專利名稱：：偶聯(lián)物純化的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于疫苗領域并涉及一種純化糖抗原_載體蛋白偶聯(lián)物的新方法。
背景技術：
：在過去20年中，開發(fā)了包含細菌莢膜多糖與蛋白質載體相偶聯(lián)的偶聯(lián)疫苗。例子包括b型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(Hib)偶聯(lián)疫苗[1]以及針對肺炎鏈球菌[2]和腦膜炎奈瑟球菌血清型C(MenC)[3]的偶聯(lián)疫苗。已經批準的疫苗中所用的載體蛋白包括破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、白喉毒素的無毒CRM197突變體和腦膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜蛋白復合物。理想的是，載體蛋白應能誘導對偶聯(lián)的B-細胞表位(如多糖)的強大輔助作用，而不誘導對其本身的抗體應答。采用在大多數(shù)II類主要組織相容性復合物分子結合時有免疫原性的通用表位是達到此目的的一種方法[4]。已在TT和其它蛋白中鑒定到這種表位。或者，可利用多表位載體蛋白，如參考文獻5所述?！┨强乖c載體蛋白偶聯(lián)，應純化反應混合物以去除未與糖蛋白偶聯(lián)的游離載體蛋白和未偶聯(lián)的糖。本領域已知多種純化游離和偶聯(lián)的載體蛋白的方法，包括疏水色譜法、切向超濾法、透析法等[也可參見參考文獻6和7等]。然而，這些方法存在各種缺陷。例如，參考文獻8提出采用凝膠過濾來純化GBS偶聯(lián)物。然而，該方法需要大量凝膠過濾基質并且難以大規(guī)模生產應用。另一種方法涉及超濾，例如采用lOOKDa膜的切線流透析，該方法只有當糖抗原具有適當?shù)母叻肿恿繒r才有效，因而不適用于GBS血清型III偶聯(lián)物或糖蛋白小于100kDa的其他偶聯(lián)物。此外，超濾產率低下并可導致偶聯(lián)物應激。因此，本發(fā)明的目的是提供一種從諸如未偶聯(lián)的載體蛋白和未偶聯(lián)的糖等雜質純化糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的改良方法。
發(fā)明內容已發(fā)現(xiàn)糖抗原與載體蛋白的偶聯(lián)可改變載體蛋白對羥基磷灰石的結合親和力。因此，在包含糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、未偶聯(lián)的載體蛋白和其他蛋白質的混合物中，污染物/未偶聯(lián)的蛋白質與羥基磷灰石結合而糖抗原_載體蛋白偶聯(lián)物基本上不發(fā)生結合。因此，本發(fā)明提供了一種從混合物純化糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的方法，該方法包括使所述混合物與羥基磷灰石接觸并收集游離的糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。未結合的載體蛋白可任選地從羥基磷灰石洗脫，在偶聯(lián)反應中重復使用、進行分析或棄去?；旌衔锟砂强乖?載體蛋白偶聯(lián)物和未偶聯(lián)的蛋白質。然而，混合物也可受到其他蛋白質的污染。本發(fā)明方法能夠去除任何污染的蛋白質，從而提供純化的糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種制備藥物組合物的方法，該方法包括以下步驟i)使包含糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和游離載體蛋白的混合物與羥基磷灰石相接觸，ii)收集游離的糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，和iii)將步驟ii)獲得的所述糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物與藥學上可接受的稀釋劑或載體混合。本發(fā)明還提供了由所述方法制備的組合物。載體蛋白載體蛋白可選自本領域已知的那些載體蛋白，例如破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)或其衍生物，如白喉毒素的無毒CRM197突變體[9-11]。其他合適的載體蛋白包括，腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[12]、合成肽[13、14]、熱激蛋白[15，16]、百日咳蛋白[17，18]、細胞因子[19]、淋巴因子[19]、激素[19]、生長因子[19]、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細胞表位的人造蛋白[20]如N19[21]、流感嗜血桿菌的D蛋白[22-24]、肺炎球菌溶血素[25]、肺炎球菌表面蛋白PspA[26]、鐵攝取蛋白[27]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[28]等等。然而，可使用任何載體蛋白，只要它能夠結合羥基磷灰石。白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)和CRM197是目前兒科疫苗中使用的主要載體，例如來自GSK的HIBERIX和MENIT0RIX偶聯(lián)物使用TT作為載體，HIBTITER產品使用CRM197，PREVENAR中的肺炎球菌偶聯(lián)物使用CRM197，MENJUGATE和MENINGITEC產品使用CRM197，NEISVAC-C使用TT?；蛘?，可使用多表位載體蛋白，如參考文獻5所述。這些多表位載體包括N19。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的載體蛋白是CRM197。糖抗原優(yōu)選地，本發(fā)明純化的組合物中偶聯(lián)于載體蛋白的糖抗原是細菌糖，具體是細菌莢膜糖。也可使用LPS或LOS作為抗原。優(yōu)選地，本發(fā)明糖抗原的分子量為5KDa以上，更優(yōu)選8KDa以上(即10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250KDa以上)。本發(fā)明組合物中可包含的細菌莢膜糖的例子包括腦膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、W135和/或Y)、月市炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尤其是4、6B、9V、14、18C、19F禾P/或23F)、無乳鏈球菌(Str印tococcusagalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和/或VIII型，如參考文獻29-32中所述的糖抗原)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(可分型菌株a、b、c、d、e和/或f)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(如血清型5禾口8)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(E.faecium)(三糖重復)、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)、克雷伯菌(Klebsiellas卯.)等的莢膜糖。本發(fā)明組合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Candidaalbicans)的葡聚糖)和真菌莢膜糖，如新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)莢膜的莢膜糖?？砂牧硪环N糖是釀膿鏈球菌群特異性抗原(GAS糖)。LPS和LOS的例子包括從綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01、05血清型分離的LPS。腦膜炎奈瑟球菌血清群A(MenA)莢膜是(a1—6)-連接的N_乙?；鵢D_甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分0-乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清群B(MenB)莢膜是(a2—8)-連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清群C(MenC)莢膜糖是(a2—9)-連接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可變的0-乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清群W135糖是含有唾液酸_半乳糖二糖單元[—4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Gal-a-(l—]的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可變的0_乙?；痆33]。腦膜炎奈瑟球菌血清群Y糖類似于血清群W135糖，除了二糖重復單元用葡萄糖代替了半乳糖[—4)_D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—]。它也在唾液酸的7位和9位含有可變的0-乙?；?。優(yōu)選地，糖抗原來自GBS，血清型Ia，lb和/或III。還優(yōu)選是來自其他GBS血清型的糖抗原，例如血清型n、iv、v、vi、vn和/或vni。具體說，糖抗原可以是來自這些血清型的無乳鏈球菌莢膜糖，與細菌肽聚糖主鏈中的GlcNAc殘基共價相連。不同血清型的莢膜多糖化學相關，但抗原性顯著不同。所有GBS莢膜多糖共有以下三糖核心P-D-GlcpNAc(1—3)P-D-Galp(1—4)P-D-Glcp各種GBS血清型的區(qū)別在于修飾其核心的方式。例如，血清型la和III的區(qū)別在于，核心中采用GlcNAc(la)或Gal(III)來連接連續(xù)的三糖核心(圖1)。血清型Ia和lb的核心中都是[a-D-NeupNAc(2—3)P-D-Galp-(1—]二糖與GlcNAc相連，只是連接鍵是1—4(la)或1—3(lb)。GBS-相關疾病主要是由血清型Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII和VIII引起的，超過90%是由以下五種血清型引起的la、Ib、II、III和V。本發(fā)明優(yōu)選使用的糖來自這五種血清型中的一種。如圖2所示，這五種血清型各自的莢膜糖包括(a)末端N-乙?；?神經氨酸(NeuNAc)殘基(一般稱為唾液酸)，在所有情況下2—3連接至半乳糖殘基；和(b)三糖核心內的N-乙?；?葡糖胺殘基(GlcNAc)。載體蛋白可以如參考文獻34所述偶聯(lián)于糖抗原的混合物。載體蛋白可偶聯(lián)于一種糖或者可偶聯(lián)于多種不同種類的糖。在本發(fā)明中，優(yōu)選載體蛋白偶聯(lián)于2、3、4或更多種不同的糖抗原。所述抗原可來自抗原性相同或不同的病原體。因此，載體蛋白可以是單價，其中每個載體蛋白分子偶聯(lián)于一種細菌血清群的糖，或者可以是多價，其中兩個或更多個(例如2、3、4、5、6或更多)抗原性不同的糖抗原偶聯(lián)于同一載體蛋白分子(例如，參見參考文獻34)。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清群的糖抗原，例如該組合物可包含血清群A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選這些組合物包含血清群C和Y的糖。其它優(yōu)選組合物包含血清群C、W135和Y的糖。尤其優(yōu)選的組合物包含血清群A、C、W135和Y的糖。在其他組合中，載體蛋白可偶聯(lián)于Hib糖偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎奈瑟球菌血清群，優(yōu)選一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清群的糖。例如，載體蛋白可偶聯(lián)于Hib糖和腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和Y中一種或多種(即1、2、3或4種)的糖。本發(fā)明也提供上述病原體的糖的其它組合。莢膜糖抗原的制備制備莢膜糖抗原的方法是熟知的。例如，參考文獻35描述了腦膜炎奈瑟球菌糖抗原的制備。參考文獻36第14章描述了流感嗜血桿菌糖抗原的制備?，F(xiàn)有技術描述了肺炎鏈球菌糖抗原和偶聯(lián)物的制備。例如，PrevenarTM是一種7-價肺炎球菌偶聯(lián)疫苗。參考文獻37、38和39中詳細描述了無乳鏈球菌糖抗原的制備方法。參考文獻40中詳細描述了無乳鏈球菌糖抗原的優(yōu)選制備方法?？捎靡阎夹g純化莢膜糖，如本文引用的幾篇參考文獻所述。糖抗原可以經化學修飾。例如，可修飾它們，用封閉基團取代一個或多個羥基。這種方法對腦膜炎球菌血清群A特別有用，其中用封閉基團取代乙?；煞乐顾鈁41]。這種修飾的糖仍然是本發(fā)明意義上的血清群A糖。具體說，可修飾來自GBS的糖抗原。例如，當糖抗原是無乳鏈球菌血清型V莢膜糖時，則可以如參考文獻42所述修飾糖抗原。具體說，無乳鏈球菌血清型V莢膜糖可脫唾液酸化(圖3)。脫唾液酸化的GBS血清型V莢膜糖可通過以下方式制備在溫和酸性條件下(例如0.1M硫酸，8(TC持續(xù)60分鐘)處理純化的GBS血清型V莢膜糖或者用神經氨酸酶處理，如參考文獻42所述。一種優(yōu)選的制備脫唾液酸化GBS血清型V莢膜糖的方法是在81°C+/_3"用1M乙酸處理純化的糖2小時?？梢韵鄬τ谂c天然情況下發(fā)現(xiàn)的莢膜糖對該糖進行化學修飾。例如，糖可被去-0-乙?；?部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N_丙?；?部分或全部)等?？稍谂悸?lián)之前、期間或之后進行去乙?；?，但優(yōu)選在偶聯(lián)前進行。根據具體糖，去乙?；赡芑蚩赡懿挥绊懫涿庖咴裕鏝eisVac-CTM疫苗采用去_0_乙?；奶牵鳰enjugate是乙?；?，但這兩種疫苗都有效。可用常規(guī)實驗評價去乙?；鹊挠绊?。所用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過純化莢膜多糖的片段化(如通過水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要純化所需大小的片段。優(yōu)選進行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小于30?？赏ㄟ^離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[43]。如果進行水解，通常對水解產物進行篩分，以去除短鏈寡糖[44]?？捎酶鞣N方法，如超濾后離子交換色譜實現(xiàn)此目的。對于血清群A腦膜炎球菌，優(yōu)選去除聚合程度小于或等于約6的寡糖；對于血清群W135和Y，優(yōu)選去除聚合程度小于4左右的寡糖。載體-糖偶聯(lián)物本發(fā)明方法純化的偶聯(lián)物可包含少量游離(即未偶聯(lián))載體。當根據本發(fā)明方法純化的組合物中給定載體蛋白存在游離和偶聯(lián)形式時，以重量計，未偶聯(lián)形式優(yōu)選不多于組合物中載體蛋白總量的5%，更優(yōu)選少于2%，更優(yōu)選小于1%，優(yōu)選小于0.5%。本發(fā)明方法純化的偶聯(lián)物的糖蛋白質比例(w/w)在1:5(即蛋白質過量)和5:i(即糖過量)之間，例如比例在i:2至ij5:i之間，比例在i:i.25到i:2.5之間。如參考文獻45所述，混合物中不同的腦膜炎球菌血清群偶聯(lián)物具有不同的糖蛋白質比例，例如一種的比例為i:2到i:5之間，而另一種的比例在5:i到i:1.99之間。可采用任何合適的偶聯(lián)反應，必要時采用任何合適的接頭。優(yōu)選通過-N^基團，例如載體蛋白中賴氨酸殘基側鏈或精氨酸殘基側鏈中的_NH2基團連接糖抗原與載體。當糖具有游離醛基時，醛基可與載體中的氨基反應，通過還原胺化形成偶聯(lián)物。也可通過-SH基團，如半胱氨酸側鏈中的-SH基團連接?！阍谂悸?lián)前活化或官能化糖?；罨砂ɡ缬们杌噭┤鏑DAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[46，47等])。其它合適技術采用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見參考文獻48的引言)當糖抗原是無乳鏈球菌莢膜糖時，偶聯(lián)通常包括糖與載體蛋白的還原胺化反應，如參考文獻37所述。還原胺化涉及載體氨基酸側鏈上的胺基與糖上醛基。由于GBS莢膜糖在其天然形式中不包括醛基，在偶聯(lián)之前糖唾液酸殘基的一部分發(fā)生高碘酸鹽氧化反應產生醛基，如圖4所示[37、49]。也可采用參考文獻50所述方法實現(xiàn)無乳鏈球菌莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)。如參考文獻51所述，偶聯(lián)物的混合物可包含一種糖/蛋白直接連接鍵的偶聯(lián)物和另一種通過接頭連接的偶聯(lián)物。當使用來自不同腦膜炎球菌血清群的糖偶聯(lián)物時這種設置尤其有用，例如MenA和MenC糖可通過接頭偶聯(lián)，而MenW135和MenY糖則直接偶聯(lián)于載體蛋白。這種偶聯(lián)物可以通過本發(fā)明的方法進行純化。各偶聯(lián)物中載體的濃度(偶聯(lián)和未偶聯(lián))可以不超過100微克/毫升，例如各偶聯(lián)物中<30微克/毫升載體蛋白。一些組合物中載體的總濃度小于500微克/毫升，例如<400微克/毫升，<300微克/毫升，<200微克/毫升，<100微克/毫升，<50微克/毫升等。接頭可用任何已知方法，如參考文獻52和53所述的方法通過接頭基團進行連接。一種連接類型包括糖的還原性胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯(lián)，然后將載體蛋白偶聯(lián)于該己二酸接頭基團的另一端[54，55]。其它接頭包括B-丙酰胺基[56]、硝基苯基_乙基胺[57]、鹵代?；u化物[58]、配糖鍵[59]、6-氨基己酸[60]、ADH[61]、C4-C12部分[62]等。作為采用接頭的替代方法，可以采用直接連接。直接連接蛋白質可包括氧化多糖，然后與蛋白質進行還原性胺化，如參考文獻63和64所述。優(yōu)選包括以下步驟的方法將氨基引入糖(如用-NH2取代末端=O基團)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生后，與載體蛋白反應?？刹捎秒p功能接頭提供偶聯(lián)糖的氨基的第一基團和偶聯(lián)載體(一般偶聯(lián)于載體的氨基)的第二基團。因此，雙功能接頭中的第一基團能夠與糖的氨基(_NH2)反應。此反應一般包括氨基氫原子的親電取代。雙功能接頭中的第二基團能夠與載體的氨基反應。此反應一般也包括氨基的親電取代。糖與載體的反應涉及氨基時，優(yōu)選采用雙功能接頭X-L-X，其中兩個X基團彼此相同，可與氨基反應；L是接頭中的連接部分。優(yōu)選X基團是N-氧琥珀酰亞胺。L優(yōu)選具有式L'-L2-L'，其中L'是羰基。優(yōu)選的L2基團是含1-10個碳原子(如Q、C2、C3、C;、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直鏈烷基，如-(CH2)4-。其它X基團是與HO-L-OH組合時形成酯的基團，如降冰片烷、對硝基苯甲酸和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。用于本發(fā)明的其它雙功能接頭包括丙烯酰鹵(如丙烯酰氯)和鹵代?；u化物。通常加入摩爾過量的接頭以修飾糖。偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的分離方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等[也可參見參考文獻65和66等]。當本發(fā)明組合物包含解聚的糖時，優(yōu)選在偶聯(lián)之前進行解聚。羥基磷灰石本發(fā)明使用的羥基磷灰石((Ca5(P04)30H)2)可以是本領域已知的各種形式之一。羥基磷灰石可以是結晶、凝膠或者樹脂的形式?？蛇x地，正常結晶形式可以在高溫下燒結以調節(jié)至陶瓷形式(Bio-Rad)。優(yōu)選羥基磷灰石是凝膠形式。優(yōu)選地，將凝膠裝填到柱中，如同柱色譜純化中常用的那樣。如果羥基磷灰石是顆粒形式，優(yōu)選直徑20微米以上，優(yōu)選40微米以上，優(yōu)選80微米以上。優(yōu)選地，羥基磷灰石的動態(tài)結合容量大于10毫克溶菌酶/克(例如，12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、35、40、45、50或更高)。pH值優(yōu)選方法在pH6-8下進行，更優(yōu)選6.5-7.5，更優(yōu)選7.2。優(yōu)選pH7.2，因為這有助于確保糖的穩(wěn)定性?？墒褂帽绢I域已知的酸/堿調節(jié)PH。磷酸鹽濃度本發(fā)明方法中使用的各種磷酸鹽濃度對反應形成的偶聯(lián)物的產率有影響。優(yōu)選地，原料以及平衡/加載后洗滌的磷酸鹽濃度為50mM以下(即45、40、35、30、25、20、15、10、5或更低)。通常采用35mM的濃度。較高的濃度可導致羥基磷灰石結合的抑制。通常采用磷酸鈉緩沖劑。其它抗原如上所述，通過加入藥學上可接受的稀釋劑或載體可將本發(fā)明純化的偶聯(lián)物配制成藥物組合物。這種組合物還可包含一種或多種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種)其他抗原，例如A.細菌抗原腦膜炎奈瑟球菌腦膜炎球菌抗原可包括純化或衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清群如A、C、W135、Y和/或B的蛋白質(如參考文獻67-73中鑒定的蛋白質)，糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡[74-77]。腦膜炎球菌蛋白質抗原可選自粘附素、自身轉運蛋白、毒素、獲鐵蛋白(ironacquisitionprotein)和膜結合蛋白(優(yōu)選完整的外膜蛋白)。也參見參考文獻78-86。肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌抗原可包括肺炎鏈球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白質。蛋白抗原可選自(例如)參考文獻87-92中任一篇所鑒定的蛋白質。肺炎鏈球菌蛋白可選自聚組氨酸三聚體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25或Spl33。也參見參考文獻93-99。釀膿鏈球菌(Str印tococcuspyogenes)(A群鏈球菌)A群鏈球菌抗原可包括參考文獻100或101中鑒定的蛋白質(包括GAS40)，GASM蛋白片段的融合物(包括參考文獻102-104中描述的融合物)，纖連蛋白結合蛋白(Sfbl)，鏈球菌血紅素相關蛋白(Shp)和鏈球菌溶血素S(SagA)。也參見參考文獻100、105和106。粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis):莫拉菌抗原包括參考文獻107和108中鑒定的抗原，外膜蛋白抗原(HMW-0MP)，C-抗原和/或LPS。也可參見參考文獻109。百日咳博德特菌(Bordetellapertussis):百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，還任選與百日咳桿菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3抗原聯(lián)用。也參見參考文獻110和111。金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌抗原包括任選地偶聯(lián)于無毒重組綠膿假單胞菌外毒素A的5型和8型金黃色葡萄球菌莢膜多糖，如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白、侵襲素(殺白細胞素、激酶、透明質酸酶)、抑制吞噬細胞吞噬(莢膜、A蛋白)、類胡蘿卜素、過氧化氫酶產生的表面因子、A蛋白質、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核細胞膜的膜損傷性毒素(任選地脫毒)(溶血素、白細胞毒素、殺白細胞素)。也可參見參考文獻112。破傷風梭菌(Clostridiumtetani)(破傷風)破傷風抗原包括破傷風類毒素(TT)，優(yōu)選用作與本發(fā)明組合物結合/偶聯(lián)的載體蛋白。白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(白喉)白喉抗原包括白喉毒素或其脫毒突變體，如CRM197。此外，考慮將能夠調節(jié)、抑制ADP核糖基化或與其相關的抗原與本發(fā)明組合物組合/共同給予/偶聯(lián)。這些白喉抗原可用作載體蛋白。流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌抗原包括B型的糖抗原，或蛋白D[24]。無乳鏈球菌(B型鏈球菌)B群鏈球菌抗原包括參考文獻100和113-116中鑒定的蛋白質抗原。例如，抗原包括蛋白質GBS80、GBS104、GBS276和GBS322。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae):淋病球菌抗原包括Por蛋白(或通道蛋白)如PorB[117]，轉運結合蛋白如TbpA和TbpB[118]，不透明蛋白(如0pa)，可還原修飾的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(0MV)制劑[119]。也參見參考文獻67-69和120。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis):沙眼衣原體抗原包括衍生自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原體，引起失明)，血清型LpL2和L3(與性病淋巴肉芽腫有關)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原體抗原也可包括參考文獻116和121-123中鑒定的抗原，包括P印A(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-樣(CT242)、L7/L12(CT316)、0mcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)禾口MurG(CT761)。也可參見參考文獻124。鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)(傷寒)抗原包括莢膜多糖，優(yōu)選偶聯(lián)物(Vi，如vax-TyVi)。B.病毒抗原正粘病毒病毒抗原可衍生自正粘病毒，如流感病毒A、B和C。正粘病毒可選自以下病毒蛋白中的一種或多種，包括血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白(Ml)、膜蛋白(M2)、一種或多種轉錄酶組分(PB1、PB2和PA)。優(yōu)選抗原包括HA和NA。流感抗原可衍生自暴發(fā)流行期(一年一次)的流感毒株?；蛘撸鞲锌乖裳苌钥赡芤鸨l(fā)流行的毒株(即與目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或對禽類有致病性并可能水平傳播給人群的流感毒株，或對人有致病性的流感毒株)。副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒病毒抗原可衍生自副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。[125-127]。肺炎病毒病毒抗原可衍生自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒，小鼠肺炎病毒和火雞鼻氣管炎病毒。肺炎病毒優(yōu)選為RSV。肺炎病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基質蛋白M和M2，核衣殼蛋白N、P和L以及非結構蛋白NS1和NS2。優(yōu)選的肺炎病毒抗原包括F、G和M。參見例如，參考文獻128。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的組分。副粘病毒(paramyxovirus):病毒抗原可衍生自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎、仙臺病毒、猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒優(yōu)選PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白質血凝素-神經氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基質蛋白(M)。副粘病毒蛋白優(yōu)選包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的組分。市售腮腺炎疫苗包括單價形式或與麻疹和風疹疫苗(匪R)混合的減毒活腮腺炎病毒。麻疹病毒病毒抗原可衍生自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基質(M)。市售麻疹疫苗包括減毒的活麻疹病毒，一般與腮腺炎和風疹(匪R)聯(lián)用。腸道病毒病毒抗原可衍生自腸道病毒，如1、2或3型脊髓灰質炎病毒，l-22型和24型柯薩奇病毒A，1-6型柯薩奇病毒B，1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和腸道病毒68-71。腸道病毒優(yōu)選脊髓灰質炎病毒。腸道病毒抗原優(yōu)選選自一種或多種下述衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰質炎疫苗包括滅活的脊髓灰質炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰質炎病毒疫苗(0PV)。嗜肝RNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括滅活的HAV疫苗。[129、130]。披膜病毒病毒抗原可衍生自披膜病毒，如風疹病毒、a病毒或動脈炎病毒。優(yōu)選抗原衍生自風疹病毒(rubivirus)，如風疹病毒抗原。披膜病毒抗原可選自El、E2、E3、C、NSP-1、NSP0-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原優(yōu)選選自El、E2或E3。市售風疹疫苗含有冷適應活病毒，一般與腮腺炎和麻疹疫苗(匪R)聯(lián)用。嗜肝DNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可選自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亞單位疫苗[130,131]。乳頭狀多瘤空泡病毒抗原可衍生自乳頭狀多瘤空泡病毒，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒。乳頭瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原優(yōu)選衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可選自衣殼蛋白(Ll)和(L2)或E1-E7，或其融合物。優(yōu)選將HPV抗原制成病毒樣顆粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可選自VP1、VP2或VP3。C.抗原制劑在本發(fā)明的其它方面，提供了吸附抗原的微粒的制備方法。該方法包括(a)通過分散含有(i)水、(ii)去污劑、(iii)有機溶劑和(iv)可生物降解聚合物的混合物提供乳液，所述可生物降解的聚合物選自聚(a-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。相對于有機溶劑，該聚合物在混合物中的濃度一般約為1%-30%，而混合物中去污劑-聚合物的重量比一般約為o.ooooi:i-o.i:i(更一般約為o.oooi:i-o.i:i，約為o.ooi:i-o.i:1，或約為o.005:i-o.i:i);(b)除去乳液中的有機溶劑；和(c)使抗原吸附于微粒表面上。在一些實施方式中，相對于有機溶劑，可生物降解聚合物的濃度約為3%-10%。本文使用的微粒由可滅菌的無毒并且可生物降解的材料形成。這些材料包括但不限于聚(a_羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。優(yōu)選地，本發(fā)明所用微粒衍生自聚(a-羥酸)，具體說，衍生自聚(交酯)("PLA")或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(〃PLG"或〃PLGA〃)，或D，L-丙交酯和己內酯的共聚物。該微?？裳苌跃哂懈鞣N分子量的各種聚合物原料，在共聚物如各種丙交酯乙交酯比例的PLG情況下，選擇是主要問題，部分取決于共同給予的大分子。下面更全面地討論這些參數(shù)。醫(yī)學方法和應用—旦配制好后，本發(fā)明組合物可直接給予對象。治療對象可以是動物；特別是，可治療人類對象?？蓪⒃摻M合物配制成專門用于接種兒童和青少年的疫苗?？赏ㄟ^全身和/或粘膜途徑給予它們?！愕?，將該組合物制備成溶液或懸液形式的注射劑；還可配制適合在注射前用液體載體溶解或懸浮的固體形式。通常通過胃腸道外(如注射，皮下、腹膜內、靜脈內或肌肉內，或者遞送至組織間隙)直接遞送該組合物。也可將該組合物給予病灶。其它給藥方式包括口服給藥和肺給藥、栓劑和透皮或經皮施用(參見例如參考文獻132)，針注射和無針注射。給藥治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。本發(fā)明疫苗優(yōu)選為無菌疫苗。它們優(yōu)選無熱原。優(yōu)選用緩沖液使(例如)pH6-pH8，通常約為pH7。當疫苗包含氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選采用組氨酸緩沖液[133]。本發(fā)明疫苗可包含低水平(如<0.01%)去污劑(如吐溫，如吐溫80)。本發(fā)明疫苗可含有(如)約15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是在需要凍干或者已經凍干的情況下。可憑經驗評估各抗原的最佳劑量。然而通常，本發(fā)明方法純化的偶聯(lián)物抗原的給藥劑量為每劑量各種糖0.1-100微克，典型劑量體積為0.5毫升。一般劑量為每劑每種糖5-20微克。以偶合物中的糖計量這些值。本發(fā)明疫苗可以是預防性(即預防感染)或治療性(即在感染后治療疾病)疫苗，但一般是預防性疫苗。本發(fā)明提供了用作藥物的本發(fā)明方法純化的偶聯(lián)物。本發(fā)明也提供了誘導患者產生免疫應答的方法，所述方法包括給予患者本發(fā)明偶聯(lián)物。免疫應答優(yōu)選能產生抵抗腦膜炎球菌病、肺炎球菌病或乙型流感嗜血桿菌的保護力，包括體液免疫應答和/或細胞免疫應答?；颊邇?yōu)選兒童。在已接受腦膜炎球菌、肺炎球菌或乙型流感嗜血桿菌初免的患者中該方法可產生加強應答。在其他實施方式中，免疫應答是針對無乳鏈球菌的保護性免疫應答，可包括體液免疫應答和/或細胞免疫應答?；颊邇?yōu)選是兒童、新生兒或懷孕婦女。在已接受無乳鏈球菌初免的患者中該方法可產生加強應答。本發(fā)明也提供本發(fā)明偶聯(lián)物在制造誘導患者產生免疫應答的藥物中的應用，其中所述患者已用與偶聯(lián)于載體的組合物所含糖抗原不同的糖抗原預先治療。本發(fā)明也提供了偶聯(lián)物在制造誘導患者產生免疫應答的藥物中的應用，其中所述12患者已用與偶聯(lián)不同載體的組合物所含抗原相同的糖抗原預先治療。所述藥物優(yōu)選為免疫原性組合物(如疫苗)。該藥物優(yōu)選用于預防和/或治療奈瑟球菌(如腦膜炎、敗血癥、淋病等)、流感嗜血桿菌(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌(如腦膜炎、敗血癥、肺炎等)引起的疾病。優(yōu)選預防和/或治療細菌性腦膜炎。在其它實施方式中，使用藥物來預防和/或治療無乳鏈球菌導致的疾病。因此也優(yōu)選預防和/或治療這種疾病。可用標準動物模型檢測這些疫苗(例如參見參考文獻134)。佐劑本發(fā)明偶聯(lián)物可與其它免疫調節(jié)劑聯(lián)用。具體說，組合物通常含有佐劑?？捎糜诒景l(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A.含礦物質的組合物本發(fā)明中適合用作佐劑的含有礦物質的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和f丐鹽。這種礦物質組合物可包括礦物鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如，參見參考文獻135的第8和9章]，或不同無機化合物的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選地含有過量磷酸鹽)，化合物可采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選吸附于該鹽。也可將含有礦物質的組合物制成金屬鹽的顆粒[136]。本發(fā)明組合物中可包含鋁鹽，A1"劑量為每劑量0.2-1.0mg。磷酸鋁佐劑一般是無定形羥基磷酸鋁，P04/A1摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml?？刹捎玫蛣┝苛姿徜X吸附，如50-100iigAl"/偶聯(lián)物/劑。采用磷酸鋁并且不需要使抗原吸附于佐劑時，在溶液中包含游離的磷酸根離子(如采用磷酸鹽緩沖液)比較有利。B.油乳劑適合用作本發(fā)明偶聯(lián)物作為佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59(5X鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%Span85，用微流化床配制成亞微米顆粒)[參考文獻135第10章；也參見參考文獻137-139]。將MF59用作FLUAD流感病毒三價亞單位疫苗的佐劑。MF59乳液宜包含擰檬酸根離子，如lOmM擰檬酸鈉緩沖液。用于組合物的尤其優(yōu)選的佐劑是亞微米水包油乳劑。本文所用的優(yōu)選亞微米水包油乳劑是任選地含有各種含量的MTP-PE鯊烯/水乳劑，如含有4-5%w/v鯊烯、0.25-1.0%w/v吐溫80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)和/或0.25-1.0%Span85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任選的N-乙酰基胞壁?；?1-丙氨?；?D-異谷氨?；?1-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)_乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑。參考文獻137和140-141詳細描述了亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫剌激劑(如胞壁酰肽)在本發(fā)明組合物中的應用?？刹捎悯徬?、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有司盤85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選《l，因為這能使乳液更穩(wěn)定。可通過下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2X溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-a生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴?？刹捎煤徬?、生育酚和Triton去污劑(如TritonX-100)的乳液?？刹捎煤徬?、聚山梨酸酯80和泊洛沙姆401("PluronicL121")的乳液?？梢杂昧姿猁}緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與用〃SAF-I"佐劑(0.05-1%Thr-MDP、5X鯊烯、2.5%PluronicL121和0.2X聚山梨酸酯80)[142]配的蘇氨酰基-MDP—起使用。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用〃AF"佐劑(5%鯊烯、1.25%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)[143]。優(yōu)選微流體化。也可用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)作為佐劑。C.皂苷制劑[參考文獻135的第22章]皂苷制劑也可用作本發(fā)明偶聯(lián)物的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的分離自皂樹(Quillaiasaponaria)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥蔬獎)、滿天星(Gypsophillapaniculata)(婚紗花)禾口月巴阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質制劑如ISCOM。QS21以商標Sti咖lonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見參考文獻144。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[145]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫剌激復合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻135的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻145-147中進一步描述了ISC0M。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[148]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻149和150。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結構通常包含一種或多種任選地與磷脂組合或一起配制的病毒蛋白。病毒體和顆粒通常無病原性、不能復制，通常不含任何天然病毒基因組?？捎弥亟M方法產生或從全病毒分離得到這種病毒蛋白。這些適用于病毒體或VLP中的病毒蛋白包括來源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉錄轉座子Ty蛋白pl)的蛋白。VLP在參考文獻151-156中有進一步描述。病毒體在(例如)參考文獻157中有進一步描述。E.細菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫剌激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷酰脂質A(MPL)和3_0_脫?；鵐PL(3dMPL)。3dMPL是3脫-0-酰基單磷酰脂質A與4、5或6酰化鏈的混合物。3脫-0-?；鶈瘟柞Ｖ|A的優(yōu)選"小顆粒"形式見參考文獻158中所述。3dMPL的這種"小顆粒"小到足以經O.22iim膜過濾除菌[158]。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質A模擬物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物如RC529[159，160]。脂質A衍生物包括大腸桿菌(Escherichiacoli)的脂質A衍生物，如0M_174。(例如)參考文獻161和162中描述了0M-174。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫剌激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結構或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫剌激作用。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻163、164和165公開了可能的類似取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻166-171中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[172]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，例如CpG-A0DN，或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-B0DN。參考文獻173-175中討論了CpG-A禾PCpG-BODN。CpG優(yōu)選是CpG-AODN。優(yōu)選構建CpG寡核苷酸時使其5'端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3'端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻172和176-178。細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選該蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT")、霍亂("CT")或百日咳("PT")菌。參考文獻179中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻180中描述了將其用作胃腸道外佐劑。毒素和類毒素優(yōu)選包含A和B亞單位的全毒素形式。優(yōu)選A亞單位含有脫毒突變；B亞單位優(yōu)選不突變。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT_G192。參考文獻181-188中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。優(yōu)選根據參考文獻189中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對比對氨基酸取代基編號，該參考文獻的全部內容特別納入本文作為參考。式I、II或III的化合物或其鹽也可用作佐劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>如參考文獻190所述，例如'ER803058'、'ER803732'、'ER804059，、'ER804442，、'ER804680，、'ER804764'、ER803022或ER804053'、ER804058'、ER804057'如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>F.人免疫調節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調節(jié)劑包括細胞因子，例如白介素(例如IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL_7、IL-12[191]、IL_23、IL-27[192]等)[193]、干擾素(例如干擾素-Y)、巨噬細胞集落剌激因子、腫瘤壞死因子和巨噬細胞炎性蛋白-la(MIP-Ia)和MIP-1P[194]。G.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質酸微球[195]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[196]。H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即直徑約100納米到約150微米，更優(yōu)選直徑約200納米到約30微米，最優(yōu)選地直徑約500納米到約10微米的顆粒)由可生物降解性無毒材料(例如聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內酯等)，優(yōu)選聚(丙交酯-乙交酯共聚物)形成，并任選經處理而具有帶負電荷表面(例如用SDS處理)或帶正電荷表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。I.脂質體(參考文獻135的第13和14章)。適合用作佐劑的脂質體制劑的例子見參考文獻197-199所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適合用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[200]。這種制劑還包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇[201]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[202]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯_8_硬脂?；?、聚氧乙烯_4_月桂醚、聚氧乙烯_35_月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP)參考文獻203和加4中描述了PCPP(聚[二(羧基苯氧基)磷腈]((poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene)制劑。L.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油_3_羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。M.咪唑并喹諾酮化合物。適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物〃瑞喹莫德3M〃)，見參考文獻205和206所述。N.縮氨基硫脲化合物縮氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻207所述內容?？s氨基硫脲在剌激人外周血單核的細胞產生細胞因子如TNF-a方面特別有效。0.色胺酮化合物色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻208所述內容。色胺酮化合物在剌激人外周血單核的細胞產生細胞因子如TNF-a方面尤其有效。P.核苷類似物各種核苷類似物可用作佐劑，如(a)埃索他賓(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜_8-氧代鳥苷)及其前藥<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(例如，(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻209-211所述的化合物;(f)具有下式的化合物式中&和R2各自獨立地是氫、鹵素、_NRaRb、-OH、C卜6烷氧基、取代的C卜6烷氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、(V6烷基或取代的C卜6烷基；R3不存在，或者是H、(V6烷基、取代的(V6烷基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R4和R5各自獨立地是氫、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(0)-Rd、C卜6烷基、取代的(V6烷基，或結合在一起形成5元環(huán)，如R4—5:X2R9R4.-5烷基)、在一所示的化學鍵處實現(xiàn)結合，和X2各自獨立地是N、C、0或S;R8是氫、鹵素、-OH、(V6烷基丄2—6烯基丄2—6炔基、-0H、-NRaRb、-(CH2)n-0-Re、-0-(Q-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是氫、C卜6烷基、取代的C卜6烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中R9a是R,.9a在一所示的化學鍵處實現(xiàn)結合，R1Q和Rn各自獨立地是氫、鹵素、C卜6烷氧基、取代的(V6烷氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自獨立地是氫、(V6烷基、取代的(V6烷基、-C(0)Rd、C6—1Q芳基；Rc各自獨立地是氫、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、C卜6烷基或取代的C卜6烷基；Rd各自獨立地是氫、鹵素、C卜e烷基、取代的(Ve烷基、C卜e烷氧基、取代的Q基、-NH2、-NH((V6烷基)、-NH(取代的C卜6烷基)、-N(Q—6烷基)2、-N(取代的6烷基)C6—1Q芳基或雜環(huán)基；Re各自獨立地是氫、Q基或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨立地是氫、C卜6烷基、取代的Q三磷酸酯基；n各自獨立地是0、l、2或3;p各自獨立地是0、l或2;或者或(g)(a)-(f)中任一項的藥學上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項的互變異構體，烷基、取代的6烷基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、雜環(huán)烷基、-c(o)iv磷酸酯基.二磷酸酯基或或互變異構體的藥學上可接受的鹽。Q.連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質含有連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質的佐劑包括TLR4拮抗劑E5564[212，213]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>0192]0193]0194]0195]0196]0197]0198]0199]0200]0201]0202]胺0203]0204]0205]乙醇0206]乙酯；0207]0208]二胺0209]4CHdO'(H0)20P0'、R.小分子免疫增強劑(SMIP)SMIP包括N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，4-二胺N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，4-二胺N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉-2N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉-2二胺二胺N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-111-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二,4-,4-1_(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺2_[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]2_[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸4-N2-1-(2-甲基丙基)-l，3-二氫-2H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-酮；丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-2，丁基-N2-二胺-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，'-c]喹啉-2，4-0210]N2-4-二胺0211]N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺1_{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2_甲基丙_2-醇l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_1_基]_2_甲基丙_2_醇N4，N4-二節(jié)基-l-(2-甲氧基_2_甲基丙基)_N2_丙基_1H_咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺。S.蛋白質體—種佐劑是由第一種革蘭陰性菌制備的外膜蛋白蛋白質體制劑與衍生自第二種革蘭陰性菌脂多糖制劑的組合，其中外膜蛋白蛋白質體和脂多糖制劑形成穩(wěn)定的非共價佐劑復合物。這類復合物包括〃IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖組成的復合物。已將它們用作流感疫苗佐劑[214]。T.其它佐劑參考文獻135和215中公開了用作免疫剌激劑的其它物質。其它有用的佐劑物質包括，甲基肌苷5'-單磷酸酯("MMP")[216]。多聚羥化吡咯雙烷類化合物[217]，如下式化合物CHzOH式中，R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的?；?、烷基(如環(huán)烷基)、烯基、炔基和芳基，或其藥學上可接受的鹽或衍生物。例子包括但不限于木麻黃(casuarine)、木麻黃_6_a_D_吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃、7_表-木麻黃、3，7_二表-木麻黃等。y菊糖[218]或其衍生物，如阿爾加穆林(algammulin)。參考文獻219所述化合物。參考文獻220所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、噴哚二酮化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[221，222]、水合酞酰胺(hydr即thalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、異噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[223]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和噴哚化合物[224]。洛索立賓(Loxoribine)(7-烯丙基_8_氧代鳥苷)[225]。陽離子脂質與(通常為中性)共脂質(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基_溴化丙銨_二植?；字乙醇胺(〃Vaxfectin")或氨基丙基_二甲基_雙十二烷基氧基_溴化丙銨_二油?；字乙醇胺(〃GAP-DLRIE:DOPE〃)的制齊U。優(yōu)選含有(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(順-9-四癸烯氧基)-l-丙銨鹽的制劑[226]。本發(fā)明也可包括以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，以下組合可用作本發(fā)明佐劑組合物(l)皂苷和水包油乳劑[227];(2)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生20物(如3dMPL)[228];(3)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任選+固醇)[229];(5)3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[230];(6)SAF，含有10X鯊烯、0.4^吐溫8()TM、5^普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產生粒度較大的乳液。(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem)，含有2X鯊烯、0.2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或細胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL);和(9)一種或多種無機鹽(如鋁鹽)+免疫剌激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。定義術語"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質，例如X+Y。與數(shù)值x相關的術語"約"表示，例如x士10X。可認為本文中所有數(shù)值都由〃約〃限定，除非文中另有說明。術語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。附圖簡述圖1顯示了GBS血清型Ia和III中重復結構之間的差異。圖2顯示了GBS血清型Ia、Ib、II、III和V中莢膜糖的重復結構。圖3顯示了來自GBS血清型V的莢膜多糖脫唾液酸化形式的重復結構。圖4顯示了末端唾液酸殘基的高碘酸鹽氧化反應。圖5和6分別顯示了用I型和II型羥基磷灰石進行偶聯(lián)物純化的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)。列關鍵點l-CRM、3-粗品偶聯(lián)物、5-流出相(偶聯(lián)物)、7-洗脫相(未偶聯(lián)CRM)。圖7和8分別顯示了I型和II型羥基磷灰石的HPLC輸出。第一峰是偶聯(lián)的CRM197-GBS血清型III，第二峰是未偶聯(lián)的CRM197。本發(fā)明實施方式實施例1偶聯(lián)物制備來自無乳鏈球菌血清型Ia、Ib和III的純化莢膜多糖通過高碘酸鹽氧化反應然后是還原胺化而與載體蛋白偶聯(lián)。載體蛋白是CRM197。比較超濾純化與采用羥基磷灰石的純化用超濾(使用lOOKDa膜進行切線流透析)或羥基磷灰石樹脂(I型或II型80微米樹脂，Bio-Rad)純化偶聯(lián)物。I型HA樹脂具有較高的蛋白質結合容量并且對于酸性蛋白質的容量更佳，而II型樹脂的蛋白質結合容量較低但對某些蛋白質的分辨率較佳。CRM197的分子量約為60KDa。雖然采用100KDa膜進行超濾能夠從偶聯(lián)/未偶聯(lián)CRM197混合物分離高分子量多糖的偶聯(lián)物(例如約150KDa的血清型Ia偶聯(lián)物，導致偶聯(lián)物總質量約210KDa)，但不能用于偶聯(lián)和未偶聯(lián)的載體蛋白的分子質量之間差異不顯著的分子量較低的偶聯(lián)物(例如血清型III偶聯(lián)物)。相反，初步實驗表明可采用I型和II型羥基磷灰石樹脂從未偶聯(lián)的CRM197純化其偶聯(lián)形式。未偶聯(lián)的CRM197結合于樹脂，偶聯(lián)蛋白因偶聯(lián)糖的保護作用而存在于流出相中。測試羥基磷灰石純化的各種參數(shù)pH值用羥基磷灰石進行色譜分離通常采用pH6.8。然而，在本實驗中采用pH7.2以確保糖的穩(wěn)定性。未發(fā)現(xiàn)這種PH的改變對色譜效率產生影響。磷酸鹽濃度測試了不同的磷酸鹽濃度以確定其對純化偶聯(lián)物的產率的影響。確定當原料和平衡/加載后洗滌緩沖液(pH7.2)中的磷酸鹽濃度《35mM時，CRM197完全結合于羥基磷灰石柱。在這種濃度下，總能在柱流出相中完全回收CRM197-Ia/Ib偶聯(lián)物，而CRM197-I11偶聯(lián)物的回收產率為80-85%。洗滌體積(加載后)由于與羥基磷灰石的相互作用，加載期間并非所有的偶聯(lián)物都能立即從柱子流出。然而發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽度30mM時，用不到1.5個柱體積(CV)的加載后洗滌液即可使所有偶聯(lián)物流出。因此，加載體積約為0.6CV，收集隨后的包含偶聯(lián)物的0.4-2.2CV。柱加載(容量)磷酸鹽濃度35mM時，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石能夠完全結合CRM197，總CRM:柱體積之比約為每毫升樹脂小于2.5毫克CRM。為了減少流出相中存在未偶聯(lián)CRM197的幾率，采用較低的CRM:柱體積，每毫升樹脂約1.5毫克CRM。前導工藝上述實驗之后，采用以下參數(shù)設定試驗工藝柱體積=4L(可接受的范圍>3L)。選定柱的直徑為20厘米(相應的高度約為11士2.5厘米)。柱沖洗與平衡5CV的400mM磷酸鈉pH6.8緩沖液以80厘米/小時(419毫升/分鐘)的速率加上5CV的35mM磷酸鈉pH7.2緩沖液以80厘米/小時的速率。柱加載與產物收集加載產物(80厘米/小時)，然后用平衡緩沖液洗滌；廢棄的流出液一直到0.4CV，收集產物一直到2.2CV，然后棄去一直到2.9CV。用2CV400mM磷酸鈉pH6.8緩沖液以80厘米/小時的流速洗脫柱，收集結合于柱的未偶聯(lián)的CRM(該餾分與所述工藝無關)。I型羥基磷灰石與II型羥基磷灰石的比較發(fā)現(xiàn)I型和II型羥基磷灰石能夠以相等的效率從混合物純化偶聯(lián)物。圖5和6分別顯示了I型和II型羥基磷灰石的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。這些凝膠結果清楚表明，流出相中不存在未偶聯(lián)的CRM197(道5)。正如預期的那樣，在洗脫相中發(fā)現(xiàn)未偶聯(lián)的CRM197(道7)。采用SE-HPLC分析原料(偶聯(lián)和未偶聯(lián)CRM197的混合物)、流出相和洗脫相。圖7和8分別顯示了I型和II型樹脂HPLC過程的圖像。各圖顯示了與純化的偶聯(lián)物和未偶聯(lián)CRM197相關的兩個不同的峰。在圖7中，雙重峰是原料，第一峰是流出相(純化的偶聯(lián)物)，第二峰是從樹脂洗脫的物質(未偶聯(lián)CRM197)。在圖8中，第一峰是流出相(純化的偶聯(lián)物)，第二峰是從樹脂洗脫的物質(未偶聯(lián)CRM197)。實施例2偶聯(lián)物制備22來自無乳鏈球菌血清型V的純化脫唾液酸化莢膜多糖通過高碘酸鹽氧化反應然后是還原胺化而與載體蛋白偶聯(lián)。載體蛋白是CRM197。測試羥基磷灰石純化的柱加載參數(shù)柱加載磷酸鹽濃度35mM時，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石能夠完全結合CRM197，總CRM:柱體積之比約為每毫升樹脂小于2.5毫克CRM。為了減少流動相中存在未偶聯(lián)CRM197的幾率，采用較低的CRM:柱體積，每毫升樹脂約1.5毫克CRM。測試工藝根據該實驗，采用以下參數(shù)設立一些測試工藝<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>分析以下測試工藝<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>[5]W099/55730[6]Lei等(2000)DevBiol(Basel)103:259-264.[7]W000/38711;美國專利6，146，902.[8]W094/06467.[9]匿名(2002年1月)ResearchDisclosure,453077.[10]Anderson(1983)InfectImmun39(1):233-238.[ll]Anderson等(1985)JClinInvest76(1):52-59.[12]EP-A-0372501.[13]EP-A_0378881.[14]EP_A0427347.[15]W093/17712[16]W094/03208.[17]W098/58668.[18]EPA0471177.[19]W091/01146[20]Falugi等(2001)EurJImmunol31:3816-3824.[21]Baraldo等(2004)InfectImmun72(8):4884-7.[22]EP-A-0594610.[23]Ruan等(1990)JImmunol145:3379-3384.[24]W000/56360.[25]Kuo等(1995)InfectImmun63:2706-13.[26]W002/091998.[27]W001/72337[28]W000/61761.[29]W002/34771[30]W003/093306[31]W004/041157[32]W02005002619[33]W02005/033148[34]W02006/067632[35]W003/007985[36]《疫苗》(Vaccine)(Plotkin等編著)，第四版，ISBN0-7216-9688-0[37]Wessels等(1990)JClinInvest86:1428-33.[38]Wessels等(1989)InfectImmun57:1089—94.[39]W02006/082527[40]2007年12月20日提交的美國專利申請US61/008，941，題為"培養(yǎng)鏈球菌的發(fā)酵過程以及獲得其CPS的純化過程"("FERMENTATIONPROCESSESFORCULTIVATINGSTREPTOCOCCIANDPURIFICATIONPROCESSESFOROBTAININGCPSTHEREFROM")[41]W003/08067825[42:W02006/050341[43:Ravenscroft等(1999)Vaccine17:2802-2816.[44:Costantino等(1999)Vaccine17:1251-1263.[45:W02007/000341.[46:Lees等(1996)Vaccine14:190-198.[47:W095/08348.[48:W098/42721[49:美國專利4356170.[so:W02006/082530.[si:W02007/000342.[52:美國專利4，882,317[53:美國專利4，695,624[54:Mol.Immunol.，1985，22，907-919[55:EP-A-0208375[56:W000/10599[57:Gever等，Med.Microbiol.Immunol,165:171-288(1979)[58:美國專利4,057,685.[59:美國專利4，673，574;4，761，283;4，808，700.[60:美國專利4，459，286.[6i:美國專利4，965，338[62:美國專利4，663，160.[63:美國專利4，761，283[64:美國專利4，356，170[65:Lei等(2000)DevBiol(Basel)103:259-264.[66:W000/38711;美國專利6，146，902.[67:W099/24578[68:W099/36544[69:W099/57280[70:W000/22430.[7i:Tettelin等(2000)Science287:1809-1815[72:W096/29412[73:Pizza等(2000)Science287:1816-1820[74:W001/52885[75:Bjune等(1991)Lancet338(8775):1093-96[76:Fukasawa等(1999)Vaccine17:2951-2958.[77:Rosenqvist等(1998)Dev.Biol.Stand.92:323-333.[78:Costantino等(1992)Vaccine10:691-698.[79:Costantino等(1999)Vaccine17:1251-1263.[so:W003/007985.[81]W000/66791[82]W001/64922[83]WOO1/64920[84]W003/020756[85]W02004/032958[86]W02004/048404.[87]W098/18931[88]W098/18930[89]美國專利6，699，703[90]美國專利6，800，744[91]W097/43303[92]W097/37026[93]Watson(2000)PediatrInfectDisJ19:331-332.[94]Rubin(2000)PediatrClinNorthAm47:269-285，v.[95]Jedrzejas(2001)Microbio1MolBiolRev65:187-207.[96]W002/22167.[97]Paoletti等，(1990)JBiolChem265:18278-83.[98]Wessels等，(1990)JClinInvest86:1428-33.[99]Baker等，(2004)JInfectDis171:879-84.[100]W002/34771[101]W02005/032582[102]W002/094851[103]Dale，Vaccine(1999)17:193-200[104]Dale，Vaccine14(10):944-948[105]Dale(1999)InfectDisClinNorthAm13:227—43，viii.[106]Ferretti等(2001)PNASUSA98:4658-4663.[107]W002/18595[108]W099/58562[109]McMichael(2000)Vaccine19增刊1:S101_107.[110]Gustafsson等(1996)N.Endl.J.Med.334:349-355.[lll]R即puoli等(1991)TIBTECH9:232-238.[112]Kuroda等(2001)Lancet357(9264):1225-1240;也可參見第1218-1219頁.[113]W003/093306[114]Schuchat(1999)Lancer353(9146):51-6[115]W02004/041157[116]W02005/002619[117]Zhu等，Vaccine(2004)22:660-669[118]Price等，InfectionandImmunity(2004)71(1):277—283)[119:Plante等，JInfectiousDisease(2000)182:848-855)[120:W002/079243[121:W000/37494[122:W003/049762[123:W003/068811[124:W099/28475.[125:Anderson(2000)Vaccine19增刊1:S59_65.[126:Kahn(2000)CurrOpinPediatr12:257-262.[127:Crowe(1995)Vaccine13:415-421.[128:JGenVirol.2004Nov;85(Pt11):3229[129:Bell(2000)PediatrInfectDisJ19:1187-1188.[130:Iwarson(1995)APMIS103:321-326.[131:Gerlich等(1990)Vaccine8增刊:S63_68&79-80.[132:W098/20734.[133:W003/009869[134:W001/30390.[135:《疫苗設計》(VaccineDesign)(1995)Powell和Newman編著.ISBN:030644867X.普萊納姆公司(Plenum).[136:W000/23105.[137:W090/14837.[138:Podda(2001)Vaccine19:2673-80.[139:Frey等(2003)Vaccine21:4234-7.[i4o:美國專利6，299，884.[i4i:美國專利6，451，325.[142:Allison禾口Byars(1992)ResImmunol143:519-25.[143:Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9.[144:美國專利5,057，540.[145:W096/33739.[146:EPA0109942.[147:W096/11711.[148:W000/07621.[149:Barr等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:247271.[i5o:Sjolanderet等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:321338.[i5i:Niikura等(2002)Virology293:273-280.[152:Lenz等(2001)JImmunol166:5346-5355.[153:Pinto等(2003)JInfectDis188:327-338.[154:Gerber等(2001)Virol75:4752-4760.[155:W003/024480[156:W003/024481[157:Gluck等(2002)Vaccine20:BIOB16.[158:EPA0689454.[159:Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278.[160:Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229.[i6i:Meraldi等(2003)Vaccine21:2485-2491.[162:Pajak等(2003)Vaccine21:836-842.[163:Kandimalla等(2003)NucleicAcidsResearch31:2393-2400.[164:W002/26757.[165:W099/62923.[166:Krieg(2003)NatureMedicine9:831-835.[167:McCluskie等(2002)FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology32179-185.[168:W098/40100.[169:美國專利6，207,646.[no:美國專利6，239，116.[i7i:美國專利6，429，199.[172:Kandimalla等(2003)BiochemicalSocietyTransactions31(第3部分)654-658.[173:Blackwell等(2003)JImmunol170:4061-4068.[174:Krieg(2002)TrendsImmunol23:64-65.[175:W001/95935.[176:Kandimalla等(2003)BBRC306:948-953.[177:Bhagat等(2003)BBRC300:853-861.[178:W003/035836.[179:W095/17211.[i8o:W098/42375.[i8i:Beignon等(2002)InfectI匪n70:3012-3019.[182:Pizza等(2001)Vaccine19:2534-2541.[183:Pizza等(2000)IntJMedMicrobiol290:455-461.[184:Scharton-Kersten等(2000)InfectI匪n68:5306-5313.[185:Ryan等(1999)InfectImmun67:6270-6280.[186:Partidos等(1999)ImmunolLett67:209-216.[187:P印poloni等(2003)ExpertRevVaccines2:285-293.[188:Pine等(2002)JControlRelease85:263-270.[189:Domenighini等(1995)MolMicrobiol15:11651167.[i9o:W003/011223.[i9i:W099/40936.[192:MatsuiM.等(2004)J.Virol78:9093.[193:W099/44636.[194]LillardJW等，(2003)BloodFeb1;101(3):807-14.2002年9月12日電子出版[195]Singh等(2001)JContRelease70:267-276.[196]W099/27960.[197]美國專利6，090，406[198]美國專利5，916，588[199]EPA0626169.[200]W099/52549.[201]W001/21207.[202]W001/21152.[203]Andrianov等(1998)Biomaterials19:109—115.[204]Payne等(1998)AdvDrugDeliveryReview31:185—196.[205]Stanley(2002)ClinExpDermatol27:571-577.[206]Jones(2003)Curr0pinInvestigDrugs4:214-218.[207]W004/60308[208]W004/64759.[209]US6，924，271.[210]US2005/0070556.[211]US5,658,731.[212]Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42.[213]US2005/0215517.[214]W002/072012.[215]《疫苗佐劑制備方法和研究策略》(VaccineAdjuvants:Pr印arationMethodsandResearchProtocols)(《分子醫(yī)學方法系列叢書》(MethodsinMolecularMedicineseries)第42巻)ISBN:1-59259-083-7.0，Hagan編[216]Signorelli禾卩Hadden(2003)IntImmunopharmacol3(8):1177—86.[217]W02004/064715.[218]Cooper(1995)PharmBiotechnol6:559-80.[219]W02006/002422.[220]W02004/87153.[221]US6，605，617.[222]W002/18383.[223]W02004/018455.[224]W003/082272.[225]美國專利5，011，828.[226]US_6586409.[227]W099/11241.[228]W094/00153.[229]W098/57659.[230]歐洲專利申請0835318,0735898和0761231.權利要求一種從混合物中純化糖抗原-載體蛋白的方法，該方法包括使所述混合物與羥基磷灰石接觸并收集游離的糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述混合物包含游離的載體蛋白和糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合物還包含其他污染蛋白。4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白選自破傷風類毒素、白喉類毒素、它們的衍生物、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、合成蛋白質、熱激蛋白、百日咳蛋白、細胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、多聚表位載體、流感嗜血桿菌的D蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白PspA、鐵攝取蛋白、艱難梭菌的毒素A或B和/或多聚表位載體如N19。5.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白是破傷風類毒素、白喉類毒素或它們的衍生物。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白是CRM197。7.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述糖抗原的分子量為50kDa以上。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述糖抗原的分子量為5kDa以上。9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述糖抗原是細菌莢膜糖。10.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述糖抗原是糖基化的。11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述糖抗原來自腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌、綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、小腸結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌或傷寒沙門菌。12.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白與來自多于一種細菌種類的糖抗原相偶聯(lián)。13.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述糖抗原通過接頭與載體蛋白相偶聯(lián)。14.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在p朋.5-pH7.5進行。15.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在pH7.2進行。16.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在50mM以下的磷酸鹽濃度進行。17.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述羥基磷灰石是凝膠形式。18.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述羥基磷灰石的粒徑為40iim以上。19.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述羥基磷灰石的動態(tài)結合容量大于10毫克溶菌酶/克。20.—種制備藥物組合物的方法，該方法包括前述權利要求中任一項所述的方法，并且還包括以下步驟iii)將步驟ii)獲得的糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物與藥學上可接受的稀釋劑或載體混合。21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(iv)將步驟(iii)的產品與佐劑混合。22.根據權利要求20或21所述方法制備的藥物組合物，所述組合物用于(i)治療，(ii)引起免疫應答，或者(iii)用作疫苗。23.根據權利要求20或21所述方法制備的藥物組合物在生產用于(i)引起免疫應答或(ii)治療細菌感染的藥物中的應用。全文摘要本申請涉及純化糖抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的方法。具體說，本發(fā)明提供了采用羥基磷灰石從游離的載體蛋白如CRM197純化糖抗體-載體蛋白偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明還涉及采用該方法制備疫苗的方法。文檔編號A61P31/04GK101795713SQ200880106077公開日2010年8月4日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權日2007年7月17日發(fā)明者C·貝魯西,F·伯爾蒂,F·諾萊利,G·阿弗拉尼,M·比吉奧申請人:諾華有限公司