專利名稱：枸杞和炎癥的制作方法
枸杞和炎癥 本發(fā)明總體上涉及炎癥領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及天然化合物在制備治療炎癥的產(chǎn)品
中的用途。例如，枸杞提取物被證實(shí)具有抗炎特性。 炎癥是組織對(duì)有害剌激，例如病原體，損傷的細(xì)胞，或剌激物的復(fù)雜生物應(yīng)答。其 通常是生物體清除有害剌激和引發(fā)組織愈合過程的保護(hù)性嘗試。但是，未充分控制的炎癥 可以導(dǎo)致幾種疾病，不論受試者的年齡如何。 衰老與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常有關(guān)，例如細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的顯著下降，伴隨增加 的體液免疫功能異常(例如，對(duì)疫苗的低應(yīng)答)。此外衰老經(jīng)常與輕度炎癥狀態(tài)有關(guān)。因 此，尤其很多老年人處于促進(jìn)發(fā)病和死亡的感染和非感染疾病的高風(fēng)險(xiǎn)中。
枸杞因其對(duì)健康的多種益處而聞名，這是基于復(fù)合營(yíng)養(yǎng)(例如，玉米黃素，維生素 和寧夏枸杞多糖)成分。 但是，該領(lǐng)域仍然需要具有抗炎特性的可獲得的天然化合物。 例如，營(yíng)養(yǎng)介入，如n-3PUFA (多不飽和脂肪酸)減弱了炎性細(xì)胞功能，而且降低了
細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如，淋巴細(xì)胞增殖和NK活性)，其可以導(dǎo)致對(duì)于宿主防御潛在的不
利影響。 因此本發(fā)明的目的是為本領(lǐng)域提供可選的天然化合物，其具有抗炎特性并且對(duì)于 受試者的免疫防御沒有任何不利影響。 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)枸杞提取物具有抗炎特性。因此本發(fā)明的目的是通過為本領(lǐng) 域提供枸杞提取物在制備治療和/或預(yù)防炎癥的產(chǎn)品中的用途而達(dá)到的。而且發(fā)現(xiàn)維持了 免疫應(yīng)答。 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是包括枸杞或其一部分和任選地包含乳或乳蛋白的 載體的初級(jí)組合物，在制備治療和/或預(yù)防炎癥的產(chǎn)品中的用途。
該產(chǎn)品可以設(shè)計(jì)用于口服或局部施用。 乳或乳蛋白可以獲自動(dòng)物或植物來源，或來自其混合物。優(yōu)選地，乳是牛奶，駱駝 奶，水牛奶，山羊奶，綿羊奶，植物乳，尤其是大豆乳或其混合物。乳蛋白應(yīng)當(dāng)理解為可獲自 上面列出的一種或多種乳類型的蛋白級(jí)分。
優(yōu)選地，初級(jí)組合物是易混合組合物。 特別是如果初級(jí)組合物包含乳或包含乳蛋白的載體，其有利地具有完整枸杞的基 本活性組分的封閉范圍，其具有在水相系統(tǒng)中良好的穩(wěn)定性，可混合性和/或可分散性。
進(jìn)一步地，特別是如果包含乳或包含乳蛋白的載體，該初級(jí)組合物，以更好的生物 利用率和穩(wěn)定性形式，具有增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其具有令人愉快的味道和顏色。其能夠被直 接應(yīng)用或被濃縮或干燥成粉末，用于日常消費(fèi)的食物產(chǎn)品中的幾種應(yīng)用或其它營(yíng)養(yǎng)用途。
如果初級(jí)組合物通過如下方法制備，那么可以獲得所有這些特性，所述方法用于 制備初級(jí)組合物以遞送枸杞的基本親脂和/或親水生物活性組分，包括步驟i)在乳或包 括乳蛋白的液體介質(zhì)中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維以獲得水性懸浮液 iii)任選巴氏滅菌產(chǎn)生的懸浮液iv)任選在加工過程中加入合成的或天然的生物活性組 分v)和進(jìn)一步任選干燥該懸浮液以得到粉末。
因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，通過如下方法可得到初級(jí)組合物，該方法包括 步驟i)在乳或包括乳蛋白的液體介質(zhì)中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維
以獲得水性懸浮液iii)任選巴氏滅菌獲得的懸浮液iv)任選在加工過程中加入合成的或
天然的生物活性組分v)和進(jìn)一步任選干燥該懸浮液以得到粉末。 該方法的主要的益處是天然的和低成本，使得可以以其天然組分中穩(wěn)定的水溶和 脂溶化合物組合的形式改善改善多種營(yíng)養(yǎng)物的遞送，無有機(jī)溶劑殘留。 在另外一方面，本發(fā)明提供了一種增加枸杞材料的生物活性化合物在水相系統(tǒng)中 的可混合性或可分散性，穩(wěn)定性，和生物利用率的方法，其利用上述方法，尤其地，通過使用 乳或乳蛋白，大豆乳或來自植物的乳樣蛋白提取和遞送枸杞的功能成分的多種營(yíng)養(yǎng)物來實(shí) 現(xiàn)。 上述初級(jí)組合物能夠用于釋放枸杞的功能成分的多種營(yíng)養(yǎng)物，其具有改進(jìn)的生物 利用率，可混合性和穩(wěn)定性。 術(shù)語生物活性化合物可以被理解為意思是當(dāng)口服或局部應(yīng)用時(shí)，顯示出生物活性 或健康影響的分子或組分。 枸杞可以例如，以果實(shí)和該植物的其它部分的形式使用。果實(shí)可以新鮮的，濃縮的 或干燥的材料形式，例如，風(fēng)干或冷凍干燥的材料使用。但優(yōu)選使用干燥的成熟果實(shí)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，初級(jí)組合物包含枸杞的至少一部分基本親脂和 /或親水生物活性組分。 基本的親脂和/或親水生物活性組分優(yōu)選選自包括脂質(zhì)，生物堿，蛋白質(zhì)，糖類， 糖蛋白，類胡蘿卜素，多酚化合物例如黃酮類化合物，維生素，礦物質(zhì)或其混合物的組。
類胡蘿卜素可以選自包括胡蘿卜素和葉黃素例如，番茄紅素，胡蘿卜素，六氫番茄 紅素，八氫番茄紅素，角黃素，P _隱黃素，辣椒紅，葉黃素，玉米黃素，或那些脂肪酸酯形式 或其混合物的組。 糖蛋白優(yōu)選選自包括阿拉伯半乳聚糖蛋白，尤其枸杞多糖和能夠由13 _葡糖基 Yariv試劑檢測(cè)的大分子的組。 黃酮類化合物優(yōu)選選自包括黃酮例如5， 7， 4'-三羥黃酮，毛地黃黃酮，或香葉木 素，黃酮醇例如櫟精，楊梅黃酮，4'， 5， 7-三羥黃酮醇，黃烷酮，花色素例如花葵素，二甲翠雀 素，或異黃酮例如染料木黃酮，大豆黃素，或其混合物的組。 本發(fā)明的初級(jí)組合物可以在乳中或包括乳蛋白的載體中含有至少包含枸杞或其 中一部分的基本生物活性組分，不包括不溶性纖維。乳載體可以是來自動(dòng)物或植物來源的 脫脂乳或全脂乳形式(例如，大豆乳，果汁或椰子乳，等)。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，根 據(jù)希望得到的初級(jí)組合物使用牛奶或大豆乳。舉例來說，包含乳的載體可以是包括乳蛋白， 如酪蛋白或乳清蛋白的任何可食用的液體。
植物油可以任選加入到液體介質(zhì)中。 枸杞材料可以在所述乳或包括乳蛋白的液體介質(zhì)中以約i : i到i : iooo，優(yōu)選 從i : 5到i : 50的各自比例混合和碾磨?；旌虾湍肽ゲ襟E可以在從i到95t:，優(yōu)選從
約20到80°C ，和更優(yōu)選從40到80°C的溫度下進(jìn)行。然后，不溶性纖維可以被至少部分去
除以獲得水性懸浮液。 其可以通過任何常規(guī)方法進(jìn)行。產(chǎn)生的初級(jí)組合物可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)一步被巴氏滅菌和/或干燥成粉末。獲得的初級(jí)組合物也可以是液體或凝膠形式。
這樣品發(fā)明提供了初級(jí)組合物，其包括與完整果實(shí)相似譜的重要營(yíng)養(yǎng)物，其具有 良好穩(wěn)定性，可混合性和生物利用率。如果選擇粉末形式，這些組合物可以在水相系統(tǒng)中是 高度可分散的。在這種情況下，舉例來說，粉末在冷水或熱水中是可分散的。其同樣能夠加 入乳中。 另外，組合物可以包含一種或多種乳化劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑和其它添加劑。優(yōu)選 使用相容于食物的乳化劑，如磷脂，例如卵磷脂，聚氧乙烯山梨糖醇酐單或三硬脂酸酯，單 月桂酸酯，單棕櫚酸酯，單或三油酸酯，單或二甘油酯。 也可以使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的任何類型的穩(wěn)定劑。
可以使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的任何類型的抗氧化劑。
可以進(jìn)一步使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的添力口劑，香味劑，色素。
依照初級(jí)組合物預(yù)期的最終用途，可以加入乳化劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑和添加劑。
該組合物可以進(jìn)一步包含合成的或天然的生物活性成分如氨基酸，脂肪酸，維生 素，礦物質(zhì)，類胡蘿卜素，多酚等。其優(yōu)選在巴氏滅菌和/或干燥之前，通過干燥或者潮濕混 合加入到所述組合物中。 使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品可以是膳食補(bǔ)充劑，用作或用于藥物的補(bǔ)充劑或用作或用 于乳膏的補(bǔ)充劑。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該產(chǎn)品預(yù)期用于由人或?qū)櫸锸褂煤?或應(yīng)用于 人或?qū)櫸铩?該產(chǎn)品可以施用于任何年齡的受試者，尤其是嬰兒，兒童，青少年，成年人和/或 老年人。但是，枸杞的益處似乎尤其適合于成年人和老年人。 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品預(yù)期在食品中或作 為食品，用于人類消費(fèi)。該食品可以經(jīng)腸應(yīng)用-為了本發(fā)明的目的，包括口服的或-胃腸外 的。 因此，該初級(jí)組合物可以是口服應(yīng)用的食品中的添加齊U，例如在營(yíng)養(yǎng)組合物，食品 補(bǔ)充劑，寵物食物產(chǎn)品，化妝品制劑中或在藥物制劑中。初級(jí)組合物也可以是局部使用的產(chǎn) 品，如化妝品或藥物制品中的添加劑。 因此，通過使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品可以是營(yíng)養(yǎng)完全配方食品，乳制品，冷藏的或耐 貯藏飲料，用于哺乳母親的產(chǎn)品，液體飲料，湯，膳食補(bǔ)充劑，膳食替代品，營(yíng)養(yǎng)棒，甜食，乳 或發(fā)酵乳制品，酸乳酪，奶粉，腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制品，嬰兒配方奶粉，嬰兒營(yíng)養(yǎng)制品，濃湯，谷類制品 或發(fā)酵谷類制品，冰淇淋，糖果，甜點(diǎn)，餅干，蛋糕，巧克力，熱牛奶咖啡，助卩啡，烹飪制品例如 蛋黃醬，番茄醬，或沙拉醬，寵物食品或?qū)櫸镲嬈?。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，用于人類消費(fèi)的 食品組合物由上面的初級(jí)組合物補(bǔ)充。初級(jí)組合物，優(yōu)選粉末形式的初級(jí)組合物，能夠按照 獲得上述生物活性營(yíng)養(yǎng)物日常攝入的量在上面提到的食品或飲料中分散，其可以根據(jù)希望 的效果和目標(biāo)組織選擇。為獲得有益效果而由個(gè)體消費(fèi)的初級(jí)組合物或食品組合物的量還 取決于其大小，類型和年齡。 如果該產(chǎn)品是口服施用的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，其可以存在于膠囊，明膠膠囊，軟膠囊，片 劑，糖衣片劑，丸劑，糊劑或錠劑，樹膠，或可飲用的溶液或乳劑，糖漿或凝膠中。初級(jí)組合 物的劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員意欲達(dá)到的目的變化，但通常在初級(jí)組合物為約O. 1到100重量百分?jǐn)?shù)之間。這樣的補(bǔ)充劑也可以包括增甜劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑，添加劑，調(diào)味劑
和/或色素。此外，化妝用目的的補(bǔ)充劑可以包括有關(guān)皮膚的活性組合物。 在另外一種實(shí)施方式中，如果本發(fā)明的產(chǎn)品是藥物組合物，其可以被施用用于預(yù)
防和/或治療性治療。 在治療應(yīng)用中，組合物以足以至少部分治愈或抑制疾病癥狀和其并發(fā)癥的量被施 用。足以達(dá)到該目的的量被定義為"治療有效劑量"。對(duì)該目的有效的量取決于本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的多種因素，例如疾病的嚴(yán)重程度和病人的體重和一般狀態(tài)。在預(yù)防應(yīng)用中，根據(jù) 本發(fā)明的組合物以足以至少部分降低患病風(fēng)險(xiǎn)的量應(yīng)用于易感特定疾病或處于特定疾病 風(fēng)險(xiǎn)的病人。這樣的量定義為"預(yù)防有效劑量"。再次，準(zhǔn)確的量取決于多種病人的特定因 素，例如，病人的健康狀況和體重。 本發(fā)明的組合物，如果作為藥物組合物施用，優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的載體一起施 用，載體的基本性質(zhì)根據(jù)施用方式而不同，例如，經(jīng)腸的，口服的和局部(包括眼科用)途 徑。希望的劑型可以使用各種賦形劑制備，包括，例如，藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸 鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂。 可以理解的是，技術(shù)人員可以基于其掌握的知識(shí)，考慮施用的途徑，選擇靶向活性 化合物到目的組織，例如，皮膚，結(jié)腸，胃，眼睛，腎臟或肝臟的適宜的組分和蓋侖形式。
本發(fā)明也涉及包含上述初級(jí)組合物的化妝品組合物。例如，其可以配制在洗劑，洗 發(fā)劑，乳膏，防曬霜，曬后霜?jiǎng)?，抗衰老霜?jiǎng)┖?或軟膏中。能夠局部使用的組合物進(jìn)一步包 含可以在化妝品中使用的脂肪或油，例如CTFA化妝品原料手冊(cè)(Washington)中提到的那 些。加入其它的化妝活性成分也是可能的。組合物進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)劑(structuring agent) 和乳化劑。其它的賦形劑，著色劑，香料或遮光劑也可以加入到該組合物?？梢岳斫獾氖?， 本化妝品制品可以包含技術(shù)人員已知的不同成分的混合物，以保證所述物質(zhì)快速滲透入皮 膚和預(yù)防其貯存過程中的降解。 可以理解的是，本發(fā)明的概念可以同樣用作輔助性治療，協(xié)助目前使用的藥物。由 于本發(fā)明的化合物可以容易地與食品材料一起施用，可以應(yīng)用包含大量所述物質(zhì)的專門臨 床食品。 上述食品，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，化妝品或藥物組合物施用給寵物或人，獲得改善的健康狀 況，尤其是通過至少部分地減輕炎癥。 能夠通過應(yīng)用使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品而被治療的炎癥可以選自急性炎癥例如膿 毒癥，感染，燒傷，和慢性炎癥例如炎性腸病，克隆病，潰瘍性結(jié)腸炎，壞死性腸結(jié)腸炎，皮膚 炎癥，例如紫外線或化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚炎癥，濕疹，反應(yīng)性皮膚，銀屑病，白癜風(fēng)，痤瘡，炎性腸 病綜合征，肝臟炎癥，酒精性肝硬化，變態(tài)反應(yīng)，特異反應(yīng)性，骨炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng) 性紅斑狼瘡，Gougerot-Sjogren' s綜合征，賴特爾綜合征，脊髓灰質(zhì)炎，皮肌炎，甲狀腺炎， 巴澤多病，橋本病，I型糖尿病，艾迪生病，自身免疫性肝炎，乳糜瀉，比爾默病，多發(fā)性硬化， 肌無力，腦脊髓炎，眼炎癥，肥胖相關(guān)的炎癥，年齡相關(guān)的輕度炎癥，Blau' s綜合征，阿爾茨 海默氏病，心血管疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，代謝綜合征，牙齦炎和paronditis。
本發(fā)明人已經(jīng)研究了本發(fā)明的初級(jí)組合物抗炎效果的分子機(jī)制。不希望受理論約 束，發(fā)明人現(xiàn)在相信，其抑制巨噬細(xì)胞的LPS-介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(

圖1)和人腸上 皮細(xì)胞內(nèi)TNF- a或LPS-誘導(dǎo)的NF_ k B活化途徑(圖2)。在臨床前研究中，包括本發(fā)明初
7級(jí)組合物的膳食補(bǔ)充劑在急性腸炎的小鼠模型中顯示了強(qiáng)烈抗炎特性(圖3到10)。此外， 本發(fā)明的初級(jí)組合物還能夠減少年老小鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，例如，TNF-a (圖 11)。而且，包括本發(fā)明初級(jí)組合物的膳食補(bǔ)充劑增強(qiáng)年老小鼠體內(nèi)抗原特異性的體液和細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(分別見圖12和13)。這樣，本發(fā)明的初級(jí)組合物被證實(shí)有益于減輕炎 癥狀態(tài)。同時(shí)，本發(fā)明的初級(jí)組合物還能夠支持免疫系統(tǒng)。 因此，本發(fā)明制備的產(chǎn)品可以用于減輕炎癥狀態(tài)和_同時(shí)-提升免疫系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明的初級(jí)組合物具有恢復(fù)受損免疫和炎癥反應(yīng)到穩(wěn)態(tài)的潛力。通過此 雙重效應(yīng)，本發(fā)明的初級(jí)組合物適于，例如，在老年的，臨床的和寵物營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)品中使用。
本發(fā)明的初級(jí)組合物尤其有益于維持衰老過程中的免疫功能，同時(shí)減輕年齡相關(guān) 的輕度炎癥狀態(tài)。 本發(fā)明的初級(jí)組合物也可以應(yīng)用于控制急性或慢性炎癥的臨床產(chǎn)品。 因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品被用于改善受損
的免疫應(yīng)答。其也可以用于增強(qiáng)抗原特異性的體液免疫應(yīng)答和/或增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。 另外，該初級(jí)組合物和/或本發(fā)明的產(chǎn)品可以用于治療或預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)的疾 病。發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)使用該初級(jí)組合物和/或本發(fā)明的產(chǎn)品能夠誘導(dǎo)抗氧化基因顯著的 增加，例如，GPX-1， CAT1和S0D2(圖9)。因此，該初級(jí)組合物和/或本發(fā)明的產(chǎn)品可以提 供針對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)，所述氧化應(yīng)激由例如，自由基，如 02—，超氧陰離子；11202，過氧化 氫； 0H，羥基自由基；R00H，有機(jī)氫過氧化物；R0 ，烷氧自由基；ROO ，過氧自由基；H0C1， 次氯酸；00N0-，過氧亞硝酸根;禾口 /或N0 弓l起。 本領(lǐng)域技術(shù)人員明確的是，可以自由組合本文所述的任何特征而不脫離本發(fā)明原 始公開的范圍。 從下面的實(shí)施例和附圖來看，本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)是顯而易見的。 圖1顯示了小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW細(xì)胞)中通過LWB抑制LPS-介導(dǎo)的IL_6的產(chǎn)生。 圖2顯示了人腸上皮細(xì)胞系(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NF- k B報(bào)告基因的HT-29)中通過LWB抑 制LPS-介導(dǎo)的NF- k B的活化。 圖3顯示了TNBS施用后體重的減輕。平均數(shù)+/_SEM。 圖4顯示了宏觀的得分評(píng)定。右側(cè)區(qū)平均數(shù)+/-SEM ;左側(cè)區(qū)個(gè)體值和中位數(shù)。
圖5顯示了組織學(xué)得分評(píng)定。右側(cè)區(qū)平均數(shù)+/-SEM ;左側(cè)區(qū)個(gè)體值和中位數(shù)。
圖6顯示了 COX-2與參考蛋白(肌動(dòng)蛋白)的比例。右側(cè)區(qū)平均數(shù)+/-SEM ;左 側(cè)區(qū)個(gè)體值和中位數(shù)。 圖7顯示了 pSTAT3的表達(dá)。右側(cè)區(qū)平均數(shù)+/-SEM ;左側(cè)區(qū)個(gè)體值和中位數(shù)。
圖8顯示了急性腸炎的小鼠模型中促炎基因，例如TNFa ， IL_6和IL_1 P和蛋白 質(zhì)，例如KC的表達(dá)，補(bǔ)充或不補(bǔ)充LWB。 圖9顯示了急性腸炎的小鼠模型中抗氧化基因，例如，GPX-1 ， CAT1和S0D2的表達(dá)， 補(bǔ)充或不補(bǔ)充LffB。
圖10顯示了抗氧化能力。右側(cè)區(qū)平均數(shù)+/-SEM ;左側(cè)區(qū)個(gè)體值和中位數(shù)。 圖11顯示了與正常年老小鼠(H20)和成年鼠(CTRL)肝臟中觀察到的水平相比，
8補(bǔ)充LWB的年老小鼠肝臟中編碼TNF- a的基因的表達(dá)。 圖12顯示了年老小鼠體內(nèi)抗原(KLH)特異性的抗體反應(yīng)。 圖13顯示了年老小鼠體內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)。 實(shí)施例1 包含枸杞和乳的初級(jí)組合物的制備(LWB，乳糖-枸杞，Lacto-Wo If berry)
將干燥的枸杞果實(shí)(40g)和全脂乳(300g)加入到1升的容器?；旌衔锉３?靜止不動(dòng)10分鐘，在氣氣條件下用Polytron (Dispersing and MixingTechnology by KINEMATICA, PT3000)以26000rpm處理15分鐘。在Polytron處理過程中，混合物的溫度 通過水浴方法維持在80-85°C ，之后冷卻到室溫。獲得的混合物接著以2000G離心10分鐘。 丟棄固體殘余物。液相(306g橘黃色乳)被凍干。干燥產(chǎn)品最終被磨碎，產(chǎn)生54g橘黃色 粉末，其與枸杞果實(shí)粉末相比，顯示出極好的水分散性和改善的玉米黃素穩(wěn)定性。
實(shí)施例2
試劑 來自先導(dǎo)批N'WB03A1506H，照上述方式在NRC(雀巢研究中心，Lausanne)生產(chǎn) 的乳糖-枸杞(LWB)粉末和枸杞提取粉末(批次N'WB03A1506H)由J.Wang(FS， Lipids & Bioactives)提供。來自大腸桿菌血清型055 :B5的脂多糖(LPS)購(gòu)自Sigma (St. Louis, M0)。經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，從產(chǎn)后20天的不同健康供者收集人母乳(HM)。鑰孔血藍(lán)蛋白 (KLH)購(gòu)自Sigma。
細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系RAW 264. 7(TIB-71，來自ATCC， Manassas, Virginia, USA)在添加10X熱滅活FCS(Amimed)和1%青霉素/鏈霉素(Invitrogen，Paisley,UK)的 Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Amimed，Bioconc印t，Allschwill， Switzerland)中，于 37°C，5% 0)2/空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用胰蛋白酶/EDTA(Sigma，St-Louis，MO，USA)傳代 細(xì)胞。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29克隆34細(xì)胞(S卩，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 NF- k B報(bào)告基因的HT-29細(xì) 胞)在包含1%穩(wěn)定卜谷氨酰胺和添加10%熱滅活(56t:—個(gè)小時(shí))FCS，l^青霉素/鏈霉 素(Sigma，St Louis，MO) ， 500ug/ml G418 (Invitrogen)禾口 100ug/ml normocin (Invivogen) 的高葡萄糖(4. 5g/l)DMEM(Bioconc印t， Allschwill， Switzerland)中，于37。C，5X C02/ 空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2天更換直到細(xì)胞單層達(dá)到約90%匯合。使用胰蛋白酶/ EDTA(Sigma)傳代細(xì)胞。
定量LPS-介導(dǎo)的IL-6表達(dá) RAW264. 7細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔接種于平底96孔板(Nunc, Rosklide， Denmark) 普通培養(yǎng)基中，置于37"，5%0)2/空氣的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)三天后(即，細(xì)胞達(dá)到約80%匯 合)，不存在或存在LWB樣品(終濃度0. 1-1 % )情況下，細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中以0. 5ug/ml 大腸桿菌LPS(055 :B5，Sigma)剌激或不剌激24小時(shí)。接著收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液并用于定量 IL-6的產(chǎn)量。根據(jù)制造商的說明通過ELISA(Murine IL-6Eli-pair， Diaclone， Besancon， France)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的白細(xì)胞介素6 (IL-6)水平。
NF- k B的活性 HT-29克隆34細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔接種于平底96孔板(Nunc)培養(yǎng)物維持培 養(yǎng)基中。培養(yǎng)3-4天后(即，細(xì)胞達(dá)到約80%匯合)，在磷酸鹽緩沖液(PBS) (Sigma)中清
9洗細(xì)胞，接著在不存在或存在LWB樣品的情況下，在包含1%青霉素/鏈霉素的DMEM中，以 LPS(10ng/ml+5X人母乳)或者重組TNF-a (10ng/ml ;R&D systems, Oxon， England)剌激 或不剌激24小時(shí)。接著收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液并貯存于+4°C 0/N直到分析NF-kB的活性。 NF-KB激活后，HT-29克隆34細(xì)胞在培養(yǎng)上清液中分泌堿性磷酸酶(SEAP)。根據(jù)制造商的 說明(Applied Biosystems， Bedford, USA)，使用熒光檢測(cè)方法(Phospha—Light System) 檢測(cè)SEAP釋放。簡(jiǎn)要地，細(xì)胞培養(yǎng)上清液與Phospha-Light System的反應(yīng)緩沖液在白色 平底96孔聚丙烯板(Greiner)中孵育20分鐘，使用Spectraf luor Plus分光光度計(jì)(Tecan 8634 Hombrechtikon， Switzerland)檢測(cè)熒光。結(jié)果表達(dá)為相對(duì)發(fā)光單位(RLU)。
TNBS-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型 TNBS結(jié)腸炎模型是由化學(xué)產(chǎn)品三硝基苯磺酸(TNBS)以150mg/kg的劑量誘導(dǎo) 的急性炎癥模型。每組10只小鼠，在誘導(dǎo)結(jié)腸炎前七天已經(jīng)用包含l^LWB(50mg)的飲食 喂養(yǎng)，直到處死。在施用TNBS后1到4天，50mgL WB通過管飼法供給，以補(bǔ)償與急性腸炎 相關(guān)的低飲食攝入。評(píng)估每只動(dòng)物的體重減輕，宏觀的組織學(xué)評(píng)分，C0X-2， pSTAT3，促炎和 抗氧化基因表達(dá)和抗氧化能力。宏觀的和組織學(xué)評(píng)分根據(jù)Wallace (Wallace等，1989)和 Ameho(Ameho等，1997)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。COX-2 (誘導(dǎo)型環(huán)加氧酶，72kDa蛋白)負(fù)責(zé)急性 炎癥條件下前列腺素的可誘導(dǎo)的生物合成。Stat3是很多細(xì)胞因子的重要信號(hào)分子；尤其 是對(duì)促炎細(xì)胞因子，如IL-6而言。
在年老小鼠中評(píng)估免疫調(diào)節(jié)的研究設(shè)計(jì) 無特定病原體的雄性C57BL/6J小鼠(4周大小)購(gòu)自Charles RiverLaboratories Inc (France)。小鼠在常規(guī)環(huán)境(12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，溫度22。C，濕度56% )下飼養(yǎng)和 自由飲水和進(jìn)食半合成的Kliba 3434。小鼠維持每籠5只直到5個(gè)月大小，接著它們被單獨(dú) 關(guān)在籠中。所有條件和動(dòng)物處理均由雀巢和國(guó)家倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，其與瑞士聯(lián)邦獸醫(yī)顧問 意見一致。21個(gè)月大小的小鼠被隨機(jī)分入2組，每組10只動(dòng)物。非補(bǔ)充的對(duì)照小鼠(H20， n = 10每年齡組)和LWB補(bǔ)充小鼠(LWB， n = 10每年齡組)接受半合成飲食(AIN-93)。 LWB以0.5% (w/v)的溶液以飲用水形式提供，其新鮮配制并每隔一天更換。在試驗(yàn)過程 中(44天)，允許所有小鼠自由飲水和取食。同樣的研究設(shè)計(jì)被進(jìn)行兩次，并也用8個(gè)月大 小的小鼠進(jìn)行(11 = 8每組)。為了研究體內(nèi)T細(xì)胞依賴的體液應(yīng)答(抗原特異性的抗體 產(chǎn)生)，年老小鼠在試驗(yàn)的第15天通過皮下注射(100ul)l^明礬(Brenntag Biosector， Frederikssund， Denmark)中惰性抗原鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH， Sigma) 100ug進(jìn)行免疫。DTH反 應(yīng)被用作細(xì)胞免疫的體內(nèi)度量。在引發(fā)之前和之后24小時(shí)到8天進(jìn)行耳厚度(耳腫脹) 測(cè)量，以確定產(chǎn)生DTH反應(yīng)的能力。簡(jiǎn)要地，用KLH免疫小鼠7天后(即試驗(yàn)的第22天)， 通過注射回憶抗原KLH(O. 5ug/ml， 10ul)到每只小鼠的右耳引發(fā)DTH反應(yīng)。左耳單獨(dú)注射 載體(鹽水二PBS)并作為每只動(dòng)物的內(nèi)部對(duì)照。引發(fā)后24小時(shí)，和接下來的7天過程中， 非引發(fā)的耳(左耳)和引發(fā)的耳(右耳)均被測(cè)量。DTH反應(yīng)(KLH-PBS)表達(dá)為耳腫脹程 度，g卩，耳厚度的變化，應(yīng)用下面的公式A耳厚度-[(引發(fā)的耳(右，KLH)厚度-非誘發(fā)耳 (左，PBS)耳厚度)，其中A耳厚度=[引發(fā)后耳厚度-引發(fā)的前耳厚度]。在第0，15，29 天從尾靜脈并且第44天通過心臟穿剌收集血液樣品。小鼠在試驗(yàn)的第44天被處死。在尸 體解剖中，移除肝臟并且迅速在液氮中凍存一塊。樣品貯存于-S(TC直至進(jìn)一步分析。
定量KLH-特異性的IgG2a抗體水平
血清中KLH-特異性的IgG2a抗體的量通過ELISA測(cè)定。簡(jiǎn)要地，微量滴定板用 KLH(50ul/孔，100ng/ml)包被并在37 °C孵育3小時(shí)。自由結(jié)合位置用ELISA緩沖液在 37t:封閉l小時(shí)。接著加入樣品并在+4t:孵育過夜。搖動(dòng)下，結(jié)合的抗體與來自Southern Biotechnologies (Birmingham, USA)的綴合生物素的山羊抗小鼠IgG2a( y 2a鏈特異性的) 于37t:反應(yīng)1小時(shí)。平板在加入來自KPL的TMB過氧化物酶底物后于450nm讀數(shù)?？?KLH IgG2a抗體水平被表達(dá)為0D45。 值的均值。
基因表達(dá) 肝臟樣品被轉(zhuǎn)移到lml RNA裂解緩沖液中(Macherey-Nagel， Duren， Germany)并 使用Ribolyzer(Hybaid， Waltham， MA， USA)以下面的設(shè)置勻漿:功率6，20分鐘。使用商 業(yè)上可獲得的試劑盒(NucleoSpinRNA II試劑盒；Macherey-Nagel， Duren， Germany)進(jìn) 行RNA提取。使用Ribogreen RNA定量試劑盒(Molecular Probes ;Eugene， OregonUSA) 實(shí)現(xiàn)RNA定量，并使用Agilent RNA 6000Nano LabChip試劑盒測(cè)定RNA質(zhì)量(Agilent Technologies, Palo Alto，USA)。根據(jù)制造商的說明(Applied biosystems, Biosystems ; Rokreutz， Switzerland)，使用Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄總RNA (2 y g)。定制的具有48 個(gè)TaqMan探針的低密度陣列(LDA)(負(fù)荷能力技術(shù)monoplicates中每張卡8個(gè)樣品)購(gòu) 自Applied Biosystems (Foster City， USA)并根據(jù)制造商的說明使用。以SDS2. 2. 2計(jì)算 機(jī)軟件(A卯lied Biosystems)，使用相對(duì)定量方法A ACt法計(jì)算基因表達(dá)。得到的循環(huán) 閾值(Ct)值被輸出到MS Excel (Microsoft, USA)進(jìn)一步分析。簡(jiǎn)要地，首先計(jì)算A Ct值 (艮P，靶基因的Ct值-GAPDH持家基因的Ct值)，接著使用下面的公式2—ACtX 106，確定相 對(duì)mRNA表達(dá)。
—般統(tǒng)計(jì)分析 通過平均數(shù)+/-SEM或標(biāo)準(zhǔn)差，和斯氏T檢驗(yàn)(非配對(duì))，或當(dāng)適合時(shí)，兩因素方差 分析，來分析數(shù)據(jù)。低于5%的概率值被認(rèn)為是顯著的。
結(jié)果 A)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳糖_枸杞的抗炎特性 乳糖-枸杞(LWB)溶液在體外抑制小鼠巨噬細(xì)胞系由LPS介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子 IL-6的釋放(圖1)和人腸上皮細(xì)胞中LPS-介導(dǎo)的NF- k B的活化(圖2)。
B)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳糖_枸杞抗炎和免疫增強(qiáng)效應(yīng)
a.病理的急性炎癥 具有LWB的膳食補(bǔ)充劑在急性腸炎小鼠模型中證實(shí)了強(qiáng)烈的抗炎特性。口服施 用1%的LWB獲得了體重減輕的改善(圖3)、宏觀的和組織學(xué)的病變(圖4和5)的改善， C0X-2和pSTAT3表達(dá)水平的顯著降低(圖6和圖7)。另外，與對(duì)照組相比，結(jié)腸內(nèi)促炎基 因，例如TNFa 、IL-6和IL-1 P和蛋白質(zhì)，例如KC的表達(dá)下降(圖8)。并行地，LWB i秀導(dǎo)了 結(jié)腸內(nèi)抗氧化基因例如GPX-1， CAT1和S0D2的顯著增加(圖9)并增強(qiáng)了血漿中的抗氧化 防御(圖10)。 b.生理的年齡相關(guān)的輕度炎癥 相對(duì)于成年小鼠體內(nèi)觀察到的水平，具有LWB膳食補(bǔ)充劑(飲用水中0. 5% )導(dǎo)致 了年老小鼠肝臟中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)下降(圖11 :編碼TNF-a的基因作為示例)。
c.年老小鼠體內(nèi)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)
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具有LWB的膳食補(bǔ)充劑(飲用水中0. 5% )改善了年老小鼠體內(nèi)體液(圖12)和 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(圖13)。
權(quán)利要求
包含枸杞或其一部分的初級(jí)組合物在制備治療和/或預(yù)防炎癥的產(chǎn)品中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述初級(jí)組合物進(jìn)一步包含乳或含有乳蛋白的載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l-2之一的用途，其中所述初級(jí)組合物和/或產(chǎn)品不包含不溶性纖維。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3之一的用途，其中所述產(chǎn)品經(jīng)設(shè)計(jì)用于經(jīng)口、局部、經(jīng)腸和/或胃 腸外施用；和/或其中該產(chǎn)品是膳食補(bǔ)充劑，用作或用于藥物的補(bǔ)充劑或用作或用于乳膏 的補(bǔ)充劑；和/或其中該產(chǎn)品設(shè)計(jì)用于由人或?qū)櫸锸褂煤?或應(yīng)用于人或?qū)櫸铩?br> 5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4之一的用途，其中該產(chǎn)品設(shè)計(jì)用于食品中或作為食品用于人類消 費(fèi)，例如作為營(yíng)養(yǎng)完全配方食品、乳制品、冷藏的或耐貯藏飲料、用于哺乳母親的產(chǎn)品、液體 飲料、湯、膳食補(bǔ)充劑、膳食替代品、營(yíng)養(yǎng)棒、甜食、乳或發(fā)酵乳產(chǎn)品、酸乳酪、奶粉、腸營(yíng)養(yǎng)產(chǎn) 品、嬰兒配方奶粉、嬰兒營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、濃湯、谷類或發(fā)酵谷類產(chǎn)品、冰淇淋、糖果、甜點(diǎn)、餅干、蛋 糕、巧克力、熱牛奶咖啡、咖啡、烹飪制品例如蛋黃醬、番茄醬、或沙拉醬、寵物食品或?qū)櫸镲?br> 6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5之一的用途，其中所述產(chǎn)品是片劑、膠囊劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、粉劑、凝膠劑、乳膏、干燥口服補(bǔ)充劑、濕潤(rùn)口服補(bǔ)充劑、沐浴露、牙膏、洗發(fā)劑、 漱口水、唇膏、或個(gè)人衛(wèi)生產(chǎn)品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的用途，其中所述初級(jí)組合物包含枸杞親脂和/或親水生物 活性組分的至少一部分，其中所述親脂和/或親水生物活性組分優(yōu)選選自脂質(zhì)、生物堿、蛋 白質(zhì)、糖類、糖蛋白、類胡蘿卜素、多酚化合物如黃酮類化合物、維生素、礦物質(zhì)或其混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述糖蛋白選自阿拉伯半乳聚糖蛋白，尤其枸杞多糖 和能夠由P-葡糖基Yariv試劑檢測(cè)的大分子，或其混合物；和/或其中黃 >酮類化合物選自 黃酮例如5， 7， 4'-三羥黃酮，毛地黃黃酮，或香葉木素，黃酮醇例如櫟精，楊梅黃酮，4' ， 5， 7_三羥黃酮醇，黃烷酮，花色素例如花葵素，二甲翠雀素，或異黃酮例如染料木黃酮，大豆黃 素，或其混合物；和/或其中類胡蘿卜素選自胡蘿卜素和葉黃素例如，番茄紅素，胡蘿卜素， 六氫番茄紅素，八氫番茄紅素，角黃素，P _隱黃素，辣椒紅，葉黃素，玉米黃素，或那些脂肪 酸酯的形式，或其混合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l-8之一的用途，其中所述乳來自動(dòng)物或植物來源，或其混合物；優(yōu)選 地，乳是牛奶、駱駝奶、水牛奶、山羊奶、綿羊奶、植物乳，尤其是大豆乳或其混合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l-9之一的用途，其中通過包括如下步驟的方法得到初級(jí)組合物i) 在乳或包含乳蛋白的液體介質(zhì)中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維以獲得水 性懸浮液iii)任選巴氏滅菌獲得的懸浮液，iv)任選在加工過程中加入合成的或天然的生 物活性組分，v)和進(jìn)一步任選干燥該懸浮液以得到粉末。
11. 根據(jù)權(quán)利要求i-io之一的用途，其中炎癥選自急性炎癥例如膿毒癥，感染，燒傷，和慢性炎癥例如炎性腸病，克隆病，潰瘍性結(jié)腸炎，壞死性腸結(jié)腸炎，皮膚炎癥，例如紫外線 或化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚炎癥，濕疹，反應(yīng)性皮膚，銀屑病，白癜風(fēng)，痤瘡，炎性腸病綜合征，肝臟 炎癥，酒精性肝硬化，變態(tài)反應(yīng)，特異反應(yīng)性，骨炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡， Gougerot-Sjogren' s綜合征，賴特爾綜合征，脊髓灰質(zhì)炎，皮肌炎，甲狀腺炎，巴澤多病，橋 本病，I型糖尿病，艾迪生病，自身免疫性肝炎，乳糜瀉，比爾默病，多發(fā)性硬化，肌無力，腦脊 髓炎，眼炎癥，肥胖相關(guān)的炎癥，年齡相關(guān)的輕度炎癥，Blau' s綜合征，阿爾茨海默氏病，心 血管疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，代謝綜合征，牙齦炎和paronditis。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的用途，其中所述產(chǎn)品同時(shí)加強(qiáng)免疫系統(tǒng)、改善受損的免 疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性的體液免疫應(yīng)答，和/或增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的用途，其中所述產(chǎn)品設(shè)計(jì)由嬰兒、兒童、青少年、成年人 和/或老年人使用。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13之一的用途，其中所述產(chǎn)品設(shè)計(jì)用于維持免疫功能和/或減輕 炎癥狀態(tài)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l-14之一的用途，用于治療或預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及炎癥領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及天然組合物在制備治療或預(yù)防炎癥的產(chǎn)品中的用途。例如，枸杞提取物被證實(shí)具有抗炎特性。本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及包含枸杞或其一部分的初級(jí)組合物在制備治療或預(yù)防炎癥的產(chǎn)品中的用途。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101795699SQ200880106070
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者D·菲利普, K·維達(dá)爾, O·巴萊沃爾, P·比舍利, S·布蘭-斯佩里森, 王軍寬 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司