專利名稱：用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品的制作方法
用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品
背景技術：
水產(chǎn)養(yǎng)殖似乎是滿足漁業(yè)(extractive fishing)所無法滿足的不斷增長的水產(chǎn)食品需求的唯一可能。在過去的50年間，全世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量已由50年代早期的不足 100萬噸的產(chǎn)量提高到2004年的5940萬噸。該產(chǎn)量水平的價值為703億美元。全世界總產(chǎn)量的69. 6%產(chǎn)于中國，21. 9%產(chǎn)于亞洲其它地區(qū)和太平洋地區(qū)，3. 5%產(chǎn)于西歐地區(qū)，并且0.4%產(chǎn)于中東歐地區(qū)。在環(huán)境方面，2004年來自海水養(yǎng)殖(咸水水產(chǎn)養(yǎng)殖)的水產(chǎn)產(chǎn)量為3020萬噸，占總產(chǎn)量的50. 9%。淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖提供2580萬噸4% )，而其余340萬噸(5.7%)來自半咸水(brackish)環(huán)境的產(chǎn)量。所有數(shù)據(jù)均來自于FisheriesTechnical Paper 2006, State of World Aquaculture(FAO)。歐洲的水產(chǎn)產(chǎn)量僅占世界產(chǎn)量的3%，但在數(shù)個種類的生產(chǎn)方面處于領先地位，例如大西洋鮭魚、鱒魚、海鱸、金頭鯛(gilthead seabream)、大菱鲆和貽貝。2002年的產(chǎn)量超過130萬噸，價值32. 8億歐元。地中海國家中最重要的物種是金頭鯛、海鱸和大菱鲆。2002 年，金頭鯛和海鱸二者的產(chǎn)量為181000噸，主要產(chǎn)地為希臘、土耳其、西班牙、意大利和法國。大菱鲆在2002年的產(chǎn)量為5320噸，其中75%產(chǎn)自西班牙。所有數(shù)據(jù)均來自FA0。魚類疾病已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的障礙，并且正對世界上很多國家的經(jīng)濟發(fā)展造成嚴重影響。疾病在很多情況下導致高死亡率，并且是重大產(chǎn)量損失的原因。水產(chǎn)損失還導致食物供應減少、收入和就業(yè)損失以及各種相關的社會后果。影響上述物種的最常見疾病及其病原(causal agent)(細菌或病毒)為弧菌病(弧菌屬美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞禾中(Photobacterium damselaesubsp. damselae, Vibrio spp·))、巴斯德菌
( ^Afe^T^ff(Photobacterium damselae subp. piscicida) )> ^jtff
菌病(photobacteriosis)(美人魚發(fā)光桿菌巴斯德菌亞種(Photobacterium damselae subp. pasteurella))、屈接桿菌病(flexibacteriosis)(海洋屈接桿菌(Tenacibaculum maritimum))、分枝桿菌病(myxobacteriosis)(海岸屈接桿菌(Flexibacter maritimus))、癤病(殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida))、鏈球菌病(副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis))、冬季疾病綜合癥(病鯖假單胞菌(Pseudomonas anguillis印tica))、病毒性腦病禾口視網(wǎng)膜病(viral encephaloretinopathy)(野田村病毒(Nodavirus))、淋巴囊腫(虹膜病毒科(Iridoviridae))、腸脹氣綜合癥(distendedgut syndrome)(病毒樣顆粒)、感染性胰腺壞死(IPNV)、感染性造血組織壞死(IHNV)或病毒性出血性敗血癥(VHS)。所有數(shù)據(jù)均來自Cultured AquaticSpecies Information Programme (FAO)。水產(chǎn)養(yǎng)殖場中物種的養(yǎng)殖條件(即高密度的動物或水生環(huán)境)適合于傳染性病原 (disease agent)在個體之間的傳播。此外，養(yǎng)殖場中的魚類在對其處理(manipulation) 期間產(chǎn)生的應激可能導致免疫系統(tǒng)抑制，所述免疫系統(tǒng)的抑制促進病原體的感染。因此，已在疫苗或免疫刺激產(chǎn)品的研發(fā)中投入大量研究精力以預防魚類疾病。由于避免了抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大量使用，疾病的預防還減少了對環(huán)境的影響。現(xiàn)已有數(shù)種產(chǎn)品用于魚類的疫苗接種或免疫系統(tǒng)刺激。實際上，已有可用于普通細菌性魚類疾病(例如弧菌病、發(fā)光桿菌病、癤病、屈撓桿菌病、冬季疾病綜合癥或鏈球菌病)以及可用于普通病毒性魚類疾病 (例如IPNV或IHNV)的疫苗(參見Toranzo等人，2005和Sommerset等人，2005的綜述)。疫苗接種有三種常見方法浸漬、注射和口服給藥。腹膜內(nèi)注射是最有效的疫苗接種途徑，這是因為其允許更好的劑量控制，并且可使用產(chǎn)生更好免疫應答的佐劑。但是，由于對魚類的鎮(zhèn)靜和處理可能導致動物的應激，并且可能在疫苗給藥不謹慎時對魚類造成傷害，所以注射途徑也存在一些缺點。此外，無法通過此途徑對小魚進行疫苗接種。由于簡單快速，所以養(yǎng)殖場常使用浸漬法，但該方法不能進行嚴格的劑量控制，并且使魚類產(chǎn)生應激并具有頑固的免疫系統(tǒng)抑制。疫苗的口服給藥不需要對魚類進行處理，并且是適合于對所有大小的動物進行免疫接種的方法，所述動物包括開始進食的幼魚，由于這些魚更易于被病原體感染，所以這一點非常重要?？诜緩降膸讉€缺點在于不能進行嚴格的劑量控制，并且需要大量抗原以進行免疫?？诜o藥的最大障礙是抗原常因酸性環(huán)境或蛋白酶活性而在腸中失活，并且阻止活性抗原的腸吸收。因此，有效的口服給藥需要對抗原進行保護(即包封)，以防止抗原在腸中降解(Hart等人，1988 ；Quentel和Vigneulle, 1997)。用于保護抗原免于降解的不同方法已顯示出一些具有前景的結果，例如包埋在脂質(zhì)體或藻酸鹽微粒中 (Ire 等人，2005 ；Maurice 等人，2004)。現(xiàn)有技術描述在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用免疫刺激劑(immunostimulant)以提高魚類對疾病的抵抗力。 已記載了很多不同免疫刺激劑的化學性質(zhì)和作用方式，所述免疫刺激劑例如細菌的結構元件(LPS)、來自細菌和絲狀真菌的各種β_1，3葡聚糖產(chǎn)物、來自酵母細胞壁的β_1，3/1，6 葡聚糖、來自多種生物來源的復雜碳水化合物結構(葡聚糖)、存在于某些動物的提取物中或通過魚類蛋白的酶解而制備的肽、核苷酸、合成產(chǎn)品(左旋咪唑)和維生素C(參見Raa， 1996的綜述)。所用的某些免疫刺激劑還增強特異性抗體反應(參見&ikai，1999的綜述)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中的數(shù)種情形適合于免疫刺激劑的使用，例如對魚類的處理、水溫變化、較高的病原體暴露、疫苗佐劑和所有應激狀態(tài)?，F(xiàn)已公布了關于免疫刺激劑在金頭鯛免疫系統(tǒng)中的作用的多項研究，所述免疫刺激劑例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞壁 (OrtUfio 等人,2002 ；Rodriguez 等人，2003)、殼多糖(Esteban 等人，2000 ；Esteban 等人， 2001 ；Cuesta 等人，2003)、維生素 C 和 E(Cuesta 等人，2002 ；Ortufio等人，2003)和左旋咪唑(Mulero等人，1998 ;CueSta等人，2002)。在已知對魚類有效的免疫刺激劑中，葡聚糖、 殼多糖和左旋咪唑增強吞噬活性，而酵母葡聚糖和維生素C還激活補體活性?，F(xiàn)已公開了將B-I，3/1，6葡聚糖作為免疫刺激劑應用的數(shù)項研究，并且在涉及提高大比目魚幼體在其發(fā)育關鍵期的存活率(0ttesen，Lunde和Engstad，1999)、增強對細菌性疾病的抵抗力(Raa 等人，1990 ；Robertsen 等人，1990)以及增強疫苗功效(Raa 等人，1990 ；Rorstad, Aasjord 和Robertsen，1993)的方面取得良好結果。由于細胞因子調(diào)控重要生物過程(例如細胞生長、細胞活化、炎癥、免疫力、組織修復、纖維化和形態(tài)發(fā)生)的量，所以細胞因子是屬于廣義概念的“免疫調(diào)節(jié)劑”的蛋白質(zhì)。 細胞因子是共享數(shù)種性質(zhì)的不同種類的蛋白質(zhì)，并且對于先天性及適應性免疫應答的介導效應期(mediate effectors phases)的發(fā)育和機能都至關重要。近幾年已克隆了大量細胞因子，并在多個魚類物種中進行測序(參見Bird等人，2002的綜述)?？砂凑占毎蜃拥墓δ軐⑵浞殖伤念?br> a)介導先天性免疫的細胞因子。在魚類中得到最佳表征的此類細胞因子是包括 IFNa和IFN β的I型干擾素(IFN)，包括IL-1 a、IL-1 β、IL-1受體拮抗劑和IL-18的白細胞介素(IL-I)家族，以及包括TNF a、TNF β、Lt β和Fas配體的腫瘤壞死因子(TNF)家族，其中TNFa是在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)控功能的最重要成員；b)調(diào)控造血作用的細胞因子；c)調(diào)控淋巴細胞的細胞因子；和d)控制非特異性效應細胞的細胞因子。在魚類中得到最佳表征的此類細胞因子是b)組中的白細胞介素2(IL_2)以及c) 組中的干擾素Y (IFNy)和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF^)0TNFa是單核細胞/巨噬細胞在急性炎癥期間產(chǎn)生的炎性細胞因子，并且負責細胞內(nèi)不同范圍的信號轉(zhuǎn)導事件。TNFa在對抗寄生性、細菌性和病毒性感染中作為重要介質(zhì)發(fā)揮作用(Czarniecki, 1993 ；Goldfeld 和 Tsai, 1996 ；Steinshamn 等人，1996)。TNFa 還具有其它重要的治療功能，包括抗腫瘤(Vilcek和Lee，1991)、睡眠調(diào)節(jié)(Krueger等人， 1998)和胚胎發(fā)育(Wride和Sanders，1995)。TNFa通過作為三聚體與細胞膜受體TNFR-I 或TNFR-2結合來發(fā)揮這些功能(Dembic等人，1990 ；Loetscher等人，1990)，這兩種受體均大量存在于大多數(shù)細胞中(Letscher等人，1991 ；Schoenfeld等人，1991)。TNFamRNA似乎在多種細胞中轉(zhuǎn)錄，并且主要以轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)控(Han等人， 1990)。TNFa以膜結合形式和可溶形式這兩種形式存在，每種形式可能具有不同的生理作用(Watts等人，1997)。TNFa表達為^kDa的膜結合前體，其被解聚素金屬蛋白酶 (TACEiTNFa轉(zhuǎn)化酶)溶蛋白性裂解，以產(chǎn)生17kDa的C端活性形式(Black等人，1997 ； Moss 等人，1997)。已對數(shù)種哺乳動物的TNF α基因(TNF α gen)完全或部分測序，所述哺乳動物包括人(Pennica 等人，1984)、黑猩猩(Kutsi 等人，2002)、小鼠(Shirai 等人，1988)、犬(Zucker 等人，1994)或貓(McGraw等人，1990)。也已對數(shù)種魚類的TNFa基因或TNF α基因片段測序，所述魚類例如黑鯛(black seabream) (Cai等人，2003)、虹鱒(Laing等人，2001)、鯉魚(Saeij等人，200 或斑馬魚(Phelan等人，2003)或金頭鯛(Garcia-Castillo等人， 2002)。金頭鯛的TNFa基因具有4個外顯子和3個內(nèi)含子，長度為1244pb。cDNA由1359pb 組成，其包括762pb的開放讀碼框(ORF)、142pb的5，-非翻譯區(qū)(UTR)和455pb的3'UTR0 推導蛋白具有253個氨基酸，估計分子量為^kDa,其(特別是在參與同受體相互作用的 C-端末端)與其它魚類的TNFa具有高序列同源性。TNFa蛋白包含在第37和第M殘基之間的跨膜區(qū)以及與TACE溶蛋白性裂解相關的Thr-Leu保守序列(Garcia-Castillo等人，2002)。因此，可以區(qū)分253個氨基酸的膜結合蛋白(proTNFa)和167個氨基酸的可溶蛋白(sbTNFa)。表達研究揭示TNFa在所檢測的所有金頭鯛組織(例如肝、腮、血液、頭腎、腹膜滲出液、腦和脾)中的組成型表達，巨噬細胞是此分子的主要來源之一。US 5871751 公開了用于治療對鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum)的感染敏感的魚類的疫苗和方法。所述疫苗包括缺少完整細胞表面相關蛋白P57的滅活微生物， 并可包被腸溶衣以供口服遞送。所述腸溶衣包括聚合物包衣，其不在胃中溶解和/或降解，但在進入腸道的較高PH環(huán)境時溶解。所公開疫苗的優(yōu)選實施方案是使用球形糖微球制成， 其由包含缺少完整細胞表面相關蛋白P57的滅活微生物的第一層包被，隨后由腸溶衣的第二層包被，所述第二層包含不在魚類的胃中溶解和/或降解的材料。WO 03/020040A1公開了由包封了含抗原的單細胞生物的多細胞生物組成的口服疫苗。此疫苗用于飼喂待接種疫苗的水生動物(例如魚類)。根據(jù)WO 03/020040，通過兩步飼喂將在單細胞微生物中表達的抗原遞送到水生動物中，即將單細胞微生物(包含抗原)飼喂給多細胞生物以及將多細胞生物飼喂給水生動物。根據(jù)WO 03/020040，總是需要單細胞微生物和多細胞生物二者同時存在。待表達的抗原依賴于誘導的免疫應答是否針對目標病原體。WO 03/020040描述了作為細菌抗原的假單胞菌外毒素A(PE)、作為單細胞微生物的大腸桿菌(E. coli)、作為多細胞生物的鹵蟲無節(jié)幼體(Artemianauplii)。根據(jù)WO 03/020040所公開的口服給藥疫苗的制備，所選的抗原嚴格依賴于疫苗應當針對的目標病原體。ES 2189608A1公開了用于生產(chǎn)重組金頭鯛(Sparus aurata L. ) IL-1 β的方法及其在經(jīng)濟魚類中作為疫苗佐劑和免疫刺激劑的用途。根據(jù)ES2189608，通過將其克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)表達載體中來生產(chǎn)重組IL_1 β。將由此獲得的重組蛋白純化，并用作漁業(yè)養(yǎng)殖中的免疫刺激劑和疫苗佐劑。本發(fā)明的目的是提供適合于口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品，其不發(fā)生水解和/或降解，并可被所給藥的生物完全吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一目的是提供能夠向目標個體直接給藥的免疫刺激產(chǎn)品。本發(fā)明的另一目的是提供能夠被生物吸收的免疫刺激產(chǎn)品，所述免疫刺激產(chǎn)品以大量的初始給藥量向所述生物給藥。本發(fā)明的又一目的是提供免疫刺激產(chǎn)品，其并非特異性地針對一個選定的病原體或一組選定的病原體。本發(fā)明的目的還在于提供制備可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品的方法，以及免疫刺激產(chǎn)品用于在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖中激活免疫應答的用途。因此，本發(fā)明提供至少包含微囊化的重組魚類細胞因子(特別是腫瘤壞死因子 α (TNFa))的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品、制備包含微囊化重組魚類細胞因子的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品的方法、及其用于在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖中激活免疫應答的用途。本發(fā)明的一方面體現(xiàn)在充當免疫刺激劑的活性分子(即細胞因子，特別是腫瘤壞死因子a (TNFa))是屬于期望激活其免疫應答的相同魚類物種的細胞因子的事實。由于這樣能夠增強已屬于某物種的一系列免疫刺激劑(immimostimulator)，從而激活該物種的免疫反應，因此這一方面非常重要。這意味著不通過任何方式向所述物種給藥外源因子、化合物或產(chǎn)品，從而使所得結果具有極大的優(yōu)勢，并且獲得較為安全的途徑。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，充當免疫刺激劑的活性分子是從魚類本身獲得的細胞因子，即腫瘤壞死因子a (TNFa)0因此，在提供免疫刺激產(chǎn)品時不會在動物中引入外源物質(zhì) (strange substance)，并避免了副反應的可能性。根據(jù)本發(fā)明，從魚類組織中分離編碼所選細胞因子的基因，并將其克隆到用于在適合的宿主微生物中表達細胞因子的表達載體中。在生物反應器中使用適合的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，以獲得最佳的細胞因子表達和高生物質(zhì)產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案，所述宿主微生物是酵母，優(yōu)選巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和釀酒酵母，最優(yōu)選巴斯德畢赤酵母。選擇酵母作為宿主微生物不是偶然的，而是因為酵母是能夠取決于所選的表達載體而在細胞外或細胞內(nèi)表達所選細胞因子的真核微生物。這一方面使得能夠決定如何表達重組蛋白，從而在發(fā)酵過程中以及在所得產(chǎn)品的純化中提供多個優(yōu)點。隨后對所述重組蛋白(單獨獲得或在宿主微生物內(nèi)獲得)進行微囊化過程，由此在任選的純化步驟后獲得即可給藥的微囊化蛋白。所述“微囊化過程”是指適合于為重組細胞因子提供至少部分包被的任何過程，所述包被適合于保護所述細胞因子免于腸降解。實際上，在口服給藥免疫刺激物質(zhì)的情況下，必須有有效的保護方法以避免所述物質(zhì)的腸降解，并允許幾乎完全的腸吸收。微囊化是使用聚合材料的連續(xù)薄膜環(huán)繞或包被液體或固體材料的極小液滴或顆粒，從而獲得微粒的技術過程。微囊化技術廣泛應用于多種生物和化學體系，并可生產(chǎn)大量的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，用于對所關注及所選的細胞因子 (特別是TNFa )成功實現(xiàn)微囊化的主要技術是通過噴霧干燥進行霧化。在通過噴霧干燥進行霧化的技術中，將活性分子溶解或懸浮在熔體或聚合物溶液中，并留在干燥顆粒中。根據(jù)本發(fā)明，用于保護重組蛋白微粒免受存在于腸中酸性PH影響的最有用的聚合物選自例如 醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯、羧甲基纖維素、甲基丙烯酸共聚物 (即甲基丙烯酸共聚物LS，例如Eudragit L-30和Kollicoat)。其它可用的聚合物選自例如麥芽糊精、殼聚糖、明膠、淀粉或阿拉伯膠。在本發(fā)明中已使用TNFa作為在微生物中表達的細胞因子的實例，隨后將其與多種聚合物混合以保護蛋白免受腸的酸性環(huán)境和蛋白酶活性的影響。當宿主微生物允許重組蛋白(即TNF α)在細胞外過度表達時，可以將其直接使用。另一優(yōu)點在于，當所述蛋白在宿主微生物內(nèi)過度表達時，對相同的微生物進行微囊化過程，從而獲得能夠直接使用并體現(xiàn)所有上述優(yōu)點的微囊化微生物。通過噴霧干燥將所得的過度表達蛋白干燥，并添加到對健康魚類具有有益效果的魚食中。本發(fā)明開發(fā)的產(chǎn)品對水產(chǎn)市場具有重大意義，其預防感染所致的魚類疾病、保護某些應激環(huán)境下的魚類，并作為疫苗佐劑。根據(jù)本發(fā)明，由于微囊化過程而獲得的優(yōu)點，當所述免疫刺激產(chǎn)品用于成魚的處理時，均可將其直接給藥。反之，當所述免疫刺激產(chǎn)品用于小魚或幼魚的處理時，可將其飼喂給多細胞生物(例如鹵蟲無節(jié)幼體)，隨后將易于被小魚群食用的所述多細胞生物飼喂給小魚。在上述兩種情況下，所述免疫刺激產(chǎn)品的微囊化均使得能夠安全地保持所述產(chǎn)品的主要特征和活性，從而產(chǎn)生巨大的優(yōu)勢。例如，現(xiàn)已將金頭鯛的重組SbTNFa進行純化，并在體內(nèi)和體外測定其生物活性。 重組蛋白在N-端末端包含六個組氨酸標記以用于親和色譜純化以及免疫印跡中的抗-多組氨酸mAb檢測。腹膜內(nèi)注射導致a)引發(fā)腹膜滲出液和頭腎(HK)白細胞的呼吸爆發(fā)；b) 向注射位點快速募集吞噬粒細胞；以及c)在HK中誘導粒細胞生成。sbTNFa能夠在體外誘導HK細胞的強烈增殖。本發(fā)明的另一優(yōu)點體現(xiàn)在表達TNF α細胞因子的宿主微生物本身能夠充當免疫刺激物質(zhì)的額外來源的事實。實際上，細菌的某些結構元件(來自酵母細胞壁的葡聚糖或者來自多種生物來源的復雜碳水化合物結構(葡聚糖))可用作免疫刺激劑?，F(xiàn)在通過以下實施例說明本發(fā)明，所述實施例是使用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要意義的數(shù)個魚類物種的TNFa進行的。然而，在實施本發(fā)明時，也可使用其它魚類物種的TNFa 以及其它細胞因子。然而，本發(fā)明也適用于提取的或通過合成獲得的細胞因子。附圖簡述現(xiàn)在參考所附的以下非限制性實施例和附圖更為詳細地進一步公開本發(fā)明，其中

圖1 顯示用于基因構建體的引物。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖2 包含金頭鯛sbTNFa及推導蛋白序列的DNA片段。以斜體字顯示BamHI限制位點。圖3 包含金頭鯛Hise-sbTNFa及用于在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用于在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖4 包含海鱸Hise-sbTNFa及用于在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的 DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用于在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖5 包含大菱鲆Hise-sbTNFa及用于在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用于在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖6 顯示SDS-PAGE和使用抗多組氨酸mAb的蛋白質(zhì)印跡法(分別為A和B)。箭頭表示在1)大腸桿菌；2)釀酒酵母和幻巴斯德畢赤酵母中表達的金頭鯛的His6-sbTNFa。圖7 在飼喂染色的重組酵母60分鐘后，對鹵蟲無節(jié)幼體的顯微觀察。A)鹵蟲無節(jié)幼體和B)消化道內(nèi)的用DTAF熒光染色的酵母。圖8 通過依賴魯米諾化學發(fā)光顯示由頭腎白細胞產(chǎn)生的呼吸爆發(fā)活性。圖9 頭腎和腸中的數(shù)個炎性基因的mRNA水平。優(yōu)選實施方案描述實施例1 金頭鯛TNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆至Ij pET15b 中使用LPS刺激的頭腎cDNA作為PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5 (圖1)擴增sbTNF a。這兩個引物都包含BamHI限制位點，用于隨后在質(zhì)粒pETMb (Novagen)的相同位點中克隆PCR產(chǎn)物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50μΜ、0. 2mM引物、含MgCl2 的IX緩沖液PLUS和1單位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在 EppendorfMastercycler Gradient中進行循環(huán)反應，包括95°C 2分鐘的1個循環(huán)，95°C 45 秒、60°C 45秒和72°C 30秒的25個循環(huán)，以及隨后72°C 10分鐘的1個循環(huán)。使用QIAquick PCR Purification Kit ^liagen)純化PCR產(chǎn)物，并在室溫下使用1單位的T4DNA連接酶 (New England BioLabs,Inc.)以插入片段(insert)質(zhì)粒=3 1 的比例與質(zhì)粒 pGEM-T Easy(Promega)連接(Iigate) 16小時。使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，并涂布在包含氨芐西林和X-Gal (Sigma)的LB平板上。將平板在37°C下溫育，并選擇數(shù)個所得白色菌落以檢測插入片段的存在，所述檢測是通過用QIApr印SpinMiniprep Kit(Qiagen) 分離質(zhì)粒，并用BamHI消化來進行的。將包含插入片段(具有BamHI末端的sbTNF α ；圖 2)的所選質(zhì)粒命名為PVP81。使用10單位的BamHI消化此質(zhì)粒和500ng的pETMb，從而釋放PVP81的sbTNFa，并將pET 1 線性化。在低熔點瓊脂糖(agarose low meelting) (Pronadisa)凝膠中電泳分離，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit ^jiagen)純化插入片段和線性質(zhì)粒二者，并在室溫下使用1單位的T4DNA連接酶(New EnglandBioLabs, Inc.) 連接16小時。使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，并涂布在包含氨芐西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，并分離數(shù)個所得菌落的質(zhì)粒，用BamHI消化以檢測插入片段的存在，并用PvuII消化以檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析儀 (CIB, CSIC)對所選質(zhì)粒進行測序。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和表達試驗使用包含sbTNF α的質(zhì)粒pETMb轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，并將混合物涂布在包含氨芐西林的LB平板上。將數(shù)個所得菌落在LB-氨芐西林培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物稀釋到新鮮LB-氨芐西林中，然后在37°C下培養(yǎng)至0D_ = 0. 8，并在25°C或 37°C下使用ImM異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG ；Applichem)誘導0. 25_4小時。通過離心 0. Iml誘導培養(yǎng)物(HOOOrpm)來檢查全細胞提取物中的蛋白表達，并在SDS上樣緩沖液中煮沸以溶解細胞團塊(cell pellet)，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb(Sigma)的蛋白質(zhì)印跡法。實施例2 金頭鯛sbTNF α在釀酒酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 p424_GPD 中使用包含sbTNF α的質(zhì)粒pET 1釙作為PCR中的模板，以使用引物TNF-EC0F和 TNF-ECOR(圖1)擴增包括613pb的Hi%-sbTNF α的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用于在質(zhì)粒p4M-GPD(ATCC 87357)的相同位點中克隆PCR產(chǎn)物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ M、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩沖液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環(huán)反應，包括95°C 5分鐘的1個循環(huán)，95°C 30秒、62°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環(huán)，以及隨后720C 10分鐘的1個循環(huán)。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產(chǎn)物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和250ng p4M_GPD，隨后在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細胞中，并在含100 μ g/ml氨芐西林的LB平板上選擇包含質(zhì)粒的菌落。使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物PRO-GPD和TER-GPD (圖1)，通過菌落PCR鑒定重組體。使用 QIApr印 SpinMiniprep Kit ^jiagen)純化包含 His6_sbTNF α 的所得質(zhì)粒 p424_GPD，并在使用EcoRI消化后檢測插入片段的釋放，并通過SmaI和NcoI消化檢測插入片段的方向。 還使用ABI Prism 3130基因分析儀(University of Murcia)對質(zhì)粒進行測序。釀酒酵母的轉(zhuǎn)化和表達試驗用于轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株為EGY48 (Invitrogen)。為了制備用于轉(zhuǎn)化的EGY48，將在YPD培養(yǎng)基蛋白胨、酵母提取物、2%葡萄糖)中生長的OD6tltl = 0.5的IOOml培養(yǎng)物的細胞在4°C下以2500rpm離心5分鐘。在用無菌水清洗(waste)的步驟后，將細胞重新懸浮于 IX LiAc-TE(0. IM醋酸鋰、IOmM Tris pH 7. 5、lmM EDTA pH 8.0)中。為了進行轉(zhuǎn)化，將10 μ 1 0. 3 μ g/ μ 1的DNA與50 μ 1細胞和50 μ gDNA載體(預先煮沸的鮭魚DNA)混合。隨后將其加入到混合物(mix) IX LiAc-TE-PEG(如上文所述的LiAc-TE和PEG 40%)，并在30°C下溫育30分鐘，隨后添加DMSO至10%，并在42°C下溫育10分鐘。將細胞涂布到 MMSS+SDC-Trp (包含2%葡萄糖、0. 17%酵母氮源、0. 25%硫酸銨、IM山梨醇和SDC-Trp的基本培養(yǎng)基)平板上，在30°C下溫育數(shù)天，直至出現(xiàn)菌落。SDC(合成葡萄糖補充劑(synthetic dextrosecomplete))包括20mg/l腺嘌呤、精氨酸、組氨酸、色氨酸和尿嘧啶，30mg/l亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸和異亮氨酸，50mg/l苯丙氨酸，200mg/l蘇氨酸，150mg/l纈氨酸。為了檢測Hk6-SbTNFa的表達，將數(shù)個菌落在YPD培養(yǎng)基或MM+SDCIrp (包含 2%葡萄糖、0.17%酵母氮源、0.25%硫酸銨和SDC-Trp的基本培養(yǎng)基)中培養(yǎng)數(shù)小時。為了檢查蛋白表達，將全細胞提取物在Branson超聲波儀150中以10個30秒的脈沖超聲破碎，或者將其在珠磨式組織研磨器(bead beater)中以8個1分鐘的脈沖用玻璃珠破碎。在處理后，通過離心收集細胞剩余物，并通過在SDS上樣緩沖液中煮沸來對上清液進行 HiS6-SbTNF α檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質(zhì)印跡法。實施例3 金頭鯛sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中使用包含sbTNF α的質(zhì)粒pET 1釙作為PCR中的模板，以使用引物TNF-EC0PP和 TNF-ECOR (圖1)擴增包括618pb的Hi%-sbTNFa的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用于在質(zhì)粒pPICZA (Invitrogen)的相同位點中克隆PCR產(chǎn)物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ m、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩沖液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環(huán)反應，包括95°C 5分鐘的1個循環(huán)，95°C 30秒、55°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環(huán)，以及隨后720C 10分鐘的1個循環(huán)。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產(chǎn)物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和200ng p4M_GPD，隨后在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 T0P10F'感受態(tài)細胞中，并在含25 μ g/ml博萊霉素(zeocin) (Invitrogen)的低鹽LB平板上選擇包含質(zhì)粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PIC5和PIC3，通過菌落PCR鑒定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit(Qiagen)純化包含Hi -sbTNF α 的所得質(zhì)粒pPICZA，并通過用EcoRI消化檢測插入片段的釋放，并通過用BioI消化檢測插入片段的方向。還使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，Universityof Murcia)對質(zhì)粒進行測序。在重組質(zhì)粒中，sbTNFa的起始密碼子(star codon)ATG位于用于在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖幻中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物TNF-EC0PP中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗在將巴斯德畢赤酵母電穿孔之前，通過在37°C下用McI或RiieI消化來將包含 HiS6-SbTNFa的質(zhì)粒pPICZA線性化，以供隨后在巴斯德畢赤酵母的基因組DNA中的重組及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit ^liagen)純化總量為5 μ g的線性質(zhì)粒，并洗脫到10μ 1無菌水中。用于電穿孔的巴斯德畢赤酵母菌株為Χ-33。為了制備用于電穿孔的 Χ-33，將OD6tltl = 1. 5的IOOml培養(yǎng)物的細胞在4°C下以1500Xg離心5分鐘。在用無菌水清洗的2個步驟后，將細胞重新懸浮于IM山梨醇中，如前所述進行離心，并最后重新懸浮于 ImllM山梨醇中。為了電穿孔，將10 μ 1 DNA與80 μ 1細胞混合，并轉(zhuǎn)移到冰冷的0. 2cm電穿孔管(electroporation cuvette,BioRad)中。溫育 5 分鐘，然后將細胞在 MicroPulser 電穿孔儀(BioRad)中在25 4 6、1.51^和400 0的條件下施以脈沖。隨即向管中添加Iml冰冷的IM山梨醇，并將所得混合物在30°C下溫育1小時。將細胞涂布到包含100 μ g/ml博萊霉素(Invitrogen)的YPDS平板上，在30°C下溫育數(shù)天，直至出現(xiàn)菌落。使用引物PIC5和 PIC3的PCR和2X PCR Master Mix (i^ermentas)分析數(shù)個轉(zhuǎn)化體是否存在插入片段，并測定 HiS6-SbTNFa 的表達。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit(Fermentas) 分離基因組DNA，并使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hk6-SbTNF α的DNA 片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。在30°C和250rpm下，將帶有Hi%-sbTNFa的重組巴斯德畢赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生生物質(zhì)，隨后進行甲醇誘導直至培養(yǎng)物達到OD6tltl約為 6。通過在3000 X g下離心5分鐘來收集細胞，并將團塊重新懸浮于包含0. 5%甲醇的200ml 基本培養(yǎng)基中直至OD6tltl約為1，以誘導表達。如前所述溫育培養(yǎng)物，每M小時添加0.5% 甲醇以維持誘導。在數(shù)個時間點收集樣品以分析蛋白表達。為了檢查蛋白表達，將全細胞提取物在Branson超聲波儀150中以10個30秒的脈沖超聲破碎，或者將其在珠磨式組織研磨器中以8個1分鐘的脈沖用玻璃珠破碎。在處理后，通過離心收集細胞剩余物，并通過在SDS上樣緩沖液中煮沸來對上清液進行Hk6-SbTNF α檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質(zhì)印跡法。實施例4 海鱸SbTNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆到 pETMb 中使用得自肝的海鱸cDNA作為PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5擴增sbTNF α。 這兩個引物都包含BamHI限制位點，用于隨后在質(zhì)粒pETMb (Novagen)的相同位點中克隆 PCR產(chǎn)物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50μΜ、0. 2mM引物、含MgCl2的IX緩沖液PLUS和 1 單位 Eco Taq PLUSDNA 聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在 Smart Cycler (Cepheid) 中進行循環(huán)反應，包括95°C 5分鐘的1個循環(huán)，95°C 45秒、55°C 45秒和72°C 90秒的30 個循環(huán)，以及隨后72°C 10分鐘的1個循環(huán)。在0. 8%瓊脂糖凝膠(Pronadisa)中電泳分離，然后使用 QIAquick Gel Extraction Kit ^jiagen)純化 PCR 產(chǎn)物。在 37°C下使用 10 單位BamHI將純化片段和質(zhì)粒pETMb消化2小時，并在22°C下使用1單位T4DNA連接酶 (Fermentas)將此前使用PCRPurification Kit純化的DNA連接過夜。使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，并涂布在包含氨芐西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，并使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物T7F和T7R(圖1)，通過菌落PCR鑒定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit ^jiagen)分離數(shù)個所得菌落的質(zhì)粒，用BamHI消化檢測插入片段的釋放，并用PvuII消化檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)對重組質(zhì)粒進行測序。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和表達試驗如實施例1所述進行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和海鱸Hk6-SbTNF α的表達試驗。實施例5 海鱸sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中如實施例3所述，將海鱸His6-sbTNF α克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)對包含海鱸Hk6-SbTNF α的所得質(zhì)粒pPICZA進行測序。與實施例3—樣，sbTNFa的起始密碼子ATG位于用于在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖4)中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物 TNF-EC0PP 中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗如實施例3所述進行電穿孔，但使用RiieI (Fermentas)進行質(zhì)粒的線性化。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit (Fermentas)分離 DNA，并使用 EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hi%-sbTNF α的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。同樣如實施例3所述進行表達試驗。實施例6 大菱鲆SbTNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆到 pETMb 中使用得自肝的大菱鲆cDNA作為PCR中的模板，以使用引物TNFR0-BAMF和 TNFR0-BAMR(圖1)擴增sbTNFa。這兩個引物都包含BamHI限制位點，用于隨后在質(zhì)粒 pET 15b (Novagen)的相同位點中克隆PCR產(chǎn)物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50 μ M、0. 2mM 引物、含MgCl2W IX緩沖液PLUS和1單位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler (Cepheid)中進行循環(huán)反應，包括95°C 5分鐘的1個循環(huán)，95°C 45 秒、55°C 45秒和72°C 90秒的30個循環(huán)，以及隨后72°C 10分鐘的一個循環(huán)。在0. 8%瓊脂糖凝膠(Pronadisa)中電泳分離，然后使用 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)純化 PCR產(chǎn)物。在37°C下使用10單位BamHI將純化片段和質(zhì)粒pETMb消化2小時，并在22°C 下使用1單位T4DNA連接酶(Fermetas)將此前使用PCR Purification Kit純化的DNA連接過夜。使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，并涂布在包含氨芐西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，并使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物T7F和T7R，通過菌落PCR鑒定重組體。分離數(shù)個所得菌落的質(zhì)粒，用BamHI消化檢測插入片段的釋放，并用PvuII消化檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析儀(CIB，CSIC)對所選質(zhì)粒進行測序。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和表達試驗如實施例1所述進行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和大菱鲆Hk6-SbTNF α的表達試驗。實施例7 大菱鲆sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中如實施例3所述，將大菱鲆Hk6-SbTNF α克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)對包含大菱鲆Hi -sbTNF α的所得質(zhì)粒pPICZA 進行測序。與實施例3—樣，sbTNFa的起始密碼子ATG位于用于在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖幻中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物 TNF-EC0PP 中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗如實施例3所述進行電穿孔，但使用RiieI (Fermentas)進行質(zhì)粒的線性化。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit (Fermentas)分離 DNA，并使用 EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hi%-sbTNF α的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。
同樣如實施例3所述進行表達試驗。實施例8 通過色譜純化sbTNF α使用AKTA Explorer FPLC(GE Healthcare)，通過親和色譜純化在大腸桿菌、釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母中表達的Hk6-SbTNF α。通過帶有Ni2+的固定化金屬離子親和層析 (IMAC)用Hisl^rap FF柱(GE Healthcare)進行純化，這是用于純化組氨酸標記蛋白的方法。通過UNICORN 5. 10測量^Onm的吸光度。以lml/min的流速，使用至少5倍柱體積的結合緩沖液OOmM磷酸鈉、0. 5M NaCl、5mM咪唑，pH 7. 4)平衡體積為Iml的柱。隨后如實施例 2所述，通過超聲處理或珠磨式組織研磨器溶解生長的培養(yǎng)物樣品，并進一步離心以去除團塊并獲得澄清的上清液，此后將2mL此上清液的樣品上柱。使用結合緩沖液洗柱，直到吸光度達到穩(wěn)定的基線(10-15柱體積)。最后使用漸增量的20-25柱體積的線性梯度的洗脫緩沖液QOmM磷酸鈉、0. 5M NaCUO. 5M咪唑，pH 7.4)洗脫與柱結合的蛋白。使用自動流分收集器收集Iml洗脫物流分。通過SDS-PAGE和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的免疫印跡法檢測包含蛋白的流分中是否存在Hk6-SbTNF α。將所選流分混合，并通過Bradford(Sigma) 測定Hk6-SbTNF α的量。在必要時，使用凝血酶-瓊脂糖(Recom-Τ ；Sigma)去除Hk6標記。實施例9 通過SDS-PAGE和免疫印跡法檢測sbTNF α通過用12. 5%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析帶有Hk6-SbTNFa的樣品。使用0. 考馬斯(coomassie)將凝膠染色30分鐘，并區(qū)分出對應于HiS6-SbTNF α的2 IkDa帶。為了通過免疫印跡法檢測Hi S6-SbTNF α，在上述SDS-PAGE后，在TBS (20mM Tris-HCl、150mM甘氨酸(glicine)、20 %甲醇)中，在100V下將凝膠向硝酸纖維素膜 (Sigma)中轉(zhuǎn)移 1 小時。在 4°C下使用含有 5% BSA 的 TTBS(IOmM Tris-HClUOOmM NaCl, 0. 1 % Tween 20)將所述膜溫育過夜以阻斷蛋白。使用TTBS清洗所述膜，然后將其與 TTBS+5% BSA+1 1000抗多組氨酸mAb (Sigma) —起溫育2小時。隨后再次使用TTBS和 TBS清洗所述膜，隨后使用ECL (Amersham Biosciences)染色。顯示出對應于Hi -sbTNF α 的21kDa單帶(圖6)。實施例10 通過發(fā)酵培養(yǎng)酵母在生物反應器系統(tǒng)(Applicon)中進行轉(zhuǎn)化酵母的發(fā)酵培養(yǎng)。例如，將巴斯德畢赤酵母菌株在含有YPGly培養(yǎng)基的燒瓶中培養(yǎng)M小時直至培養(yǎng)物達到0D_高于30。隨后將生長的培養(yǎng)物接種到含有MMG (含甘油的基本培養(yǎng)基)的生物反應器系統(tǒng)中。培養(yǎng)條件為溫度30°C，pH5.00(通過添加朋3進行控制)，在500-1250rpm 下攪拌，以及攪拌下30%的氧級聯(lián)。通過BioXpert V2測量參數(shù)。以分批方式進行發(fā)酵直到培養(yǎng)物達到0D_為50-80。此后以分批進料方式進行發(fā)酵，并開始供給甘油，持續(xù)10小時(0D_為260-280的培養(yǎng)物)。最后供給甲醇，持續(xù)40小時，在OD6tltl為380-420時結束培養(yǎng)。通過免疫印跡法分析重組TNF HiS6-SbTNF α的表達分析(參見實施例9)。實施例11 重組酵母的微囊化在發(fā)酵達到預期的生物量和重組TNF HiS6-SbTNFa的最佳表達后，在無菌條件下收集液體培養(yǎng)基(broth)，并配以20%麥芽糊精(malodextrin)和10%保護聚合物Kollicoat MAE lOOP(BASF)。隨后通過噴霧干燥器(Buchi)泵吸配置的懸浮液，將入口溫度控制在120°C，并將出口溫度控制在85 °C。通過免疫印跡法分析重組酵母的最終微囊以確定沒有細胞存活并且存在TNF HiS6-SbTNFa (參見實施例 10)。實施例12 利用微囊化的重組酵母富集鹵蟲無節(jié)幼體將鹵蟲無節(jié)幼體在裝有500ml無菌全濃度(full-strength)海水的燒瓶中孵化(去被膜卵)過夜，通過與魚池氣泵相連的送風管曝氣，并在往復振蕩的水浴中保持在 ^°C。孵化后M小時，將無節(jié)幼體收集到富集系統(tǒng)中。此系統(tǒng)由裝有IOOml清潔海水的燒瓶組成，其放置于相同的水域中并各自曝氣。對所有試驗，通過采集自10個0. 5ml海水的樣品來評估孵化比例和無節(jié)幼體的數(shù)量。通過用DTAF染色微囊化重組酵母來評估用該酵母富集的鹵蟲無節(jié)幼體的最佳制備時間。隨后，使用染色酵母飼喂鹵蟲無節(jié)幼體。在飼喂后0分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘和120分鐘殺死該鹵蟲無節(jié)幼體。使用熒光顯微鏡觀察富集的鹵蟲。結果(圖7)顯示在飼喂后，首先觀察到口腔區(qū)域的微囊化重組酵母量的增加，隨后整個腸道充滿微囊化重組酵母，并且不能區(qū)分細胞個體。富集鹵蟲無節(jié)幼體的最佳時間為60分鐘。實施例13 金頭鯛sbTNFa在巴斯德畢赤酵母中的表達和分泌將His6-sb TNFa 克隆至Ij pPICZ a A 中使用包含sbTNFa的質(zhì)粒pETMb作為PCR中的模板，以使用引物TNF-ECOF和 TNF-ECOR(圖1)擴增包括615pb的Hi%-sbTNF α的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用于在質(zhì)粒pPICZ a A(Invitrogen)的相同位點中克隆PCR產(chǎn)物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ M、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩沖液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環(huán)反應，包括95°C 5分鐘的1個循環(huán)，95°C 30秒、55°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環(huán)，以及隨后720C 10分鐘的1個循環(huán)。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產(chǎn)物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和200ng pPICZA，隨后在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 T0P10F'感受態(tài)細胞中，并在含25 μ g/ml博萊霉素(Invitrogen)的低鹽LB平板上選擇包含質(zhì)粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PICa和PIC3，通過菌落PCR 鑒定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit ^liagen)純化包含Hi -sbTNF α的所得質(zhì)粒pPICZ α Α,并通過用EcoRI消化檢測插入片段的釋放，并通過用NdeI消化檢測插入片段的方向。還使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，Universityof Murcia)對質(zhì)粒進行測序。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗在將巴斯德畢赤酵母電穿孔之前，通過在37°C下用McI或RiieI消化來將包含 HiS6-SbTNF α的質(zhì)粒pPICZ α A線性化，以供隨后在巴斯德畢赤酵母的基因組DNA中的重組及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit ^liagen)純化總量為5 μ g的線性質(zhì)粒，并洗脫到10μ1無菌水中。用于電穿孔的巴斯德畢赤酵母菌株為Χ-33。為了制備用于電穿孔的Χ-33，將OD6tltl = 1. 5的IOOml培養(yǎng)物的細胞在4°C下以1500Xg離心5分鐘。在用無菌水清洗的2個步驟后，將細胞重新懸浮于IM山梨醇中，如前所述進行離心，并最后重新懸浮于ImllM山梨醇中。為了電穿孔，將10 μ 1 DNA與80 μ 1細胞混合，并轉(zhuǎn)移到冰冷的0. 2cm 電穿孔管(BioRad)中。溫育5分鐘，然后將細胞在MicroPulser電穿孔儀(BioRad)中在 25μ F、l. 5kV和400 Ω的條件下施以脈沖。隨即向管中添加Iml冰冷的IM山梨醇，并將所得混合物在30°C下溫育1小時。將細胞涂布到包含ΙΟΟμ g/ml博萊霉素(Invitrogen)的 YPDS平板上，在30°C下溫育數(shù)天，直至出現(xiàn)菌落。使用引物PIC5和PIC3的PCR和2X PCR Master Mix (i^ermentas)分析數(shù)個轉(zhuǎn)化子是否存在插入片段，并測定Hi%-sbTNF α的表達。 在所選的菌落中，使用Genomic DNAPurification Kit(Fermentas)分離基因組DNA，并使用 EcoTaq PLUS DNA 聚合酶(Ecogen)擴增包含 Hk6-SbTNF α 的 DNA 片段，以使用 ABI Prism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。在30°C和250rpm下，將帶有Hi%-sbTNFa的重組巴斯德畢赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生生物質(zhì)，隨后進行甲醇誘導直至培養(yǎng)物達到OD6tltl約為 6。通過在3000Xg離心5分鐘來收集細胞，并將團塊重新懸浮于包含0. 5%甲醇的200ml 基本培養(yǎng)基中直至OD6tltl約為1，以誘導表達。如前所述溫育培養(yǎng)物，每M小時添加0.5% 甲醇以維持誘導。在數(shù)個時間點收集樣品以分析蛋白表達。為了檢查蛋白表達，通過在SDS 上樣緩沖液中煮沸來對樣品的上清液進行Hk6-SbTNFa檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質(zhì)印跡法。實施例14 微囊化重組酵母的功效將體重為 120g 的健康金頭鯛(Sparus aurata L. ) (Sparidae, Perciform, Teleostei)樣本飼養(yǎng)在天然溫度和光照期的2m3流動海水池(溶解氧6ppm，流速20%池體積/小時)中，并使用商品飼料顆粒(Trouvit，Burgos，Spain)飼喂，每天兩次。對實驗組飼喂其基礎食物，但每兩天補充0. 1%、1%或10%的對照酵母或過度表達成熟(活性) sbTNF α的微囊化酵母。在所有取樣時間(處理后2天、4天、6天和10天)將該樣本稱重， 并取出頭腎和腸，并將其處理以供光學顯微鏡研究和基因表達研究。所描述的實驗遵循歐盟理事會(European Union Council) (86/609/EU)和西班牙穆爾西亞大學生物倫理委員會 (Bioethical Committee of the University of Murcia(Spain))有關使用實驗動物的方針。測量作為不同刺激時間后由頭腎白細胞懸液產(chǎn)生的依賴魯米諾化學發(fā)光的呼吸爆發(fā)活性(Sepulcre等人，2007)。所有試驗均使用五條魚進行，一式三份。相同試驗重復兩次以驗證結果。使用SPSS 13. 0. 1統(tǒng)計軟件包進行所有統(tǒng)計分析。通過方差分析(ANOVA)和 Tukey多范圍檢驗(Tukeymultiple range test)來分析數(shù)據(jù)以測定組間差異。魚的食欲、生長速率、游動行為和外觀形態(tài)未受到處理的影響，并且在試驗期間也未觀察到死亡。此外，在飼喂包含SbTNFa的酵母達10天的魚的腸中未發(fā)現(xiàn)組織病理學損傷和吞噬細胞(即嗜酸性粒性白細胞和巨噬細胞)浸潤。如頭腎白細胞呼吸爆發(fā)所測定的， 單獨給藥酵母對魚的免疫狀態(tài)沒有顯著影響。與之明顯不同的是，飼喂0. 和過度表達sbTNF α的微囊化酵母的魚在處理后4天表現(xiàn)出劑量依賴性增加的呼吸爆發(fā)(圖8)。意外的是，給藥酵母對頭腎和腸中除TLR9之外的數(shù)個炎性基因的mRNA水平?jīng)]有顯著影響，但TLR9的表達顯著上調(diào)(圖9)。 上述結果表明，達10天的給藥所述免疫刺激劑未對魚產(chǎn)生任何副作用。由于呼吸爆發(fā)活性被廣泛用作魚免疫狀態(tài)的指標(Mulero等人，1998, Garcia-Castillo等人，2004 ； Chaves-Pozo等人，2005 ；Sepulcre等人，2007)，因此在飼喂包含TNF α的酵母的魚中激活此應答表明所述免疫刺激劑有效，并且會保護魚類免于非生物應激(即由對魚的處理導致的應激)和生物(病原體)應激。此外，由于TLR9受體是識別病毒和細菌病原體的關鍵成分，因此由給藥所述免疫刺激劑所導致的腸中TLR9的表達上調(diào)同樣表明魚的腸道會受到更好的抗病毒和細菌感染保護(Ishii和Akira，2006)。綜上所述，所有上述結果還表明重組sbTNF α是通過系統(tǒng)性激活先天免疫細胞并增加TLR9表達的優(yōu)異口服疫苗佐劑。
權利要求
1.可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品，其至少包含微囊化的細胞因子和腸保護聚合物，其中所述細胞因子是魚類細胞因子、或軟體動物細胞因子或甲殼類動物細胞因子。
2.如權利要求1所述的免疫刺激產(chǎn)品，其中所述細胞因子是重組細胞因子。
3.如權利要求2所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于所述微囊化的重組細胞因子是腫瘤壞死因子α (TNF α )。
4.如權利要求2所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于所述微囊化的重組細胞因子在宿主微生物中過度表達，所述宿主微生物是酵母。
5.如權利要求4所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于所述酵母是巴斯德畢赤酵母 (Pichia Pastoris)0
6.如權利要求1-5中任一項所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于所述細胞因子源自適于水產(chǎn)養(yǎng)殖的海洋生物，例如金頭鯛(Sparus aurata)、狼鱸(Dicentrarchus labrax)、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)(Psetta maxima)(Dentex dentex)、$口勿 鯛(Diplodus puntazzo)、黑斑小鯛(Pagellus bogaraveo)、大西洋白姑魚(Argyrosomus regius)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla) (Octopus sp.)。
7.如前述任一項權利要求所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于將所述產(chǎn)品飼喂給多細胞生物。
8.如權利要求7所述的免疫刺激產(chǎn)品，其中所述多細胞生物是鹵蟲(Artemiasp.)或輪形動物(phylum Rot if era)。
9.如前述任一項權利要求所述的免疫刺激產(chǎn)品，其特征在于用腸保護聚合物將所述細胞因子和/或所述包含所述重組細胞因子的宿主微生物微囊化。
10.制備如權利要求2所述的免疫刺激產(chǎn)品的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟-從魚類、軟體動物或甲殼類動物的組織中選擇并分離編碼所選細胞因子的cDNA，-在至少一種用于在至少一種適合的宿主微生物中表達細胞因子的表達載體中克隆所述 cDNA,-培養(yǎng)所述宿主微生物的宿主細胞，獲得重組細胞因子或包含所述重組細胞因子的宿主微生物培養(yǎng)物，-將所述重組細胞因子或所述包含所述重組細胞因子的宿主微生物微囊化，獲得微囊化的重組細胞因子或微囊化的包含所述重組細胞因子的宿主微生物。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于所述宿主微生物是選自巴斯德畢赤酵母、 酉良(Saccharomyces cerevisiae)禾口ILSI；^ 會(Kluyveromyces lactis)白勺# 母。
12.如權利要求10或11所述的方法，其特征在于所述微囊化步驟是通過在腸保護聚合物的存在下經(jīng)噴霧干燥實施霧化來進行的。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述腸保護聚合物選自醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯、羧甲基纖維素、甲基丙烯酸共聚物、麥芽糊精、殼聚糖、明膠、淀粉、阿拉伯膠。
14.如權利要求1-9中任一項所述的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品用于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中免疫刺激魚類、軟體動物或甲殼類動物的用途。
15.如權利要求14所述的免疫刺激產(chǎn)品的用途，其中所述細胞因子源自所要免疫刺激的相同的魚類、軟體動物或甲殼類動物物種。
16.如權利要求14或15所述的用途，其中所述魚類、軟體動物或甲殼類動物選自金頭鯛、狼鱸、虹鱒、瘤棘鲆、細點牙鯛、尖吻重牙鯛、黑斑小鯛、大西洋白姑魚、歐洲鰻鱺、章佳.ο
17.如權利要求14-16所述的用途，其中所述免疫刺激是通過在飼喂期間將所述產(chǎn)品與食物共同給藥來進行的。
18.如權利要求14-16所述的用途，其特征在于所述免疫刺激是通過以下步驟進行的 將所述免疫刺激產(chǎn)品向多細胞生物給藥，獲得富集的多細胞生物，并隨后向所述物種飼喂所述富集的多細胞生物。
19.如權利要求18所述的用途，其中所述多細胞生物是鹵蟲或輪形動物。
20.富集有可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品的多細胞生物，所述免疫刺激產(chǎn)品至少包含微囊化的魚類、軟體動物或甲殼類動物的細胞因子。
21.如權利要求1-9中任一項所述的可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品作為疫苗佐劑的用途。
22.如權利要求1-9中任一項所述的免疫刺激產(chǎn)品，其還包含用于魚類、軟體動物或甲殼類動物的疫苗。
23.如權利要求22所述的免疫刺激產(chǎn)品，其中將所述疫苗與所述細胞因子微囊化。
全文摘要
本發(fā)明涉及可口服給藥的免疫刺激產(chǎn)品，其包含微囊化的細胞因子和用于保護所述細胞因子的腸保護聚合物，所述細胞因子是魚類、軟體動物或甲殼類動物的細胞因子，優(yōu)選重組細胞因子，例如在宿主微生物中過度表達的腫瘤壞死因子α(TNFα)。
文檔編號A61K9/50GK102209530SQ200880131935
公開日2011年10月5日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2008年10月10日
發(fā)明者F·J·羅加索萊爾, J·A·洛佩斯馬斯, J·P·索拉岡薩雷斯, J·加林多比列加斯, M·佩尼亞爾韋爾梅利亞多, P·馬丁內(nèi)斯奧爾蒂斯, S·A·施特賴滕貝爾格, V·穆萊羅門德斯, Y·佩德雷尼奧洛佩斯 申請人:普羅貝爾特醫(yī)藥公司