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日
發(fā)明者韓斌 申請人:北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司