專利名稱：新型抗體的制作方法
新型抗體本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人胰島素樣生長因子受體(hIGF-lR)的抗體及其抗原結(jié) 合片段。本發(fā)明還涉及用所述抗體及其抗原結(jié)合片段、包含所述抗體及其抗原結(jié)合片段的 藥物組合物治療疾病或病癥的方法以及制備方法
背景技術(shù)：
人胰島素樣生長因子受體(也稱為IGF-1R、⑶221或EC2. 7. 112)是與胰島素受體 具有70%同源性的酪氨酸激酶受體。該受體由與該受體高親和力結(jié)合的兩個配體-IGF-I 和IGF-II激活。該受體是二硫鍵連接的a 0 二聚體，表示為(a 0)2。a-鏈全部為胞 外區(qū)，而0鏈為跨膜的并且具有胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。配體介導的受體激 活觸發(fā)胞內(nèi)事件，其包括MAPK和PI3K-蛋白激酶B途徑的激活。已知IGF-1R在正常的胎 兒和出生后生長和發(fā)育中具有重要作用，推測其在癌癥生物中具有重要作用并且參與了很 多生物途徑，如有絲分裂、轉(zhuǎn)化和凋亡預防(在Baserga等人(1997，2003)、Hasnain等人 (2000)、Larsson等人(2005)、Romano (2003)中詳細綜述)。此外，已知在多種腫瘤類型中 受體表達水平是上調(diào)的(Khandwala等人的綜述(2000))，并且配體IGF-1的水平增加與發(fā) 展前列腺癌的風險增加有關(Chan等人(1998))。已知IGF-1R信號傳導通路的拮抗劑在體 外和體內(nèi)具有抗腫瘤作用(Hofmarm等人(2005)和Zhang等人(2004)中的綜述)。方法 包括中和抗體(參見Kull等人(1983)和Li等人(1993)、Xiong等人(1992)、Burtrum等 人(2003)、Cohen 等人(2005)、Maloney 等人(2003)、Jackson-Booth 等人(2003))；反義 (參見 Resnicoff 等人(1994)、Lee 等人(1996)、Muller 等人(1998)、Trojan 等人(1993)、 Lie等人(1998)、Shapiro等人(1994)；顯性失活突變體(Prager等人(1994))和小分子酪 氨酸激酶抑制劑(參見Hopfner等人(2006))和IGF結(jié)合蛋白(IGFBP-參見Nickerson等 人(1997))。已知的單克隆抗體包括描述于下列專利中的那些W099/60023、W003/100008、 W002/053596、W004/071529、EP0629240B、ff003/059951, W003/10662U ff004/083248, W004/087756、US2006452167A。本領域已經(jīng)熟知抗體結(jié)構(gòu)，尤其是已知重鏈恒定區(qū)具有糖基化糖鏈，其可能為 N-糖苷連接的糖鏈，例如N-乙?；咸前罚⑶移淇梢詭r藻糖基化或不被巖藻糖基化。測量巖藻糖基化的方法在本領域內(nèi)是熟知的，例如對于抗體群，可以使用酸水解 從抗體上去除糖基化糖鏈的單糖，這些可以用染料(如2-氨基苯甲酸(2-AA))標記。然后 可以進行熒光檢測的反相高效液相色譜并構(gòu)建標準曲線用于樣品定量。然后可以計算每個 抗體群中巖藻糖與甘露糖的比率。因此需要具有改善的效應子功能的抗體，例如具有改善 的ADCC和/或CDC功能。附圖簡述

圖1 由ELISA檢測的純化鼠單克隆抗體與人IGF-1R的結(jié)合。圖2A-E 由ELISA檢測的純化的6E11嵌合抗體和6E11人源化抗體與人IGF-1R的 結(jié)合。在圖2A中，由于抗體濃度極低而不能準確定量，H0L0的結(jié)合曲線遷移至右側(cè)。在圖 2D中，與其他分析相比，盡管整體趨勢類似，但信號則是降低的。圖3 在3T3/LISN c4細胞與純化的抗人IGF-1R的鼠單克隆抗體一起孵育24小時后，IGF-1R受體下調(diào)。圖4 純化的鼠單克隆抗體6E11、5G4和15D9介導的受體磷酸化的抑制。圖 5 顯示與 6Ellc 相比，H0L0 和 HOLOIgGlm(AA)和 H1L0 和 HlOLOIgGlm(AA)介導 的受體磷酸化抑制的實例。圖 6 顯示 H0L0 和 HOLOIgGlm(AA)和 H1L0 和 HlOLOIgGlm(AA)介導的受體磷酸化 抑制的實例。圖7A 顯示在競爭ELISA中各種純化的鼠單克隆抗體活性的實例。圖7B 顯示在競爭ELISA中H1L0的活性與6Ellc相比的實例。圖8A-C 競爭ELISA，證明純化的6E11鼠單克隆抗體或6E11嵌合抗體或6E11人源 化抗體抑制IGF-1R受體與第二中和抗體結(jié)合的能力。在圖8A中，H0L0和HOLOIgGlm(AA) 顯示了與圖8B和8C中顯示的重復測定相比增加的信號。圖9A:如ELISA所測定，純化的鼠單克隆抗體與重組的食蟹猴(cynomolgus macaque) IGF-1R 的結(jié)合。圖9B:與6E11嵌合體(6Ellc)相比，純化的人源化單克隆抗體與重組食蟹猴 IGF-1R的結(jié)合。圖10 使用純化的鼠單克隆抗體的胰島素受體結(jié)合ELISA。與陽性對照抗體(R&D Systems MAB15441)相反，純化的抗體6E11、5G4和15D9顯示在高達10 y g/ml的濃度下與 胰島素受體未結(jié)合。圖11 證明抗體識別Colo205腫瘤細胞系表達的人IGF-1R的FACS分析。圖12 使用純化的鼠單克隆抗體在腫瘤和正常前列腺樣品的冷凍組織樣品上進 行的免疫組化。圖13 使用純化的鼠單克隆抗體在乳腺腫瘤樣品的冷凍組織樣品上進行的免疫組化。圖14 使用純化的H1L0人源化單克隆抗體和6E11嵌合單克隆抗體在乳腺腫瘤樣 品的冷凍組織樣品上進行的免疫組化。圖15 純化的鼠單克隆抗體對IGF-1介導的3T3/LISN c4細胞增殖的抑制。圖16 純化的H1L0人源化單克隆抗體或6E11嵌合單克隆抗體對IGF-1介導的 3T3/LISN c4細胞增殖的抑制。圖17A-E 純化的人源化單克隆抗體或純化的鼠6E11單克隆抗體對IGF-1介導的 3T3/LISN c4細胞增殖的抑制。圖18 如碘化吡啶染色和流式細胞術(shù)所測定的純化的鼠單克隆抗體對IGF-1介導 的細胞周期的抑制。圖19 JGF-1的存在為NCI-H838細胞提供了一些對喜樹堿誘導的凋亡的保護。 6E11的添加逆轉(zhuǎn)了對IGF-1介導的凋亡的保護。圖20 在交聯(lián)抗體存在下純化的鼠單克隆抗體不存在拮抗活性(agonistic activity) 在不存在配體和存在抗小鼠交聯(lián)抗體的情況下用抗體樣品孵育3T3/LISN c4 細胞。受體磷酸化水平由ELISA來估計。圖21 用6E11單克隆抗體處理后裸鼠中3T3/LISN c4腫瘤生長的抑制。圖22 用6E11單克隆抗體處理后裸鼠中3T3/LISN c4腫瘤生長的抑制。
圖23 用6E11單克隆抗體處理后裸鼠中Colo205腫瘤生長的抑制。圖24 :A)抗體IGF1R-E和B)抗體IGF1R-F的寡糖組成。圖25 與重組人IGF-1R結(jié)合的ELISA圖26 用抗-CD20抗體進行的ADCC測定。圖 27 抗-CD20 抗體與 Fc y RIIIa_A)Fc y RHIa(Phe 變體),B)Fc y RHIa(Val 變 體)結(jié)合的動力學。圖 28 抗-IGF-1R 抗體與 Fc y RIIIa_A) Fc y RHIa (Phe 變體),B) Fc y RHIa (Val 變體)結(jié)合的動力學。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種抗體制劑，其包含含有免疫球蛋白重鏈恒 定區(qū)的抗體、或其與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)合的抗原結(jié)合片段，其中所述免疫球蛋白重 鏈恒定區(qū)賦予抗體或抗原結(jié)合片段效應子功能，并且其中所述抗體或抗原結(jié)合片段與生長 因子受體特異性結(jié)合，并且其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)在至少2個位置具有突變并且 具有改變的糖基化特征，使得巖藻糖和甘露糖的比率為0.8 3或更低，從而使所述抗體或 抗原結(jié)合片段與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)缺乏所述突變和改變的糖基化特征的等同抗體或 抗原結(jié)合片段相比具有增強的效應子功能。本發(fā)明還提供一種制備如本文所述的抗體的方法，其包括在細胞系中表達抗體或 其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)改造以調(diào)控存在或不存在巖藻糖與N-糖 苷連接的糖鏈的結(jié)合，所述N-糖苷連接的糖鏈與免疫功能分子結(jié)合。在另一實施方式中，提供一種部件試劑盒，所述試劑盒包含本文所述的組合物和 使用說明書。還提供一種治療經(jīng)受癌癥折磨的人類患者的方法，所述方法包括給予治療有效量 的本文所述抗體制劑的步驟。發(fā)明詳述本發(fā)明提供特異性結(jié)合IGF_1R(如特異性結(jié)合hIGF-lR)的抗體或其抗原結(jié)合片 段。在本發(fā)明的一個實施方式中提供特異性結(jié)合hIGF-lR并中和hIGF-lR活性的抗 體或其抗原結(jié)合片段，其包含特異性結(jié)合IGF-1R的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域 包含SEQ. ID. NO :1的⑶R H3或其變體，其中⑶R H3中的一個或兩個氨基酸殘基與SEQ. ID. NO 1相應位置的氨基酸殘基不同。在本發(fā)明的一個實施方式中，氨基酸殘基的這些不同為保守置換。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供特異性結(jié)合IGF-1R并包含CDRH3的抗體或 其抗原結(jié)合片段，所述CDRH3為SEQ. I. D. NO 1中所示的序列變體，其中所述變體的所述 ⑶RH3的一個或兩個殘基在內(nèi)在位置7和/或位置9與SEQ. I. D. NO 1對應位置(其中，第 一殘基為位置1，W ；最后的殘基為v，在位置14)中的殘基不同。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供特異性結(jié)合IGF-1R并包含CDRH3的抗體或其 抗原結(jié)合片段，所述CDRH3為SEQ. ID. NO 1中所示的序列變體，其中所述變體的所述CDRH3 內(nèi)的一個或兩個殘基與SEQ. ID. NO 1中對應位置中的殘基不同，其通過在位置7將R置換
6為S，或通過在位置9將K置換為R，或通過在位置7將R置換為S并在位置9將K置換為 R來達成。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié) 合片段還包含下列序列的一個或多個SEQ. ID. NO 2中所示的⑶RH2 ；SEQ. ID. NO 3中所示 的 CDRH1 ；SEQ. ID. NO 4 中所示的 CDRL1 ；SEQ. ID. NO 5 中所示的 CDRL2 ；禾口 SEQ. ID. NO 6 中 所示的⑶RL3。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合片段的一個或多個CDR可以包含 上述序列中所示的CDR的變體。各變體CDR包含一個或兩個與所列序列中相應位置的氨基 酸殘基不同的氨基酸殘基。氨基酸殘基中的這種置換可以為保守置換，例如將一個疏水氨 基酸置換為另一疏水氨基酸，例如用纈氨酸或異亮氨酸置換亮氨酸。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié) 合片段包含⑶RH3，還包含下列序列中的一個或多個:CDRH2 :SEQ. ID. NO 2 ；CDRH1 :SEQ. ID. NO 3 ；CDRL1 :SEQ. ID. NO 4 ；CDRL2 :SEQ. ID. NO 7 ；禾口 CDRL3 :SEQ. ID. NO :6。在本發(fā)明的又一個實施方式中，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原 結(jié)合片段包含⑶RH3，還包含下列序列中的一個或多個⑶RH2 :SEQ. ID. NO 2 ；⑶RH1 :SEQ. ID. NO 3 ；CDRL1 :SEQ. ID. NO 4 ；CDRL2 :SEQ. ID. NO 7 ；禾口 CDRL3 :SEQ. ID. NO :6，其中一個或 多個CDR可以被其變體取代，各變體CDR含有1或2個氨基酸置換。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ. ID. NO 1的⑶R H3 和SEQ.ID.N0 :3的⑶R HI。在另一個實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ.
H3和SEQ. ID.N0:7的⑶RL2。在又一個實施方式中，本發(fā)明的抗體或其 抗原結(jié)合片段包含 SEQ. ID. NO :1 的 CDR H3 和 SEQ. ID. NO 3 的 CDR HI 和 SEQ. ID. NO 7 的 CDRL2。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段， 并且還包含下列⑶R CDRH1 :SEQ. ID. NO 3CDRH2 :SEQ. ID. NO 2CDRH3 :SEQ. ID. NO 1CDRL 1 :SEQ. ID. NO 4CDRL 2 : SEQ. ID. NO :7CDRL 3 :SEQ. ID. NO :6在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供特異性結(jié)合IGF-1R的抗體或其抗原結(jié)合片 段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含為上述序列的變體的CDR。在本發(fā)明的另個一實施方式中，提供特異性結(jié)合IGF-1R的抗體或其抗原結(jié)合片 段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ. ID. NO 8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ. ID. NO 9的輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域、或SEQ. ID. NO 10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ. ID. NO 11的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、 或SEQ. ID. NO 12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ. ID. NO 13的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、或SEQ. ID. NO 14 的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ. ID. NO 16的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、或SEQ. ID. NO 15的重鏈可變結(jié)構(gòu) 域和SEQ. ID. NO 16的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供包含SEQ. ID. NO :12、SEQ. ID. NO 14或SEQ.
7ID. NO 15的分離的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域，例如其包含SEQ. ID. NO :12。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原 結(jié)合片段包含根據(jù)本發(fā)明所述的CDR、或根據(jù)本發(fā)明所述的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所 述抗體或其抗原結(jié)合片段為大鼠、小鼠、靈長類(例如，短尾猴、舊域猴(Old World monkey) 或類人猿(Great Ape)或人的抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段還結(jié)合靈長類 IGF-1R，例如食蟹猴IGF-1R。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原 結(jié)合片段在人框架背景中(例如作為人源化或嵌合抗體)包含下列CDR的一個或多個如 SEQ. ID. NO 1 中所示的 CDRH3、SEQ. ID. NO 2 中所示的 CDRH2、SEQ. ID. NO 3 中所示的 CDRH1、 SEQ. ID. NO 4 中所示的 CDRL1、SEQ. ID. NO 5 中所示的 CDRL2 和 SEQ. ID. NO 6 中所示的 CDRL3。在本發(fā)明的一個實施方式中，人源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域在接受者抗體框架內(nèi)包含 SEQ. ID. NO 1-3中所示的⑶R，其具有在框架區(qū)內(nèi)與SEQ. ID. NO 59中的人接受者序列大于 80%的同一性，或具有在框架區(qū)內(nèi)大于85%、或大于90%、或大于95%、或大于98%、或大 于99%的同一性。在本發(fā)明的一個實施方式中，人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在接受者抗體框架內(nèi)包含 SEQ. ID. NO 4-6中所示的⑶R，其具有在框架區(qū)內(nèi)與SEQ. ID. NO 60中的人接受者序列大于 80%的同一性，或具有在框架區(qū)內(nèi)大于85%、或大于90%、或大于95%、或大于98%、或大 于99%的同一性。在SEQ ID NO 59 和 SEQ. ID. NO 60 中，CDR 序列的位置由 Xaa，s 表示。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗 原結(jié)合片段包含根據(jù)本發(fā)明所述的CDR、或根據(jù)本發(fā)明所述的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中 所述抗體還包含恒定區(qū)，它可以為任何同種型或亞類。在一個實施方式中，所述重鏈恒定 區(qū)為IgG同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。在一個實施方式中，所述抗體為 IgGl。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的抗體，并且其包含恒定區(qū) 以便所述抗體具有降低的ADCC和/或補體活化或效應子功能。在一個此類實施方式中，重 鏈恒定區(qū)可以包含天然失活的IgG2或IgG4同種型恒定區(qū)或突變的IgGl恒定區(qū)。適宜的 修飾實例在EP0307434中描述。一個實例包括丙氨酸殘基在位置235和237 (EU指數(shù)編號) 處的置換。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的抗體，其中所述抗體能 夠具有至少一些效應子功能，例如其中它能夠具有一些ADCC和/或⑶C功能。在本發(fā)明的 一個實施方式中，提供了特異性結(jié)合IGF-1R(例如人IGF-1R)的包含恒定區(qū)的抗體或其與 恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含SEQ. ID. NO 1的⑶RH3或其變體，所述變體在⑶RH3中 含有1或2個氨基酸置換，例如含有恒定區(qū)的抗體或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段包含 選自下列的 CDR :CDRH1 :SEQ. ID. NO :3、CDRH2 :SEQ. ID. NO :2、CDRH3 :SEQ. ID. NO :1、CDRL1 SEQ. ID. NO :4、CDRL2 :SEQ. ID. NO 7 和 CDRL3 :SEQ. ID. NO :6，且其還包含 IgGl 野生型、IgG2 野生型、IgG3野生型、IgG4野生型的恒定區(qū)或其增強形式。
在本發(fā)明的一個實施方式中，包含恒定區(qū)的抗體或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片 段特異性結(jié)合選自下列的生長因子受體IGF-1R、EGFR、HER_2或HER-3。例如，其特異性結(jié) 合HER-2或HER-3，或例如其特異性結(jié)合IGF-1R或EGFR，例如人IGF-1R。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，所 述抗體或其抗原結(jié)合片段在其重鏈恒定區(qū)包含一個或多個突變，使得所述抗體或抗原結(jié) 合片段具有增強的效應子功能。例如，其中其具有增強的ADCC或增強的CDC或其中其 具有增強的ADCC和⑶C效應子功能。適宜的修飾的實例描述于Shields等人J. Biol. Chem(2001)276 :6591_6604 ；Lazar 等人 PNAS(2006) 103 4005-4010 和 US6737056 ； W02004063351 和 W02004029207 中。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了包含重鏈恒定區(qū)的抗體或其與重鏈恒定區(qū)連 接的抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合IGF-1R，例如人IGF-1R。所述抗體或其抗原結(jié)合片段 可以包含SEQ. ID. NO :1的⑶RH3或其變體，變體中⑶R H3中的一個或兩個氨基酸殘基與 SEQ. ID. NO 1中對應位置的氨基酸殘基不同，且包含突變的重鏈恒定區(qū)使得所述抗體或其 抗原結(jié)合片段與野生型相比具有增強的效應子功能。例如，特異性結(jié)合IGF-1R的抗體或 其抗原結(jié)合片段包含SEQ. ID. NO 1的⑶R H3，例如抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自下列的 CDR :CDRH1 :SEQ. ID. NO :3、CDRH2 :SEQ. ID. NO :2、CDRH3 :SEQ. ID. NO :1、CDRL1 :SEQ. ID. NO 4、⑶RL2 :SEQ. ID. NO 7和⑶RL3 :SEQ. ID. NO :6，且包含突變的重鏈恒定區(qū)使得所述抗體或 其抗原結(jié)合片段與野生型相比具有增強的效應子功能。在本發(fā)明的一個實施方式中，這些突變在選自239、332和330(IgGl)的一個或多 個位置或其他IgG同種型的等同位置。適宜的突變的實例為S239D和I332E和A330L。在 一個實施方式中，所述抗體或抗原結(jié)合片段在位置239和332突變，如S239D和I332E，例如 其在選自239和332和330的三個或更多個位置突變，如S239D和I332E和A330L。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或 其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，并且其包含選自下列序列中所示的恒定區(qū)SEQ ID N0:64和SEQ ID. NO :66，例如抗體或抗原結(jié)合片段包含SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:15的 可變結(jié)構(gòu)域以及SEQ ID N0:64或SEQ ID NO :66中所示的重鏈恒定區(qū)，例如，包含重鏈恒定 區(qū)的抗體或其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段包含SEQ ID NO 14,SEQ ID.N0:15和SEQ ID.N0:64。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體 或其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，并且其包含選自下列序列所示的那些的重鏈恒定 區(qū)SEQ ID N0:64和SEQ ID. NO :66，例如抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID N0:14和SEQ ID. NO :16的可變結(jié)構(gòu)域以及SEQ ID NO 64或SEQ ID NO :66中所示的重鏈恒定區(qū)例如抗 體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID NO 14, SEQ ID. N0:16和SEQ ID. NO :64。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或其 與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含具有改變的糖基化特征的重鏈恒定區(qū)以使所述 抗體或其抗原結(jié)合片段具有增強的效應子功能。例如，其中其具有增強的ADCC或增強的 CDC或其中其具有增強的ADCC和CDC效應子功能。制備具有改變的糖基化特征的抗體的適 宜方法的實例描述于 W02003011878、W02006014679 和 EP1229125 中。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或 其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合IGF-1R，例如人IGF-1R。所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含SEQ. ID. NO :1的⑶RH3或其變體，其中⑶R H3中的一個或兩個氨 基酸殘基與SEQ. ID. NO 1中相應位置的氨基酸殘基不同，且包含具有改變的糖基化特征的 重鏈恒定區(qū)以使得所述抗體或抗原結(jié)合片段與野生型相比具有增強的效應子功能。例如，特異性結(jié)合IGF_1R(例如人IGF-1R)的抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ. ID. NO :1的CDR H3，例如抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自下列的CDR :CDRH1 :SEQ. ID. NO 3 ；CDRH2 :SEQ. ID. NO 2 ；CDRH3 :SEQ. ID. NO 1 ；CDRL1 :SEQ. ID. NO 4 ；CDRL2 :SEQ. ID. NO 7 和⑶RL3 :SEQ. ID. NO :6，且包含具有改變的糖基化特征的重鏈恒定區(qū)以使得所述抗體或抗 原結(jié)合片段與野生型相比具有增強的效應子功能。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了抗體制劑，其中所述抗體制劑中巖藻糖與甘 露糖的比率為0.8 3或更低，例如0.7 3或更低、或0.6 3或更低、或0.5 3或更 低、或0.4 3或更低或0.3 3或更低、或0.2 3或更低或0.1 3或更低。在一個實 施方式中，抗體制劑含有可忽視的或不含有結(jié)合巖藻糖。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了包含抗體或其抗原結(jié)合片段的抗體制劑， 所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID N0:14和SEQ ID NO 15的可變結(jié)構(gòu)域或SEQ ID N0:14和SEQ ID NO :16的可變結(jié)構(gòu)域并且其中所述抗體制劑中巖藻糖與甘露糖的比率為 0.8 3或更低，例如0.7 3或更低、或0.6 3或更低、或0.5 3或更低、或0.4 3 或更低或0.3 3或更低、或0.2 3或更低或0.1 3或更低。在一個實施方式中，抗體 制劑含有可忽視的或不含有結(jié)合巖藻糖。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或其 與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含突變的重鏈恒定區(qū)和改變的糖基化特征以使抗 體或抗原結(jié)合片段具有增強的效應子功能，例如其中其具有下列功能的一種或多種增強 的ADCC或增強的CDC，例如其中其具有增強的ADCC功能。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體制劑包含含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的抗體， 或其與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)賦予 抗體或抗原結(jié)合片段效應子功能，并且其中所述抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合生長因子 受體，并且其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)在至少2個位置上具有突變并且具有改變的糖 基化特征以使巖藻糖與甘露糖的比率為0.8 3或更低，從而使所述抗體或抗原結(jié)合片段 與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)缺乏所述突變和改變的糖基化特征的等同抗體或抗原結(jié)合片段 相比具有增強的效應子功能。所述抗體制劑改變的糖基化特征不是所述免疫球蛋白重鏈突 變的結(jié)果。例如，這些抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合IGF_1R(例如人IGF-1R)，并且包含 SEQ. ID. NO :1的CDR H3，例如抗體或抗原結(jié)合片段包含選自下列的CDR :CDRH1 :SEQ. ID. NO 3 ；CDRH2 :SEQ. ID. NO 2 ；CDRH3 :SEQ. ID. NO 1 ；CDRL1 :SEQ. ID. NO 4 ；CDRL2 :SEQ. ID. NO 7 和⑶RL3 :SEQ. ID. NO :6，且包含突變的重鏈恒定區(qū)并具有改變的糖基化特征以使得所述抗 體或抗原結(jié)合片段具有增強的效應子功能。例如這些抗體或抗原結(jié)合片段可以包含SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15的可變結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16的可變結(jié)構(gòu)域。 在本發(fā)明的一個這種實施方式中，所述突變在選自239、332和330(IgGl)的一個或多個位 置或其他IgG同種型的等同位置。適宜的突變的實例為S239D和I332E和A330L。在一個 實施方式中，包含恒定區(qū)的抗體或與其恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段具有在239和332的突
10變，例如S239D和I332E或還可以包含在選自239和332和330的三個或更多個位置的突 變，例如 S239D 和 I332E 和 A330L。在一個實施方式中，所述抗體制劑中巖藻糖與甘露糖的比率為0.8 3或更低，例 如0.7 3或更低、或0.6 3或更低、或0.5 3或更低、或0.4 3或更低或0. 3 3 或更低、或0.2 3或更低或0.1 3或更低。在一個實施方式中，抗體制劑含有可忽視的 或不含有結(jié)合巖藻糖。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或其 與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含嵌合的重鏈恒定區(qū)，例如其中其包含至少一個 來自IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域以使抗體或抗原結(jié)合片段具有增強的效應子功能，例如其中其具有 下列功能的一個或多個增強的ADCC或增強的CDC，例如其中其具有增強的CDCC。例如，所 述抗體或抗原結(jié)合片段可以包含一個來自IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域或兩個CH2結(jié)構(gòu)域都可來自 IgG3。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體 或其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含突變的和嵌合的重鏈恒定區(qū)，例如其中其 包含至少一個來自IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域和一個來自IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域，其中所述IgGlCH2 結(jié)構(gòu)域在選自239和332和330的位置上具有一個或多個突變，例如所述突變選自S239D 和I332E和A330L，以使所述抗體具有增強的效應子功能，例如其中其具有下列功能的一個 或多個增強的ADCC或增強的CDC，例如其中其具有增強的ADCC和增強的CDCC。在一個實 施方式中，所述IgGlCH2結(jié)構(gòu)域具有突變S239D和I332E。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的包含重鏈恒定區(qū)的抗體或 其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含嵌合的重鏈恒定區(qū)和改變的糖基化特征以使 所述重鏈恒定區(qū)包含至少一個來自IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域和一個來自IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域，并 且其具有改變的糖基化特征以使巖藻糖和甘露糖的比率為0.8 3或更低，從而使所述抗 體或抗原結(jié)合片段與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)缺乏所述突變和改變的糖基化特征的等同抗 體或抗原結(jié)合片段相比具有增強的效應子功能，使得所述抗體或抗原結(jié)合片段具有增強的 效應子功能，例如其中其具有下列功能的一個或多個增強的ADCC或增強的CDC，例如其具 有增強的ADCC和增強的CDCC。在替代性實施方式中，所述抗體或抗原結(jié)合片段具有至少一個IgG3CH2結(jié)構(gòu)域和 至少一個來自IgGl的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其中兩個IgG CH2結(jié)構(gòu)域都根據(jù)本文所述的限制條 件發(fā)生突變。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了抗體制劑，所述抗體制劑包含含有重鏈恒定 區(qū)的抗體或其與重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其包含突變的和嵌合的重鏈恒定區(qū)，其 中所述抗體制劑具有改變的糖基化特征以使所述抗體或抗原結(jié)合片段具有增強的效應子 功能，例如其中其具有下列功能的一個或多個增強的ADCC或增強的CDC。在一個實施方 式中，所述突變選自位置239和332和330，例如，所述突變選自S239D和I332E和A330L。 在另一個實施方式中，重鏈恒定區(qū)包含至少一個來自IgG3的CH2結(jié)構(gòu)域和一個來自IgGl 的CH2結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，重鏈恒定區(qū)具有改變的糖基化特征使得巖藻糖和甘露 糖的比率為0.8 3或更低，從而使得所述抗體或抗原結(jié)合片段具有與免疫球蛋白重鏈恒 定區(qū)缺乏所述突變和改變的糖基化特征的等同非嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段相比具有增
11強的效應子功能。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了重組轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導的宿主細胞，所述宿主 細胞包含至少一個表達盒，例如，所述表達盒包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié) 合片段的重鏈的多核苷酸，并且還包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的輕 鏈的多核苷酸，或其中具有兩個表達盒，第一個編碼輕鏈，第二個編碼重鏈。例如，在一個 實施方式中，第一個表達盒包含編碼本發(fā)明所述的包含恒定區(qū)的抗體或其抗原結(jié)合片段的 重鏈的多核苷酸，所述抗原結(jié)合片段連接恒定區(qū)；其還包含第二盒，所述第二盒含有編碼根 據(jù)本發(fā)明所述的包含恒定區(qū)的抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈的多核苷酸，所述抗原結(jié)合片 段連接在恒定區(qū)，例如所述第一表達盒包含編碼選自下列的重鏈的多核苷酸SEQ. ID. NO 40、SEQ. ID. NO 41或SEQ. ID. NO 67或SEQ. ID. NO :70，并且第二表達盒包含編碼選自下列 的輕鏈的多核苷酸:SEQ. ID. NO 42或SEQ. ID. NO :69。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述細胞包含含有一 個或多個表達盒的載體，所述一個或多個表達盒編碼本文所述的包含恒定區(qū)的抗體或其抗 原結(jié)合片段的重鏈和/或輕鏈，所述抗原結(jié)合片段與恒定區(qū)連接。例如，此類宿主細胞可 以包含編碼輕鏈的第一載體和編碼重鏈的第二載體，例如所述第一載體編碼選自下列的重 鏈:SEQ. ID. NO 37,SEQ. ID. NO 38 或 SEQ. ID. NO :68，并且第二載體編碼輕鏈，如 SEQ IDN0 39的輕鏈。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的宿主細胞，其中所述細 胞為真核細胞，例如其中所述細胞為哺乳動物細胞。此類細胞系的實例包括CH0或NS0。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了制備根據(jù)本發(fā)明所述的包含恒定區(qū)的抗體或 其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基(例如無血清培養(yǎng)基)中 培養(yǎng)宿主細胞的步驟。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述抗體進一 步純化至相對于含所述抗體的無血清培養(yǎng)基的至少95%或更高(例如98%或更高)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供包含根據(jù)本發(fā)明所述的含有恒定區(qū)的抗體或 其抗原結(jié)合片段和藥學上可接受的載體的藥物組合物，所述抗原結(jié)合片段與恒定區(qū)連接。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了部件試劑盒，所述部件試劑盒包含根據(jù)本 發(fā)明所述的組合物以及使用說明書。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了治療受類風濕性關節(jié)炎折磨的人類患者的 方法，所述方法包括如下的步驟給予根據(jù)本發(fā)明所述的治療有效量的包含恒定區(qū)的抗體 或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段?？梢詫愣▍^(qū)的抗體或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié) 合片段與藥學上可接受的載體聯(lián)合。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了治療受癌癥折磨的人類患者的方法，所述 方法包括如下的步驟給予根據(jù)本發(fā)明所述的治療有效量的包含恒定區(qū)的抗體或其與恒定 區(qū)連接的抗原結(jié)合片段。可以將包含恒定區(qū)的抗體或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段與藥 學上可接受的載體聯(lián)合。在本發(fā)明的又一個實施方式中，提供了治療受癌癥折磨的人類患者的方法，所述 方法包括如下的步驟給予治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明所 述的含有恒定區(qū)的抗體或其與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段和藥學上可接受的載體。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明所述的包含恒定區(qū)的抗體或其 與恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，所述疾病或病 癥選自類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬或癌癥，例如急性成淋巴細胞性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、 AIDS相關性癌癥、AIDS相關性淋巴瘤、肛門癌、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞 瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌、肝外膽管癌、膀胱癌、骨肉瘤(Osteosarcoma)/惡性纖維組 織細胞骨癌(Malignant Fibrous Histiocytoma Bone Cancer)、腦月中瘤(例如，腦干膠質(zhì) 瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原發(fā)性神 經(jīng)外胚層瘤、視通路和下丘腦膠質(zhì)瘤)、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、伯基特(Burkitt)淋巴 瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、未知原發(fā)性、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(Carcinoma of Unknown Primary, PrimaryCentral Nervous System)、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠 質(zhì)瘤、子宮頸癌、兒童期癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性骨髓增生性 疾病、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文家族腫 瘤(Ewing' s Family of Tumors)、盧頁夕卜生殖細胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、 性腺外生殖細胞瘤(ExtragonadalGerm Cell Tumor)、肝外膽管癌、眼內(nèi)黑素瘤眼癌、視網(wǎng) 膜母細胞瘤眼癌、膽囊癌、胃(Stomach)癌、胃腸道類癌瘤、生殖細胞瘤(例如，顱外的、性 腺外的、和卵巢的)、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(例如，成人、兒童腦干、兒童大腦星 形細胞瘤、兒童視通路和下丘腦的)、毛細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞(肝)癌、何杰金 氏(Hodgkin)淋巴瘤、下咽癌、下丘腦和視通路膠質(zhì)瘤、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細胞癌(內(nèi)分泌 胰腺)、卡波濟氏(Kaposi)肉瘤、腎(腎細胞)癌、喉癌、白血病(例如，急性淋巴細胞性 的、急性髓性的、慢性淋巴細胞性、慢性髓性的、和毛細胞)、唇部和口腔癌、肝癌、非小細胞 肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS-相關的、伯基特型的、皮膚T-細胞性的、何杰金 型的、非何杰金型的、以及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性的)、瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨 球蛋白血癥、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、髓母細胞瘤、黑素瘤、眼內(nèi)(眼)黑素瘤、 默克爾(Merkel)細胞癌、間皮瘤、原發(fā)灶不明的頸部轉(zhuǎn)移鱗癌(Metastatic Squamous Neck Cancerwith Occult Primary)、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿細胞瘤 (Plasma Cell Neoplasm)、蕈樣肉芽腫病、骨髓增生異常綜合癥、骨髓增生異常性/骨髓組 織增生性疾病、髓系白血病、慢性髓細胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻 腔和鼻竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵 巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、低度惡性潛能卵巢瘤、胰腺癌、胰島細胞性胰腺癌、鼻 竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、成松果體細胞瘤、垂體瘤、漿細胞瘤/多發(fā) 性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎) 癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、涎腺癌、軟組織肉瘤、子宮肉 瘤、塞扎里(Sezary)綜合征、非黑素性皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗 狀細胞癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、妊娠性滋養(yǎng)層細胞瘤、 原發(fā)部位未知的瘤、原發(fā)部位未知的癌、尿道癌、子宮內(nèi)膜性子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視 通路和下丘腦膠質(zhì)瘤、外陰癌、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、以及維爾姆斯氏(Wilms)腫 瘤。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中患者經(jīng)受下列疾病 的一種或多種的折磨類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌或骨髓瘤。定義本文所用的術(shù)語“抗體”具有最廣義的意義，具體涵蓋了單克隆抗體(包括全長單 克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們顯示 出所需的生物活性即可。這些隨后將更詳細地解釋。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指由基本上同源抗體群所獲得的抗體，即各抗 體包含的群體除了可能少量存在的可能的天然突變外是相同的。單克隆抗體針對單一抗原 結(jié)合位點具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克 隆抗體制劑相比，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。用于多核苷酸和多肽的“同一性”，是指根據(jù)情況使用下列⑴和⑵所提供的算 法計算的比較(1)多核苷酸的同一性通過下列步驟來計算用給定序列中核苷酸的總數(shù)乘以界
定同一性百分比的整數(shù)除以100，然后用所述序列中核苷酸的所述總數(shù)減去前面的得數(shù)， pt/ .nn 彡 xn-(xn y),其中，rm為核苷酸改變的數(shù)；xn為給定序列的核苷酸總數(shù)；對于95%，y為0. 95， 對于97%為0. 97，對于100%為1. 00 ； 為乘法算子的符號，其中將xn和y的任何非整數(shù) 的得數(shù)約減為最近的整數(shù)，再用xn將其減去。編碼多肽的多核苷酸序列的改變可以在此編 碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或移碼突變，從而由這些改變而改變由多核苷酸編碼的多肽。(2)多肽的同一性通過下列步驟來計算用氨基酸的總數(shù)乘以界定同一性百分比 的整數(shù)除以100，然后用氨基酸的所述總數(shù)減去前面的得數(shù)，或na ^ xa- (xa y),其中，na為氨基酸改變的數(shù)；xa為序列中的氨基酸總數(shù)；對于95%，y為0. 95，對 于97%為0. 97，對于100%為1. 00 ； 為乘法算子的符號，其中將xa和y的任何非整數(shù)的 得數(shù)約減為最近的整數(shù)，再用xa將其減去。如本文所用的術(shù)語“變體”是指分別與參考多核苷酸或多肽不同但保持著基本性 質(zhì)的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸變體在核苷酸序列上與另一多核苷酸(參考多核苷 酸)不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列。如下面所討論，核苷酸變化可能導致參考序列所編碼的多肽中出現(xiàn)氨基酸置換、添加、 缺失、融合蛋白和平截。典型的多肽變體在氨基酸序列上與另一多肽(參考多肽)不同。 通常，不同是有限的，從而使得參考多肽和變體的序列整體上非常類似并且在許多區(qū)域上 相同。變體和參考多肽可能因一個或多個置換、添加、缺失以任何組合而在氨基酸序列上不 同。置換的或插入的氨基酸殘基可以是或不是基因編碼的氨基酸殘基。在本領域內(nèi)已熟知 的是某些氨基酸置換被認為是“保守的”。根據(jù)常見側(cè)鏈性質(zhì)，氨基酸分成幾組，能保持所有 或基本上所有本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和力的組內(nèi)置換被認為是保守置換， 參見下表側(cè)鏈成員疏水met、ala、val、leu、ile中性親水cys、ser、thr
14
酸性堿性
asp、glu
asn> gin、his、lys、arg gly>pro trp、tyr、phe影響鏈定位的殘基芳族在本發(fā)明的某些方面，可以包括這樣的變體其中幾個，例如5-10、1-5、1-3、1_2 個氨基酸殘基或1個氨基酸殘基以任何組合置換、缺失或添加。多核苷酸或多肽的變體可 以是天然產(chǎn)生的，例如等位變體；或可以為不知道是否天然產(chǎn)生的變體。非天然產(chǎn)生的多核 苷酸和多肽變體可以通過誘變技術(shù)、通過直接合成和通過技術(shù)人員所知道的其他重組方法 來制備?！胺蛛x的”是指“通過人手”由其天然狀態(tài)改變的；或從其原始環(huán)境改變或移出的； 或者二者。例如，天然存在于活的有機體的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是自其自然狀 態(tài)的共存材料所分離的相同多核苷酸或多肽為“分離的”，其包括但不限于當將此多核苷酸 或多肽再引入細胞時，即使所述細胞與分離出多核苷酸或多肽的細胞是相同物種或類型。整個本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求書中，術(shù)語“包含”和“包括”與由......組
成”和“由......構(gòu)成”混合使用。也就是說，這些詞欲表達可能包括本文所允許而未特別
列出的其他元素或整數(shù)。本文所用的術(shù)語“糖基化特征”是指抗體群中的糖基化水平。在整個本發(fā)明說明書中所用的與本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段相關的術(shù)語“特 異性結(jié)合”是指抗體結(jié)合人IGF-lR(hlGF-lR)而不結(jié)合或不明顯結(jié)合其他人蛋白。然而，該 術(shù)語并不排除本發(fā)明抗體還可能與其他形式的IGF-1R(例如靈長類IGF-1R)交叉反應的事實。在整個本發(fā)明說明書中所用的與本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段有關的術(shù)語“中 和”是指在存在本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段的條件下，與不存在這種抗體及其抗原結(jié) 合片段的情況下IGF-1R的生物活性相比，其IGF-1R的生物活性降低。中和可能由于但不 限于阻斷配體結(jié)合、防止配體激活受體、下調(diào)IGF-1R或影響效應子功能中的一個或多個而 引起。中和水平可以幾種方法測量，例如，通過使用下面實施例中所示的測定，例如可以如 實施例23中所述實施的LISN細胞增殖測定。此分析中IGF-1R的中和通過估計在中和抗 體的存在下腫瘤細胞增殖的降低來測量。中和水平還可以在例如受體磷酸化測定中測量，該測定可以如實施例13所述進 行。此測定中IGF-1R的中和通過估計在中和抗體存在下受體磷酸化的抑制來測量。如果抗體或其抗原結(jié)合片段能夠中和，則表明諸如hIGF-I或hIGF-II等人IGF-1R 結(jié)合蛋白與其受體之間相互作用受到了抑制。被認為對人IGF-1R有中和活性的抗體在 LISN細胞增殖測定或受體磷酸化測定(分別如實施例23和實施例13所示)中具有小于 10微克/毫升、或小于5微克/毫升、或小于2微克/毫升、或小于1微克/毫升的IC5Q。在本發(fā)明的另一方面，提供了與本文所例示的抗體具有等價中和活性的抗體或其 抗原結(jié)合片段，例如在LISN細胞增殖測定或受體磷酸化測定(分別如實施例23和實施例 13所示)中保持著H0L0和HOLOIgGlm(AA)和H1L0和HlOLOIgGlm(AA)中和活性的抗體。在整個說明書中，抗體序列中的氨基酸殘基根據(jù)Kabat方式進行編號。類似地，術(shù) 語〃 CDR"、‘‘ CDRL1"、‘‘ CDRL2"、‘‘ CDRL3"、‘‘ CDRH1 〃，‘‘ CDRH2"、‘‘ CDRH3"根據(jù)如 Kabat 等人在 Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987 中所 述的Kabat編號系統(tǒng)。對所屬領域的那些技術(shù)人員來說顯而易見的是存在CDR序列的另外 定義，如在Chothia等人(1989)中所述的那些。對所屬領域的那些技術(shù)人員來說顯而易見的是術(shù)語“源自，，不僅僅定義材料物理 起源意義上的來源，還定義了與該材料結(jié)構(gòu)上相同(在一級氨基酸序列上)但不來自參考 來源的材料。因此“CDRH3所源自的供體抗體中所發(fā)現(xiàn)的殘基”不必需是從供體抗體純化 的。“嵌合抗體”是指含有源自供體抗體的天然產(chǎn)生的可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈)與源 自接受者抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)結(jié)合的一種工程抗體?！叭嗽椿贵w”是指具有源自非人供體免疫球蛋白的CDR，而剩余的免疫球蛋 白源分子部分源自一個(或多個)人免疫球蛋白的一種工程抗體。此外，可以改變框 架支撐殘基以保持結(jié)合親和力(參見，例如Queen等人，Proc. Natl Acad Sci USA,86 10029-10032(1989) ；Hodgson 等人，Bio/Technology,9 :421 (1991))。適宜的人接受者抗 體可以是根據(jù)與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列的同源性選自下列常見數(shù)據(jù)庫的一個例 如，KABAT 數(shù)據(jù)庫、Los Alamos數(shù)據(jù)庫、以及Swiss Protein數(shù)據(jù)庫。特征為與供體抗 體的框架區(qū)同源(基于氨基酸)的人抗體可能適于提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變框架區(qū) 以用于供體CDR插入?？梢灶愃品绞竭x擇能夠供給輕鏈恒定區(qū)或可變框架區(qū)的適宜接受者 抗體。應了解接受者抗體重鏈和輕鏈不需要源自相同的接受者抗體?，F(xiàn)有技術(shù)描述了制備 這種人源化抗體的幾種方法_參見例如EP-A-0239400和EP-A-054951。術(shù)語“供體抗體”是指這樣的抗體(單克隆的和/或重組的)將其可變結(jié)構(gòu)域、 CDR、或其他功能片段或其類似物的氨基酸序列供給第一免疫球蛋白配對體以提供改變的 免疫球蛋白編碼區(qū)從而得到具有供體抗體的抗原特異性和中和活性的表達變化的抗體。術(shù)語“接受者抗體”是指與供體抗體異源的抗體(單克隆的和/或重組的)，它將 編碼其重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的所有(或任何部分，但優(yōu) 選所有)氨基酸序列供給第一免疫球蛋白配對體。人抗體是接受者抗體?！癈DR”定義為抗體的互補決定區(qū)氨基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高變 結(jié)構(gòu)域。參見，例如 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 4 版，U. S. Department of Health and HumanServices, National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可變部分有3個重鏈和3個輕鏈⑶R(或⑶R區(qū))。因此， 本文所用的“CDR”是指所有3個重鏈CDR、或所有3個輕鏈CDR(或適當?shù)脑挒樗兄劓満?所有輕鏈CDR)。抗體的結(jié)構(gòu)和蛋白的折疊可能意味著其他殘基應被認為是抗原結(jié)合區(qū)的 一部分，而且技術(shù)人員也應如此理解。參見，例如Chothia等人，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable domains ；Nature342，第 877—883 頁。CDR提供了抗體與抗原或表位結(jié)合的大部分接觸殘基。本發(fā)明中所關注的CDR源 自供體抗體重鏈和輕鏈可變序列，包括天然產(chǎn)生的CDR類似物，該類似物還具有或保持著 與它們所來源的供體抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。本文所用的術(shù)語“VH”和分別指抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。如本文所用的術(shù)語“效應子功能”是指抗體依賴性的細胞介導的細胞毒活性 (ADCC)和補體依賴性細胞毒活性(CDC)介導的反應、Fc介導的吞噬作用和經(jīng)由FcRn受
16體的抗體循環(huán)中的一種或多種。據(jù)信抗體恒定區(qū)和多個Fc受體的相互作用介導了抗體的 效應子功能。顯著的生物學效應可能是效應子功能的結(jié)果，尤其是抗體依賴性細胞毒作用 (ADCC)、補體結(jié)合(補體依賴性細胞毒作用或CDC)、吞噬作用(抗體依賴性細胞介導的吞噬 作用或ADCP)和抗體半衰期/清除的結(jié)果。通常，介導效應子功能的能力需要將抗體與抗 原結(jié)合并且不是所有抗體都介導每個效應子功能。效應子功能可以多種方法測量，包括例如通過Fc YRIII與自然殺傷細胞結(jié)合或 通過Fc yRI與單核細胞/巨噬細胞結(jié)合來測量ADCC效應子功能。例如，在天然殺傷細胞 測定中與針對等同的野生型抗體或其抗原結(jié)合片段測定時本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段 具有增加的ADCC效應子功能。此類測定的實例可以參見Shields等人，2001The Journal of Biological Chemistry,第 276 卷，第 6591-6604 頁；Chappel 等人，1993The Journal of BiologicalChemistry,第 268 卷，第 25124-25131 頁；Lazar 等人，2006PNAS，103 ； 4005-4010。檢測CDC功能的測定實例包括1995J Imm Meth 184 :29_38中所描述的那些?？梢愿鶕?jù)所需的效應子性質(zhì)而對抗體的重鏈恒定區(qū)進行多種改型?；旧先?乏a)通過經(jīng)典途徑激活補體；和b)介導抗體依賴性細胞毒作用的功能的人恒定區(qū)包 括IgG4恒定區(qū)和IgG2恒定區(qū)。已經(jīng)分別描述了含有特定突變的IgGl恒定區(qū)能降低與 Fc 受體的結(jié)合，從而降低 ADCC 和 CDC (Duncan 等人，Nature 1988，332 ；563-564 ； Lund 等 人 J. Immunol. 1991，147；2657-2662 ；Chappel 等人 PNAS 1991,88 ；9036-9040 ；Burton 和 Woof, Adv. Immunol. 1992,51 ； 1-84 ；Morgan 等人，Immunology 1995,86 ；319-324 ；Hezareh 等人，J. Virol. 2001,75(24) ；12161-12168)。據(jù)描述含有特定突變或在殘基Asn297上具有 改變的糖基化的人IgGl恒定區(qū)也能增強與Fc受體的結(jié)合。還顯示它們在一些情況下也能 增強ADCC和CDC(Lazar 等人PNAS 2006，103 ;4005_4010 ;Shields等人 J Biol Chem 2001， 276 ；6591-6604 ；Nechansky 等人 Mol Immunol, 2007, 44 ；1815-1817)。對于IgG抗體，包括ADCC和ADCP的效應子功能由重鏈恒定區(qū)與免疫細胞表面 所呈現(xiàn)的Fcy受體家族的相互作用來介導。在人中，這些受體家族包括FCYRI (⑶64)、 FcyRII (⑶32)和Fc y RIII (⑶16)?？贵w結(jié)合抗原的相互作用和Fc/Fc y復合體的形成誘 導許多效應，包括細胞毒作用、免疫細胞激活、吞噬作用、以及炎性細胞因子的釋放。已知 恒定區(qū)中的特定置換(包括S239D/I332D)能增加重鏈恒定區(qū)對某些Fc受體的親和力，從 而增強抗體的效應子功能(Lazer等人PNAS 2006)。1.抗體結(jié)構(gòu)完整抗體完整抗體包括異源多體糖蛋白，所述異源多體糖蛋白包含至少兩個重鏈和兩個輕 鏈。除了 IgM之外，完整抗體通常為約150Kda的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕(L) 鏈和兩個相同的重(H)鏈構(gòu)成。通常，各輕鏈通過一個共價二硫鍵連接至重鏈，而不同免疫 球蛋白同種型重鏈之間的二硫鍵數(shù)目也不同。各重鏈和輕鏈還具有鏈內(nèi)二硫鍵。各重鏈在 一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，其后是一些恒定區(qū)(0^、012、013)。各輕鏈具有可變結(jié)構(gòu)域
和在其另一端的恒定區(qū)；輕鏈的重鏈恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對齊，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與 重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。來自大部分脊椎動物物種的抗體輕鏈可以基于恒定區(qū)的氨基酸序列 歸為稱作k和Y的兩種類型中的一種。根據(jù)它們重鏈的重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，人抗體可以分為5種不同的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可以再分為下面的亞類 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；以及IgAl和IgA2。小鼠和大鼠存在的物種變體具有至少IgG2a、 IgG2b?？贵w可變結(jié)構(gòu)域賦予抗體結(jié)合特異性，其中某些區(qū)域顯示特定的變異性，它們稱為 互補決定區(qū)(CDR)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域較保守的部分稱為框架區(qū)(FR)。完整重鏈和輕鏈的可變結(jié) 構(gòu)域各自包含由3個⑶R連接的4個FR。各鏈中的⑶R通過FR區(qū)緊密的保持在一起，并與 另一條鏈的CDR提供抗體的抗原結(jié)合位點的形成。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合， 但是會顯示出多種效應子功能，例如參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、經(jīng)由 結(jié)合Fcy受體的吞噬作用、經(jīng)由新生兒Fc受體(FcRn)的半衰期/清除率以及經(jīng)由補體的 Clq組分級聯(lián)的補體依賴性細胞毒作用。1. 1. 2 人抗體人抗體可以通過本領域內(nèi)技術(shù)人員所已知的多種方法制備。人抗體可以使用 人骨髓瘤或小鼠_人異源骨髓瘤細胞系通過雜交瘤方法制備，參見Kozbor J. Immunol 133,3001， (1984)禾口 Brodeur, Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,第51-63 i (Marcel Dekker Inc，1987)。替代性方法包括使用噬菌體文庫 或轉(zhuǎn)基因小鼠，它們都使用人可變結(jié)構(gòu)域庫(參見Winter G，(1994), Annu. Rev. Immunol 12,433-455 ；Green LL(1999), J.Immunol, methods 231,11—23)?，F(xiàn)在可以使用幾種轉(zhuǎn)基因小鼠株系，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座替換成了 人免疫球蛋白基因片段(參見，Tomizuka K, (2000) PNAS97, 722-727 ；Fishwild D.M(1996) Nature Biotechnol. 14，845-851，Mendez MJ, 1997, Nature Genetics，15，146-156)。在抗 原刺激后，這些小鼠能夠產(chǎn)生人抗體庫，可以從中選擇所關注的抗體。特別值得注意的是 Trimera 系統(tǒng)(參見 Eren R 等人，(1998) Immunology 93 :154_161)，其中將人淋巴細胞 移植到經(jīng)輻照的小鼠；選擇淋巴細胞抗體系統(tǒng)(SLAM，參見Babcook等人，PNAS(1996)93 7843-7848)，其中對人(或其他物種)淋巴細胞進行大量采集的體外抗體制備過程，然后進 行解卷(deconvulated)、限度稀釋和選擇程序；以及Xenomouse II (Abgenix Inc)。一替 代方法得自Morphotek Inc,該方法使用Morphodoma 技術(shù)。可以使用噬菌體展示技術(shù)來制備人抗體(及其片段)，參見McCafferty ；Nature, 348,552-553(1990)和 Griffiths AD 等人(1994) EMB013 :3245_3260。根據(jù)此技術(shù)，將抗體 可變結(jié)構(gòu)域基因框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要衣殼蛋白基因中，并 且在噬菌體粒子表面上展示(通常借助于輔助噬菌體)為其功能抗原結(jié)合片段。基于抗體 功能性質(zhì)的選擇導致選擇了編碼顯示那些性質(zhì)的抗體的基因?？梢允褂檬删w展示技術(shù)來 從文庫中選擇抗原特異性抗體，該文庫由自經(jīng)受上述疾病或病癥折磨的個體所取得或得自 未免疫的人供體的B細胞制得(參見Marks J. Mol. Bio. 222，581-597，1991)。當需要包含 恒定結(jié)構(gòu)域的完整人抗體時，有必要將噬菌體展示來源的片段再克隆到包含所需的恒定區(qū) 的哺乳動物表達載體和建立的穩(wěn)定表達細胞系中?？梢允褂糜H和力成熟技術(shù)(Marks ；Bio/technol 10,779-783(1992))來改善結(jié)合 親和力，其中通過用天然產(chǎn)生的變體連續(xù)替換H和L鏈可變結(jié)構(gòu)域來改善主要人抗體的親 和力，并根據(jù)改善的親和力進行選擇?，F(xiàn)在還可使用此技術(shù)的變化形式，如“表位印跡”，參 見 W0 93/06213。還參見 Waterhouse ;Nucl. Acids Res 21,2265-2266(1993)。1. 2嵌合和人源化抗體
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完整的非人抗體在治療人疾病或病癥中的應用可能隨之具有目前已確定的免疫 原性問題，也就是說患者的免疫系統(tǒng)可能將非人的完整抗體識別為非自身的，并引起中和 反應。這在將非人抗體多次給予人類患者時尤其明顯。近年來已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)來克服 這些問題，通常包括降低在完整抗體中的非人氨基酸序列組成，同時保持從被免疫的動物 (例如，小鼠、大鼠或兔)獲得非人抗體時的相對便利。一般來說使用兩種方法來達成。第 一種是嵌合抗體，它通常包含與人恒定區(qū)融合的非人(例如嚙齒動物，如小鼠)可變結(jié)構(gòu) 域。由于抗體的抗原結(jié)合位點定位在可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)，所以嵌合抗體保持其對抗原的結(jié)合親 和力，但是獲得了人恒定區(qū)的效應子功能，因此能夠執(zhí)行例如如上所述的效應子功能。通常 使用重組DNA方法來制備嵌合抗體。使用常規(guī)方法對編碼抗體的DNA(例如，cDNA)進行分 離并測序(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼本發(fā)明抗體的H和L鏈的基因的寡核苷酸 探針)。雜交瘤細胞為此種DNA的一般來源。一旦分離，將DNA置于表達載體中，然后將該 表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞，如大腸桿菌(E. Coli)、COS細胞、CH0細胞或骨髓瘤細胞等不會 另外產(chǎn)生免疫球蛋白的那些，從而獲得抗體合成。可以通過將人L和H鏈的編碼序列置換為 相應的非人(如，鼠)H和L恒定區(qū)來修飾DNA，參見，例如Morrison ；PNAS 81,6851(1984)。第二種方法包括制備人源化抗體，其中通過將可變結(jié)構(gòu)域人源化來降低抗體的非 人內(nèi)含物。有兩種人源化技術(shù)是常用的。第一種是通過CDR移植來進行人源化。CDR產(chǎn)生 接近抗體N-末端的環(huán)，它們在此處形成位于框架區(qū)所提供的支架內(nèi)的表面?？贵w的抗原結(jié) 合特異性主要由表面特征和其CDR表面的化學特征決定。這些特征繼而由各CDR的構(gòu)象、 CDR的相對分布、以及構(gòu)成CDR的殘基側(cè)鏈的性質(zhì)和分布所決定。免疫原性的顯著降低可以 通過僅將非人(如鼠)抗體(“供體”抗體)移植到人框架(“接受者框架”)和恒定區(qū)來 取得(參見 Jones 等人(1986) Nature 321，522-525 和 Verhoeyen M 等人(1988) Science 239,1534-1536)。然而，⑶R移植本身可能不會產(chǎn)生完全保留的抗原結(jié)合性質(zhì)，常發(fā)現(xiàn)的 是如果要恢復顯著的抗原結(jié)合親和力的話，供體抗體的一些框架殘基(有時稱為“回復突 變”)需要保持在人源化分子中(參見Queen C等人(1989)PNAS 86，10，029-10，033 ;Co， M等人(1991)Nature 351，501-502)。在這種情況下，從數(shù)據(jù)庫中選擇顯示與非人供體抗體 具有最高序列同源性的人可變結(jié)構(gòu)域以提供人框架(FR)。人可以從人通用抗體或個體 人抗體中選擇。需要時，將來自供體抗體的主要殘基置換為人接受者框架以保持CDR構(gòu)象。 可以使用抗體的計算機建模來協(xié)助鑒別這些結(jié)構(gòu)上重要的殘基，參見W099/48523?；蛘?，人源化可以通過“鑲飾”方法達成。獨特的人和鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可 變結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)計分析表明在人和鼠抗體中的暴露殘基的精確模式不同，大多數(shù)個體表面位 置最優(yōu)選的是具有少數(shù)不同殘基(參見PadlanE.A.等人；(1991)Mol. Immunol. 28,489-498 和Pedersen J. T.等人(1994) J. Mol. Biol. 235 ；959-973)。因此，可能通過替換在其框架區(qū) 內(nèi)與人抗體中通常所發(fā)現(xiàn)的那些不同的暴露殘基來降低非人Fv的免疫原性。由于蛋白抗 原性可能與表面可接近性相關，所以表面殘基的取代可能足以使小鼠可變結(jié)構(gòu)域不被人免
G. E. ^A (1994) in Handbookof Experimental Pharmacology 第 13 卷:The pharmacology of monoclonalAntibodies, Springer-Verlag,第 105-134 頁)。這種人源化方法被稱為“鑲飾”，因為只有抗體表面改變了，支持殘基則保持不變。1. 3雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩個不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。本領域內(nèi)已知制備這類抗體的方法。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備是基于兩對免疫球蛋白H鏈-L 鏈的共表達，其中兩個H鏈具有不同的結(jié)合特異性，參見Millstein等人，Nature 305 537-539(1983) ；W093/08829 ；和 Traunecker 等人 EMB0，10，1991，3655-3659。由于 H 鏈禾口 L 鏈的隨機分類，會產(chǎn)生10種不同抗體結(jié)構(gòu)的可能混合物，其中僅有一種具有所需的結(jié)合特 異性。另一方法包括將具有所需結(jié)合特異性的可變結(jié)構(gòu)域融合到包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū) 的至少一部分的重鏈恒定區(qū)上。在一個實施方式中，至少一個融合體中存在含有結(jié)合輕鏈 所需的位點的CH1區(qū)。編碼這些融合體的DNA、以及L鏈(如果需要的話)插入單獨的表達 載體中，然后將它們共轉(zhuǎn)染到適宜的宿主有機體。然而也可以將2條或所有3條鏈的編碼序 列插入到一個表達載體中。在一個方法中，雙特異性抗體由下面的部分構(gòu)成在一臂上具有 第一結(jié)合特異性的H鏈；和H-L鏈對，在另一臂上提供第二結(jié)合特異性，參見W094/04690。 還參見Suresh等人在Enzymology 121，210，1986中的方法。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了雙特異性抗體，其中所述抗體的至少一個結(jié)合 特異性是針對hIGF-lR的，并且所述抗體中和hIGF-lR的活性。此類抗體還可以包含人IgG 同種型(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體還可以為多特異性的，例如 通過組合一些抗原結(jié)合片段而形成的多特異性抗體。1.4抗原結(jié)合片段這類抗原結(jié)合片段包含部分重鏈或輕鏈可變序列(例如，免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域 氨基端或羧基端的少量缺失)，它們保持著與片段來源的抗體相同的抗原結(jié)合特異性和相 同或相似的中和能力。在本發(fā)明的某些實施方式中，提供了中和hIGF-lR活性的抗原結(jié)合片段這類片 段可以是完整和/或人源化和/或嵌合抗體的功能性抗原結(jié)合片段，如上述抗體的Fab、 Fab'、F(ab' )2、Fv、ScFv。傳統(tǒng)上，這些片段通過完整抗體的蛋白水解消化(例如通過木 瓜蛋白酶消化)來制備(參見，例如W094/29348)，但是也可以從重組轉(zhuǎn)化的宿主細胞直接 制備。對于ScFv的制備，參見Bird等人；(1988) Science，242，423-426。此外，抗原結(jié)合片 段可以使用下文所述的多種工程技術(shù)來制備。Fv片段的兩個鏈之間相互作用的能量似乎比Fab片段要低。為了穩(wěn)定VH和\ 結(jié)構(gòu)域的締合，用肽(Bird 等人，(1988)Science 242，423-426 ;Huston 等人，PNAS，85， 5879-5883)、二硫鍵(Glockshuber 等人，(1990) Biochemistry, 29,1362-1367)和“旋鈕孔 (knob in hole) ” 突變(Zhu 等人(1997)，Protein Sci.，6，781-788)來連接它們。ScFv 片段可以通過本領域技術(shù)人員所熟知的方法來制備，參見Whitlow等人(1991)MethodS companion MethodsEnzymol,2,97-105 ；禾口 Huston 等人(1993)Int. Rev. Immunol 10, 195-217。ScFv可以在諸如大腸桿菌等細菌細胞中制備，但是更優(yōu)選的是在真核細胞中制 備。ScFv的一個缺點是產(chǎn)物為單價的，這就排除由于多價結(jié)合而增加親和力以及它們的短 的半衰期?？朔@些問題的嘗試包括通過下列方法而由含另外的C末端半胱氨酸的ScFV 制備二價(ScFv' )2 化學偶聯(lián)(Adams 等人(l"3)Can. Res 53,4026-4034 ；和 McCartney 等人(1995) Protein Eng. 8, 301-314)；或含未配對C末端半胱氨酸殘基的ScFv的自發(fā)性 位點特異性二聚作用(參見 Kipriyanov 等人(1995)Cell.Biophys 26，187-204)?；蛘?， 可以通過將肽連接子縮短至3至12個殘基形成“雙體(diabodies)，，來使ScFv形成多聚 體，參見Holliger等人PNAS (1993)，90，6444-6448?？s短連接子還可以得到ScFv三聚體(“三體(triabodies) ”，參見 Kortt 等人(1997) ProteinEng，10，423-433)和四聚體(“四 體(tetrabodies) ”，參見 Le Gall 等人(1999) FEBS Lett，453，164-168)。二價 ScFv 分子 的構(gòu)建還可以通過與蛋白二聚化基序基因融合形成“微型抗體”(參見Pack等人(1992) Biochemistry 31，1579-1584)和“微型體(minibody) ”(參見 Hu 等人(1996)，Cancer Res. 56,3055-3061)來達成。ScFv-Sc_Fv串聯(lián)體((ScFV)2)還可以通過由第三肽連接子連 接兩個ScFv單元來制備，參見Kurucz等人(1995) J. Immol. 154，4576-4582。雙特異性雙 體可以通過兩個單鏈融合產(chǎn)物的非共價締合來制備，所述兩個單鏈融合產(chǎn)物由來自一個抗 體的VH結(jié)構(gòu)域通過短的連接子連接到另一抗體的\結(jié)構(gòu)域而構(gòu)成，參見Kipriyanov等人 (1998)，Int. J. Can77，763-772。這種雙特異性雙體的穩(wěn)定性可以通過引入二硫鍵或上述 “旋鈕孔”突變，或通過形成單鏈雙體(ScDb)來增強，其中兩個雜交ScFv片段通過肽連接子 連接，參見Kontermann等人(1999) J. Immunol. Methods 226179-188。四價雙特異性分子通 過如下方式獲得例如，將ScFv片段融合至IgG分子的CH3結(jié)構(gòu)域或經(jīng)由鉸鏈區(qū)融合到Fab 片段，參見Coloma等人(1997)Nature Biotechnol. 15，159-163?；蛘?，四價雙特異性分子 通過融合雙特異性單鏈雙體而制備(參見Alt等人，(1999) FEBS Lett 454，90-94)。較小的 四價雙特異性分子還可以通過如下方法來形成SCFV-SCFV串聯(lián)體與含螺旋-環(huán)-螺旋基 序的連接子的二聚化(DiBi微型抗體，參見Muller等人(1998)FEBS Lett 432，45_49)，或 包含四個抗體可變結(jié)構(gòu)域(\和\)的單鏈分子二聚化，所述四個抗體可變結(jié)構(gòu)域以防止分 子間配對的方向定位(串聯(lián)雙體，參見Kipriyanov等人，(1999) J. Mol. Biol. 293，41-56)。 雙特異性F(ab' )2片段可以通過Fab'片段的化學偶聯(lián)或通過經(jīng)由亮氨酸拉鏈的異源二 聚化而制備(參見 Shalaby 等人，(1992) J. Exp. Med. 175，217-225 和 Kostelny 等人(1992)， J. Immunol. 148，1547-1553)。還可以使用分離的 VH 和 Vl 結(jié)構(gòu)域(Domantis plc)，參見 US 6，248，516 ；US 6，291，158 ；US 6，172，197。在一個實施方式中，提供了中和hIGF-lR活性的如上所述的特異性結(jié)合hIGF-lR 的抗原結(jié)合片段(例如ScFv、Fab、Fab'、F(ab' )2)或工程抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合片 段可以包含下列序列的一個或多個SEQ. ID. NO 1中所示的⑶RH3、SEQ. ID. NO 2中所示的 CDRH2、SEQ. ID. NO 3 中所示的 CDRH1、SEQ. ID. NO 4 中所示的 CDRL1、SEQ. ID. NO 5 中所示 的 CDRL2、以及 SEQ. ID. NO 6 中所示的 CDRL3。1. 5異源綴合抗體異源綴合抗體也可形成本發(fā)明的實施方式。異源綴合抗體由使用任何方便的交聯(lián) 方法形成的兩個共價連接的抗體構(gòu)成。參見，例如，US 4，676，980。1. 6其他修飾據(jù)信抗體恒定區(qū)和各種Fc受體(FcyR)之間的相互作用介導抗體的效應子功 能，該功能包括抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)、補體結(jié)合、吞噬作用以及抗體的半衰期/ 清除?？梢愿鶕?jù)所需的性質(zhì)而對本發(fā)明抗體的恒定區(qū)進行多種修飾。例如，使得能夠得到 另外的溶解性抗體、非溶解性抗體的恒定區(qū)特定突變在EP 0629 240B1和EP 0307 434B2 中詳細描述；或者可以將補救性受體結(jié)合表位引入抗體中以延長血清半衰期，參見US 5，739，277。目前認識到的人 Fc y 受體有 5 種:Fc yR(I),Fcy RIIa、Fc yRIIb.Fcy RHIa 和新生兒 FcRn。Shields 等人，(2001) J. Biol. Chem 276，6591-6604 證明一組常見的 IgGl 殘基參與所有Fc y R的結(jié)合，而Fc Y RII和Fc Y RIII則利用此常見組之外的不同位點。當
21下面一組IgGl殘基變?yōu)楸彼釙r能降低與所有Fc y R的結(jié)合Pro-238、ASp-265、ASp-270、 Asn-297和Pro-239。它們所有都在IgG CH2結(jié)構(gòu)域中并在連接CHI和CH2的鉸鏈附近聚集。 而Fc y RI僅利用所述常見組的IgGl殘基來結(jié)合，F(xiàn)c y RII和Fc y RIII除所述常見組外還 與其他殘基相互作用。一些殘基的改變僅降低與Fc y RII (例如，Arg-292)或Fc y RIII (例 如，Glu-293)的結(jié)合。一些變體顯示出與FcyRII或FcyRIII結(jié)合的增強，但是不影響 與另一受體的結(jié)合(例如Ser-267Ala增強與FcyRII的結(jié)合，但是不影響與Fc y RIII的 結(jié)合)。其他變體顯示出與Fc y RII或Fc Y RIII結(jié)合的增強，同時降低與另一受體的結(jié)合 (例如Ser-298Ala增強與FcyRIII的結(jié)合，降低與FcyRII的結(jié)合)。對于Fc y Rllla， 最佳的結(jié)合IgGl變體組合了在Ser-298、GlU-333和Lys_334的丙氨酸置換。據(jù)信，新生兒 FcRn受體參與兩種抗體的清除和跨組織的轉(zhuǎn)胞吞(transcytosis)作用(參見，Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 和 Ghetie 等人(2000) Annu. Rev. Immunol. 18,739-766)。 確定與人FcRn直接相互作用的人IgGl殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、 Asn434和His435。在此部分所述的這些位置的任何一處的改變可能延長本發(fā)明抗體的血 清半衰期和/或改變效應子性質(zhì)。其他修飾包括本發(fā)明抗體的糖基化變體。已知抗體在其恒定區(qū)保守位置的糖基化 對抗體功能具有顯著影響，尤其是上述那些效應子功能，參見，例如Boyd等人(1996)，Mol. Immunol. 32，1311-1318。本發(fā)明預期其中添加、置換、缺失或修飾一個或多個碳水化合物部 分的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的糖基化變體。天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇 氨酸基序的引入產(chǎn)生碳水化合物基序酶促連接的可能位點，因此可以用于實施抗體糖基 化。在Raju等人(2001) Biochemistry 40，8868-8876中，通過使用3_1，4_半乳糖轉(zhuǎn)移酶 和/或a，2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的再次半乳糖基化和/或再次唾液酸化過程增加了 TNFR-IgG 免疫粘合素的末端唾液酸化。據(jù)信末端唾液酸化的增加能延長免疫球蛋白的半衰期。與大 多數(shù)糖蛋白一樣，抗體通常制備成糖形的混合物。當抗體在真核細胞，尤其在哺乳動物細 胞中制備時，此混合物尤其明顯。已經(jīng)開發(fā)了許多方法來制備指定的糖形，參見Zhang等 人 Science (2004)，303，371 ；Sears 等人，Science, (2001) 291，2344 ;Wacker 等人(2002) Science, 2981790 ；Davis 等人(2002) Chem. Rev. 102,579 ；Hang 等人(2001) Acc. Chem. Res 34，727。因此，本發(fā)明預期多個如本文所述的(單克隆)抗體(可能為IgG同種型，例如 IgGl)，所述抗體包括指定數(shù)(例如，7或更少，例如5或更少，如2個或1個)的糖形的所述 抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的其他實施方式包括與諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧乙烯等非 蛋白類聚合物偶聯(lián)的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段。蛋白與PEG綴合是延長蛋白半衰期 以及降低蛋白抗原性和免疫原性的確定技術(shù)。已經(jīng)研究了不同分子量和類型(直鏈或分 支)的PEG化用于完整抗體以及Fab'片段的用途，參見Koumenis I. L.等人(2000) Int. J.Pharmaceut. 198 :83_95。2.制備方法本發(fā)明的抗體可以制備成多克隆群，但是更優(yōu)選是制備成單克隆群(也就是說制 備成針對特定抗原結(jié)合位點的基本上同源的相同抗體群)。對于本領域的那些技術(shù)人員顯 而易見的是群意味著大于一種抗體實體。本發(fā)明的抗體可以在下列轉(zhuǎn)基因有機體中制備 如山羊(參見 Pollock 等人(1999)，J. Immunol. Methods 231 :147_157)、雞(參見 Morrow
22KJJ(2000)Genet. Eng. News 20:1-55)、小鼠(參見 Pollock 等人)或植物(參見 DoranPM， (2000)Curr. Opinion Biotechnol. 11，199-204 ；Ma JK-C(1998)，Nat. Med. 4 ；601-606 ；Baez J 等人，BioPharm(2000) 13 :50_54，Stoger E 等人；(2000) Plant Mol. Biol. 42 :583_590)。 抗體還可以通過化學合成來制備。然而，本發(fā)明的抗體通常使用本領域技術(shù)人員所熟知的 重組細胞培養(yǎng)技術(shù)來制備。將編碼抗體的多核苷酸分離并插入到諸如質(zhì)粒等可復制載體中 以用于進一步克隆(擴增)或表達。一種可用的表達系統(tǒng)為谷氨酸合成酶系統(tǒng)(如Lonza Biologies所出售的)、尤其是在宿主細胞為CH0或NS0時(參見下文)。使用常規(guī)方法(例 如，寡核苷酸探針)能容易地對編碼抗體的多核苷酸進行分離和測序?？梢允褂玫妮d體包 括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微小染色體，其中質(zhì)粒為典型的實施方式。一般來說，這些載 體還包括可操作地連接到輕鏈和/或重鏈多核苷酸以利于表達的信號序列、復制起點、一 個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸可以 插入單獨的載體并轉(zhuǎn)染到相同的宿主細胞中，或者需要時，重鏈和輕鏈可以插入同一載體， 以轉(zhuǎn)染到宿主細胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了構(gòu)建編碼本發(fā)明的抗體或其抗原 結(jié)合片段的輕鏈和/或重鏈的載體的方法，該方法包括將編碼本發(fā)明抗體的輕鏈和/或重 鏈的多核苷酸插入到載體中。本領域的技術(shù)人員已知的是編碼與天然產(chǎn)生的蛋白相同蛋白的合成基因或野生 型基因可以通過改變基因中所用的密碼子來設計。這些設計技術(shù)包括將在哺乳動物基因中很少用的基因中的那些密碼子替換為更 常用于哺乳動物基因中的氨基酸的密碼子。此過程稱為密碼子優(yōu)化，其使用目的在于用密 碼子優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)染的宿主細胞所產(chǎn)生的蛋白總水平比用野生型序列轉(zhuǎn)染的更高。已經(jīng)公 開了幾種方法(Nakamura 等人，Nucleic Acids Research 1996,24 :214_215 ；W098/34640 ； W097/11086)。密碼子使用頻率可以源自許多物種的高表達基因的文獻來源(參見，例如 Nakamura 等人 Nucleic Acids Research 1996，24 :214_215)。還公開了人的密碼子使用表 (W02005025614)。對于本領域的那些技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于遺傳密碼子的簡并性，也可 以使用編碼本發(fā)明多肽的本文所公開的那些多核苷酸的替代多核苷酸(尤其是密碼子經(jīng) 優(yōu)化以在給定宿主細胞中表達的那些)。3. 1信號序列本發(fā)明的抗體可以制備成與異源信號序列的融合蛋白，該融合蛋白在成熟蛋白的 N末端具有特異性裂解位點。該信號序列應被宿主細胞識別和加工。對于原核宿主細胞來 說，所述信號序列可以為例如，堿性磷酸酶、青霉素酶、或熱穩(wěn)定腸毒素II前導序列。對 于酵母分泌來說，所述信號序列可以為例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導序列、a因子前導序列或酸 性磷酸酶前導序列，參見，例如W090/13646。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，諸如單純皰疹病毒 (herpessimplexkD信號等病毒分泌前導序列和天然免疫球蛋白信號序列可能是合適的。 通常，在閱讀框內(nèi)將信號序列連接到編碼本發(fā)明抗體的DNA。3. 2復制起點復制起點在本領域內(nèi)是熟知的，PBR322適于大多數(shù)的革蘭氏陰性菌；質(zhì)粒適 于大多數(shù)的酵母；諸如SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV等多數(shù)病毒起點適于大多數(shù)哺乳動物細胞。通常，哺乳動物表達載體不需要復制組分，但是可以使用SV40，因為其含有早期啟動 子。3. 3詵擇標記典型的選擇基因編碼如下的蛋白(a)能賦予對如下抗生素或其他毒素的抗性 如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素；或(b)能夠彌補營養(yǎng)缺陷型的缺陷或提供復合 培養(yǎng)基中不可得到的營養(yǎng)。選擇方案可以包括阻止宿主細胞生長。用編碼本發(fā)明抗體的基 因成功轉(zhuǎn)染的細胞由于(例如)選擇標記所賦予的藥物抗性而得以存活下來。另一個實例 為所謂的DHFR選擇標記，其中在存在氨甲喋呤的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。在典型的實施方式 中，在遞增量的氨甲喋呤的存在下培養(yǎng)細胞以擴增所關注的外源基因的拷貝數(shù)。CH0細胞是 特別可用于DHFR選擇的細胞系。另一實例是谷氨酸合成酶表達系統(tǒng)(Lonza Biologies)。 用于酵母的適宜選擇基因為trpl基因，參見Stinchcomb等人Nature 282，38，1979。3. 4啟動子適于表達本發(fā)明抗體的啟動子可操作地與編碼抗體的DNA/多核苷酸連接。用于 原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、0 -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸 和雜交啟動子，如Tac。適于在酵母細胞中表達的啟動子包括3_磷酸甘油酸激酶或其他糖 酵解酶，例如烯醇化酶、3磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄 糖6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶。誘導性酵母啟動子包括乙醇脫氫酶 2、異細胞色素(isocytochromeK、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負責氮代謝或麥芽糖/半乳 糖利用的酶。用于在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達的啟動子包括病毒啟動子，如多瘤、禽痘和腺 病毒(例如，腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒(尤其立即早期啟動 子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肝炎B病毒、肌動蛋白、勞斯氏(rou)肉瘤病毒(RSV)啟動子和早期或晚 期猿猴(Simian)病毒40。當然，啟動子的選擇是基于其與用于表達的宿主細胞的適當相容 性。因此，在一個實施方式中，提供包含下列的第一質(zhì)粒RSV和/或SV40和/或CMV啟動 子、編碼本發(fā)明輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA、kC區(qū)以及新霉素和氨芐青霉素抗性的選擇標 記；和包含下列的第二質(zhì)粒RSV或SV40啟動子、編碼本發(fā)明重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)的DNA、 編碼、1恒定區(qū)的DNA、DHFR和氨芐青霉素抗性標記。3. 5增強子元件適當時(例如，用于在高等真核生物中表達時)，可以使用在載體中可操作地連接 在啟動子元件上的增強子元件。適宜的哺乳動物增強子序列包括來自珠蛋白、彈性蛋白酶、 白蛋白、胎蛋白和胰島素的增強子元件?；蛘?，可以使用來自真核細胞病毒的增強子元件， 如SV40增強子(bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子、桿狀病毒增強子 或鼠IgG2a基因座(參見W004/009823)。增強子可以位于載體上啟動子上游的位點。3. 5. 5-多腺苷酸化信號在真核系統(tǒng)中，腺苷酸化信號可操作地與編碼本發(fā)明抗體的DNA/多核苷酸連接。 此信號通常位于開放閱讀框的3’端。在哺乳動物系統(tǒng)中，非限制性實例包括源自生長激素、 延伸因子-la和病毒(例如SV40)基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列的信號。在酵母系 統(tǒng)中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和乙醇脫氫 酶l(ADH)基因的那些。在原核系統(tǒng)中，多腺苷酸化信號通常是不需要的，取而代之的是通常使用較短且更明確限定的終止子序列。當然，多腺苷酸化/終止序列的選擇是基于其與 用于表達的宿主細胞的適當相容性。3. 6宿主細胞用于克隆或表達編碼本發(fā)明抗體的載體的適宜宿主細胞為原核細胞、酵母細胞 或高等真核細胞。適宜的原核細胞包括真細菌，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)， 如埃希氏桿菌屬(Escherichia)，如大腸桿菌(例如 ATCC 31,446 ；31, 537 ；27, 325),J 桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella Proteus)、 如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等沙門氏菌(Salmonella)、如粘制沙 雷菌(Serratiamarcescans)等沙雷氏菌屬(Serratia)和志賀氏菌屬(Shigella)以 及如枯草桿菌(B. subtilis)和蘚樣芽胞桿菌(B. licheniformis)(參見DD 266 710) 等桿菌、如綠膿桿菌(P. aeruginosa)等假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬 (Str印tomyces)。在酵母宿主細胞中，預期釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂 殖酵母屬 (schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(例如，ATCC 16，045 ； 12，424 ；24178 ；56，500)、耶氏酵母(yarrowia) (EP402, 226)、畢赤酵母屬(Pichia Pastoris) (EP183, 070，還參見 Peng 等人 J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192)、念珠菌屬 (Candida)、里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP244, 234)、青霉素(Penicillin)、彎頸霉 (Tolypocladium)和諸如構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)等曲霉。盡管本發(fā)明特別預期原核和酵母宿主細胞，但是本發(fā)明的宿主細胞為高等真核細 胞。適宜的高等真核宿主細胞包括哺乳動物細胞，如cos-l (ATCCN0 :CRL 1650)、⑶S_7 (ATCC CRL 1651)、人胚腎細胞系 293、幼倉鼠腎細胞(BHK) (ATCC CRL. 1632)、BHK570 (ATCC NO CRL 10314) ,293 (ATCC NO :CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞 CH0 (例如 CH0-K1，ATCC NO :CCL 61 ;DHFR-CH0 細胞系，如 DG44 (參見 Urlaub 等人，(1986) SomaticCell Mol. Genet. 12， 555-556))，尤其是適于懸浮培養(yǎng)的那些CH0細胞、小鼠塞托利(Sertoli)細胞、猴腎細胞、 非洲綠猴腎細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、犬腎細胞(ATCC CCL 34)、人肺細胞(ATCC CCL 75), Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤細胞，例如NS0 (參見US 5，807，715)、Sp2/0、Y0。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細胞，該宿主細胞包含 編碼本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈和/或輕鏈的載體。此宿主細胞包含編碼所 述輕鏈的第一載體和編碼所述重鏈的第二載體。細菌發(fā)酵細菌系統(tǒng)特別適于抗原結(jié)合片段的表達。此類片段定位在細胞內(nèi)或在周質(zhì)內(nèi)?？?以根據(jù)本領域內(nèi)的技術(shù)人員已知的方法提取不可溶性周質(zhì)蛋白并將其折疊以形成活性蛋 白，參見 Sanchez 等人(1999) J. Biotechnol. 72，13-20 和 Cupit PM 等人(1999) Lett Appl Microbiol，29，273-277。3. 7細胞培養(yǎng)方法可以通過本領域的技術(shù)人員已知的任何方法來培養(yǎng)用編碼本發(fā)明抗體或其抗原 結(jié)合片段的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。可以在轉(zhuǎn)瓶、滾瓶或中空纖維系統(tǒng)中培養(yǎng)宿主細胞，但是 對于大規(guī)模制備，具體使用攪拌反應罐來進行懸浮培養(yǎng)。優(yōu)選地，將攪拌罐改造成適于使用 例如噴霧器、擋板或低剪切葉輪的通氣條件。對于鼓泡柱和空運反應器，可以采用用空氣 或氧氣鼓泡的直接通氣。當宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)基補充有細胞保護劑
25(如弗朗尼克F-68(plUr0niC F-68))以幫助防止因通氣過程而造成的細胞損害。依據(jù)宿 主細胞特征，可以使用微載體作為錨定依賴性細胞系的生長基質(zhì)；或者使細胞適應懸浮培 養(yǎng)(這是通常情況)。宿主細胞，尤其無脊椎動物宿主細胞的培養(yǎng)可以利用許多操作模型， 例如分批補料、反復分批加工(參見Drapeau等人(1994) cytotechnology 15 103-109)、 延伸分批加工(extendedbatch process)或灌注培養(yǎng)。盡管重組轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞 可以在含血清的培養(yǎng)基(例如胎牛血清(FCS))中培養(yǎng)，例如此類宿主細胞可以在無血清的 合成培養(yǎng)基(如Keen等人(1995) Cytotechnology 17 153-163中所公開的)、或市售培養(yǎng) 基(如ProCHO-CDM或UltraCHO (Cambrex NJ，USA))中培養(yǎng)，需要時，該培養(yǎng)基可以補充能 量來源，如葡萄糖和合成的生長因子，如重組胰島素。宿主細胞的無血清培養(yǎng)可能需要那些 細胞適應在無血清條件下生長。一種適應方法是，將這類宿主細胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 將80%的培養(yǎng)基重復更換為無血清培養(yǎng)基以使宿主細胞學習適應無血清條件(參見，例 如 Scharfenberg K 等人(1995) in Animal Cell technology :Developments towards the 21st century (Beuvery E. C.等人編輯)，第 619-623 頁，Kluwer Academic publishers)?？梢允褂枚喾N技術(shù)來回收和純化分泌到培養(yǎng)基中的本發(fā)明抗體，以提供適于預期 用途的純化程度。例如，本發(fā)明抗體用于治療人類患者時通常要求至少95%的純度，更典 型98%或99%或更高的純度(與粗培養(yǎng)基相比)。在第一種情況下，通常使用離心，然后使 用例如微量過濾、超濾、和/或深層過濾來澄清上清液的步驟從培養(yǎng)基中清除細胞碎片?？?以使用許多其它的技術(shù)，例如透析和凝膠電泳和色譜技術(shù)，如羥磷灰石(HA)、親和色譜(任 選地包括親和標記系統(tǒng)，如多聚組氨酸)和/或疏水作用色譜(HIC，參見US 5，429，746)。 在一個實施方式中，在多個澄清步驟之后，使用蛋白A或G親和色譜，然后通過進一步的色 譜步驟，例如離子交換和/或HA色譜、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻色譜，以及硫酸銨沉 淀來捕獲本發(fā)明的抗體。通常，還采用多個病毒清除步驟(例如，使用DV-20濾器的納米過 濾)。在這些各種步驟之后，得到純化的(優(yōu)選為單克隆的)制劑，該制劑包含至少75mg/ ml或更多，例如100mg/ml或更多的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段，因此其形成了本發(fā)明的 實施方式。適宜的是此制劑基本上不含本發(fā)明抗體的聚集形式。4.藥物組合物上述本發(fā)明抗體的純化制劑(尤其為單克隆制劑)可以結(jié)合到藥物組合物中用 于治療人類疾病和病癥，如類風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；或癌癥，例如急性成淋巴細胞性白 血病、腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關性癌癥、AIDS相關性淋巴瘤、肛門癌、兒童小腦星形細胞瘤、 兒童大腦星形細胞瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌、肝外膽管癌、膀胱癌、骨肉瘤/惡性纖維 組織細胞骨癌、腦腫瘤(例如，腦干膠質(zhì)瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質(zhì) 瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、視通路和下丘腦膠質(zhì)瘤)、乳腺癌、 支氣管腺瘤/類癌、伯基特淋巴瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、未知原發(fā)性、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng) 腫瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、兒童期癌、慢性淋巴細胞 性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚T細胞淋 巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文家族腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、 肝外膽管癌、眼內(nèi)黑素瘤眼癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、生殖細 胞瘤(例如，顱外的、性腺外的、和卵巢的)、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、膠質(zhì)瘤(例如，成人、兒童 腦干、兒童大腦星形細胞瘤、兒童視通路和下丘腦的)、毛細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞
26(肝)癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘腦和視通路膠質(zhì)瘤、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細胞癌(內(nèi)分 泌胰腺)、卡波濟氏肉瘤、腎(腎細胞)癌、喉癌、白血病(例如，急性淋巴細胞性的、急性髓 性的、慢性淋巴細胞性、慢性髓性的、和毛細胞)、唇部和口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細 胞肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS-相關的、伯基特型的、皮膚T-細胞性的、何杰金型的、非何杰金 型的、以及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性的)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、骨惡性纖維組織細 胞瘤/骨肉瘤、髓母細胞瘤、黑素瘤、眼內(nèi)(眼)黑素瘤、默克爾細胞癌、間皮瘤、原發(fā)灶不明 的頸部轉(zhuǎn)移鱗癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿細胞瘤、蕈樣肉芽腫病、骨 髓增生異常綜合癥、骨髓增生異常性/骨髓組織增生性疾病、髓系白血病、慢性髓細胞樣白 血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、口腔癌、 口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、低度惡性 潛能卵巢瘤、胰腺癌、胰島細胞性胰腺癌、鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、 成松果體細胞瘤、垂體瘤、漿細胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系 統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎)癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、 橫紋肌肉瘤、涎腺癌、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞扎里綜合征、非黑素性皮膚癌、默克爾細胞 皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲 狀腺癌、妊娠滋養(yǎng)層細胞瘤、原發(fā)部位未知的瘤、原發(fā)部位未知的癌、尿道癌、子宮內(nèi)膜性子 宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視通路和下丘腦膠質(zhì)瘤、外陰癌、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、 以及維爾姆斯氏(Wilms)腫瘤。通常，此類組合物包含已知的且為可接受的藥學實踐所需要的藥學上可接受的載 體，參見，例如 Remingtons Pharmaceutical Sciences，第 16 片反，(1980)，Mack Publishing Co。此類載體的實例包括無菌載體，如鹽水、林格(Ringer)氏溶液或葡萄糖溶液，它們用適 宜的緩沖液緩沖至PH在5至8的范圍內(nèi)。用于注射(例如，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、皮 下、肌內(nèi)或直接門靜脈)或連續(xù)輸注的藥物組合物合適地不含可以看見的微粒物質(zhì)，并且 可以包含0. lng至lOOmg的抗體，例如介于5mg和25mg之間的抗體。制備此類藥物組合物 的方法是本領域的技術(shù)人員所熟知的。在一個實施方式中，藥物組合物包含0. lng至lOOmg 呈單位劑型的本發(fā)明抗體，以及任選的使用說明書。可以根據(jù)本領域的技術(shù)人員所熟知或 顯而易見的方法來將本發(fā)明的藥物組合物凍干(冷凍干燥)以便在給藥前重構(gòu)。當本發(fā)明 的實施方式包括IgGl同種型的本發(fā)明抗體時，可以將銅的螯合劑，如檸檬酸鹽(例如檸檬 酸鈉)或EDTA或組氨酸添加到藥物組合物中以降低銅介導的此同種型抗體的降解程度，參 見 EP0612251。給予本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的有效劑量和治療方案通常根據(jù)經(jīng)驗來確定， 并依據(jù)如下因素如患者的年齡、體重和健康狀況以及要治療的疾病或病癥。這些因素在主 治醫(yī)師的職責范圍內(nèi)。選擇適當劑量的指南可以參見，例如Smith等人(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York,但通常在 lmg 與 lOOOmg 之間。方便地，本發(fā)明還涵蓋藥物組合物，其包括一部件試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明抗 體或其抗原結(jié)合片段及其他藥物和使用說明書。本發(fā)明還涵蓋包含治療有效量的本文所述抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物， 所述藥物組合物用于治療疾病，所述疾病對IGF-I和IGF-1R或IGF-II和IGF-IR之間相互 作用的中和應答。
根據(jù)本發(fā)明，提供了包含治療有效量的人源化單克隆抗體的藥物組合物，所述抗 體包含選自SEQ. I. D. NO 14的VH結(jié)構(gòu)域和選自SEQ. I. D. NO 16的VL結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含治療有效量的人源化單克隆抗體的藥物組合物，所述抗 體包含選自SEQ. I. D. NO 15的VH結(jié)構(gòu)域和選自SEQ. I. D. NO 16的VL結(jié)構(gòu)域。方便地，本發(fā)明還涵蓋藥物組合物構(gòu)成的部件試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明抗體 或其抗原結(jié)合片段及其他此類藥物、和任選地使用說明書。本發(fā)明還涵蓋包含治療有效量的本文所述抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物， 其用于治療疾病，所述疾病能對IGF-1R活性的中和應答。在本發(fā)明的另一個實施方式中，藥物組合物包含抗體與其他治療劑或輻射治療的 組合，例如與其他類包括下列的藥物聯(lián)合有絲分裂抑制劑；烷化劑；抗代謝劑；嵌入性抗 生素(intercalating antibiotic)；生長因子抑制劑；細胞周期抑制劑；酶；拓撲異構(gòu)酶 抑制劑；抗存活劑；生物反應修飾劑；抗激素劑和抗血管發(fā)生劑(包括抗生長因子受體拮 抗劑，包括曲妥單抗(trastuzumab)(赫賽汀(Here印tin))、愛必妥(Erbitux)(西妥昔單 抗(cetuximab))；抗生長因子抗體，如貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯丁 (Avastin)))； 血小板源生長因子受體(PDGFR)、神經(jīng)生長因子(NGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR) 的拮抗劑；小分子酪氨酸激酶抑制劑，例如拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib) 等；化療劑，包括吉西他濱(gemcitabine)、依立替康(irinotecan)、紫杉醇(paclitaxel)、 順鉬、多柔比星(doxorubicin)、托泊替康(topotecan)、環(huán)磷酰胺、美法侖(melphalan), 氮烯唑胺(dacarbazine)、柔紅霉素(daunorubicin)、氨基喜樹喊(aminocamptothecin)、 依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、阿霉素(adriamycin)、5_氟尿嘧啶、阿 lllfi^f (cytosine arabinoside (Ara-C)) > S # M (Thiotepa), ^ ^ fjf (Taxotere) > 白 消安(Buslfan)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、泰素(Txaol)、氨甲蝶呤、長春堿(Vinblastine)、 博來霉素(Bleomycin)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、絲裂霉素C(Mitomycin C)、米 托惠酉昆(Mitoxantrone)、長春新喊(Vincreistine)、長春 I卷濱(Vinorelbine)、卡 鉬(Carboplatin)、洋紅霉素(Carminomycin)、氨基蝶呤(Aminopterin)、放線菌素 D(Dactinomycin)，它們用于治療人類疾病和病癥，如類風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；或癌癥， 如急性成淋巴細胞性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關性癌癥、AIDS相關性淋巴瘤、肛門 癌、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌、肝外膽管癌、膀 胱癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞骨癌、腦腫瘤(例如，腦干膠質(zhì)瘤、小腦星形細胞瘤、大腦 星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、視通路和下 丘腦膠質(zhì)瘤)、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、伯基特淋巴瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、未知原發(fā) 性、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、 兒童期癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、結(jié)腸癌、結(jié) 腸直腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文家族腫瘤、顱外生殖細 胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、肝外膽管癌、眼內(nèi)黑素瘤眼癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤眼癌、膽囊癌、胃 癌、胃腸道類癌瘤、生殖細胞瘤(例如，顱外的、性腺外的、和卵巢的)、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、 膠質(zhì)瘤(例如，成人、兒童腦干、兒童大腦星形細胞瘤、兒童視通路和下丘腦的)、毛細胞性 白血病、頭頸部癌、肝細胞(肝)癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘腦和視通路膠質(zhì)瘤、眼內(nèi) 黑素瘤、胰島細胞癌(內(nèi)分泌胰腺)、卡波濟氏肉瘤、腎(腎細胞)癌、喉癌、非白血性白血
28病(例如，急性淋巴細胞性的、急性髓性的、慢性淋巴細胞性、慢性髓性的、和毛細胞)、唇部 和口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS-相關的、伯基特型的、皮 膚T-細胞性的、何杰金型的、非何杰金型的、以及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性的)、瓦爾登斯特 倫氏巨球蛋白血癥、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、髓母細胞瘤、黑素瘤、眼內(nèi)(眼)黑素 瘤、默克爾細胞癌、間皮瘤、原發(fā)灶不明的頸部轉(zhuǎn)移鱗癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥、多發(fā)性 骨髓瘤/漿細胞瘤、蕈樣肉芽腫病、骨髓增生異常綜合癥、骨髓增生異常性/骨髓組織增生 性疾病、髓系白血病、慢性髓細胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻 竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵 巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、低度惡性潛能卵巢瘤、胰腺癌、胰島細胞性胰腺癌、鼻竇和鼻腔 癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、成松果體細胞瘤、垂體瘤、漿細胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、 胸膜肺母細胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎)癌、腎盂和 輸尿管移行細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、涎腺癌、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞扎里 綜合征、非黑素性皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、皮膚T-細 胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、妊娠滋養(yǎng)層細胞瘤、原發(fā)部位未知的瘤、原發(fā) 部位未知的癌、尿道癌、子宮內(nèi)膜性子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視通路和下丘腦膠質(zhì)瘤、外 陰癌、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、以及維爾姆斯氏(Wilms)腫瘤。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以與一種或多種其他治療活性劑或輻射聯(lián)合 使用，例如與其他類包括下列的藥物聯(lián)合有絲分裂抑制劑；烷化劑；抗代謝劑；嵌入性抗 生素；生長因子抑制劑；細胞周期抑制劑；酶；拓撲異構(gòu)酶抑制劑；抗存活劑；生物反應修 飾劑；抗激素劑和抗血管發(fā)生劑(包括抗生長因子受體拮抗劑，包括曲妥單抗(赫賽汀)、 愛必妥(西妥昔單抗)；抗生長因子抗體，如貝伐單抗(阿瓦斯丁)；血小板源生長因子受 體(PDGFR)、神經(jīng)生長因子(NGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的拮抗劑；小分子抗 IGF-1R劑；小分子酪氨酸激酶抑制劑，包括拉帕替尼、吉非替尼等；化療劑，包括吉西他濱、 依立替康、紫杉醇、順鉬、多柔比星、托泊替康、環(huán)磷酰胺、美法侖、氮烯唑胺、柔紅霉素、氨基 喜樹堿、依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、塞替派、泰索帝、白 消安、環(huán)磷酰胺(cytoxin)、泰素、氨甲蝶呤、長春堿、博來霉素、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米 托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱、卡鉬、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線菌素D。因此本發(fā)明在又一實施方式中提供這種聯(lián)合在治療疾病中的用途，其中IGF-1受 體信號促進所述疾病或中和受體活性對所述疾病有利；以及所述抗體或其抗原結(jié)合片段在 制備用于聯(lián)合治療病癥的藥物中的用途，所述病癥如類風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；或癌癥，例 如急性成淋巴細胞性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關性癌癥、AIDS相關性淋巴瘤、肛門 癌、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌、肝外膽管癌、膀 胱癌、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞骨癌、腦腫瘤(例如，腦干膠質(zhì)瘤、小腦星形細胞瘤、大腦 星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、視通路和下 丘腦膠質(zhì)瘤)、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、伯基特淋巴瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、未知原發(fā) 性、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、 兒童期癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、結(jié)腸癌、結(jié) 腸直腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文家族腫瘤、顱外生殖細 胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、肝外膽管癌、眼內(nèi)黑素瘤眼癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、生殖細胞瘤(例如，顱外的、性腺外的、和卵巢的)、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、 膠質(zhì)瘤(例如，成人、兒童腦干、兒童大腦星形細胞瘤、兒童視通路和下丘腦的)、毛細胞性 白血病、頭頸部癌、肝細胞(肝)癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘腦和視通路膠質(zhì)瘤、眼內(nèi) 黑素瘤、胰島細胞癌(內(nèi)分泌胰腺)、卡波濟氏肉瘤、腎(腎細胞)癌、喉癌、白血病(例如， 急性淋巴細胞性的、急性髓性的、慢性淋巴細胞性、慢性髓性、和毛細胞)、唇部和口腔癌、肝 癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS-相關的、伯基特型的、皮膚T-細胞性 的、何杰金型的、非何杰金型的、以及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性的)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白 血癥、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、髓母細胞瘤、黑素瘤、眼內(nèi)(眼)黑素瘤、默克爾細 胞癌、間皮瘤、原發(fā)灶不明的頸部轉(zhuǎn)移鱗癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿 細胞瘤、蕈樣肉芽腫病、骨髓增生異常綜合癥、骨髓增生異常性/骨髓組織增生性疾病、髓 系白血病、慢性髓細胞樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽 癌、成神經(jīng)細胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、 卵巢生殖細胞瘤、低度惡性潛能卵巢瘤、胰腺癌、胰島細胞性胰腺癌、鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁 腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、成松果體細胞瘤、垂體瘤、漿細胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺母 細胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎)癌、腎盂和輸尿管移 行細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、涎腺癌、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞扎里綜合征、非 黑素性皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、 睪丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、妊娠滋養(yǎng)層細胞瘤、原發(fā)部位未知的瘤、原發(fā)部位未知 的癌、尿道癌、子宮內(nèi)膜性子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視通路和下丘腦膠質(zhì)瘤、外陰癌、瓦爾 登斯特倫氏巨球蛋白血癥、以及維爾姆斯氏(Wilms)腫瘤。 當本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段與其他治療活性劑聯(lián)合使用時，各組分可以通 過任何方便的途徑一起或單獨、相繼或同時給予。 上面所提到的聯(lián)合可以方便地以在藥物制劑形式中使用呈現(xiàn)，因此包含上面所定 義的聯(lián)合的藥物制劑最佳的是其與藥物上可接受的載體或賦形劑一起構(gòu)成本發(fā)明的另一 個實施方式。這種聯(lián)合的單個組分可以一起或單獨、相繼或同時以單獨的或聯(lián)合的藥物制 劑給予。當聯(lián)合在相同的制劑中時，應了解兩種組分必須是穩(wěn)定的并且彼此相容且與制劑 的其他組分相容，并且可以經(jīng)配制以供給藥。當單獨配制時，它們可以任何方便的制劑，以 本領域內(nèi)所熟知的抗體及其抗原結(jié)合片段的方法方便地提供。當與對相同疾病有活性的第二治療劑聯(lián)合時，各組分的劑量可以與抗體或其抗原 結(jié)合片段單獨使用時不同。本領域的技術(shù)人員應很容易地了解適當?shù)膭┝?。因此，本發(fā)明在另一實施方式中提供包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段以及另 一治療活性劑的聯(lián)合。上面所提到的聯(lián)合可以方便地以在藥物制劑形式中使用呈現(xiàn)，因此包含上面所定 義的聯(lián)合的藥物制劑與其藥物上可接受的載體一起代表本發(fā)明的另一個實施方式。下列實施例例示了本發(fā)明的多個方面。這些實施例并不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā) 明的范圍由所附的權(quán)利要求書限定。實施例實施例1-單克降抗體的制備一般根據(jù) E Harlow and D Lane, Antibodies a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory，1988中所述的方法通過雜交瘤細胞制備單克隆抗體(mAb)。SJL小鼠 通過腹腔注射在RIBI佐劑中的人IGF-lR(R&DSyStemS，#305-GR)接觸抗原并加強。自應答 動物收獲脾，將其與X63Ag8653GFPlL5骨髓瘤細胞融合以制備雜交瘤。使用FMAT (ABI8200) 和BIAcore A100篩選結(jié)合IGF-1R的雜交瘤上清材料。使用ABI8200確定與重組IGF-1R (R&D Systems-305-GR-050 和 391-GR-050)和 HEK293T 表達的人 IGF-1R、HEK293T 表達的食蟹 猴IGF-1R結(jié)合以及與HEK293T表達的人胰島素受體不結(jié)合。使用BIAcore A100來評估 結(jié)合雜交瘤所制備的重組IGF-1R(R&D Systems, #305-GR)抗體的動力學。使用兔抗小鼠 IgG(BR-1005-14, Biacore AB)將抗體捕獲在芯片上。使用半固體培養(yǎng)基(甲基纖維素溶 液)、Omnitrays和ClonePix FL系統(tǒng)對所關注的雜交瘤進行單克隆。棚列2-■討,禾口艦使要擴大化的雜交瘤在組織培養(yǎng)基上生長至4個225cm2培養(yǎng)瓶匯合的規(guī)模。此 時，通過以400g離心5分鐘來收獲細胞。用100ml無血清培養(yǎng)基(JRH610)重懸團以洗滌細 胞。然后以400g離心細胞5分鐘。吸取上清液并將其丟棄。使用150ml新鮮的無血清培 養(yǎng)基來重懸細胞團。然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至新的225cm2培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中5天。 然后收獲上清液并以400g離心20分鐘。收獲上清液并用0. 2 y M濾器無菌過濾以備純化。 使用蛋白A樹脂柱純化抗體。用PBS pH7. 4透析純化的抗體。實施例3-構(gòu)建IGF-1R表達載體全長的人IGF-1R表達盒的制備除了在核苷酸3510處的變化外，人IGF-1R cDNA表達盒與GenBankX04434相同。 這種改變導致了甘氨酸1170的密碼子由〃 GGC”沉默地變?yōu)椤?GGG"。人IGF-1R cDNA從 pcDNA3. 1(-)載體(Invitrogen)中表達。人 IGF-1R 的序列在 SEQ ID NO 44 中示出。全長的鼠IGF-1R表達盒的制備除了在核苷酸3522處的變化外，鼠IGF-1R cDNA表達盒與GenBankAF056187相同。 這種變化導致了甘氨酸1174的密碼子由〃 GGT”沉默地變?yōu)椤?GGG"。鼠IGF-1R cDNA從 pcDNA3. 1D-V5-His T0P0 載體(Invitrogen)中表達。鼠 IGF-1R 的序列在 SEQ ID NO 46 中示出。全長食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis)) IGF-1R表達盒的制備通過PCR從食蟹猴腎cDNA文庫克隆食蟹猴IGF-1R的新序列。引物基于人IGF-1R 數(shù)據(jù)庫條目NM_000875。將PCR引物設計成在5’端具有Kozak基序，并且具有側(cè)BamHI和 NotI限制位點。將BamHI-NotI PCR產(chǎn)物克隆到pCDNA3. ID中，其中載體T7序列接近IGF 編碼序列的5’末端。所獲得的cDNA與人序列在蛋白水平上具有99. 6%的同一性(有4aa 與人不同)。食蟹猴IGF-1R的序列在SEQ ID NO 45中示出。全長人胰島素受體(B型)表達盒的制備將編碼B型人胰島素受體的DNA盒(SEQ ID NO 53)克隆到pcDNA3. 1 (Invitrogen) 中。SEQ ID NO 53的編碼序列與Genbank條目M10051中所示的序列相同，只是做了下列 改變
核苷酸編號是基于開始的蛋氨酸的"A”為核苷酸1(對應于M10051中核苷酸序 列的位置139)。核苷酸m氨基酸SEQ ID No 53M10051
511171TAC(Tyr)CAC(His)
783261GAT(Asp)GAC (Asp)
909303CAG (Gin)CAA(Gin)
1343448ATC(Ile)ACC (Thr)
1474492CAG(Gin)AAG(Lys)
1638546GAC (Asp)GAT(Asp)
1650550GCA(Ala)GCG (Ala)
38341278AAC(Asn)AAG(Lys)使用標準方法和Lipofectamine試劑(Invitrogen)在293HEK-T細胞中瞬時表達 人、鼠和食蟹猴IGF-1R和B型人胰島素受體的載體。實施例4-使用BacMam的重組蛋白制備和表汰pFastBacMam載體骨架的構(gòu)建用SnaBI和Hpal消化pFastBac 1 (Invitrogen)來移除多角體蛋白啟動子。這通 過來自pcDNA3 (Invitrogen)的3. lkb NruI-Bstll07I片段來連接，pcDNA3含有巨細胞病 毒立即早期(CMV IE)啟動子和多連接子以及BGH多聚A位點和驅(qū)動G418抗性基因表達的 SV40啟動子。該載體使得能夠在哺乳動物細胞中產(chǎn)生在CMV啟動子控制下表達基因的桿狀 病毒。還可以通過將細胞進行G418選擇而選擇出穩(wěn)定的衍生物。人IGF-IR-Fc融合蛋白構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒設計成表達與Xa因子裂解位點和來自IgGl的人Fc序列融合 的人IGF-1R胞外結(jié)構(gòu)域序列。通過PCR擴增編碼人IGF-1R cDNA的胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸 1-935)的序列并將其融合至Xa因子裂解位點和來自人IgGl的Fc序列。然后將整個插入 片段以Hindlll-BamH片段亞克隆到pFastBacMam表達載體中。人IGF-IR-Fc融合蛋白的 序列在SEQ ID NO 47中示出。食蟹猴IGF-IR-Fc融合蛋白構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒設計成表達與Xa因子裂解位點和來自IgGl的人Fc序列融合的 食蟹猴IGF-1R胞外結(jié)構(gòu)域序列。通過用Xbal剪切移除載體骨架的82bp Xbal片段和再連 接來修飾人IGF-1R表達質(zhì)粒。這移除了第二 NotI位點。通過PCR以Hindlll-NotI片段 擴增編碼食蟹猴IGF-1R的胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-935)的編碼序列并將其連接到修飾的人 IGF-1人表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)Hindlll和Not I剪切以去除人的序列。食蟹猴IGF-IR-Fc融 合蛋白的序列在SEQ ID N0 48中示出。使用BacMam的重組蛋白表達使用編碼融合至Xa因子裂解位點和來自人IgGl的Fc序列的人和食蟹猴 IGF-1R胞外結(jié)構(gòu)域序列的質(zhì)粒載體來指導用BacMam系統(tǒng)的蛋白表達。使用Invitrogen Bac-to-Bac系統(tǒng)制備桿狀病毒。使用標準方法將初始P0儲料擴大為1升P1儲料。通過用 所需的BacMam病毒(通常為10至100至1的M0I，盡管通常對此進行優(yōu)化以使蛋白產(chǎn)量最 大化)感染1-5升懸浮培養(yǎng)的HEK293-F細胞來開始蛋白制備。培養(yǎng)2_3天后，收獲細胞上
32清液，通過離心去除細胞，然后從清澈的上清液中純化表達的蛋白。實施例5-構(gòu)津IGF-1R配體表汰質(zhì)粒對加工形式的IGF-1(氨基酸 49-118，Swiss-prot P01343)和 IGF_II(氨基酸 25-91, Swiss-prot P01343)的基因序列進行密碼子優(yōu)化以用于大腸桿菌表達。通過構(gòu)建重 疊寡核苷酸并將其克隆到pET-21b(NoVagen)的Ndel-BamHI位點而從頭制備基因。對于生 物素化IGF-1R配體的制備，將C末端15個氨基酸的生物素化標簽序列(GLNDIFEAQKIEWHE， 參考Schatz 1993) SEQ ID NO 17引入基因構(gòu)建體。人IGF-I配體和IGF-II配體的序列分別在SEQ ID NO 49和SEQ IDNO 51中示出。實施例6-IGF-1R配體的表汰和純化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)細胞，然后使用具有100 y g/ml氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基進行表達，然后用ImM IPTG在37°C誘導16小時，通過離心收獲細胞團。通過下 列步驟將IGF-1R配體以不溶性包涵體分離將細胞團在50mM Tris pH8. 0、200mM NaClUmM EDTA、5mM DTT中重懸，超聲裂解，通過離心在包涵體部分中回收。通過下列步驟制備可溶 性IGF-1R配體在50mM Tris pH8. 0、6M鹽酸胍中使包涵體溶解，然后迅速稀釋至100倍 過量體積的50mM Tris pH8. 0、ImM氧化谷胱甘肽、ImM還原的谷胱甘肽，然后在4°C混合16 小時。將可溶性蛋白濃縮并離心以去除不可溶性材料，然后通過反相HPLC用含乙腈梯度的 Spherisorb C6柱(Waters)純化生物活性的IGF-1R配體。對于具有生物素化標簽的IGF-1R配體，通過將5mM ATP、5mMMgCl2、ImM d_生物素 和lyM生物素連接酶加入至純化的蛋白中來進行生物素化。在室溫下孵育混合物3小時。 通過尺寸排阻色譜使用Superdex 75柱(GE Healthcare)純化生物素化的IGF-1R配體。用 PBS透析純化的IGF-1R配體，使用BSA標準物和BioRad考馬斯基蛋白測定進行定量，然后 以等分試樣儲存在-80°C。通過質(zhì)譜驗證純化蛋白的分子量。標記的人IGF-I配體和標記 的人IGF-II配體的序列分別在SEQ ID NO 50和SEQ IDNO 52中示出。實施例7-雜交瘤可變結(jié)構(gòu)域的測序使用得自Qiagen(#74106)的RNeasy試劑盒從各雜交瘤克隆的約106個細胞的 細胞團中提取總RNA。使用AccessQuick RT-PCR系統(tǒng)(A1702)來制備重鏈和輕鏈可變區(qū) 的cDNA，使用的是對鼠前導序列和鼠化61/1 或IgG2b/K恒定區(qū)特異性的簡并引物。克隆 經(jīng)純化的RT-PCR片段，通過序列比對、數(shù)據(jù)庫檢索和與KABAT(Sequences of Proteins
of Immunologicallnterest,第 4 版，U. S. Department of Health and Human Services,
Nationallnstitutes of Health(1987))中所列的已知免疫球蛋白可變序列比對獲得各雜 交瘤的通用序列。 雜交瘤6E11、9C7、2B9、15D9和5G4的可變結(jié)構(gòu)域的序列號在下表1中顯示雜交瘤
重鏈可變區(qū)的 SEQ I. D. N0
輕鏈可變區(qū)的 SEQ I. D. N0 6E119C72B95G415D9
8 18 10 20 22
9 19 11 21 23
Table 1_雜交瘤重鏈和輕鏈可變區(qū)的SEQ I. D. NO 實施例8 嵌合抗體的構(gòu)建通過PCR克隆構(gòu)建嵌合抗體，該嵌合抗體包含移植到人IgGl/ k野生型恒定區(qū)上 的親本鼠可變結(jié)構(gòu)域。根據(jù)通用序列，設計擴增鼠可變結(jié)構(gòu)域的引物，其引入了利于向哺乳 動物表達載體中克隆所需的限制性位點。6E11嵌合抗體(6Ellc)的全長重鏈和輕鏈在SEQ I. D. NO 24 和 SEQ I. D. NO 25 中給出。實施例9 人源化策略通過將來自鼠6E11抗體的⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1和⑶RL3以及來自鼠9C7 抗體的⑶RL2移植到適宜的人框架序列上來制備人源化抗體。人源化L0輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列在下文給出(SEQ I. D. NO 16)。人源化H0和HI重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列在下文給出(分別為SEQ I. D. NO 14和 SEQ I. D. N0 15)。人源化抗體載體的構(gòu)建使用PCR基策略和重疊寡核苷酸從頭構(gòu)建編碼人源化重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 的DNA片段。將PCR產(chǎn)物克隆到分別含人Yl恒定區(qū)和人K恒定區(qū)的哺乳動物表達載體 中。這是野生型Fc區(qū)。使用類似的策略，將重鏈可變區(qū)也克隆到含有兩個丙氨酸取代基L235A和 G237A(EU指數(shù)編號)的人Yl恒定區(qū)變體上。這些構(gòu)建體在本文中稱為IgGlm(AA)。包含 IgGlm(AA)變體的兩種人源化構(gòu)建體表示為HOLOIgGlm(AA) (SEQ ID NO 54和SEQ ID NO 39)和 HlLOIgGlm(AA)(SEQ IDN0 56 和 SEQ ID NO 39)。除非另有說明，否則本文實施例中所用的所有人源化構(gòu)建體都包含野生型人、1 恒定區(qū)。實施例10-CH0細胞中的重組抗體表達將分別編碼嵌合抗體或人源化抗體的重鏈和輕鏈的表達質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染到 CH0-K1細胞中。在一些情況下，上清材料在結(jié)合測定和活性測定中用作測試物。在其他情 況下，將上清材料無菌過濾并使用蛋白A通過親和色譜回收抗體。抗體也在穩(wěn)定的多克隆 CH0細胞系統(tǒng)中表達。將編碼重鏈和輕鏈的DNA載體共同電穿孔到懸浮的CH0細胞中。在 搖瓶中，在MR1基礎選擇培養(yǎng)基中在37°C，5% C02,130-150rpm的條件下對細胞進行傳代， 直到細胞存活率和細胞計數(shù)有所改善。然后將CH0細胞接種到MR1基礎x2選擇培養(yǎng)基中， 并在34°C，5% C02,130-150rpm的條件下孵育10-14天。通過離心使細胞成團，無菌過濾上 清液。通過蛋白A純化回收抗體。雜交瘤和/或嵌合mAb和/或人源化Mab之間的比較數(shù)據(jù)實施例11-受體結(jié)合ELISA將0. 4 ii g/mL 組氨酸標記的重組人 IGF_1R(R&D Systems, #305-GR-050)捕獲到涂 覆有0. 5-1 ii g/mL 6xHis (Abeam, #ab9108)的兔多克隆抗體的ELISA板上。在整個板上滴 定來自測試上清液或純化材料的抗IGF-1R抗體。通過用IPR綴合的山羊抗小鼠IgG抗體 (Dako,P0260)或山羊抗人k輕鏈過氧化物酶綴合物(Sigma，A7164)處理來檢測受體結(jié)合 水平。使用0PD過氧化物酶底物(Sigma，P9187)對ELISA進行顯影。圖1顯示鼠抗體6E11、5G4和15D9的結(jié)合曲線。
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圖2顯示H0L0和HOLOIgGlm(AA)和HlLOIgGlm(AA)的結(jié)合曲線，該曲線確定它們 具有與6E11嵌合體相似的結(jié)合活性。實施例12-警體下調(diào)將3T3/LISN c4細胞(表達人IGF-1R的鼠NIH 3T3細胞系，參見Kaleko等人 (1990)Molecular and Cellular Biology, 10(2) :464_473)與 5 ii g/mL 抗體一起在 37°C 下孵育24小時，然后用IGF-I(100ng/ml)刺激10分鐘，接著收獲細胞。將這些細胞團的裂 解物在SDS PAGE凝膠上跑膠，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。通過用兔抗IGF-lReC_20抗體(Santa CruzBiotechnology, sc-713)處理來檢測IGF-1R，然后用抗兔HRP綴合的第二抗體(P0217) 處理，用增強化學發(fā)光試劑(GE Healthcare)檢測。圖3顯示3T3/LISN c4細胞與單克隆抗體6E11的孵育導致IGF_lRe鏈下調(diào)。實施例13-IGF-1刺激的警體磷酸化的抑制將3T3/LISN c4細胞以10 000細胞/孔的密度在96孔板上鋪板，使其在完全 DMEM(改良的DMEM-H印es+10% FCS)中生長1-2天。將抗hIGF-lR抗體(雜交瘤上清液或 純化抗體)添加到細胞中，孵育1小時。將30-50ngrhIGF-l (R&D Systems 291-G1或50ng/ ml rhIGF-I (參見實施例 5 禾P 6))或 100ng/ml rhIGF-2 (R&D Systems 292-G2 或 100ng/ ml rhIGF-2 (參見實施例5和6))添加到處理的細胞中，再孵育20分鐘以刺激受體磷酸化。 將細胞在PBS中洗滌一次，然后通過添加RIPA裂解緩沖液(150mM NaCl、50mMTrisHCl、6mM 脫氧膽酸鈉、吐溫20)和蛋白酶抑制劑混合物(Roche 11697 498 001)裂解。將板冷凍 30分鐘或過夜。解凍后，將來自各孔的裂解液轉(zhuǎn)移到96孔ELISA板上，該板經(jīng)2 u g/ml抗 IGF-1R捕獲抗體(R&D SystemsMAB391)預涂覆，用4% BSA/TBS封閉。在一些實驗中，可以 使用替代性捕獲抗體(以1 P g/ml涂覆的2B9SEQ ID NO 10和11)。將所述板在4°C孵育 過夜。用TBST(TBS+0. 吐溫20)洗滌板，將在4% BSA/TBS中1/2500稀釋的銪標記的抗 磷酸酪氨酸抗體(PerkinElmer DELFIA Eu_NlPT66)添加到各孔中。孵育1小時后，洗滌所 述板，添加DELFIA增強(PerkinElmer 1244-105)溶液。孵育10分鐘后，使用設定以測量 銪時間分辨熒光(TRF)的平板讀數(shù)儀測定受體磷酸化水平。圖4顯示純化的鼠單克隆抗體6E11、5G4和15D9介導的受體磷酸化抑制的實例。圖5顯示與6E11嵌合抗體(6Ellc)相比，H1L0介導的受體磷酸化抑制的實例。圖6顯示在野生型IgGlFc區(qū)和取代的IgGlFc區(qū)(IgGlm(AA))背景下H0L0和H1L0 介導的受體磷酸化抑制的實例。實施例14競爭性ELISA用2 u g/ml抗人IGF-1R拮抗抗體涂覆ELISA板，并用4% BSA/PBS封閉。在存在 純化的單克隆抗體(鼠(6E11)，嵌合的或人源化的)的條件下添加400ng/ml的多聚His標 記的重組人IGF-1R(R&D Systems#305-GR)，在室溫下孵育1小時。將板在TBST(TBS+0. 1% 吐溫20)中洗滌，然后添加12-30 u g/mlHRP標記的抗多聚-His抗體(Sigma A7058-1VC)。 將板孵育1小時，然后再次洗滌，用0PD底物(Sigma P9187)顯影。通過添加2M硫酸來終 止反應，光吸收在490nm處測量。圖7A顯示各種純化的鼠單克隆抗體在競爭性ELISA中的活性的實例。圖7B顯示在競爭性ELISA中H1L0的活性與6E11嵌合體(6Ellc)比較的實例。圖8A顯示在競爭性ELISA中各種純化人源化抗體的活性與鼠親本抗體(6E11)和嵌合體(6E11C)比較的實例。圖8B-C顯示各種純化的人源化抗體在競爭性ELISA中的活性的實例。實施例15-食蟹猴IGF-1R結(jié)合ELISA用1-2 u g/ml的重組食蟹猴IGF_1R(參見實施例4)涂覆96孔ELISA板過夜，并 用4% BSA/PBS將其封閉。添加純化的抗hIGF-lR抗體，在室溫下孵育1小時。將板在TBST 中洗滌，將0. 6-1. Oil g/mlHRP綴合的抗小鼠Ig(DAK0#P0260)添加到各孔中。將板在室溫 下孵育1小時，用TBST洗滌，并用OPD底物(Sigma P9187)或TMB底物(Sigma T8665)顯 影。用2M硫酸終止反應，通過測量490nm(用于OPD)和450nM(用于TMB)處的光吸收來測 定結(jié)合水平。對于含有人IgGl/CK恒定區(qū)的抗體，用山羊抗人k輕鏈過氧化物酶綴合物 (Sigma, A7164)替代HRP綴合的抗小鼠Ig檢測抗體。圖9A顯示純化鼠單克隆抗體結(jié)合重組食蟹猴IGF-1R的實例。圖9B顯示純化的人源化單克隆抗體與6E11嵌合體(6Ellc)相比結(jié)合重組食蟹猴 IGF-1R的實例。實施例16-胰島素警體結(jié)合ELISA用0. 5 ii g/ml的重組人胰島素受體(R&D Systems 305-GR)涂覆96孔ELISA板過 夜，并用4%BSA/PBS將其封閉。將純化的抗hIGF-lR抗體或小鼠抗人胰島素受體抗體(R&D Systems MAB15441)添加到板中，在室溫下孵育1小時，然后用TBST洗滌。將在4%BSA/ PBS中的HRP綴合的抗小鼠Ig (DAK0#P0260)以1/5000 (650ng/ml)添加到各孔中，將板孵育 1小時。洗滌板，通過添加TMB底物(Sigma T8665)進行顯影。用2M硫酸終止反應，通過在 450nm處測量光吸收來檢測結(jié)合。對于含有人IgGl/CK恒定區(qū)的抗體檢測，用山羊抗人K 輕鏈過氧化物酶結(jié)合物(Sigma，A7164)替代上面所列的檢測抗體(HRP綴合的抗小鼠Ig)。圖10顯示使用純化鼠單克隆抗體的胰島素受體結(jié)合ELISA的實例。與陽性對照 抗體(R&D Systems MAB15441)相反，純化的抗體6E11、5G4和15D9顯示在高達10 u g/ml 的濃度下不與胰島素受體結(jié)合。實施例17-結(jié)合動力學測定使用Biacore 系統(tǒng)來估計人IGF-1R的抗IGF-1R抗體的結(jié)合動力學。使用抗體 捕獲方法來進行動力學分析。簡言之，對于人源化抗體，使用抗小鼠IgG抗體(Biacore，目 錄號BR-1005-14)進行小鼠親本抗體和蛋白A的分析。根據(jù)Biacore 標準方案，利用機器 軟件中所固有的固定Wizard工具，通過初級胺偶聯(lián)將抗小鼠抗體或蛋白A固定到CM5生物 傳感芯片上(在通常固定時水平為3000-4000吸收單元(RU’ s))。然后，由雜交瘤上清液 或純化的材料直接捕獲抗IGF-1R抗體。上清液的捕獲水平取決于雜交瘤的初始濃度，該水 平在約20RU，s至650RU，之間變化。對于純化的材料，測試抗體的捕獲水平通常在250與 500RU，s之間。捕獲后，使基線穩(wěn)定，然后使重組IGF-1R、得自R&D Systems的組氨酸標記 材料(目錄號305-GR)以指定濃度(通常在0-256nM的范圍內(nèi))通過表面。由于高親和力 的相互作用，使用多達1小時的解離時間。通過使用100mM磷酸或10mM甘氨酸，pH 1. 5的 酸洗脫進行再生，再生不會顯著影響表面捕獲用于另一分析步驟的抗體的能力。該操作在 25°C和37°C下進行。實驗在TlOOBiacore 系統(tǒng)上，使用T100對照和分析軟件進行。使實 驗數(shù)據(jù)適應于機器分析軟件中所固有的11結(jié)合模型。圖2-6顯示用上清液和純化的材料進行的一系列實驗。
表2-在25°C和37°C下選擇純化的鼠IGF-1R單克隆的動力學數(shù)據(jù)抗體25°C親和力37°C親和力25°C親和力(nM)(nM)(第一(nM)(第二輪(第三輪-T0022 表3-H1L0和H0L0的上清材料與6Ellc相比的動力學數(shù)據(jù)。該輪(T0037R3)實驗 在37 °C下進行 表4-上清材料 H0L0 和 HOLOIgGlm(AA)和 H1L0 和 HlOLOIgGlm(AA)與 6Ellc 相比 的動力學數(shù)據(jù)。該輪(T0040R2)實驗在37°C下進行第一輪
6Ellc (純化的)8. 52e43.32e-50. 39第二輪 (第一輪和第二輪的H1L0上清液相同，而純化的6Ellc則為不同批次。)表5-純化的H0L0和H1L0與6E11嵌合體(6E1 lc)相比的動力學數(shù)據(jù)。該輪 (T0040R1)實驗在37°C下進行。表6-純化的 H0L0 和 HOLOIgGlm(AA)和 H1L0 和 HlOLOIgGlm(AA)與 6E11 嵌合體
(6Ellc)相比的動力學數(shù)據(jù)。三輪獨立的實驗在37°C下進行。
實施例18-使用Biacore測定的配體結(jié)合的抑制使用兩種不同密度的捕獲生物素化IGF-1進行實驗。簡言之，200或4000RU穩(wěn)定 地捕獲在鏈酶親和素傳感芯片上。為了測定抗IGF-1R抗體的中和能力，將不同濃度的抗體 與固定濃度的重組IGF-1R預混合。作為對照，還將未生物素化IGF-1與相同濃度的IGF-1R 混合。然后將該混合物通過IGF-1表面，測量最大結(jié)合點。然后將此結(jié)果與具有相同濃度的 his標記的IGF-1R而不存在抗IGF-1R抗體的樣品進行比較。中和抗體的存在阻斷IGF-1R 與IGF-1的結(jié)合并降低觀察到的最大結(jié)合。通過比較數(shù)值來計算抑制百分比。用兩次4M 氯化鎂進行再生。實驗在Biacore 3000系統(tǒng)上進行。下面的表7和8顯示所獲得的抑制百分比以及用于獲得這些結(jié)果的抗體、IGF-1和 IGF-1R的詳細濃度。表7-200RU的IGF-1表面的抑制值 表8-4000RU的IGF-1表面的抑制值 實施例19-熒光激活的細胞分選(FACS)分析 在FACS緩沖液(在PBS中的4 % FCS)中用10 y g/ml抗hlGF-lR純化抗體對 Colo205細胞染色1小時。細胞還在適宜的陰性對照小鼠抗體(Sigma#I5154)中染色。將細胞在FACS緩沖液中洗滌，然后用抗小鼠IgG PE第二抗體(Sigma P8547)染色。將細胞在 FACS緩沖液中洗滌并在Cell Fix(BektonDickinson)中固定，然后通過流式細胞術(shù)分析、。圖11證明抗體6E11能夠識別在人腫瘤細胞系表面上天然表達的IGF-1R。實施例20-冰凍組織切片的免疫組化將組織切片到載玻片上，用丙酮固定2分鐘，然后裝入自動載玻片染色儀 (DakoCytomation S3400)上。然后封閉載玻片，使用標準免疫化學染色法用鼠抗體(第一 抗體)和抗小鼠Ig-HRP第二抗體(DakoCytomation Envision試劑盒)進行染色。在此二 級孵育之后，洗滌載玻片，用DakoCytomation EnvisionDAB溶液顯色、沖洗、脫水并蓋蓋玻 片以便觀察。使用不相關的對照抗體(從M0PC21雜交瘤純化的小鼠IgGl)作為陰性對照。以相似的方式分析人源化抗體和嵌合抗體，不同的是這些抗體經(jīng)過生物素化以利 于檢測。然而，如ELISA所測定(數(shù)據(jù)未顯示)，發(fā)現(xiàn)生物素標簽的存在會降低這些抗體的活 性，因此將所用第一抗體的濃度增加到多達100ug/ml。用鏈酶親和素-HRP (DakoCytomation Cat#1016)代替上述第二抗體(DakoCytomation Envision試劑盒-抗小鼠Ig-HRP綴合 物)。將另一無關抗體也生物素化并用作陰性對照(Sigma#I5154)。如下對樣品進行分析。在用校準載體(#69935000,05041103097)校準儀器，然后 將載玻片裝入Chroma Vison細胞自動成像系統(tǒng)中，并且在10X下掃描。進行數(shù)據(jù)分析以 計算組織染色百分比(定義為棕色/棕色+藍色X 100)。圖12和13顯示6E11染色的人腫瘤組織樣品。引入陽性對照抗體作為參考 (Abeam,#4065)。圖14顯示6E11嵌合體(6Ellc)和H1L0染色的人腫瘤組織樣品。實施例21-AKT信號傳導的抑制用50iU在PBS中的2%明膠涂覆Costar 96孔板(#3598)，在37°C培養(yǎng)箱中孵育 至少1小時。使用前，用PBS沖洗板一次。用胰蛋白酶處理主要人前脂肪細胞，離心并吸掉 培養(yǎng)基。用10mL溫的前脂肪細胞生長培養(yǎng)基(ZenBi0，#PM-l)重懸細胞。在前脂肪細胞生 長培養(yǎng)基(ZenBio)中將細胞密度調(diào)整到150，000細胞/mL。用1百萬細胞各自接種兩個含 有50ml培養(yǎng)基的T225Costar瓶。用Multidrop384或類似儀器將剩余細胞接種到涂覆明膠 的96孔板中(lOOiil = 15，000細胞/孔)。在37°C，5% 0)2氣氛中，90%濕度的條件下將 所述細胞孵育過夜。第二天，移去培養(yǎng)基，添加200 yl誘導培養(yǎng)基，并用Breath-Easy透氣 膜(Sigma#Z380059)覆蓋板。在37°C，5% C02氣氛中，90%濕度的條件下將板孵育6天。6 天后，吸出培養(yǎng)基，添加200 ill分化培養(yǎng)基。用Breath-Easy透氣膜覆蓋板并在37°C，5% C02氣氛中，90%濕度的條件下孵育7天。細胞分化后，吸出培養(yǎng)基，用200 u LPBS沖洗細胞 一次。添加75 yl脂肪細胞饑餓培養(yǎng)基，覆蓋板并在37°C，5% 0)2氣氛中，90%濕度的條件 下孵育過夜。將測試樣品在脂肪細胞饑餓培養(yǎng)基中稀釋成4X終濃度。將25yL稀釋的測 試化合物添加到各孔中，在37°C孵育1小時。將IGF-1配體(R&DSystems, #291-G1)在脂 肪細胞饑餓培養(yǎng)基中稀釋至30nM，添加20 ii L的30nMIGF-I到各孔中(終濃度為5nM)。在 37°C將板精確孵育5分鐘，然后通過將培養(yǎng)基彈到水槽中去除上清液。在紙巾上將板干燥。添加65 u 1的完全裂解緩沖液(含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的MSD裂解緩沖液) 到各孔中，用加熱的板密封器密封板。將板儲存在-80°C (用于之后的分析)或在室溫下放 在震蕩器(約500rpm)上15分鐘，然后進行MSD測定。
使用MSD磷酸化測定試劑盒(#K111CAD)估計磷酸化AKT (pSer473)的水平。簡言 之，將150 u L/孔的封閉液(溶于MSD Tris洗滌緩沖液的MSD封閉劑A)添加到MSD測定 板的各孔中。密封板，在室溫下將其放在300rpm的臺頂式平板振蕩器上1小時。將封閉液 從MSD板上移去，用200 u L/孔的1 XMSD Tris洗滌緩沖液將板洗滌4次。將50 y L/孔來 自細胞板的細胞裂解物轉(zhuǎn)移到MSD板的對應孔中并密封。在室溫下使用臺頂式平板振蕩器 將其以300rpm搖晃1小時。用200 u L/孔的1 XMSD Tris洗滌緩沖液(ELx405)將板洗滌 4次。將25 ii L稀釋的檢測抗體混合物(終濃度為lOnM)添加到MSD板的各孔中。室溫 下使用臺頂式平板振蕩器上將板以300rpm搖晃1小時，然后用200 y L/孔的1XMSD Tris 洗滌緩沖液(ELx405)將其洗滌4次。將150 u L具有表面活性劑的讀數(shù)緩沖液T添加到各 孔中，所述平板用MSD 6000SECT0R讀數(shù)儀進行讀數(shù)。盡管信號強度隨著在讀數(shù)緩沖液中的 時間降低，但是信號窗通常能保持穩(wěn)定約20-30分鐘。下表9顯示來自三個獨立的板的數(shù)據(jù)匯總，該表表明純化的鼠親本Mab、嵌合Mab 和人源化Mab抑制了 IGF-1介導的AKT磷酸化誘導。板1和2平行操作。板3在另一天操 作。數(shù)值表示成 PIC50 ( = -loglO (IC50)，單位 g/ml)表9-各純化抗體在AKT磷酸化測定中的活性 實施例22-MCF7細胞的增殖測定將MCF-7細胞(ATCC HBT-22)以10000細胞/孔的密度接種在96孔板中，在完全 培養(yǎng)基(MEM+Earles鹽+10%FCS+0. lmg/ml牛胰島素(Sigma 10516))中生長2天。洗滌細 胞，在無血清MEM(無血清，無胰島素)中孵育4小時。移除培養(yǎng)基，換成在無血清培養(yǎng)基中 稀釋的一定濃度范圍內(nèi)(0. 014-10 y g/ml)的純化抗體(10(^1/孔)。將細胞孵育1小時， 然后再添加IGF-I (R&D Systems#291-Gl)至終濃度為50ng/ml。所有處理以三次重復進行。 將細胞在37°C，5%C02的條件下孵育5天。孵育后，將15iU MTT染料溶液(Promega#G402A) 添加到各孔中，將板再孵育4小時。將100 ill終止/溶解溶液(Promega#G401A)添加到各 孔種，在室溫下輕輕搖晃所述板過夜。第二天，通過用平板讀數(shù)儀測量570nm處的光吸收來 測定增殖水平。圖15顯示各純化的小鼠單克隆抗體抑制腫瘤細胞增殖的活性。實施例23-增殖分析-LISN細胞將LISN細胞(3T3hIGF-lR)以10000細胞/孔的密度接種在白壁96孔板(Corning 3610)中，在完全培養(yǎng)基(改良的DMEM-H印es+10%FCS)中生長1天。移去培養(yǎng)基，將細胞 在無血清MEM中孵育4小時。移去培養(yǎng)基，換成在無血清培養(yǎng)基中稀釋的一定濃度范圍內(nèi) (0. 0041-3 u g/ml終濃度)的純化抗體(50 yl/孔)。將細胞孵育1小時，然后再添加50 u 1/ 孔的IGF-I (R&D Systems#291-Gl或IGF-I-參見實施例5和6)至終濃度為50ng/ml。所有處理以三次重復進行。將細胞在37°C，5%C02的條件下孵育3天。孵育后，將100 ill新鮮 制備的Promega CellTitre-Glo試劑(Promega G7571)添加到各孔中，搖晃板2分鐘。將 所述板在室溫下再孵育10分鐘以使信號穩(wěn)定，然后用Wallac Victor平板讀數(shù)儀測量發(fā)光信號。圖16和17A-E顯示純化的6E11鼠單克隆抗體、6Ellc H0L0和HOLOIgGlm(AA)和 H1L0和HlLOIgGlm(AA)的活性。該數(shù)據(jù)確定了 H0L0和H1L0可以在體外抑制腫瘤細胞增殖。實施例24-細胞周期抑制將NCI-H838 (ATCC CRL-5844)細胞以2X 105細胞/孔的密度接種在24孔微量培 養(yǎng)板中，在1ml完全RPMI (RPMI+10% FCS)中生長過夜。第二天，用SFM(無血清RPMI培養(yǎng) 基)洗滌細胞，并在lml相同培養(yǎng)基中孵育4小時。從細胞中吸去培養(yǎng)基，添加500iU含有 20 u g/ml純化抗體的SFM(終濃度為10 u g/ml)。將細胞孵育1小時。在一些孔中，添加在 SFM中的IGF-IR&DSystems 291-G1)至終濃度為50ng/ml。將經(jīng)處理的細胞孵育過夜。第二 天，用PBS輕輕洗滌細胞，然后通過添加200 ill Versene溶液(Invitrogen#15040)收獲。 將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔V底板中。通過離心使細胞成團，然后添加80%冷乙醇固定，在 冰上孵育30分鐘。使細胞成團，在200 ill 50 u g/ml碘化丙啶、0. ImM EDTA、0. 1% Triton X-100、0. 05mg/ml RNA酶A中重懸。將細胞在黑暗中于冰上孵育直到通過流式細胞術(shù)分析。圖18顯示在存在IGF-I，細胞被誘導進入周期的條件下各處理組的細胞周期狀 態(tài)。在存在6E11抗體的條件下細胞周期被抑制至與不存在IGF-1的條件下孵育的細胞相 當?shù)乃健嵤├?5-凋亡的保護用在100 u 1完全RPMI培養(yǎng)基中的NCI-H838細胞(ATCC CRL-5844)以密度10000 細胞/孔接種96孔微量培養(yǎng)板并生長2天。然后在SFM(無血清RPMI)中洗滌細胞，在 100 ill SFM中孵育4小時。移去培養(yǎng)基，然后用無抗體、陰性對照抗體或純化的抗hIGF-lR 抗體以 20 u g/ml 處理。另外用僅 SFM、SFM+20ng/ml IGF_l、SFM+5 u M 喜樹堿、或 SFM+5 u M 喜樹堿+20ng/ml IGF-1處理細胞。所有處理的終體積都為100 yl，三次重復測定。然后 將板孵育20小時。將培養(yǎng)基從孔中吸出，通過添加200iU在PBS中的0. 5%NP-40裂解細 胞，然后在室溫下邊搖晃邊孵育5分鐘。將20iU裂解物轉(zhuǎn)移到備好的來自Roche細胞死 亡ELISA試劑盒的微量培養(yǎng)板中，添加80 yl孵育緩沖液。按照試劑盒插頁(Roche Cat. N0:1 544 675)中所述的方案進行，使用酶標儀測量405nm處的光吸收。圖19顯示IGF-I的存在為NCI-H838細胞提供了一些針對喜樹堿誘導的凋亡的保 護。6E11的添加逆轉(zhuǎn)了對IGF-1介導的凋亡的保護。實施例26-在存在或不存在交聯(lián)抗體的條件下不存在拮抗作用用在完全DMEM(改良的DMEM Hepes+10 % FCS)中的3T3/LISN c4細胞以密度 10000細胞/孔接種96孔微量培養(yǎng)板并使其生長2天。將純化的抗IGF-1R抗體滴定到在 完全DMEM中的細胞上，各稀釋物以三次重復測量。在一些實驗中還包括報告具有拮抗活性 的抗體(#556000，BD Biosciences)和/或50ng/ml的IGF-I作為陽性對照。還包括無關抗 體和僅培養(yǎng)基的陰性對照。在其他實驗中，抗體滴定中包括抗小鼠交聯(lián)抗體(Sigma M8144) 或抗人交聯(lián)抗體(Sigma 13382)，比率為2 1 [抗IGF-I Ab][交聯(lián)Ab]。將板孵育30分鐘。吸去培養(yǎng)基，將細胞用PBS輕輕洗滌一次，然后用RIPA裂解緩沖液(150mMNaCl、50mM TrisHCl、6mM脫氧膽酸鈉、吐溫20)和蛋白酶抑制劑混合物(Roche 11 697 498 001)裂 解。將板放在-20°C過夜。解凍后，將100 yl裂解物樣品轉(zhuǎn)移到96孔ELISA板上，該板經(jīng) 2 u g/ml抗IGF-1R捕獲抗體(R&DSystems MAB391)預涂覆，并用用4% BSA/TBS封閉。將板 在4°C孵育過夜。用TBST(TBS+0. 吐溫20)洗滌所述板4次，將在4% BSA/TBS中1/2500 稀釋的銪標記的抗磷酸酪氨酸抗體(DELFIA Eu-N1PT66, PerkinElmer)添加到各孔中。孵 育1小時后，像之前一樣洗滌板，添加DELFIA增強溶液(PerkinElmer 1244-105)。孵育10 分鐘后，使用設定用來測量銪時間分辨熒光(TRF)的平板讀數(shù)儀測定受體磷酸化水平。圖20顯示在存在交聯(lián)抗體的條件下6E11在高達10 u g/ml濃度下沒有拮抗活性。實施例27-同種異體移棺樽型-3T3/LISN c4使用3T3/LISN c4細胞的體內(nèi)腫瘤模型來測定6E11鼠單克隆抗體抑制無胸腺 裸鼠中預構(gòu)建的腫瘤生長的能力。通過與Cohen等人，Clinical CancerResearch 11: 2063-2073 ((2005)中所公開的那些類似的方法誘導腫瘤。概括來說，將懸浮在0. lml Matrigel 中的2. 5X106LISN細胞皮下接種到4-6周齡的無胸腺CDlnu/nu小鼠中。腫瘤 達到約150mm3大小后，用在0. 2ml PBS中的250 y g抗體通過腹膜內(nèi)注射處理小鼠3周，每 周2次。通過游標卡尺沿兩個直徑測量腫瘤，3次/周，使用公式(長X [寬]2)/2計算體 積。數(shù)據(jù)分析如下使用隨機系數(shù)回歸分析來分析Log1(l轉(zhuǎn)化腫瘤體積。這估計了各組的截 距(基線)和斜率(腫瘤生長率)。與PBS處理組相比，在6E11組中生長速率降低了 31% (圖 21，p = 0. 0007)。在類似的實驗中，將在基質(zhì)膠(Matrigel)中的2. 5X 106細胞皮下移植到裸鼠中。 移植后18天，將腫瘤體積為100-200mm3的小鼠隨機分組，8只動物/處理組。通過腹膜內(nèi)注 射以250 u g/小鼠和100 u g/小鼠的劑量給予抗IGF-1R抗體6E113周，2次/周。對照動 物在相同方案中接受鹽水。每周測量兩次腫瘤大小和小鼠體重。與鹽水處理組相比，在35 天時100 u g/小鼠和250 u g/小鼠組所測量的腫瘤體積分別降低了 56%和70% (圖22)。實施例28-由6E11小鼠親本抗體產(chǎn)生的Colo205細胞腫瘤的生長抑制用Colo205細胞的體內(nèi)腫瘤模型被用于測定6E11鼠單克隆抗體抑制雌性HRLN nu/nu鼠中預構(gòu)建的腫瘤生長的能力。將1X106Co1o205細胞懸浮在50%基質(zhì)膠中，皮下 移植到裸鼠的側(cè)腹。一旦腫瘤達到約80-120mm3大小(等于第1天，圖23)后，通過腹膜 內(nèi)注射用10mg/kg抗體處理小鼠，3天一次，共10次注射。通過標尺測量腫瘤，使用公式 (長X [寬]2)/2計算體積。數(shù)據(jù)分析如下使用隨機系數(shù)回歸分析來分析Log1(l轉(zhuǎn)化腫瘤 體積。這估計了各組的截距(基線)和斜率(腫瘤生長率)。與溶媒對照(PBS)相比，在 6E11抗體中的生長率降低了 58% (圖23，p = 0. 0019)。在獨立情況下進行上述類似的實驗。然而，在使用Colo205細胞的這個第二實驗 中，沒有觀察到6E11處理動物中腫瘤生長的抑制。不存在6E11抑制的原因尚不知道(數(shù) 據(jù)未顯示)。還使用移植1X107A549細胞的小鼠進行了與上述類似的實驗。然而，在這個實驗 中，沒有觀察到6E11處理動物中腫瘤生長的抑制。不存在6E11抑制的原因尚不知道(數(shù) 據(jù)未顯示)。盡管這后兩個實驗的數(shù)據(jù)似乎顯示本發(fā)明抗體在這些模型中不抑制腫瘤生長，但
42相信前兩個腫瘤模型(同種異體移植模型和第一個colo205模型)是較為穩(wěn)固的。在這前 兩個模型中給出陽性信號(即，顯示抑制腫瘤生長)的對照抗體在第二 Colo205腫瘤模型 研究或A549腫瘤模型研究中不顯示抑制，由此，我們比較確信，來自前兩個腫瘤模型的數(shù) 據(jù)比后兩個模型更能代表測試抗體的活性。實施例29-表達載體的構(gòu)建構(gòu)建了兩個抗CD20抗體。從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(登錄20SL)獲得可變區(qū)。使用兩 個IgGl恒定區(qū)野生型IgGl恒定區(qū)和基于野生型人IgGl序列的Fc區(qū)變體，該Fc區(qū)變體 具有兩個取代基(S239D/I332E，基于Kabat，EU指數(shù))。對抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)進行密碼 子優(yōu)化，通過重疊寡核苷酸PCR技術(shù)裝配。使用標準分子生物學技術(shù)將可變區(qū)和Fc區(qū)克隆 到PTT5附加型載體和哺乳動物表達載體中?？笴D20IgGl重鏈、含有S239D/I332取代基的抗CD20IgGl重鏈以及抗CD20輕鏈 Ck的多核苷酸序列分別在SEQ ID 71-73中示出。相應的蛋白序列在SEQ ID 74-76示出。使用類似的方法和標準分子生物學技術(shù)制備抗IGF-1R抗體。通過重疊寡核苷酸 PCR技術(shù)裝配重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)，通過限制性消化將它們?nèi)诤显谝黄?，并連接到 標準哺乳動物表達載體中?？笽GF-1R HOIgGl重鏈、含有S239D/I332取代基的抗IGF-1R HOIgGl重鏈以及抗 IGF-1R HOIgGlR L0輕鏈Ck的多核苷酸序列分別在SEQ ID :70、67和69中示出。相應的 蛋白序列分別在SEQ ID :37、68和39中示出。在一些情況下，多核苷酸序列和相應的蛋白序列代表成熟抗體序列，其中信號肽 序列已在翻譯后加工期間被裂解掉。為了指導分泌蛋白的表達，需要將信號肽序列添加到 N-末端。一個這樣的實例由SEQ ID :43示出。實施例30-抗⑶20和抗IGF1R抗體的抗體表達和純化培養(yǎng)貼壁的CHO DG44FUT8缺失細胞直到細胞處于對數(shù)生長期，然后沖洗并用胰蛋 白酶處理，然后通過離心使細胞成團。將懸浮的CHO-Ela細胞也培養(yǎng)到對數(shù)生長期，然后通 過離心使所需數(shù)目細胞成團。將貼壁和懸浮CH0細胞在冰PBS中洗滌，重懸于電穿孔緩沖液中。通過電穿孔將 細胞與含有下表(表10)所列的人源化重鏈和輕鏈DNA序列的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。將電穿孔 細胞重懸在選擇培養(yǎng)基中，在37°C，5% C02的條件下孵育。對于FUT8缺失的細胞，觀察到轉(zhuǎn)染體的集落后，擴增細胞培養(yǎng)物，使其達到匯合， 然后收獲。對于CHO-Ela細胞系，在存活率達到80%后進行10-14天的制備操作。在制備 操作結(jié)束時進行收獲。使用Hi-trap蛋白A柱從上清液純化抗體。表10 本研究中所用的抗體列表 實施例31-與重組IGF-1R的結(jié)合用在PBS中的1 y g/ml抗his-標記的抗體(Abcam，ab9108)涂覆96孔高結(jié)合力 板，在4°C下儲存過夜。用含有0.05%吐溫20的Tris緩沖鹽洗滌板兩次。將200yL封閉 液(在DPBS緩沖液中的5% BSA)添加到各孔中，將板在室溫下孵育至少1小時。然后再進 行一次洗滌步驟。將0. 4 ii g/mL的重組人IGF-1R_ systems)以50 y L/孔添加到各孔 中。將板在室溫下孵育1小時，然后洗滌。將整個板的測試抗體在封閉液中進行連續(xù)稀釋。 再孵育1小時，洗滌板。將山羊抗人K輕鏈特異性的過氧化物酶綴合的抗體在封閉液中稀 釋至1 y g/mL,添加50 y L到各孔中。將板孵育1小時。再次進行洗滌步驟，然后添加50 u 1 OPD SigmaFast底物到各孔中，15分鐘后通過添加25iiL 3M硫酸終止反應。使用VersaMax Tunable酶標儀(分子儀器)用堿性終點方法在490nm處讀取光吸收。如圖25中所示出，抗體樣品IGF1R-E、_F、_G和_H顯示與重組人IGF-1R結(jié)合 程度相當。此圖代表兩個獨立測定的合成，其中樣品IGF1R-E在一個測定中估計，樣品 IGF1R-F、-G和-H在另一測定中估計。實施例32-使用FUT8缺失的CHO DG44細胞系表達的抗IGF-1R抗體的糖基化特征將使用FUT8缺失的CHO DG44細胞系和CH0_Ela制備的抗IGF-1R抗體(抗體 IGF1R-E和IGF1R-F)還原，然后通過用PNG酶-F消化去糖基化。對寡糖進行液相色譜/質(zhì) 譜(LC/MS)以計算寡糖特定的質(zhì)量。衍生的結(jié)構(gòu)是由寡糖質(zhì)量分析而得出的推斷。圖24總結(jié)了由抗體樣品IGF1R-E和IGF1R-F獲得的寡糖組合物。它顯示出由 IGF1R-F抗體樣品獲得的所有寡糖種類均為巖藻糖陰性的。實施例33-FcyRIIla(V和F變體)的表達/制備將FcyRIIIa受體的胞外結(jié)構(gòu)域與⑶33信號序列和lOxHis標簽一起克隆到 pFastBacMam-1 質(zhì)粒中。SEQ ID :77 和 SEQ ID :78 分別提供 Fc y Rllla 的 V 和 F 變體表 達盒的蛋白序列。用Bacmam病毒感染10L規(guī)模的wave-bagHEK細胞培養(yǎng)物。收獲上清 液，通過正切流動過濾(lOkmwco)將其濃縮至1L，緩沖液換為50mM HEPES pH 7. 7、150mM NaCl，50mM咪唑。然后進行兩步色譜純化固定金屬離子親和色譜(5ml His Trap粗FF， GEHealthcare)，隨后是在 Superdex 75 上的尺寸排阻色譜(XK26/60，GEHeathcare)。始終 使用HEPES緩沖系統(tǒng)，最終緩沖液為50mM HEPES pH7. 7,150mM NaCl。在尺寸排阻柱上觀察 到單峰。最終蛋白產(chǎn)物在SDS-PAGE凝膠上出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這表明為異源糖基化。實施例34與Fc yRIIIa受體結(jié)合的動力學使用標準NHS/EDC活化將Qiagen抗多聚組氨酸抗體(目錄號34670)固定到CM5 生物傳感芯片上，將所述抗體在PH4. 0的乙酸鹽緩沖液中稀釋至50ug/ml，以5 yl/分鐘通 過活化表面20分鐘，然后用乙醇胺封閉表面。使用前，先通過用100mM磷酸進行幾個再生 步驟來調(diào)整芯片。對于Fc y RHIa與各抗體構(gòu)建體的相互作用分析，捕獲多聚組氨酸標記的受體至 約20RU，s。以512、128、32、8和2nM注射抗體覆蓋捕獲表面，使用受體捕獲表面上的緩沖 液注射作為雙參考。在每次抗體/緩沖液注射后使用100mM磷酸進行再生。該操作使用 HBS-EP緩沖液進行，在25°C下在TlOOBiacore機器上進行。使用機器所固有的分析軟件用 1 1和二價模式分析數(shù)據(jù)。對于這些實驗，一般二價模式提供更好的實驗數(shù)據(jù)適合度。結(jié)果顯示在表11和圖27 (抗⑶20抗體)和表12和圖28 (抗IGF-1R抗體)中。圖
4527和28顯示在一個抗體濃度下不同抗體的代表跡線，示出了不同構(gòu)建體之間解離率的不 同。該數(shù)據(jù)與改變Fc區(qū)(通過取代或工程糖基化或通過這兩種方法)的抗體與FcyRIIIa 結(jié)合的改善相一致。圖27和28顯示改變Fc區(qū)(通過取代或工程糖基化或通過這兩種方 法)的抗體解離率也有所改善，尤其是抗體⑶20-D和IGF-1R-H。表11-抗CD20抗體與FcyRIIIa結(jié)合的動力學 表12-抗IGF-1R抗體與Fc yRIIIa結(jié)合的動力學 實施例35-ADCC測定該測定是基于J. Imm. Meth. (1995) 184 :29_38中所述的方法。如下制備銪標記的靶細胞(RAJI細胞)。收獲RAJI細胞并計數(shù)，在15ml falcon管 中以終密度 107 細胞制備。用 HEPES 緩沖液(50mM HEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2, pH7. 4)洗滌細胞一次，使細胞成團，添加1ml冰銪標記緩沖液(含有600iiM EuCl3、3mM DTPA和25mg/l硫酸葡萄糖的HEPES緩沖液)。在標記開始時，劇烈震蕩細胞懸浮液，在冰上 孵育30分鐘期間，每10分鐘劇烈震蕩一次。標記后，添加10ml冰修復緩沖液(含有294mg/ 1 CaCl2.2H20和1.8g/l D-葡萄糖的HEPES，pH7. 4)，將細胞在冰上再孵育10分鐘。然后離心細胞，倒出上清液，再用修復緩沖液洗滌細胞兩次，然后用完全培養(yǎng)基洗滌一次。對標記 的細胞進行計數(shù)，將其在無血清培養(yǎng)基中以105/ml重懸。將細胞儲存在冰上。如下制備純化的人血單核細胞(PBMC或效應子)。以2000rpm離心100ml全血細 胞lOmin去除血清。用PBS將剩余樣品稀釋至原始體積的2倍。通過添加15ml淋巴細胞分離劑并以1500rpm離心1分鐘來制備密度梯度管。將 25ml血液懸浮液添加到密度梯度管中，以2500rpm離心20分鐘，停止離心。棄去上面10ml 上清液。將剩余物(包括“棕黃”層)傾倒入清潔的管中，用PBS加滿，以1500rpm離心5分 鐘。棄去上清液，收集細胞團，在培養(yǎng)基中洗滌1次，離心。對細胞進行計數(shù)，在無血清培養(yǎng) 基中稀釋至5xl06/ml。使用96孔圓底板如下設立測定板。用無血清RPMI培養(yǎng)基以12 u g/ml (終濃度為 4ug/ml)在1. 0ml的終體積中稀釋測試抗體。在無血清RPMI培養(yǎng)基中再進行3倍稀釋。根據(jù)下面所示的平板規(guī)劃將50 u 1抗體稀釋物添加到適當?shù)目字?。添?0 yl培 養(yǎng)基到A和H行的所有孔中。添加100 yl銪標記的靶細胞到適當標記的板的所有孔中。添 加20iU lOXtriton到所有板H行的所有孔中。將所述板在4°C孵育至少30分鐘。添加50 u 1培養(yǎng)基到僅標記靶標的列的所有孔中。添加50 u 1 PBMC到標記效應 子靶標的列的所有孔中，得到的最終效應子靶標比率為25 1。以1500rpm將板離心3 分鐘，在37°C孵育3-4小時。將200iU增強溶液(ffallac/Perkin Elmer目錄號1244-105) 添加到96孔Munc ELISA免疫吸附板(一個Elisa板與各測定板對應)。將20 yl上清液 從測定板轉(zhuǎn)移到ELISA板中，并在室溫下在平板振蕩器上孵育至少30分鐘，或在4°C孵育過 夜。使用時間延遲熒光法(Wallac Victor酶標儀)測量銪釋放。自發(fā)裂解=從細胞和培 養(yǎng)基單獨釋放的銪的測量值。最大裂解=通過添加Triton-XlOO (非離子型去污劑)所致 的靶細胞非特異性裂解。96-孔板規(guī)劃 抗⑶20抗體的一個ADCC的測定結(jié)果顯示在圖26中，確定了抗體樣品 CD20-A、-B、-C和-D顯示出特異性抗RAJI細胞活性，其中樣品CD20-B、-C和-D顯示出相 當?shù)幕钚浴Ｊ褂脕碜?個不同供體的PBMC效應子細胞重復該測定共5次。在所有情況下 都看到了相同的趨勢。還可以使用表達不同⑶20水平的其他靶細胞系進行類似的測定。這些細胞系的 實例包括Daudi、Ramos、D0HH-2、Granta-519、FL-18?；蛘呖梢怨こ讨苽浔磉_不同CD20水 平的細胞系。這種方法的一個實例在vanMeerten等人(Clinical Cancer Research第12 卷，4027-4035，July 1，2006)的報道中給出。對于兩種方法，需要通過如下方法優(yōu)化測定 的各靶標效應子組合例如改變靶細胞上樣條件、或效應子靶標細胞比率、孵育時間；或 通過使用其他的讀數(shù)系統(tǒng)，例如LDH?？梢灶A見的是，就ADCC活性而言，替代性靶細胞系可 能有機會區(qū)別不同抗體樣品。實施例36-ADCC測定使用IGF-1R-G、IGF-1R-H和非抗體對照進行IGF-1R的類似ADCC測定，所述非抗 體對照使用A549靶細胞和CD3/CD19缺失的PBMC效應子細胞制劑。細胞裂解根據(jù)廠家的 方案(Promega)通過乳酸脫氫酶釋放測量。對于許多樣品，所觀察到的總裂解超過了理論 最大值，因此該測定被認為是技術(shù)上失敗的(結(jié)果未顯示)。需要進一步優(yōu)化來建立有意義 的測定。序列表 序列表SEQ ID 1 WILYYGRSKWYFDVSEQ ID 2 NINPNNGGTNYNQKFKDSEQ ID 3 DYYMNSEQ ID 4 RSSQSIVQSNGDTYLESEQ ID 5 RISNRFSSEQ ID 6 FQGSHVPYTSEQ ID 7 RVSNRFSSEQ ID 8 EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKAT LTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSSSEQ ID 9 DVLMTQTPLSLPVSL⑶HASISCRSSQSIVQSN⑶TYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRASEQ ID 10 QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSI SKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID 11 NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSST DFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRASEQ ID 12 EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKAT LTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSSEQ ID 13
52
DVLMTQTPLSLPVSL⑶HASISCRSSQSIVQSN⑶TYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTSEQ ID 14 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVT MTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSSEQ ID 15 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVT MTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSSEQ ID 16 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSN⑶TYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTSEQ ID 17 GLNDIFEAQKIEWHESEQ ID 18 EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKAT LTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSSSEQ ID 19 DVLMTQSPLSLPVSL⑶HASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRASEQ ID 20 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKAT LTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSSSEQ ID 21 DVLMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRASEQ ID 22 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKAT LTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSSSEQ ID 23 DVLMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRASEQ ID 24 MGWSfflFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVA NINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 25 MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSL⑶HASISCRSSQSIVQSN⑶TYLEWYLQKPGQSPK LLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGECSEQ ID 26 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAG GCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGC AAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGT CCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATT CTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCGSEQ ID 27 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGC AGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCC AAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTSEQ ID 28 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAG GCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGC AAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGT CCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATT CTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCGSEQ ID 29 GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGC AGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCC AAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTSEQ ID 30 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAG GCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGC AAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGT CCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATT CTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQ ID 31 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGC AGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCC AAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGSEQ ID 32 ATGGGATGGAGCTGGATCTTTTTCTTCCTCCTGTCAGAAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTG CAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCAC TGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATG GTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATG GAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAA ATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGG ACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQ ID 33 ATGAAGTTGCCTGTTCGGCTCGTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATG ACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGT TCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAA TTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGT AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTG GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCC CTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQ ID 34 CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAG GCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGG CAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTA GCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATT CTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID 35 CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAG GCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGG CAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTA GCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATT CTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID 36 GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGT AGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCC TCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCG ACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCT TACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGSEQ ID 37 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMG NINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID 38 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMG NINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID 39 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSN⑶TYLEWYLQKPGQSPQ LLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGECSEQ ID 40 ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTG GTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCAC CGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATG GCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATG GAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCC CCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGG CCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGC CCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAG AACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTAT CGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATC ACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGASEQ ID 41 ATGGGATGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCAACTGGCGTGCACTCTCAGGTCCAGCTG GTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCMGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCAC CGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATG GCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATG GAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAA GTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCC CCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGG CCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGC CCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAG AACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTAT CGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATC ACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGASEQ ID 42 ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATG ACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGT GCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCG TCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCAC AAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCG GCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCC CTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCT GACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCG TGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGASEQ ID 43 MGWSCIILFLVATATGVHSSEQ ID 44 MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLENCTVIEGYLHILLISKAED YRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESL⑶LFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKN ADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVGNKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRA CTENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDRDFCANILSAESSDSEGFVIHD GECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENF MGLIEVVTGYVKIRHSHALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDHRNLTIKAGKMYFAFNPKL CVSEIYRMEEVTGTKGRQSK⑶INTRNNGERASCESDVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYRDLISFTVYYKEAP FKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNA SVPSIPLDVLSASNSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTIDIEEVTE NPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSIFVPRPERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADT YNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSASNFVFARTMPAEGADDIPGPVT WEPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNYTARIQATSLSGNGSW TDPVFFYVQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWE VAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVS QGQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLNANKFVHRDLAARNCMVAEDF 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71CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGG AGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGA GCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACC TACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG 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CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACC CTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA TTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC CTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGASEQ ID NO 73CAGATCGTCCTGAGCCAGAGCCCCGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAAGTGACCATGACCTGC AGGGCCTCCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCTCACCCAAGCCCTGGATCTACGC CACCAGCAACCTCGCCTCTGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCAGCTACTCCCTGACCATCA GCAGGGTGGAGGCAGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCAACCTTCGGCGGCGGC ACAAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAG CGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATG CCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACC CTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCC CGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGASEQ ID NO 74QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKAT LTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYG⑶WYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 75QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKAT LTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYG⑶WYFNVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.SEQ ID NO 76QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID 77MPLLLLLPLLWAGALAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISS QASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGK GRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHHHHHH.SEQ ID 78MPLLLLLPLLWAGALAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGK GRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQHHHHHHHHHH.
權(quán)利要求
抗體制劑，其包含含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的抗體，或其與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)連接的抗原結(jié)合片段，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)賦予所述抗體或抗原結(jié)合片段效應子功能，并且其中所述抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合生長因子受體，并且其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)在至少2個位置上具有突變并且具有改變的糖基化特征，以使巖藻糖與甘露糖的比率為0.8∶3或更低，從而使所述抗體或抗原結(jié)合片段與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)缺乏所述突變和改變的糖基化特征的等同抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增強的效應子功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體制劑，其中所述生長因子受體選自IGF-1R、EGFR、HER_2 或 HER-3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制劑，其中所述生長因子受體為人IGF-1R。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的抗體制劑，其中所述重鏈恒定區(qū)源自IgG同種型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體制劑，其中所述重鏈恒定區(qū)源自IgGl。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體制劑，其中所述重鏈恒定區(qū)包含至少一個來自IgG3的 CH2結(jié)構(gòu)域和至少一個來自IgGl的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的抗體制劑，其中至少一個所述CH2結(jié)構(gòu)域來自 IgGl，并且其中所述突變在IgGl的位置239和332。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體制劑，其中所述突變?yōu)镾239D和I332E。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的抗體制劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈恒定 區(qū)在位置330還有突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體制劑，其中所述330突變?yōu)锳330L。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的抗體制劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段 的重鏈恒定區(qū)包含N-糖苷連接的糖鏈，當與等同的野生型重鏈恒定區(qū)中得到的巖藻糖水 平相比時，所述糖鏈具有降低的巖藻糖水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體制劑，其中在所述總的N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖與 甘露糖的比率為至少0.5 3。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的抗體制劑，其中所述N-糖苷連接的糖鏈不含有結(jié)合 巖藻糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的抗體制劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段 為人源化的或嵌合的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的抗體制劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段 還結(jié)合靈長類IGF-1R。
16.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求所述的抗體制劑，其中所述抗體為單克隆的。
17.制備根據(jù)任一項上述權(quán)利要求所述的抗體制劑的方法，其包括在細胞系中表達抗 體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段經(jīng)改造適于調(diào)控存在或不存在巖藻糖與 N-糖苷連接的糖鏈的結(jié)合，所述N-糖苷連接的糖鏈與免疫功能分子結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細胞系為哺乳動物細胞系。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細胞系為CH0細胞系。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段由所 述宿主細胞分泌到培養(yǎng)基中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中相對于含有所述抗體或其抗原結(jié)合片段的無血 清培養(yǎng)基，進一步將所述抗體或其抗原結(jié)合片段純化至至少95%或更高。
22.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的抗體制劑以及藥學上可 接受的載體。
23.部件試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物以及使用說明書。
24.治療經(jīng)受癌癥折磨的人類患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利 要求1至15所述的抗體制劑或權(quán)利要求23所述的組合物的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述患者經(jīng)受乳腺癌的折磨。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述患者經(jīng)受前列腺癌的折磨。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的抗體制劑在制備治療選自下列疾病或病癥的 藥物中的用途類風濕性關節(jié)炎、乳腺癌、前列腺癌、肺癌或骨髓瘤。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的抗體制劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段 中和IGF-IR的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合IGF-IR，尤其是hIGF-IR的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還公開了包含本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的抗體制劑。制備此類抗體或抗原結(jié)合片段的方法及其用途也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
文檔編號A61K39/395GK101855244SQ200880109440
公開日2010年10月6日 申請日期2008年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月1日
發(fā)明者J·H·艾利斯, P·A·漢布林 申請人:葛蘭素集團有限公司