專利名稱：抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痘菌病毒接種炎癥組織提取物的新型醫(yī)藥用途，具體而言，涉及含有
痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的由抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減 輕劑。
背景技術(shù)：
目前，在癌癥(惡性腫瘤)的治療中，適當(dāng)?shù)胤謩e單獨使用或者并用外科手術(shù)、放 射線照射、化學(xué)療法。其中，在化學(xué)療法中所使用的抗癌劑(抗惡性腫瘤劑)是原本具有細(xì) 胞毒性、細(xì)胞障礙性的物質(zhì)，不僅對癌(惡性腫瘤)細(xì)胞造成損害，對人類的正常細(xì)胞也造 成損害，從而產(chǎn)生副作用，因此，對患者給藥時，在盡可能預(yù)防或減輕這樣的副作用的同時 發(fā)揮充分的抗癌(抗惡性腫瘤)效果是非常重要的。 作為抗癌劑給藥所伴隨的副作用，可以列舉血液障礙、消化器官障礙、神經(jīng)障礙， 但是，作為最近的趨勢，特別是急性或慢性的神經(jīng)損害的問題正在增大。其原因在于發(fā)揮顯 著抗癌效果的新抗癌劑所產(chǎn)生的主要副作用以神經(jīng)障礙的情況居多、最近成為治療重點的 多劑并用療法造成的影響、以及對血液障礙和消化器官障礙的副作用的改善趨勢。這樣，現(xiàn) 在以癌癥的化學(xué)療法所伴隨的副作用為中心的神經(jīng)障礙，由于神經(jīng)細(xì)胞難以再生，一旦發(fā) 生則沒有有效的對策，從而呈現(xiàn)重病癥狀或成為不可逆的障礙，因此在治療上成為重要的 問題。 抗癌劑給藥所伴隨的神經(jīng)障礙，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自律神經(jīng)系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng) 以外，還有味覺等感覺器官。其中，發(fā)生頻率相對較高的問題有剌痛或燒灼樣痛等疼痛、四 肢末端的麻痹、灼熱感等知覺異常、對冷剌激過敏等知覺過敏、感覺消失、感覺麻痹和不協(xié) 調(diào)感等感覺異常、知覺性運動失調(diào)、肌肉無力等末梢神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)障礙。該抗癌劑給藥所 導(dǎo)致的末梢神經(jīng)系統(tǒng)的病變主要是由軸索的變性引起的。軸索中的微管在細(xì)胞分裂時形成 紡錘體，在維持細(xì)胞器的配置和物質(zhì)輸送等細(xì)胞的正常機(jī)能中發(fā)揮重要作用，但是紫杉醇、 多西紫杉醇等紫杉烷類藥劑、和長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱等長春花堿類藥劑 通過以微管為目標(biāo)發(fā)揮作用來抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，因此對正常的神經(jīng)細(xì)胞的微管也 造成傷害，從而引起神經(jīng)障礙。另外，奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、奈達(dá)鉑等鉑制劑對神經(jīng)細(xì)胞造 成直接損傷，結(jié)果繼發(fā)軸索障礙。 但是，抗癌劑導(dǎo)致的神經(jīng)毒性仍然是研究進(jìn)展甚微的領(lǐng)域，神經(jīng)障礙的預(yù)防和對 癥方法還沒有確立。因此，為了緩和麻痹癥狀而使用甲鈷胺等維他命制劑和中藥牛車腎氣 丸，對疼痛使用抗抑郁藥(鹽酸阿米替林)、抗癲癇藥(卡馬西平)、抗心律失常藥(鹽酸美 西律)和腎上腺皮質(zhì)類固醇等，但是目前為止，仍然沒有確立根治或預(yù)防的方法，將藥劑終 止或減量給藥是控制住神經(jīng)障礙的唯一確實的方法(但是，即使給藥終止后，神經(jīng)障礙有 時也會持續(xù)或者惡化)。由于如上所述的現(xiàn)狀，臨床上強(qiáng)烈要求一種對由抗癌劑導(dǎo)致的神經(jīng) 障礙有效的預(yù)防或減輕劑。 關(guān)于作為本發(fā)明藥劑的有效成分的痘菌病毒接種炎癥組織提取物，公開有鎮(zhèn)痛作用、鎮(zhèn)靜作用、抗應(yīng)激作用、抗過敏作用(參照專利文獻(xiàn)D、免疫促進(jìn)作用、抗癌作用、肝 硬化抑制作用(參照專利文獻(xiàn)2)、對特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療效果(參照專利文 獻(xiàn)3)、對帶狀皰疹后神經(jīng)痛、腦水腫、癡呆、脊髓小腦變性癥等的治療效果(參照專利文獻(xiàn) 4)、對雷諾綜合癥、糖尿病性神經(jīng)障礙、亞急性視神經(jīng)脊髓病后遺癥等的治療效果(參照專 利文獻(xiàn)5)、激肽釋放酶產(chǎn)生抑制作用、末梢循環(huán)障礙改善作用(參照專利文獻(xiàn)6)、骨萎縮 改善作用(參照專利文獻(xiàn)7)、對敗血癥和內(nèi)毒素性休克的治療有效的一氧化氮產(chǎn)生抑制作 用(參照專利文獻(xiàn)8)、對骨質(zhì)疏松癥的治療效果(參照專利文獻(xiàn)9)、基于Nef作用抑制作 用.和趨化因子產(chǎn)生抑制作用的艾滋病治療效果(專利文獻(xiàn)10、11)、對腦梗塞等缺血性疾 病的治療效果(專利文獻(xiàn)12)、對纖維肌痛癥的治療效果(專利文獻(xiàn)13)、對感染癥的治療 效果(專利文獻(xiàn)14)等。 特別是在專利文獻(xiàn)5中，記載了作為本發(fā)明藥劑的有效成分的痘菌病毒接種炎癥 組織提取物改善由機(jī)體局部的血流障礙導(dǎo)致的陷入缺血狀態(tài)的組織和臟器的機(jī)能障礙所 伴隨產(chǎn)生的麻痹、疼痛、四肢冷感、知覺異常等癥狀。但是，專利文獻(xiàn)5中公開的痘菌病毒接 種炎癥組織提取物對麻痹、疼痛、四肢冷感、知覺異常等的改善作用是基于對血流障礙導(dǎo)致 的缺血狀態(tài)的血流改善作用的效果，如本發(fā)明這樣的由抗癌劑給藥的副作用(細(xì)胞損傷) 產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕作用，是該提取物基于完全不同的發(fā)病機(jī)理對末梢神經(jīng) 障礙的效果，是迄今為止仍然未知的知識。即，該提取物對起因于抗癌劑給藥導(dǎo)致的神經(jīng)軸 索的微管障礙、神經(jīng)軸索的脫髓鞘、對神經(jīng)細(xì)胞的直接障礙等產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障礙的減輕
等有效仍然是未知的，至今也沒有這樣的醫(yī)藥用途相關(guān)的發(fā)表文章和報告。 專利文獻(xiàn)1 :日本特開昭53-101515號公報 專利文獻(xiàn)2 :日本特開昭55-87724號公報(第3、5、6頁) 專利文獻(xiàn)3 :日本特開平1-265028號公報(第1、2頁) 專利文獻(xiàn)4 :日本特開平1-319422號公報(第3、4頁) 專利文獻(xiàn)5 :日本特開平2-28119號公報(第3頁) 專利文獻(xiàn)6 :日本特開平7-97336號公報(第4頁) 專利文獻(xiàn)7 :日本特開平8-291077號公報 專利文獻(xiàn)8 :日本特開平10-194978號公報 專利文獻(xiàn)9 :日本特開平11-80005號公報(第2、3頁) 專利文獻(xiàn)10 :日本特開平11-139977號公報 專利文獻(xiàn)11 :日本特開2000-336034號公報(第2、3頁) 專利文獻(xiàn)12 :日本特開2000-16942號公報 專利文獻(xiàn)13 :國際公開W02004/039383號公報 專利文獻(xiàn)14 :日本特開2004-300146號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對作為抗癌劑給藥時的副作用而產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障 礙的預(yù)防或減輕有效且安全性高的藥劑。 本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由 抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙顯示出優(yōu)異的預(yù)防或減輕效果，從而完成了本發(fā)明。
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發(fā)明的效果 痘菌病毒接種炎癥組織提取物具有預(yù)防或減輕由抗癌劑的給藥引起的末梢神經(jīng) 障礙的優(yōu)異的藥理作用。另外，含有該提取物作為有效成分的本發(fā)明的藥劑是副作用等問 題少的安全的藥劑，有用性極高。


圖1是以von Frey試驗研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由紫杉醇 給藥導(dǎo)致產(chǎn)生的知覺過敏的減輕作用的結(jié)果。 圖2是以丙酮試驗研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由紫杉醇給藥 導(dǎo)致產(chǎn)生的知覺異常的減輕作用的結(jié)果。 圖3是使用PC12細(xì)胞研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由紫杉醇誘 發(fā)的神經(jīng)突起伸展阻礙的抑制作用的結(jié)果。 圖4是使用DRG細(xì)胞研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由紫杉醇誘發(fā) 的神經(jīng)突起伸展阻礙的抑制作用的結(jié)果。 圖5是以von Frey試驗研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由奧沙利 鉑導(dǎo)致產(chǎn)生的知覺過敏的減輕作用的結(jié)果。 圖6是以冷板試驗研究本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物對由奧沙利鉑導(dǎo) 致產(chǎn)生的知覺過敏的減輕作用的結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及含有痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的、由抗癌劑導(dǎo)致的 末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑。本發(fā)明中的產(chǎn)生末梢神經(jīng)障礙的抗癌劑，是特別對微管造 成損傷從而引起末梢神經(jīng)障礙的抗癌劑。作為這樣的藥劑，能夠列舉紫杉醇、多西紫杉醇 等紫杉烷類藥劑，和長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱等長春花堿類藥劑。另外，作為 神經(jīng)細(xì)胞的損傷引起軸索損傷從而導(dǎo)致末梢神經(jīng)障礙的藥劑，可以列舉奧沙利鉑、卡鉑、順 鉬、奈達(dá)鉑等鉑制劑。作為這些抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙，有疼痛、麻痹、知覺異常、感覺 異常、知覺過敏等，因此，引起不能很好地握住物體、扣紐扣困難、步行障礙等運動失調(diào)和深 部腱反射降低等日常生活上的障礙。作為本發(fā)明藥劑的預(yù)防、改善對象的由抗癌劑導(dǎo)致的 末梢神經(jīng)障礙，不僅包括使用一類抗癌劑的單劑療法產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障礙，還包括組合作 用機(jī)制不同的多個藥劑而給藥的多劑并用療法、和以使作用機(jī)制不同的藥劑能夠發(fā)揮最大 有效性的方式將藥劑的組合和給藥方式優(yōu)化的生化調(diào)節(jié)(biochemical modulation)的療 法中產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障礙。 關(guān)于本發(fā)明的藥劑中使用的痘菌病毒接種炎癥組織提取物，對于接種了痘菌病毒 的炎癥組織中產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)、將該物質(zhì)從病態(tài)組織中提取的方法以及它們的藥理活 性等，存在如上所述的各種報道(上述專利文獻(xiàn)1至14等)。 另外，作為市售的醫(yī)藥品，存在痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取液制劑。該制劑， 如醫(yī)療用醫(yī)用品集(2007年版，財團(tuán)法人日本醫(yī)藥情報中心編輯發(fā)行)的2697-2699頁中 的記載，是含有從接種了痘菌病毒的家兔的炎癥皮膚組織提取分離的非蛋白性的活性物質(zhì) 的藥劑，確認(rèn)適用于腰痛癥、頸肩腕綜合征、癥狀性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關(guān)節(jié)炎、皮膚病(濕疹、皮炎、蕁麻疹)伴有的瘙癢、過敏性鼻炎、亞急性視神經(jīng)脊髓病后遺癥的冷感_知覺異常-疼痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等，皮下、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑以及片劑作為醫(yī)療用醫(yī)藥品取得制造認(rèn)可，并在市場上銷售。 本發(fā)明的藥劑中所使用的痘菌病毒接種炎癥組織提取物，是從上述那樣的痘菌病毒接種炎癥組織提取的非蛋白性的機(jī)體功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，在上述的醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集中也得到刊載的痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚組織提取液制劑已經(jīng)取得醫(yī)藥品制造認(rèn)可并在市場上銷售，因而能夠獲得。另外，能夠?qū)⒃谏鲜鰧＠墨I(xiàn)中記載的各種痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為本發(fā)明物質(zhì)利用，它們的制造方法和優(yōu)選的給藥量等也在文獻(xiàn)中得到說明。
本發(fā)明的藥劑中使用的痘菌病毒接種炎癥組織提取物，能夠通過以下操作得到接種痘菌病毒，破碎發(fā)痘的炎癥組織，添加提取溶劑，除去組織碎片之后，進(jìn)行除蛋白處理，使其吸附在吸附劑中，接著洗脫有效成分。 痘菌病毒接種炎癥組織提取物，例如，采用以下工序制造。 (a)接種痘菌病毒，采集發(fā)痘的兔、小鼠等的皮膚組織等，破碎發(fā)痘組織，加入水、苯酚水、生理食鹽水或加酚甘油水等提取溶劑后，過濾或離心分離，由此得到提取液(濾液或上清液)。 (b)將上述提取液調(diào)整為酸性的pH并加熱，進(jìn)行除蛋白處理。接著，將除去蛋白的溶液調(diào)整為堿性并加熱后，過濾或離心分離。
(c)將得到的濾液或上清液調(diào)整為酸性，使之吸附在活性碳、高嶺土等吸附劑上。
(d)在上述吸附劑中加入水等提取溶劑，調(diào)整為堿性的pH，洗脫吸附成分，由此能夠得到痘菌病毒接種炎癥組織提取物。此后，根據(jù)希望，也能夠適當(dāng)將洗脫液在減壓下蒸發(fā)干燥固體化或冷凍干燥而得到干固物。 作為用于接種痘菌病毒得到炎癥組織的動物，可以使用兔、牛、馬、綿羊、山羊、猴、
大鼠、小鼠等痘菌病毒感染的各種動物，作為炎癥組織，優(yōu)選兔的發(fā)痘皮膚組織。 采取這些炎癥組織并破碎，加入其1至5倍量的提取溶劑，制成乳濁液。作為提取
溶劑，可以使用蒸餾水、生理食鹽水、弱酸性至弱堿性的緩沖液等，也可以適當(dāng)添加甘油等
穩(wěn)定劑、苯酚等殺菌-防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，也可以通過冷凍融
解、超聲波、細(xì)胞膜溶解酶或表面活性劑等的處理破壞細(xì)胞組織而使提取容易進(jìn)行。 將得到的乳狀提取液通過過濾或離心分離等除去組織碎片后，進(jìn)行除蛋白處理。
除蛋白操作可以采用通常進(jìn)行的公知方法實施，可以適用加熱處理、采用蛋白質(zhì)變性劑，例如酸、堿、尿素、胍、丙酮等有機(jī)溶劑等的處理、等電點沉淀、鹽析等方法。接著，采用除去不溶物的通常方法，例如，使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃過濾器、硅藻土制品(Celite)、賽茨過濾板等的過濾、超濾、離心分離等，除去析出的不溶蛋白質(zhì)。
使用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸，將這樣操作得到的含有有效成分的提取液調(diào)整為酸性，優(yōu)選調(diào)整為pH3. 5至5. 5，進(jìn)行向吸附劑吸附的操作。作為能夠使用的吸附劑，可以列舉活性碳、高嶺土等，向提取液中添加吸附劑并攪拌，或者使提取液通過填充有吸附劑的柱，從而能夠使有效成分吸附在該吸附劑上。當(dāng)向提取液中添加吸附劑時，通過過濾或離心分離等除去溶液，能夠得到吸附了有效成分的吸附劑。 為了使有效成分從吸附劑中洗脫(脫離)，向上述吸附劑中加入洗脫溶劑，在室溫或適當(dāng)加熱下或者在攪拌下洗脫，以過濾或離心分離等通常的方法除去吸附劑，從而能夠
6實現(xiàn)該洗脫。作為所使用的洗脫溶劑，可以使用堿性溶劑，例如，調(diào)整為堿性PH的水、甲醇、
乙醇、異丙醇等或者它們的適當(dāng)?shù)幕旌先芤?，可以?yōu)選使用調(diào)整為PH9至12的水。 這樣操作而得到的提取物(洗脫液)能夠適當(dāng)調(diào)制為作為制劑用原料和醫(yī)藥品制
劑優(yōu)選的形態(tài)。例如，既可以將溶液的PH調(diào)整在中性附近制成制劑用原料，也可以通過濃
縮、稀釋來符合所希望的濃度。還可以作為注射用制劑而加入氯化鈉，調(diào)制與生理食鹽水等
張的溶液。另外，也可以通過將這些溶液濃縮干固或冷凍干燥而調(diào)制為能夠作為片劑等的
原料利用的固態(tài)物形態(tài)。 作為向患者給藥的方法，除口服給藥外，可以列舉皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)給藥等，給藥量可以根據(jù)痘菌病毒接種炎癥組織提取物的種類適當(dāng)設(shè)定。市售制劑認(rèn)可的給藥量，根據(jù)上述的醫(yī)療用醫(yī)藥品集(2697頁)，作為醫(yī)療用醫(yī)藥品基本上表示為內(nèi)服1日給藥16NU、注射劑l日給藥3.6至7. 2NU，但能夠根據(jù)疾病種類、重傷程度、患者個人差異、給藥方法、給藥期間等適當(dāng)增減(NU:神經(jīng)妥樂平單位。所謂神經(jīng)妥樂平單位，是使用疼痛閾值比正常動物低的慢性應(yīng)激動物SART應(yīng)激小鼠，按照Randall-Selitto法進(jìn)行試驗，得到的鎮(zhèn)痛效力的ED5。值所規(guī)定的單位。1NU為ED5。值為100mg/kg時的神經(jīng)妥樂平片劑的鎮(zhèn)痛活性含有成分lmg所顯示的活性。) 以下，列舉痘菌病毒接種炎癥組織提取物的制造方法的例子，以及該提取物的新的藥理作用，即抗癌劑導(dǎo)致的神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕作用相關(guān)的藥理試驗的結(jié)果，但是本發(fā)明不受這些實施例的記載的任何限制。
實施例 實施例1 在健康的成熟家兔皮膚上接種痘菌病毒，剝出發(fā)痘的皮膚，將其破碎，加入苯酚水。接著，將其加壓過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為pH5后，以90 IO(TC加熱處理30分鐘。過濾除蛋白后，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9，再以90 IO(TC加熱處理15分鐘后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為約PH4. 5，加入2%的活性碳，攪拌2小時后離心分離。向采集的活性碳中加水，以氫氧化鈉調(diào)整為PHIO，以6(TC攪拌1. 5小時后，離心分離過濾，得到上清液。再向采集的活性碳中加水，用氫氧化鈉調(diào)整為pHll，以6(TC攪拌1. 5小時后，離心分離，得到上清液。合并兩次得到的上清液，以鹽酸中和，得到痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物。在以下的藥理試驗中，適當(dāng)調(diào)整為適合實驗的濃度使用。
實施例2 在健康的成熟家兔皮膚上接種痘菌病毒使之感染后，無菌剝出發(fā)痘的皮膚，將其切碎后，加入加酚甘油水，以勻漿器磨碎成為乳狀。接著，將其過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為弱酸性(pH4. 5 5. 5)后，以IO(TC加熱處理并過濾。以氫氧化鈉將濾液調(diào)整為弱堿性(pH8. 5 10. 0)，再以IO(TC加熱處理后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為約pH4. 5，加入約1. 5%的活性碳，攪拌1 5小時后過濾。向濾取的活性碳中加入水，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9. 4 10，攪拌3 5小時后過濾，以鹽酸中和濾液。
實施例3 在健康的成熟家兔皮膚上接種痘菌病毒，使之活化后，無菌剝出活化的皮膚，將其切碎，加入水，以勻漿器磨碎成為乳狀物。接著，將其加壓過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為pH5.0后，在流通蒸氣下以IO(TC加熱處理。過濾除蛋白后，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9. l，再以 IO(TC加熱處理后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為pH4. 1，加入2%的活性碳，攪拌2小時后過濾。 再向濾液中加入5. 5%的活性碳，攪拌2小時后過濾。向最初濾取的活性碳中加水，以氫氧 化鈉調(diào)整為pH9. 9，以6(TC攪拌1. 5小時后過濾。向最初的活性碳和其后的活性碳中加水， 以氫氧化鈉調(diào)整為PHIO. 9，以6(TC攪拌1. 5小時后過濾。合并濾液，以鹽酸中和后，以使用 分子量100的膜的電透析法進(jìn)行脫鹽處理，在減壓下干燥固化。 接著，列舉將上述實施例1中得到的本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為 被檢藥物使用的由抗癌劑導(dǎo)致的神經(jīng)障礙的減輕作用相關(guān)的藥理試驗的結(jié)果的一個例子。 另外，在全部藥理試驗中，顯著性差異檢驗使用Tukey-Karmer法。
藥理試驗1 :對紫杉醇導(dǎo)致的大鼠末梢神經(jīng)障礙的作用 研究本發(fā)明的提取物(實施例1制造的痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物)對將 抗癌劑紫杉醇給藥時產(chǎn)生的由機(jī)械剌激引起的異常性疼痛(通常不引起疼痛的觸覺剌激 引起的劇痛)等知覺過敏以及低溫剌激時的知覺異常的效果。將本發(fā)明的提取物作為被檢 藥物向大鼠口服給藥，進(jìn)行以下的實驗(von Frey test以及acetone test)。
(1)被檢藥物的給藥 作為實驗動物，使用7 8周齡的SD雄性大鼠，分成對照組、紫杉醇給藥組、紫杉 醇以及被檢藥物給藥組(紫杉醇+被檢藥物給藥組)三組。對紫杉醇給藥組，持續(xù)四周將 紫杉醇每周一次向腹腔內(nèi)給藥(6mg/kg)，共計實施4次。對紫杉醇+被檢藥物給藥組，持續(xù) 四周將被檢藥物在紫杉醇即將給藥前、給藥1天后、給藥2天后每周三次口服給藥(200NU/ kg)，共計實施12次。另外，對對照組將紫杉醇給藥時的溶劑(聚氧乙烯蓖麻油乙醇= 1 : 1)同樣給藥。
(2)von Frey試驗 在以金屬網(wǎng)形成底部的籠子中，放入上述(1)中的三組大鼠，使其馴化1小時后， 使用2、4、6、8、10、15g強(qiáng)度的von Frey細(xì)絲，對后肢內(nèi)側(cè)垂直地按壓細(xì)絲直至彎曲，靜止6 秒，左右各進(jìn)行6次，測定回避反應(yīng)的次數(shù)。并且，測定在從給藥開始0、2、4、5、6周后進(jìn)行。 以細(xì)絲強(qiáng)度(g)為x、回避反應(yīng)次數(shù)為y做成散點圖后，基于使用最小二乘法描繪的y = A/ (l+(e鄧(-BX (x-C)))的S形曲線，將相當(dāng)于6次(50%)反應(yīng)的細(xì)絲強(qiáng)度作為50%反應(yīng)閾 值求出，測試被檢藥物對異常性疼痛的效果。 在圖1中表示上述試驗結(jié)果的一個例子。紫杉醇給藥組與對照組相比，50%反應(yīng)
閾值顯著降低。在紫杉醇中并用本發(fā)明的提取物給藥的紫杉醇+被檢藥物給藥組顯示與對
照組同等程度的50%反應(yīng)閾值，與紫杉醇給藥組相比顯著抑制50%反應(yīng)閾值的降低。另
外，可以確認(rèn)，紫杉醇+被檢藥物給藥組中，結(jié)束被檢藥物的給藥之后，也能持續(xù)維持對疼
痛閾值降低的抑制。從以上結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的提取物對紫杉醇導(dǎo)致的知覺過敏具有
優(yōu)異的預(yù)防或改善作用。 (3)丙酮試驗(Acetone test) 在以金屬網(wǎng)形成底部的籠子中，放入上述(1)中的三組大鼠，使其馴化1小時后， 使用MicroSprayer(PENN-CENTURY公司生產(chǎn))向后足以丙酮50 y L噴霧5秒鐘，利用丙酮 氣化時的冷卻作用付與冷剌激。觀察從噴霧開始40秒鐘內(nèi)大鼠的回避反應(yīng)，記錄直至出現(xiàn) 反應(yīng)的時間(潛伏時間)。左右各進(jìn)行三次測試，求出平均值。
在圖2中表示上述試驗結(jié)果的一個例子。對丙酮的冷剌激，紫杉醇給藥組的潛伏 時間顯著縮短，但是紫杉醇+被檢藥物給藥組的潛伏時間恢復(fù)至與對照組基本相同的程 度。從以上結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的提取物對紫杉醇導(dǎo)致的知覺異常(對冷剌激的過敏)具 有優(yōu)異的效果。另外，在熱剌激的試驗(Plantar test)中，未見紫杉醇給藥組導(dǎo)致的潛伏時 間的縮短，在紫杉醇+被檢藥物給藥組中，潛伏時間也與對照組和紫杉醇給藥組相同。在抗 癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙的癥狀中，可以特征性地列舉對冷剌激的過敏，本試驗(Acetone test)也反映了這種癥狀，顯示本發(fā)明的提取物對由抗癌劑導(dǎo)致的知覺過敏的優(yōu)異的預(yù)防 或改善作用。 藥理試驗2 :in vitro試驗體系中對紫杉醇導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞變性的作用
以研究本發(fā)明的提取物對作為抗癌劑的紫杉醇處理引起的神經(jīng)細(xì)胞變性的藥理 作用為目的，使用作為神經(jīng)分化_突起伸展的模型細(xì)胞株的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株 (PC12， Pheochromocytoma 12)以及脊髓后根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)的細(xì)胞
進(jìn)行以下實驗。 (1)細(xì)胞的培養(yǎng) 對PC12細(xì)胞使用含有5%胎牛血清、10 %馬血清、100單位/ml青霉素-鏈霉素 (Gibco BRL公司生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(MPBiomedicals公司生產(chǎn))，在37°C 、5% C02 的孵箱中培養(yǎng)于80cm3培養(yǎng)瓶中。 另夕卜，DRG細(xì)胞從雄性Sprague-Dawley系大鼠中取出進(jìn)行原代培養(yǎng)之后，將L4-5 的DRG 5節(jié)在膠原酶I (Funakoshi公司生產(chǎn))以及分散酶I (三光純藥公司生產(chǎn))中進(jìn)行 處理，接種于24孔板上進(jìn)行培養(yǎng)。并且，使用含有10%胎牛血清、100單位/ml青霉素-鏈 霉素(Gibco BRL公司生產(chǎn))的Dulbecco' s modified Eagle' s培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基， MPBiomedicals公司生產(chǎn))，在37°C、5% C02孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)藥物的處理以及神經(jīng)突起長度的測定 將PC12細(xì)胞以10000cell/we11接種于24孔板中，3小時后以福斯高林10yM進(jìn) 行處理使突起伸展，24小時后進(jìn)行藥物處理。另外，對DRG細(xì)胞培養(yǎng)一周，確認(rèn)細(xì)胞的貼附 以及突起的伸展之后，進(jìn)行藥物處理。另外，藥物為僅有紫杉醇10ng/mL的情況以及紫杉 醇10ng/mL并用各濃度的被檢藥物(0. 001、0. 003、0. 01、0. 03NU/mL)的情況分別進(jìn)行處理。 藥物處理24小時以及96小時以后，更換為含有各規(guī)定濃度的藥物以及被檢藥物的新培養(yǎng) 基，168小時后以臺盼藍(lán)染色液染色區(qū)分死細(xì)胞，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行照相(X 200， 3視野/ 恥ll)。照相后，使用分析軟件Image J測定活細(xì)胞的突起長度。 在圖3和圖4中表示上述實驗結(jié)果的一個例子。在PC12細(xì)胞和DRG細(xì)胞的任一 種細(xì)胞中均可以確認(rèn)，紫杉醇導(dǎo)致神經(jīng)突起的伸展被阻礙，但是通過并用本發(fā)明的提取物 進(jìn)行處理，可以濃度依賴性地顯著抑制突起伸展的阻礙。特別是由于在作為神經(jīng)細(xì)胞的DRG 細(xì)胞中確認(rèn)上述效果，暗示本發(fā)明的提取物對末梢神經(jīng)障礙的減輕作用中，對神經(jīng)突起伸 展障礙的抑制是其作用機(jī)制之一。 藥理試驗3 :對奧沙利鉑導(dǎo)致的大鼠末梢神經(jīng)障礙的作用 采用與上述的藥理試驗1同樣的方法研究本發(fā)明的提取物(實施例1制造的痘菌 病毒接種家兔炎癥皮膚提取物)對將作為鉑制劑的奧沙利鉑給藥時產(chǎn)生的機(jī)械剌激引起 的異常性疼痛等知覺過敏以及低溫剌激中的知覺異常的效果。奧沙利鉑也是最容易引起末梢神經(jīng)障礙的藥劑，強(qiáng)烈期望有預(yù)防、改善本障礙的方法。
(1)被檢藥物的給藥 與藥理試驗1同樣地將大鼠分為對照組、奧沙利鉑給藥組、奧沙利鉑給藥組與被 檢藥物給藥組(奧沙利鉑+被檢藥物給藥組)三組。奧沙利鉑(100mg冷凍干燥制劑)使 用5%的葡萄糖液溶解。對奧沙利鉑給藥組，持續(xù)四周每周2次將奧沙利鉑在連續(xù)的兩天中 向腹腔內(nèi)給藥(4mg/kg)，共計實施8次。對奧沙利鉑+被檢藥物給藥組，將被檢藥物在奧沙 利鉑給藥開始日、第二天、第三天，每周三次口服給藥(200NU/kg)。被檢藥物在奧沙利鉑即 將給藥前給藥，持續(xù)4周，共計實施12次。另外，對對照物將奧沙利鉑給藥中的溶劑(5%葡 萄糖液)同樣給藥(lmL/kg)。
(2)von Frey試驗 與藥理試驗1(2)同樣操作，每周從奧沙利鉑給藥開始日至第六天進(jìn)行von Frey 試驗，試驗被檢藥物對異常性疼痛的效果。 在圖5中表示上述試驗結(jié)果的一個例子(第二周)。在上述實驗的第二周，奧沙利 鉑給藥組與對照組相比，50%反應(yīng)閾值顯著降低。與此相對，在奧沙利鉑中并用本發(fā)明的提 取物給藥的奧沙利鉑+被檢藥物給藥組顯示與對照組同等程度的50%反應(yīng)閾值，與奧沙利 鉑給藥組相比顯著抑制50%反應(yīng)閾值的降低。從以上結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的提取物對奧沙 利鉑導(dǎo)致的知覺過敏具有優(yōu)異的預(yù)防或改善作用。
(3)冷板試驗(Cold plate test) 從奧沙利鉑給藥開始日至第五天進(jìn)行冷板試驗，檢測被檢藥物對低溫剌激時的 知覺異常的效果。試驗前一天將上述(1)的三組大鼠置于冷板(Hot/Cold plate Cat. No. 35100Ugo Basile Biological ResearchAparatus公司生產(chǎn))30分鐘使其充分馴化。試 驗當(dāng)日將大鼠置于設(shè)定于fC的冷板上，在150秒鐘期間觀察大鼠的行動，測定直至后腿回 避的反應(yīng)時間(潛伏時間)。并且，為了使行動觀察排出試驗實施者的先入之見，使大鼠各 組的給藥藥物無法判斷地進(jìn)行。試驗進(jìn)行三次進(jìn)行平均，求出平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差。多組之間 的比較，在單因素方差分析(oneiay AN0VA)后，將各組間的比較與其它藥理試驗同樣地使 用Tukey-Kramer法進(jìn)行檢驗。檢驗使用Stat View (Abacus Conc印ts， Berkeley, CA， USA)， 以不足5% (p < 0. 05)的臨界值視為顯著性差異。 在圖6中表示上述試驗結(jié)果的一個例子(第二周)。在上述試驗的第二周，對冷板 的冷剌激，奧沙利鉑給藥組的潛伏時間顯著縮短，但是奧沙利鉑+被檢藥物給藥組的潛伏 時間恢復(fù)至與對照組基本相同的程度。從以上結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的提取物對奧沙利鉑 導(dǎo)致的知覺異常(對冷剌激的過敏)具有優(yōu)異的效果。與紫杉醇同樣，奧沙利鉑導(dǎo)致的末 梢神經(jīng)障礙的癥狀中可以特征性地列舉對冷剌激的過敏，與上述藥理試驗1(3)的丙酮試 驗的結(jié)果同樣，本試驗(冷板試驗)也反映了這種癥狀，顯示本發(fā)明的提取物對抗癌劑導(dǎo)致 的知覺過敏的優(yōu)異的預(yù)防或改善作用。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性 如從上述的藥理試驗結(jié)果可以明確的那樣，本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取 物，在以紫杉醇和奧沙利鉑等抗癌劑的給藥產(chǎn)生的、機(jī)械剌激引起的異常性疼痛等知覺過 敏和低溫剌激時的知覺異常作為末梢神經(jīng)障礙的指標(biāo)而實施的大鼠口服給藥試驗中，可以 確認(rèn)對末梢神經(jīng)障礙具有優(yōu)異的預(yù)防或減輕作用。另外，在紫杉醇誘發(fā)的神經(jīng)突起伸展阻礙相關(guān)的in vitro試驗中，也顯示顯著的抑制作用。因此，本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組 織提取物對紫杉醇和奧沙利鉑等抗癌劑的給藥引起的末梢神經(jīng)障礙是有效的。市售的痘菌 病毒接種家兔炎癥皮膚提取液制劑可以常年使用，作為安全性非常高的藥劑被認(rèn)可。這樣， 本發(fā)明的痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為對四肢末端的麻痹等知覺異常和疼痛等知覺 過敏等由抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑有效，是基本沒有副作用 且安全性極高、有用性很高的藥劑。
權(quán)利要求
一種抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于含有痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于抗癌劑是微管抑 制劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于微管抑制劑是紫 杉烷類藥劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于紫杉烷類藥劑是 紫杉醇或多西紫杉醇。
5. 如權(quán)利要求3所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于紫杉烷類藥劑是紫杉醇。
6. 如權(quán)利要求2所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于微管抑制劑是長 春花堿類藥劑。
7. 如權(quán)利要求l所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于抗癌劑是鉑制劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于鉑制劑是奧沙利 鉬、卡鉑、順鉑或奈達(dá)鉑。
9. 如權(quán)利要求7所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于鉑制劑是奧沙利鉑。
10. 如權(quán)利要求1 9中任一項所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于抗癌劑導(dǎo)致的末梢神經(jīng)障礙是急性或慢性的疼痛、麻痹、知覺異常、知覺過敏或感覺異常。
11. 如權(quán)利要求1 10中任一項所述的制劑，其特征在于炎癥組織是兔子的皮膚組織。
12. 如權(quán)利要求1 11中任一項所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于 其為口服劑。
13. 如權(quán)利要求1 11中任一項所述的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，其特征在于 其為注射劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于，對作為抗癌劑給藥時的副作用而產(chǎn)生的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕，提供一種有效且安全性高的藥劑。本發(fā)明涉及痘菌病毒接種炎癥組織提取物的新型醫(yī)藥用途，涉及含有該提取物作為有效成分的末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑。將該提取物作為有效成分的本發(fā)明的藥劑，作為由抗癌劑給藥引起末梢神經(jīng)障礙的預(yù)防或減輕劑，作為副作用小且安全性高的藥劑而有用性高。
文檔編號A61P25/02GK101790377SQ20088010431
公開日2010年7月28日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者伊藤善規(guī), 大石了三, 江頭伸昭 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué);日本臟器制藥株式會社