專利名稱：：用于肺部投送的核酸微粒的制作方法
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：中眾所周知的修飾的堿基。這樣的堿基一般位于核苷酸糖基團(tuán)的r位置。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基團(tuán)。核苷酸在糖、磷酸和/或堿基部分上可以是修飾的或未修飾的(也可以互換地稱為核苷酸類似物、修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸等)?？梢砸氲胶怂嶂械幕瘜W(xué)修飾的和其它天然核酸堿基的某些非限制性的例子包括例如次黃嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基，假尿嘧啶、2,4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-垸基胞嘧啶核苷(例如5-甲基胞嘧啶核苷)、5-垸基尿嘧啶核苷(例如胸腺嘧啶核糖核苷)、5-鹵代尿嘧啶核苷(例如5-溴尿嘧啶核苷)或6-氮雜嘧啶或6-垸基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶核苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿嘧啶核苷、4-硫尿嘧啶核苷、懷丁苷(wybutosine)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞嘧啶核苷(acetyltidine)、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶核苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、(3-D-半乳糖Q核苷(galactosylqueosine)、1-甲基腺嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、2，2-二甲基鳥嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、2-甲基腺嘌呤核苷、2-甲基鳥嘌呤核苷、N6-甲基腺嘌呤核苷、7-甲基鳥嘌呤核苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲基羰基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基尿嘧啶核苷、5-甲基_2_硫尿嘧啶核苷、2_甲基硫代^6-異戊烯基腺嘌呤核苷、15-0-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸、2-硫胞嘧啶核苷、蘇氨酸衍生物等。"修飾的堿基"是指l'位的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶或其等價(jià)物之外的核苷酸堿基；這樣的堿基可以用在任何位置，例如在酶活性核酸分子的催化核心內(nèi)，和/或核酸分子的底物結(jié)合區(qū)域中。"核苷"是指雜環(huán)含氮堿基以N-糖苷鍵與糖相連。在本
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中，核苷被認(rèn)為包含了天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))和本
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中眾所周知的修飾的堿基。這樣的堿基一般位于核苷糖基團(tuán)的l'位置。核苷一般包含堿基和糖基團(tuán)。核苷在糖和/或堿基部分上可以是修飾的或未修飾的(也可以互換地稱為核苷類似物、修飾的核苷、非天然核苷、非標(biāo)準(zhǔn)核苷等)。在一個(gè)例子中，本公開的特征為帶有磷酸酯骨架修飾的修飾的酶活性核酸分子，該骨架修飾包含一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、嗎啉代、酰胺化的氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰亞胺鹽(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲縮醛(formacetal)、硫代甲縮醛和/或垸基甲硅垸基取代?？梢詫?duì)核酸(例如反義核酸和核酶)結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種不同的修飾，以增加這些分子的用途。例如，這樣的修飾可以增加儲(chǔ)存期限、體外半衰期、穩(wěn)定性以及將這樣的寡核苷酸導(dǎo)入靶位點(diǎn)的容易性，包括增加細(xì)胞膜的通透性以及賦予識(shí)別和結(jié)合靶細(xì)胞的能力。這些分子的使用，通過提供組合療法的可能性(例如靶向不同基因的多個(gè)酶活性核酸分子，結(jié)合有已知的小分子抑制劑的酶活性核酸分子，或用酶活性核酸分子(包括不同的酶活性核酸分子的基序)和/或其它化學(xué)或生物學(xué)分子的組合進(jìn)行間歇治療)，可以產(chǎn)生對(duì)疾病發(fā)展的更好的治療。用核酸分子對(duì)對(duì)象進(jìn)行治療，也可以包括不同類型的核酸分子的組合?？梢詫?duì)療法進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其包含針對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶的酶活性核酸分子(包括不同的酶活性核酸分子的基序)、反義分子和/或25A嵌合體分子的混合物，以緩解疾病的癥狀。正如上面提到的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有修飾過的核酸的微球，其中核酸與親脂性(或疏水性)成分結(jié)合。siRNA與親脂性成分的結(jié)合在本
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中是已知的(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No.20070298445，美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No.20070082845，美國(guó)專利Nos.5，B8，045、5，218，105和5,459,255，以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No,20070072904)，這種結(jié)合的siRNA的結(jié)合性質(zhì)已經(jīng)被表征。參見例如Wolfram等，NatureBiotechnology(2007)25:1149-1157(2007年9月16日在線公開)，其中描述了siRNA與膽固醇、硬脂酸、二十二垸酸、石膽酸-油酸、石膽酸或月桂酸的結(jié)合，它們中的某些與高密度脂蛋白顆粒相關(guān)聯(lián)，以及與短鏈和中鏈脂肪酸結(jié)合的siRNA，例如月桂?；?、肉豆寇?；妥貦磅；鵶iRNA，它們不與脂蛋白結(jié)合，但是與血清白蛋白相關(guān)聯(lián)，或保持在未結(jié)合的形式。Wolfram等還公開了膽固醇并不是唯一能夠?qū)iRNAs與脂蛋白顆粒結(jié)合的其它高親脂性結(jié)合物，例如長(zhǎng)鏈脂肪酸和膽汁酸，也能夠有效結(jié)合脂蛋白并介導(dǎo)siRNA攝入到細(xì)胞中。決定脂肪酸結(jié)合的siRNAs與脂蛋白顆粒的親和性的關(guān)鍵因素，是烷基鏈的長(zhǎng)度，它是親脂性的主要決定因素。在一系列脂肪酸siRNA結(jié)合物中，二十二垸基(C22)和硬脂酰基(C18)結(jié)合物在體內(nèi)顯示出與HDL的較強(qiáng)結(jié)合，并有效地沉默了基因表達(dá)，而月桂?；?C12)和肉豆蔻?；?C14)結(jié)合物以及其它中鏈和短鏈脂肪酸顯示出與脂蛋白顆粒的弱的相互作用。在其它情況下，Skobridis等ARKIVOC(2005)(vi)459-469描述了親脂性樹枝狀結(jié)構(gòu)塊(buildingblock)，并將它們摻入到寡核苷酸中。美國(guó)專利申請(qǐng)Nos.20060008822和20070275465公開了將配體與dsRNA結(jié)合可以增加其細(xì)胞吸收。例如，已將膽固醇與各種反義寡核苷酸結(jié)合，產(chǎn)生了與它們的未結(jié)合的類似物相比明顯更有活性的化合物。參見M.Manoharan，Antisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103。其它已經(jīng)與寡核苷酸結(jié)合的親脂性化合物包括l-芘丁酸，1，3-雙-0-(十六烷基)甘油和薄荷醇。申請(qǐng)還公開了其它親脂性成分，例如聚乙二醇化的甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、飽和的和單飽和的聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯，例如從對(duì)各種不同植物油的完全或部分氫化獲得的。在有利的情況下，這樣的油類可以由三、二和單脂肪酸甘油酯，以及相應(yīng)脂肪酸的二和單聚乙二醇酯構(gòu)成，其中特別優(yōu)選的脂肪酸組成包含癸酸4-10%、癸酸3-9%、月桂酸40-50%、肉豆蔻酸14-24%、棕櫚酸4-14%和硬脂酸5-15%。還描述了其它有用的成分，包含部分酯化的失水山梨糖醇和/或山梨糖醇，和飽和或單不飽和脂肪酸(SPAN-系列)或相應(yīng)的乙氧基化類似物(TWEEN-系列)，以及可商購(gòu)的成分例如Gelucire-系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol(都由法國(guó)的GattefosseCorporation,SaintPriest制造和分銷)、PEG-單油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-單月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、，聚山梨酸酯80等(由美國(guó)和世界范圍內(nèi)多家公司生產(chǎn)和分銷)。美國(guó)專利申請(qǐng)Nos,20050186591、20050288244、20070213292、20070275914、20060035254和20070161595描述了親脂性成分，包括膽固醇、脂類、油烯基、視黃基、膽固醇?xì)埢?、膽酸、金剛垸乙酸、l-芘丁酸、二氫睪酮、1，3-雙-0-(十六垸基)甘油、香葉基氧基己基、十六垸基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、03-(油?；?石膽酸、03-(油酰)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No,20060008822公開了將膽固醇與各種不同反義寡核苷酸結(jié)合，產(chǎn)生了與它們的非結(jié)合類似物相比明顯更有活性的化合物。參見M.Manoharan，Antisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103。其它已經(jīng)與寡核苷酸結(jié)合的親脂性化合物包括l-芘丁酸，1,3-雙-0-(十六垸基)甘油和薄荷醇。美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)Nos.20080039415、20070004667和20080039414公開了其它親脂性基團(tuán)，包括飽和或不飽和的線性、支鏈或環(huán)狀烷基、膽固醇或其衍生物。其它親脂性成分包括脂肪酸及其衍生物，包括直鏈、支鏈、飽和和不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、萜烯、膽汁酸和甾族化合物，包括膽固醇、維生素E、維生素K、維生素A、葉酸、陽(yáng)離子染料例如Cy3，及其衍生物或類似物。美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)No.20070026079公開了能夠增強(qiáng)化合物跨過鼻粘膜的投送的親脂性物質(zhì)，包括脂肪酸(例如棕櫚酸)、神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-I)、磷脂(例如磷脂酰絲氨酸)，和乳化劑(例如聚山梨酸酯80)，膽汁鹽例如脫氧膽酸鈉，和去污劑類的物質(zhì)，例如聚山梨酸酯80例如Tween,辛苯聚醇例如TritonX-100，以及?；?24，25-二氫夫西地酸鈉(STDHF)。本發(fā)明的各種其它方面和用于產(chǎn)生這些方面的方法，描述在美國(guó)專利申請(qǐng)Nos.:20040198640、20070173476、20050107325、20050119214、20040110296、20040249178、20050058982、20040171033禾口20050119470中。上面討論的每個(gè)專利和申請(qǐng)出版物的公開內(nèi)容，在其中描述的親脂性成分和親脂性成分與核酸的連接方面引為參考。C.制造微粒的方法在一個(gè)例子中，通過將水性非聚合性陽(yáng)離子溶液和水性核酸溶液混合并降低核酸的溶解度以形成微粒，來形成微粒。在另一個(gè)例子中，除了核酸和非聚合性陽(yáng)離子之外，反應(yīng)溶液還含有一種或多種水性或與水混溶的非離子聚合物。一般來說，這樣的過程包括通過例如將不同的溶液加熱到足夠的溫度(例如在37T:到95'C的范圍內(nèi))并持續(xù)一段足夠的時(shí)間(例如1分鐘到24小時(shí))，來溶解原料(例如核酸，非聚合性陽(yáng)離子和非離子聚合物)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"水性溶液"是指水或緩沖液?jiǎn)为?dú)作為溶劑的溶液，或水或緩沖液與一種或多種與水混溶的溶劑例如乙醇、DMSO、丙酮、N-甲基吡咯烷酮和2-吡咯烷酮混合；但是，優(yōu)選的水性溶液不含有可檢測(cè)的有機(jī)溶劑。本公開涉及核酸微粒組合物的生產(chǎn)方法和使用方法，該核酸例如但不限于反義寡核苷酸或siRNA分子。按照制造方法，將核酸(例如反義寡核苷酸，siRNA分子，或其兩種或多種的組合)溶解在含有一種或多種溶解的非聚合性陽(yáng)離子和一種或多種溶解的非離子聚合物的單相反應(yīng)溶液中。溶劑是水性的或與水混溶的(例如水、緩沖液)。然后將反應(yīng)溶液冷卻到低于活性試劑的相轉(zhuǎn)變溫度(不凝固)，由此使核酸分子和非聚合性陽(yáng)離子一起經(jīng)歷液-固相分離，以形成球形微粒，它構(gòu)成了懸浮在含有溶解的非離子聚合物和其它未摻入到核酸微粒中的成分的連續(xù)相中的不連續(xù)相。連續(xù)相本公開的制備核酸微粒的方法始于提供反應(yīng)混合物，其中一種或多種核酸、一種或多種非聚合性陽(yáng)離子和一種或多種非離子聚合物，基本上全部溶解在單一連續(xù)相中。反應(yīng)混合物的單一連續(xù)相是基于水的溶液，含有水性介質(zhì)，以及可選的與水混溶的有機(jī)溶劑或與水混溶的有機(jī)溶劑的混合物，或其組合。水性介質(zhì)可以是水、鹽溶液(例如普通鹽水)、緩沖溶液、緩沖鹽水等。適合的與水混溶的有機(jī)溶劑包括但不限于N-甲基-2-吡咯烷酮(N-甲基-2-吡咯垸酮)、2-吡咯垸酮(2-吡咯烷酮)、1,3-二甲基-2-咪唑垸酮(DMI)、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺、乙酸、乳酸、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、3-戊醇、正丙醇、苯甲醇、甘油、四氫呋喃(THF)、聚乙二醇(PEG)、PEG-4、PEG-8、PEG-9、PEG-12、PEG-14、PEG-16、PEG-120、PEG-75、PEG-150、聚乙二醇酯、PEG-4二月桂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-6異硬脂酸酯、PEG-8硬脂酸棕櫚酸酯、PEG-150硬脂酸棕櫚酸酯、聚乙二醇山梨糖醇酐、PEG-20山梨糖醇酐異硬脂酸酯、聚乙二醇單垸基醚、PEG-3二甲基醚、PEG-4二甲基醚、聚丙二醇(PPG)、聚丙烯藻酸酯、PPG-10丁二醇、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、PPG-15硬脂基醚、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇月桂酸酯，以及四氫呋喃醇聚乙二醇醚49(glycofurol)(四氫呋喃醇聚乙二醇醚)，鏈垸烴包括丙烷、丁垸、戊垸、己烷、庚垸、辛烷、壬垸、癸烷，或其組合。單一連續(xù)相(即反應(yīng)溶液)，可以通過將核酸、非聚合性陽(yáng)離子的鹽或氫氧化物、以及非離子聚合物以任何適合的次序(例如同時(shí)一起或彼此按順序)溶解在單一水性介質(zhì)中，或者通過提供這些成分的一種或兩種在相同或不同的水性介質(zhì)中的分開的溶液，然后將這些分開的溶液以任何適合的次序(例如同時(shí)一起或彼此按順序)混合，來制備。在反應(yīng)溶液和/或分開的溶液的形成中，可以任選地使用促進(jìn)各種不同成分溶解的物理手段，例如升高溫度(例如加熱)、降低壓力和/或調(diào)整pH，只要成分不受不利影響(例如核酸活性的降低，分子的降解或分解或交聯(lián))就行。在一個(gè)例子中，首先將核酸溶液與非離子聚合物溶液混合，然后將混合物與非聚合性陽(yáng)離子溶液混合。在另一個(gè)例子中，首先將非聚合性陽(yáng)離子溶液與非離子聚合物溶液混合，然后將混合物與核酸溶液混合。在另一個(gè)例子中，首先將核酸溶液與非聚合性陽(yáng)離子溶液混合，然后將混合物與非離子聚合物溶液混合。在另一個(gè)例子中，分別制備各種成分的濃縮儲(chǔ)液，并將儲(chǔ)液的等份試樣與適合的稀釋劑一起使用，以提供反應(yīng)溶液。從分開的溶液的組合得到的反應(yīng)混合物目測(cè)為單相溶液，其中沒有可見的相分離(例如混濁、乳白色、云霧狀、沉淀、結(jié)晶、乳劑、油-水分離)，或者是具有一定相分離的分散體系。在另一個(gè)例子中，在將分開的溶液在正常操作條件下(例如在環(huán)境溫度、大氣壓力下，進(jìn)行或不進(jìn)行連續(xù)攪拌)混合，可選地經(jīng)過一段足以允許反應(yīng)混合物達(dá)到平衡的溫育時(shí)間后(例如幾分鐘到幾小時(shí)，例如1小時(shí)或以下)，形成了目測(cè)透明的反應(yīng)溶液?？蛇x的溫育可以在正常操作條件下進(jìn)行，例如與分開的溶液進(jìn)行組合時(shí)相同的條件。在另一個(gè)例子中，通過一種或多種手段，例如加熱或冷卻到另一個(gè)預(yù)定的溫度，以及其它的溶解手段例如稀釋，作為分散體系的反應(yīng)混合物目測(cè)澄清。盡管反應(yīng)混合物在形成微粒前不必需是目測(cè)透明的，但是目測(cè)透明的反應(yīng)混合物允許對(duì)隨后形成的微粒的性質(zhì)(例如粒徑分布，空氣動(dòng)力學(xué)和幾何粒徑，顆粒形態(tài)學(xué)，顆粒均一性)進(jìn)行更高程度的控制。在另一個(gè)例子中，將分開的溶液預(yù)先加熱到共同的預(yù)定溫度或不同的預(yù)定溫度，然后以任何適合的次序混合(任選地在預(yù)熱的溫度下)，在組合后任選地加熱或冷卻到高于或低于預(yù)熱溫度的另一個(gè)溫度。非離子聚合物。本公開的非離子聚合物用于增強(qiáng)和/或誘導(dǎo)核酸從反應(yīng)溶液中的液-固相分離，其中核酸分子與非聚合性陽(yáng)離子聚集在一起變成固體或半固體，形成了微粒，作為可懸浮地分散在水性介質(zhì)中的不連續(xù)相，在水性介質(zhì)中非離子聚合物仍保持溶解。當(dāng)反應(yīng)溶液被帶到相分離條件下時(shí)，非離子聚合物降低了核酸的溶解度。適合的非離子聚合物包括但不限于可溶于或可混溶于水和/或反應(yīng)溶液的水性介質(zhì)的聚合物或聚合物的混合物。適合的非離子聚合物的例子包括線性或分枝非離子聚合物。水溶和/或與水混溶的非離子聚合物包括基于碳水化合物的非離子聚合物，非離子兩親性聚合物，非離子聚脂族醇，非離子聚(乙烯基)聚合物，非離子聚酯(例如非離子聚丙烯酸，非離子聚有機(jī)酸)，非離子聚氨基酸，非離子共聚物和非離子嵌段共聚物(例如泊洛沙姆(poloxamer)，例如PluronicsF127或F68)，非離子三元共聚物，非離子聚醚，天然存在的非離子聚合物，非離子聚酰亞胺，非離子環(huán)狀聚合物和非離子聚醛，可以單獨(dú)使用或其中的兩種或多種組合使用(例如任何兩種聚合物之間的重量比例為1:l到99:1)。優(yōu)選的非離子聚合物是對(duì)于核酸微粒所打算的給藥途徑來說，可接受作為藥物添加劑的非離子聚合物。包括分子量為lkD到1，000kD的聚乙二醇(PEG)，例如PEG3350、PEG8000、PEG10000、PEG20000等，分子量為lkD或以上的泊洛沙姆，例如PluronicsF127或PluronicsF68，聚乙烯吡咯垸酮(PVP)，以及它們的組合(例如PEG和PVP的1:1的混合物)。液-固相分離。核酸在反應(yīng)溶液中的液-固相分離可以通過本
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任何已知的方法來誘導(dǎo)，例如改變溫度、改變壓力、改變pH、改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度、改變其中一種或多種溶質(zhì)的濃度、改變?nèi)芤旱闹亓靠朔肿訚B透壓濃度，它們的組合等。在本公開的一個(gè)例子中，相變是通過將反應(yīng)溶液的溫度降低到低于溶解在反應(yīng)溶液中的核酸的相轉(zhuǎn)變溫度，并且不使整個(gè)反應(yīng)溶液凝固，而獲得的溫度誘導(dǎo)的相變。在冷卻過程中，對(duì)冷卻的速度進(jìn)行控制，以獲得具有所需尺寸和形狀的微粒。例如，已發(fā)現(xiàn)，在所有其它條件相同的情況下，冷卻速度與微粒的幾何尺寸顯示出反相關(guān)。也就是說，較慢的速度顯示出形成較大的微粒，而較快的速度顯示出形成較小的微粒。對(duì)于投送到潮濕或水性的耙位點(diǎn)例如肺中的區(qū)域來說，冷卻速度是o.orc/分鐘或更快，例如等于或大于下面的值，或者在任何兩個(gè)這樣的值之間的范圍內(nèi)0.05。c/分鐘，o.rc/分鐘，0.5'c/分鐘，rc/分鐘，3"C/分鐘，5'C/分鐘，1(TC/分鐘，2(TC/分鐘，5(TC/分鐘，10(TC/分鐘，200'C/分鐘，50(TC/分鐘，60(TC/分鐘。溫度變化的速度可以是恒定的或線性速度、非線性速度、斷續(xù)的或程序化的速度(具有多個(gè)相循環(huán))?？梢酝ㄟ^洗滌將核酸微粒從反應(yīng)溶液中分離，正如將在下面討論的。本公開考慮到了調(diào)節(jié)溶質(zhì)(例如核酸、非聚合性陽(yáng)離子、非離子聚合物)的濃度、溫度、壓力、pH、離子強(qiáng)度、重量克分子滲透壓濃度等，或反應(yīng)溶液的這些參數(shù)的任何組合，來控制(例如誘導(dǎo)或終止)或調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)、促進(jìn)、抑制)相變，在該相變中核酸分子從溶劑化狀態(tài)進(jìn)入聚集的固體狀態(tài)，而非離子聚合物和溶劑不經(jīng)歷相變。對(duì)于凝固點(diǎn)相對(duì)較高、或凝固點(diǎn)高于相轉(zhuǎn)變溫度的反應(yīng)溶液來說，反應(yīng)溶液可以包含一種或多種凝固點(diǎn)降低試劑，例如丙二醇、蔗糖、乙二醇、醇類(例如乙醇、甲醇)，或凝固點(diǎn)降低試劑的混合物，以降低反應(yīng)溶液的凝固點(diǎn)，從而允許核酸的相變發(fā)生，同時(shí)反應(yīng)溶液不凝固。使得當(dāng)反應(yīng)溶液的溫度降低到低于其凝固點(diǎn)時(shí)，過程也可以進(jìn)行。分離和洗滌微粒。在本公開的一個(gè)例子中，反應(yīng)溶液中含有分散在懸浮液中的新形成的核酸微粒的分散體系，適合照原樣用于最終用途。在另一個(gè)例子中，通過從反應(yīng)溶液中分離核酸微粒來收獲它們。在另一個(gè)例子中，分離的方法包括濃縮核酸微粒并用非溶劑的液體介質(zhì)洗滌它們，其中沒有摻入到微粒中的成分(例如非離子聚合物，過量的反應(yīng)試劑)溶解在該液體介質(zhì)中。濃縮微粒的非限制性的方法包括離心、透析和滲濾。洗滌的非限制性的方法包括滲濾、透析、離心洗滌。液體洗滌介質(zhì)可以是水性介質(zhì)或有機(jī)溶劑。對(duì)于具有低的水溶性的微粒來說，液體洗漆介質(zhì)可以是水性介質(zhì)或含有降低微粒的水溶性的試劑、例如本文公開的非聚合性陽(yáng)離子(例如二價(jià)陽(yáng)離子)的水性介質(zhì)。對(duì)于具有高的水溶性的活性試劑來說，可以使用有機(jī)溶劑或含有一種或多種溶解度降低試劑例如硫酸銨的水性溶劑。適合用作液體洗滌介質(zhì)的有機(jī)溶劑的例子包括上面具體指出的適于連續(xù)相的有機(jī)溶劑，更優(yōu)選二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、戊烷等。還考慮到了使用任何這些溶劑的混合物作為洗滌介質(zhì)。一種優(yōu)選的混合物是二氯甲烷或二氯甲垸與丙酮的1:l混合物。優(yōu)選情況下液體介質(zhì)具有低的沸點(diǎn)，以便容易通過例如冷凍干燥、蒸發(fā)或干燥進(jìn)行移除。液體洗滌介質(zhì)也可以是超臨界流體，例如接近其超臨界點(diǎn)的液態(tài)二氧化碳或流體。超臨界流體可以是非離子聚合物的適合溶劑，但是不是核酸微粒的溶劑。超臨界流體可以自身使用或與助溶劑一起使用?？梢允褂孟铝谐R界流體液態(tài)C02，乙烷，或氙。潛在的助溶劑可以是乙腈、二氯甲垸、乙醇、甲醇、水或2-丙醇。液體洗漆介質(zhì)還可以含有一種或多種用于降低微粒溶解性的試劑。最理想情況下，微粒在液體洗滌介質(zhì)中顯示出最小的溶解性，以使微粒的產(chǎn)率最大化。對(duì)于本公開的核酸微粒來說，溶解性降低試劑可以是任何本文公開的非聚合性陽(yáng)離子，包括但不限于Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3，。液體洗滌介質(zhì)也可以含有一種或多種可以為核酸或微粒提供附加特性的添加劑，例如增加微粒和/或其中核酸分子的穩(wěn)定性，核酸從微粒的受控釋放，或如前討論的核酸與生物學(xué)組織和細(xì)胞的改變的相互作用(例如通透性)?；谒姆椒?。在另一個(gè)例子中，反應(yīng)溶液是包含水性或與水混溶的溶劑的水性系統(tǒng)。適合的與水混溶的溶劑的例子，包括但不限于上面指出的用于連續(xù)相的那些。使用基于水的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，溶液可以被緩沖，并且可以含有提供例如生物化學(xué)穩(wěn)定作用的添加劑，以保護(hù)核酸分子。下面的表列出了示例性的核酸微粒制劑，其中鈣陽(yáng)離子被用作示例性非聚合性陽(yáng)離子。還列出了反應(yīng)溶液中相應(yīng)的最終鹽(非聚合性陽(yáng)離子的)濃度，[核酸]:[非聚合性陽(yáng)離子]的摩爾比，微粒的平均直徑，10%微粒的截止直徑(即10%的微粒具有等于或小于該值的直徑，而90%的微粒具有大于該值的直徑)，50%微粒的截止直徑，以及95%微粒的截止直徑。54<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>從上面的數(shù)據(jù)可以看出，0.333M和0.667M的鈣鹽濃度產(chǎn)生了同樣尺寸的微粒，1M和1.25M的鹽濃度產(chǎn)生了相對(duì)較小的微粒。這些以及相關(guān)的數(shù)據(jù)在下面進(jìn)一步詳細(xì)討論。這些數(shù)據(jù)證明，非聚合性陽(yáng)離子例如C^+的使用，使得形成的核酸微粒可以被容易地制備在用于肺部投送的可控尺寸范圍內(nèi)。在本發(fā)明的包含了微球的具體實(shí)施方案中，其中該微球含有被修飾以包含親脂性部分的核酸，提供了用于生產(chǎn)這種微球的方法，該方法包括將一種或多種修飾的核酸的水性溶液與一種或多種聚合物和一種或多種陽(yáng)離子的溶液的混合物加熱溫育，以及冷卻混合物以形成微球的步驟。在各種不同情況下，方法包括第一步將修飾的核酸溶解在水性溶液中，制備聚合物/陽(yáng)離子溶液，將修飾的核酸溶液與聚合物/陽(yáng)離子溶液混合，將修飾的核酸、聚合物和陽(yáng)離子的混合物在升高的溫度溫育一段設(shè)定的時(shí)間，以及以設(shè)定的速度冷卻混合物，以形成微球。在某些情況下，得到的微球是固體、球形和/或單分散的，或基本上固體、球形和/或單分散的。在提供的方法的各種不同情況下，在微球的生產(chǎn)中使用的聚合物是一種或多種線性聚合物(例如聚乙二醇，聚賴氨酸，葡聚糖等)，支鏈聚合物(參見例如Denkenwalter等1981年9月15日出版的美國(guó)專利No.4,289,872;Tam的1993年7月20日出版的美國(guó)專利No.5,229,490;Frechet等1993年10月28日公開的WO93/21259);脂類；膽固醇基團(tuán)(例如甾族化合物)；或碳水化合物或寡糖。其它可能的載體包括一種或多種水溶性聚合物附著物，例如聚乙二醇或聚丙二醇，如在美國(guó)專利No.4，640,835、4，496,689、4，301，144、4，670，417、4,791,192和4,179,337中描述的。其它在本
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中已知的有用聚合物包括單甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纖維素或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙垸共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及這些聚合物和本文描述的其它聚合物的混合物。在提供的方法中使用"一種或多種"聚合物，意指聚合物的混合物可以包含在方法中。在各種不同情況下，當(dāng)與修飾的核酸混合時(shí)，在方法中使用的聚合物或聚合物組合的終濃度為大約5%重量/體積(w/v)、5.1%w/v、5.2%w/v、5.30/0w/v、5.40/ow/v、5.5%w/v、5.6%w/v、5.7%w/v、5.8%w/v、5.9%w/v、6%w/v、6.1%w/v、6.2%w/v、6.3%w/v、6.4%w/v、6.5%Wv、6.6%w/v、6,7%w/v、6,8%w/v、6.9%w/v、7%w/v、7.1%w/v、7.20/ow/v、7.3%w/v、7.40/oWv、7.5%w/v、7.6%w/v、7.7%Wv、7.8%w/v、7.90/0w/v、8%w/v、8.1%w/v、8.2%w/v、8.30/ow/v、8.4%w/v、8.5%w/v、8.6%w/v、8.7%w/v、8.8%w/v、8.9%w/v、9%w/v、9.1%w/v、9.2%w/v、9.3%w/v、9.4%w/v、9.5%w/v、9.6%w/v、9.7%w/v、9,8%w/v、9.9%w/v、10%w/v、10.1Q/。w/v、10.2%w/v、10.3%w/v、10.4%w/v、10.5%w/v、10.6%w/v、10.7%w/v、10.8%w/v、10.9%w/v、11%\v/v、11.1%w/v、11.2%w/v、11.3%w/v、11.4%w/v、11.5%w/v、11.6%w/v、11.7%w/v、11.8%w/v、11.9%w/v、12%w/v、12.1%w/v、12.2%w/v、12.3%w/v、12.4%w/v、12.5%w/v、12.6%w/v、12.7%w/v、12.8%w/v、12.9%w/v、13%w/v、13.1%w/v、13.2%w/v、13.3%w/v、13.4%w/v、13.5%w/v、13.6%w/v、13.7%w/v、13.8%w/v、13.9%w/v、14%w/v、14.1%w/v、14.2%w/v、14.3%w/v、14.4%w/v、14.5%w/v、14.6%w/v、14.7%w/v、14.8%w/v、14.9%w/v、150/ow/v、15.10/ow/v、15.2%w/v、15.3%w/v、15.4%w/v、15.5%w/v、15.6%w/v、15.7%w/v、15.8%w/v、15.9%w/v、16%w/v、16.1%w/v、16.2%w/v、16.3%w/v、16.4%w/v、16.5%w/v、16.6%w/v、16.7%w/v、16.8%w/v、16.9%w/v、17%w/v、17.1%w/v、17.2%w/v、17.3%w/v、17.4%w/v、17.5%w/v、17.6%w/v、17.70/ow/v、17.8%w/v、17.9%w/v、18%w/v、18.1%油、18.2%w/v、18.3%w/v、18.4%w/v、18.5%w/v、18.6%w/v、18.70/0w/v、18.8%w/v、18.9%w/v、19%w/v、19.1%w/v、19,2%w/v、19.3%w/v、19.4%w/v、19.5%w/v、19.6%w/v、19.7%w/v、19.8%w/v、19.9%w/v、20%w/v、20.1%w/v、20.2%w/v、20.3%w/v、20.4%w/v、20.5%w/v、20.6%w/v、20.7%w/v、20.8%w/v、20.9%w/v、210/0w/v、21.1%w/v、21.2%w/v、21.3%w/v、21.4%w/v、21.5%w/v、21.6%w/v、21.7%w/v、21.8%w/v、21.9%w/v、22%w/v、22.1%w/v、22.2%w/v、22.3%w/v、22.4%w/v、22.5%w/v、22.6%w/v、22.7%Wv、22.8%油、22.9%w/v、23%w/v、23.1%w/v、23.2%w/v、23。.3%w/v、23.4%w/v、23.5%w/v、23.6%w/v、23.7%w/v、23.8%w/v、23.9%Wv、24%w/v、24.1%w/v、24.2%w/v、24.3%w/v、24.4%w/v、24.5%w/v、24.6%w/v、24.7%w/v、24.8%w/v、24.9%w/v、25%w/v、25.1%w/v、25.2%w/v、25.3%w/v、25.4%w/v、25.5%w/v、25.6%w/v、25.7%w/v、25.8%w/v、25.9%w/v、26%w/v、26.1%w/v、26.2%w/v、26.3%w/v、26.40/0w/v、26.5%w/v、26.6%w/v、26.7%w/v、26.8%Wv、26.9%w/v、27%w/v、27.1%w/v、27.2%w/v、27.3%w/v、27.4%w/v、27.5%w/v、27.6%w/v、27.7%w/v、27.8%w/v、27.9%w/v、28%w/v、28.10/0w/v、28.2%w/v、28.3%w/v、28.4%w/v、28.5%Wv、28.6%w/v、28.7%w/v、28.8%w/v、28.9%w/v、29%w/v、29.1%w/v、29.2%w/v、29.3%w/v、29.4%w/v、29.5%w/v、29.6%w/v、29.7%Wv、29.8%w/v、29.9%w/v、30%Wv、30.1%w/v、30.2%w/v、30.3%w/v、30.40/ow/v、30.5%w/v、30.6%w/v、30.7%w/v、30.8%w/v、30.9%w/v、31%w/v、31.1%w/v、31.2%w/v、31.3%w/v、31.4%w/v、31.5%w/v、31.6%w/v、31.7%w/v、31.8%w/v、31.9%w/v、32%w/v、32.1%w/v、32.2%w/v、32.3%w/v、32.4%w/v、32.5%w/v、32.6%w/v、32.7%w/v、32.8%w/v、32.90/0w/v、33%w/v、33.10/0w/v、33.2%w/v、33.3%w/v、33.4%w/v、33.5%w/v、33.6%w/v、33.7%w/v、33.8%w/v、33.9%w/v、34%w/v、34.1%w/v、34.2%w/v、34.30/0w/v、34.線w/v、34.5%w/v、34.6%w/v、34.7%w/v、34.8%w/v、34.9%w/v、35%w/v或以上。在含有修飾核酸的微球的制備方法中，在一種情況下，使用的陽(yáng)離子是本文中描述的和/或本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的多價(jià)陽(yáng)離子，在方法中，多價(jià)陽(yáng)離子與修飾核酸以下面的陽(yáng)離子核酸摩爾比進(jìn)行混合大約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:K38:1、39:1、40.'1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48':1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:I、57:1、58:1、59:1、60-1、61:K62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:I、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:K80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、101:1、102:1、103:1、104:1、105:1、106:1、107:1、108:1、109:1、110、110:1、111:1、112:1、113:1、114:1、115:1、116:1、117:1、118:119:1、120:1、121:1、122:1、123:1、124:1、125:1、126:1、127:1、128:1、129:1、130:1、131:1、132:1、133:1、134:1、135:1、136:1、137:1、138:1、139:1、140:1、141:1、142:1、143:1、144:1;145:1、146:1、147:1、148:1、149:1、150:1、151:1、152:1、153:1、154:1、155:1、156:1、157:1、158:1、159:1、160:1、161:1、162:1、163:1、164:1、165:1、166:1、167:1、168:1、169:1、170:1、171:1、172:1、58173:1、174:1、175:1、176:1、177:1、178:1、179:1、180:1、181:1、182:1、183:1、184.'1、185:1、；186:1、187:1、188:1、189:1、190:1、191:1、192:1、193:1、194:1、195:1、196:1、197:1、198:1、199:1、200:1、201:1、202:1、203:1、204:1、205:1、206:1、207:1、208:1、209:1、210:1、211:1、212:1、213:1、214:1、215:1、216:1、217:1、218:1、219:1、220:1、221:1、222:1、223:1、224:1、225:1、226:1、227:1、228:1、229:1、230:1、231:1、232:1、233:1、234:1、235:1、236:1、237:1、238:1、239:1、240:1、241:1、242:1、243:1、244:1、245:1、246:1、247:1、248:1、249:1、250:1、251:1、252:1、253:1、254:1、255:1、256:1、257:1、258:1、259:1、260:1、261:1、262:1、263:1、264:1、265:1、266:1、267:1、268:1、269:1、270:1、271:1、272:1、273:1、274:1、275:1、276:1、277:1、278:1、279:'1、280:1、281:1、282:1、283:1、284:I、285:1、286:1、287:1、288:1、289:1、290:1、291:1、292:1、293:1、294:1、295:1、296:1、297:1、298:1、299:1、300:1、301:1、302:1、303:1、304:1、305:1、306:1、307:1、308:1、309:1、310:1、311:1、312:1、313:1、314:1、315:1、316:1、317:1、318:1、319:1、320:1、321:1、322:1、323:1、324:1、325:1、326:1、327:1、328:1、329:1、330:1、331:1、332:1、333:1、334:1、335:1、336:1、337:1、338:1、339:1、340:1、341:1、342:1、343:1、344:1、345:1、346:1、347:1、348:1、349:1、350:1、351:1、352:1、353:1、354:1、355:1、356:1、357:1、358:1、359:1、360:1、361:1、362:1、363:1、364:1、365:1、366:1、367:1、368:1、369:1、370:1、371:1、372:1、373:1、374:1、375:1、376:1、377:1、378:1、379:1、380:1、381:1、382:1、383:1、384:1、385:1、386:I、387:1、388:I、389:1、390:1、391:1、392:1、393:1、394:1、395:1、396:1、397:1、59398:1、399:1、400:1、401:1、402:1、403:1、404:1、405:1、406:1、407:1、408:1、409:1、410:1、411:1、412:1、413:1、414:1、415:1、416:I、417:1、418:1、419:1、420:1、421:1、422:1、423:1、424:1、425:1、426:1、427:1、428:1、429:1、430:1、431:1、432:1、433:1、434:1、435:1、436:1、437:1、438:1、439:1、440:1、441:1、442:1、443:1、444:I、445:1、446:1、447:I、448:1、449:1、450:1、451:1、452:1、453:1、454:1、455:1、456:1、457:1、458:1、459:1、460:1、461:1、462:1、463:1、464:1、465:1、466:1、467:1、468:1、469:1、470:1、471:1、472:1、473:1、474:1、475:1、476:1、477:1、478:1、479:1、480:1、48h1、482:1、483:1、484:1、485:1、486:1、487:1、488:1、489:1、490:1、49h1、492:1、493:1、494:1、495:1、496:1、497:1、498:1、499:1、500:1、550:1、600:1、650:1、70O:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1、1000:1、1100:1、1200:1、1300:1、1400:、1500:1、1600:1、1700:1、1800:1、1、2000:1、2100:1、2200:1、23001、2400:1、2500:1、2600:1、2700:1、2800:1、2卯0:1、3000:1、3100:1、3200:1、3300:1、3400:1、3500:1、3600:I、37001、3800:1、3900:1、4000:1、41001、4200:1、4300:1、44001、4500:1、4600:1、4700:1、4800:1、4900:1、5000:1、51001、5200:1、5300:1、5400:1、5500:1、5600:1、5700:1、5800:1、5卯0:1、6000:1、61001、6200:1、6300:1、6400:1、6500:1、6600:1、67001、6800:1、6卯0:1、7000:1、7100:1、7200.1、7300:1、7400:1、7500:1、7600:1、7700:1、7800:1、7900:1、8000:1、8100:1、8200:1、8300:1、8400:1、8500:1、8600:1、8700:1、8800:1、8卯0:1、■0:1、9100:1、9200:1、9300:1、9400:1、9500:1、9600:1、9700:1、9800:1、99001、0000:1或以上。在聚陽(yáng)離子、水溶性聚合物和核酸的混合物中，聚陽(yáng)離子的濃度為大約5mM到大于1M，或從大約10mM到大約20mM、到大約25nM或到大約35mM，以及在這些范圍內(nèi)的所有濃度。更具體來說，聚陽(yáng)離子的終濃度是大約5mM、大約10mM、大約15mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約35mM、大約40、大約45mM、大約50mM、大約55mM、大約60mM、大約65mM、大約70mM、大約75mM、大約80、大約85mM、大約90mM、大約95mM、大約100mM、105mM、大約110mM、大約115mM、大約120mM、大約125mM、大約130mM、大約135mM、大約140、大約145mM、大約150mM、大約155mM、大約160mM、大約165mM、大約170mM、大約175mM、大約180、大約185mM、大約190mM、大約195mM、大約200mM、205mM、大約210mM、大約215mM、大約220mM、大約225mM、大約230mM、大約235mM、大約240、大約245mM、大約250mM、大約255mM、大約260mM、大約265mM、大約270mM、大約275mM、°大約280、大約285mM、大約290mM、大約295mM、大約300mM、大約305mM、大約310mM、大約315mM、大約320mM、大約325mM、大約330mM、大約335mM、大約340、大約345mM、大約350mM、大約355mM、大約360mM、大約365mM、大約370mM、大約375mM、大約380、大約385mM、大約3卯mM、大約395mM、大約400mM、大約405mM、大約410mM、大約415mM、大約420mM、大約425mM、大約430mM、大約435mM、大約440mM、大約445mM、大約450mM、大約455mM、大約460mM、大約465mM、大約470mM、大約475mM、大約480、大約485mM、大約4卯mM、大約495mM、大約500mM、505mM、大約510mM、大約515mM、大約520mM、大約525mM、大約530mM、大約535mM、大約540、大約545mM、大約550mM、大約555mM、大約560mM、大約565mM、大約570mM、大約575mM、大約580、大約585mM、大約590mM、大約595mM、大約600mM、605mM、大約610mM、大約615mM、大約620mM、大約625mM、大約630mM、大約635mM、大約640、大約645mM、大約650mM、大約655mM、大約660mM、大約665mM、大約670mM、大約675mM、大約680、大約685mM、大約690mM、大約695mM、大約700mM、大約705mM、大約710mM、大約715mM、大約720mM、大約725mM、大約730mM、大約735mM、大約740、大約745mM、大約750mM、大約755mM、大約760mM、大約765mM、大約770mM、大約775mM、大約780、大約785mM、大約7卯mM、大約795mM、大約800mM、大約805mM、大約810mM、大約815mM、大約820mM、大約825mM、大約830mM、大約835mM、大約840、大約845mM、大約850mM、大約855mM、大約860mM、大約865mM、大約870mM、大約875mM、大約880、大約885mM、大約8卯mM、大約895mM、大約900mM、大約905mM、大約910mM、大約915mM、大約920mM、大約925mM、大約930mM、大約935mM、大約940、大約945mM、大約950mM、大約955mM、大約960mM、大約965mM、大約970mM、大約975mM、大約980、大約985mM、大約990mM、大約995mM、大約1M、大約1.1M、大約1.2M、大約1.3M、大約1.4M、大約1.5M、大約1.6M、大約1.7M、大約1.8M、大約1.9M、大約2.0M、大約2.1M、大約2.2M、大約2.3M、大約2.4M、大約2.5M、大約2.6M、大約2.7M、大約2.8M、大約2.9M、大約3.0M或高于3M。在制備含有修飾的核酸的微球的方法中，核酸水性核酸溶液與聚合物/陽(yáng)離子溶液的溫育在大約2(TC、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29。C、30°C、31°C、32。C、33°C、34°C、35°C、36°C、37。C、38°C、39。C、40°C、41。C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51。C、52。C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C、63。C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69°C、70°C、71。C、72°C、73°C、74°C、75。C、76°C、77°C、78。C、79。C、80°C、81°C、82。C、83°C、84°C、85。C、86°C、87°C、88°C、89°C、卯°C、91。C、92。C、93。C、94°C、95。C、96。C、97°C、98°C、99。C、100r或更高的溫度下進(jìn)行。該溫育步驟進(jìn)行大約i分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、IO分鐘、ll分鐘、12分鐘、13分鐘、14分鐘、15分鐘、16分鐘、17分鐘、18分鐘、19分鐘、20分鐘、21分鐘、22分鐘、23分鐘、24分鐘、25分鐘、26分鐘、27分鐘、28分鐘、29分鐘、30分鐘或以上。在溫育步驟完成后，然后將混合物冷卻到最終溫度大約低于-l(TC、到大約-l(TC、到大約-9°C、到大約-8'C、到大約-7。C、到大約-6'C、到大約-5'C、到大約-4'C、到大約-3"c、到大約-2。c、到大約-rc、到大約o'c、到大約rc、到大約2°C、到大約3°C、到大約4°C、到大約5'C、到大約6°C、到大約7°C、到大約8r、到大約9'C、到大約1(TC或以上，冷卻步驟的進(jìn)行使得溫度以下述的速度降低大約低于大約o.rc/分鐘，直到大約o.rc/分鐘、O.ll'C/分鐘、0.12。C/分鐘、0.13。C/分鐘、0.14。C/分鐘、0.15tV分鐘、0.16。C/分鐘、0.17。C/分鐘、0.18。C/分鐘、0.19。C/分鐘、0.2。C/分鐘、0.2rC/分鐘、0.22t:/分鐘、0.23。C/分鐘、0.24。C/分鐘、0.25。C/分鐘、0.26°C/分鐘、0.27。C/分鐘、0.28'C/分鐘、0.29'C/分鐘、0.3。C/分鐘、分鐘、0.32。C/分鐘、0.33。C/分鐘、0.34。C/分鐘、0.35。C/分鐘、分鐘、0.37tV分鐘、分鐘、0.42'C/分鐘、分鐘、0.47'C/分鐘、分鐘、0.52'C/分鐘、分鐘、0.57。C/分鐘、分鐘、0.62匸/分鐘、分鐘、0.67。C/分鐘、分鐘、0.72'C/分鐘、分鐘、0.77"C/分鐘、分鐘、0.82'C/分鐘、分鐘、0.87"/分鐘、分鐘、0.92'C/分鐘、分鐘、0.97°(:/分鐘、0.38。C/分鐘、0.43。C/分鐘、0.48。C/分鐘、0.53'C/分鐘、0.58。C/分鐘、0.63。C/分鐘、0.68"C/分鐘、0.73。C/分鐘、0.78i:/分鐘、0.83'C/分鐘、0.88'C/分鐘、0.93'C/分鐘、0.98"C/分鐘、0.4(TC/分鐘、0.45匸/分鐘、0.5(TC/分鐘、0.45。C/分鐘、0.6(TC/分鐘、0.65'C/分鐘、0.7(TC/分鐘、0.75'C/分鐘、0.8(TC/分鐘、0.85'C/分鐘、0.9(TC/分鐘、0.95。C/分鐘、0.39。C/分鐘、0.44'C/分鐘、0.49'C/分鐘、0.54°。/分鐘、0.59。C/分鐘、0.64。C/分鐘、0.69r/分鐘、0.74IV分鐘、0.79'C/分鐘、0.84'C/分鐘、0.89'C/分鐘、0.94'C/分鐘、0.99。C/分鐘、1.(TC/分鐘、2.0。C/分0.31。C/0.36°C/0.41。C/0.46°C/0.5rc/0.56°C/0.6rc/0.66。C/o.7rc/0.76°C/0.81°C/0.86°C/0.9I°C/0.96。C/鐘、3.0。C/分鐘、4.0。C/分鐘、5.(TC/分鐘、6.0。C/分鐘、7.0。C/分鐘、8.0°C/分鐘、9.0。C/分鐘10.0。C/分鐘、11.(TC/分鐘、12.(TC/分鐘、13.(TC/分鐘、14.0。C/分鐘、15.0。C/分鐘、16.(TC/分鐘、17.(TC/分鐘、18.(TC/分63鐘、19.0'C/分鐘、20.0。C/分鐘、21.0。C/分鐘、22.0'C/分鐘、23.0。C/分鐘、24.CTC/分鐘、25.0。C/分鐘、26.0。C/分鐘、27.0。C/分鐘、28.0。C/分鐘、29.0。C/分鐘、30.0。C/分鐘、31.0。C/分鐘、32.0。C/分鐘、33.0。C/分鐘、34.0。C/分鐘、35.0。C/分鐘、36.0。C/分鐘、37.0。C/分鐘、38.0。C/分鐘、39.0。C/分鐘、40.0。C/分鐘、41.(TC/分鐘、42.0。C/分鐘、43.0。C/分鐘、44.0。C/分鐘、45.0。C/分鐘、46.0。C/分鐘、47.0。C/分鐘、48.0。C/分鐘、49.0tV分鐘、50.0'C/分鐘或更快。瞬間冷卻步驟也可以考慮。盡管不受任何具體作用機(jī)制的束縛，冷卻步驟以及它進(jìn)行的方式，在決定獲得的微球的尺寸中發(fā)揮了作用。在方法的冷卻步驟后，可選地將微球收集，洗滌，重新懸浮，和/或干燥成粉末。在一種情況下，本發(fā)明的含有一種或多種修飾核酸的微球，能夠進(jìn)入細(xì)胞并執(zhí)行生物學(xué)功能，并至少與不成為微球的一部分或沒有按照本文的描述進(jìn)行修飾的相同的核酸同樣有效。在另一種情況下，本發(fā)明的含有一種或多種修飾核酸的微球，與不成為微球的一部分或沒有按照本文的描述進(jìn)行修飾的相同的核酸相比，能夠更有效地進(jìn)入細(xì)胞并執(zhí)行生物學(xué)功能。D.含有微粒的藥物組合物正如本文提到的，制備本公開的組合物是為了投送到潮濕或水性的耙位點(diǎn)，例如肺部。制備了組合物，使得它們可以是可吸入的形式?？晌胄问娇梢允歉煞?，含有或不含可藥用賦形劑或稀釋劑，或者可吸入形式可以是定劑量的基于推進(jìn)劑的分散體系的形式。但是，核酸微粒本身不含任何賦形劑基質(zhì)，并且當(dāng)使用賦形劑時(shí)不與賦形劑形成較大的顆粒。可吸入形式可以通過使用吸入器或鼻噴入法進(jìn)行口腔或鼻內(nèi)投送。因此，本公開提供了用于患者治療的自身給藥方法。這種給藥可以在醫(yī)院、醫(yī)生辦公室中使用，也可以在醫(yī)院或醫(yī)生辦公室之外由非醫(yī)務(wù)人員使用，用于本公開的組合物的鼻部或吸入劑自身給藥。因此，在本公開的某些情況下，提供了用于患者自身給藥本公開的組合物的裝置，該裝置包含鼻吸入器，含有本公開的組合物的氣溶膠制劑以及可藥用的分散劑，其中裝置可以定量，以分散含有所需劑量的本公開的組合物的一定量的氣溶膠制劑，用于緩解或治療正在治療的疾病的癥狀。分散劑可以是任何在吸入劑和噴灑組合物中通常使用的分散劑，例如表面活性劑，例如但不限于聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸醇、以及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，或甚至是基于磷脂的表面活性劑。但是，應(yīng)該指出，本公開的可吸入裝置不需要必需使用這樣的分散劑。在優(yōu)選的例子中，本公開的組合物將采取干粉氣溶膠劑型，其中組合物作為分得很細(xì)的粉末存在。干粉制劑還可以含有增量劑，例如但不限于乳糖、山梨糖醇、蔗糖和甘露糖醇。在另一個(gè)具體的例子中，氣溶膠制劑可以是液體氣溶膠制劑，它還含有可藥用的稀釋劑，例如但不限于無菌水、鹽水、緩沖鹽水和葡萄糖溶液。因此，一般來說，組合物優(yōu)選被制備成適合于鼻內(nèi)或吸入給藥或粘膜給藥的制劑或藥物組合物。在本文中使用時(shí)，用于投送到粘膜的組合物和制劑包括可以治療性、預(yù)防性或診斷性投送到頰粘膜、食管粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、支氣管粘膜、子宮粘膜和子宮內(nèi)膜以及它們的惡性細(xì)胞類型的組合物和制劑。適合的制劑可以用粘膜通透增強(qiáng)劑配制，以便于本公開的組合物的投送。粘膜通透增強(qiáng)劑是增加本公開的組合物的跨粘膜穿透速度或便利性的試劑，例如但不限于膽汁鹽、脂肪酸、表面活性劑或醇類。在具體的例子中，通透增強(qiáng)劑可以是膽酸鈉、十二垸基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸鈉、二甲基亞砜或乙醇。制劑也可以被制備成具有最適于溶解性、藥物穩(wěn)定性、通過鼻粘膜的吸收和其它因素的pH。因此，本發(fā)明提供了用于將本發(fā)明的治療性、預(yù)防性或診斷性微粒組合物投送到粘膜的方法，包括將靶粘膜與微粒組合物相接觸的步驟，其中該微粒組合物的量能夠有效穿透并作用在靶粘膜上或中。本公開的組合物以治療有效的量、即能夠有效證實(shí)所需的藥物活性的量投送。根據(jù)本公開，給定核酸的治療有效的量取決于它所投送的耙。投送的治療結(jié)果，可以是被靶向的疾病的一種或多種癥狀的減少或緩解，和/或被靶向的具體核酸的表達(dá)、或作為靶向的結(jié)果其表達(dá)降低了的蛋白的活性的降低。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"氣溶膠"是指空氣中的懸浮物。具體來說，氣溶膠是指本公開的制劑的顆?；蜢F化及其在空氣中的懸浮物。根據(jù)本公開，氣溶膠制劑是含有本公開的用于鼻部吸入或通過口腔進(jìn)行肺部給藥的微粒的制劑。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"吸入器"是指用于例如溶液中、粉末等的藥物的鼻部和肺部給藥的裝置。例如，術(shù)語(yǔ)"吸入器"包含了推進(jìn)劑驅(qū)動(dòng)的吸入器，例如用于急性哮喘發(fā)作的抗組胺藥物給藥的吸入器，以及塑料噴灑瓶，例如用于充血緩和劑給藥的噴灑瓶。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"分散劑"是指幫助本公開的組合物的氣溶膠化、或這些組合物在粘膜組織中的吸收、或二者的試劑。但是，應(yīng)該指出，本公開的微粒，由于均勻的粒徑分布和它們的尺寸范圍，具有特別好的空氣動(dòng)力學(xué)特性。在具體的情況下，分散劑可以是粘膜通透增強(qiáng)劑。優(yōu)選情況下，分散劑是可藥用的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"可藥用的"意指被聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列于美國(guó)藥典或其它通常認(rèn)可的藥典中，可用于動(dòng)物、更具體來說人類中。66本公開的微粒是不聚集的，因此，不是必需使用試劑來促進(jìn)顆粒的分散和"分離"。但是，如果使用分散劑，它們可以包括表面活性劑等。在本
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中，這樣的表面活性劑一般用于減少由形成液體氣溶膠的溶液的霧化引起的被投送藥劑的表面誘導(dǎo)的聚集，并可用在本公開的方法和裝置中。這樣的表面活性劑的例子包括但不限于表面活性劑例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。使用的表面活性劑的量可以變化，一般在制劑重量的0.001%到4%的范圍內(nèi)。適合的表面活性劑在本
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是公知的，可以在所需性質(zhì)的基礎(chǔ)上，根據(jù)具體的制劑、寡核苷酸的濃度、稀釋劑(在液體制劑中)或粉末的形式(在干粉制劑中)等進(jìn)行選擇。對(duì)于液體氣溶膠制劑來說，寡核苷酸微?？梢院性谏砜山邮艿南♂寗┲械姆稚?。本公開的干粉氣溶膠制劑含有分得很細(xì)的冷凍干燥形式的微粒，以及可選的分散劑。"凍干"或冷凍千燥是指通過快速冷凍并在冷凍狀態(tài)下脫水(有時(shí)稱為升華)來制備干燥形式的微粒組合物。冷凍干燥在能夠引起脂類結(jié)晶的溫度下發(fā)生，以形成脂類基質(zhì)。該過程可以在真空下、在包含容器的環(huán)境溫度為大約室溫的情況下足以維持產(chǎn)物冷凍的壓力下發(fā)生，該壓力優(yōu)選低于大約500mTorr、更優(yōu)選低于大約200mTorr、更優(yōu)選低于大約1mTorr。對(duì)于無論是液體還是干粉氣溶膠制劑來說，制劑應(yīng)該被氣溶膠化，以確保氣溶膠化的藥劑事實(shí)上到達(dá)了鼻腔通道或肺的粘膜。術(shù)語(yǔ)"氣溶膠顆粒"在本文中用于描述適合用于鼻部或肺部給藥、即將會(huì)到達(dá)粘膜的液體或固體顆粒。其它參數(shù)，例如投送裝置的結(jié)構(gòu)、制劑中的其他成分、以及顆粒的特性，也應(yīng)該予以考慮。藥物的鼻部或肺部給藥的這些方面在本
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中是公知的，制劑的操作、氣溶膠化的手段以及投送裝置的結(jié)構(gòu)，至多需要本
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普通技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于投送方法來說，任何本
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中己知的氣溶膠化形式，包括但不限于噴灑瓶、液體制劑的霧狀化、霧化或泵氣溶膠化，以及干粉制劑的氣溶膠化，都可用于本公幵的實(shí)踐中。正如上面提到的，在本公開的優(yōu)選情況下，用于氣溶膠化的裝置是可吸入的干粉形式，在其它優(yōu)選例子中，裝置是定劑量的藥劑吸入器。定劑量的藥劑吸入器在給藥時(shí)提供了特定的劑量，而不是根據(jù)給藥而變化的劑量。這種定劑量的吸入器可以用于液體或干粉氣溶膠制齊J。定劑量的吸入器在本
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中是眾所周知的。對(duì)于鼻部給藥來說，有用的裝置是小的、堅(jiān)硬的瓶子，其上連接有定劑量的噴灑器。在一個(gè)例子中，定劑量藥劑通過將微粒溶液抽入具有確定體積的室來進(jìn)行投送，該室具有孔隙，其尺寸使得當(dāng)室中的液體被壓縮時(shí)通過形成噴霧進(jìn)行氣溶膠制劑的氣溶膠化。將室壓縮可以進(jìn)行制劑給藥。在具體的例子中，室是活塞裝置。這樣的裝置是可商購(gòu)的?？蛇x地，塑料擠瓶帶有孔隙或開口，其尺寸使得當(dāng)擠壓時(shí)通過形成噴霧進(jìn)行氣溶膠制劑的氣溶膠化。開口通常被發(fā)現(xiàn)在瓶子的頂部，頂部通常是尖的，與鼻腔通道部分契合，用于有效地給藥氣溶膠制劑。優(yōu)選情況下，鼻吸入器將提供定量的氣溶膠制劑，用于給藥確定劑量的待給藥組合物。通常，用于吸入到肺中的液體或干粉制劑的氣溶膠化將需要推進(jìn)劑。推進(jìn)劑可以是任何在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中常用的推進(jìn)劑。這些可用的推進(jìn)劑的具體的、非限制性的例子是氯氟烴、氫氟烴、氫氯氟烴或烴類，包括三氟甲烷、二氯二氟甲垸、二氯四氟乙醇和1,1，1，2-四氟乙烷，或其組合。68也考慮到了液體氣溶膠制劑和劑量形式。一般來說，這樣的劑量形式包含在可藥用稀釋劑中的組合物。在這種液體氣溶膠制劑中的可藥用稀釋劑包括但不限于無菌水、鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖溶液等。在具體的例子中，可用于本公開或本公開的藥物制劑中的稀釋劑，是磷酸鹽緩沖的鹽水或緩沖的鹽水溶液，其pH—般在7.0-8.0的范圍內(nèi)，或者是水。此外，本例中的制劑也可以包含其它用于pH維持、溶液穩(wěn)定、或用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑。試劑的例子包括但不限于鹽類，例如氯化鈉或氯化鉀，以及碳水化合物例如葡萄糖、半乳糖或甘露糖等。E.顆粒的體內(nèi)投送本公開中的核酸微粒適合于通過適當(dāng)?shù)耐緩襟w內(nèi)投送給對(duì)象，例如可注射、表面、口部、直腸、鼻部、肺部、陰道、頰、舌下、透過皮膚、透過粘膜、耳部、眼內(nèi)或眼部途徑。微?？梢宰鳛榉€(wěn)定的液體懸浮液投送，或配制成固體劑型例如干粉。優(yōu)選的投送途徑是肺部，它包括口腔和鼻部投送。在這種投送途徑中，可以選擇性地設(shè)計(jì)微粒，以沉積在肺的深部、上呼吸道、或呼吸道的任何地方。微粒可以作為干粉通過干粉吸入器投送，它們也可以通過定劑量的藥劑吸入器或噴霧器進(jìn)行投送。打算全身性起作用的藥物，理想情況下沉積在肺泡中，在那里有非常大的表面積，適于吸收到血流中。當(dāng)將藥物沉積定向于肺中的某些區(qū)域時(shí)，可以通過操縱微粒的基本物理學(xué)性質(zhì)、例如形狀和尺寸，將微粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑調(diào)整到最適的范圍內(nèi)。被吸入的藥物顆粒的可接受的可呼吸級(jí)份，通常通過向配方中添加賦形劑來獲得，賦形劑或者摻入到顆粒組合物中，或者作為與藥物顆粒的混合物。例如，通過與較大顆粒的(30-90)im)惰性載體顆粒例如海藻糖、乳糖或麥芽糖糊精進(jìn)行混合，實(shí)現(xiàn)了微米級(jí)藥物顆粒(大約5pm)的改進(jìn)的分散。較大的賦形劑顆粒增加顆粒的流動(dòng)性質(zhì)，它與改進(jìn)的藥效作用相關(guān)。在進(jìn)一步的改良中，賦形劑被直接摻入到小的球形顆粒中，以影響氣溶膠的性能，并潛在地增強(qiáng)蛋白藥物的穩(wěn)定性。一般來說，選擇以前已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于吸入的賦形劑，例如乳糖，或肺內(nèi)源性的有機(jī)分子，例如白蛋白和DL-a-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。其它的賦形劑，例如聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)已經(jīng)被用于對(duì)顆粒進(jìn)行工程化改造，使其具有所需的物理和化學(xué)特性。但是，使用FDA批準(zhǔn)的賦形劑的大多數(shù)吸入經(jīng)驗(yàn)是使用哮喘藥物時(shí)獲得的，該哮喘藥物具有大的空氣動(dòng)力學(xué)尺寸，理想地沉積在氣管支氣管區(qū)域，不明顯地穿透到肺部深處。對(duì)于投送到肺部深處的吸入蛋白或肽療法來說，關(guān)注的是可能發(fā)生的不想要的長(zhǎng)期副作用，例如炎癥和剌激，這可能是由于免疫應(yīng)答導(dǎo)致的，或由賦形劑當(dāng)被投送到肺泡區(qū)域時(shí)引起的。為了最小化深肺吸入療法可能的有害副作用，將用于吸入的顆粒制造成基本上由被投送的藥物構(gòu)成，可能是有利的。該策略將使肺泡暴露于賦形劑最小化，并減少使用每個(gè)劑量時(shí)沉積在肺泡表面上的顆粒的總質(zhì)量劑量，在吸入療法的長(zhǎng)期使用過程中可能使刺激最小化。具有適合于肺部深處沉積的空氣動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、基本上完全由本文描述的治療性、預(yù)防性和/或診斷性蛋白、肽或其它藥劑構(gòu)成的小的球形顆粒，對(duì)于孤立地研究長(zhǎng)期治療性或預(yù)防性劑量給藥對(duì)肺的肺泡膜的影響，可能是特別有用的。然后可以研究通過吸入來全身性投送小的球形顆粒形式的蛋白、肽或其它藥劑的效應(yīng)，而沒有由相關(guān)的賦形劑引入的復(fù)雜因素。對(duì)于通過吸入將顆粒投送到肺部深處來說，要求顆粒具有0.5-10微米的小的平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑，以及狹窄的尺寸分布。本公開還考慮到了將具有不同粒徑范圍的不同批次的顆?；旌显谝黄?。本公開的工藝方法允許制造具有上述特性的微粒。形成具有0.5到3微米的空氣動(dòng)力學(xué)直徑的顆粒，有兩種主要方法。第一種方法是產(chǎn)生相對(duì)大但非常多孔(或有孔)的微粒。因?yàn)榭諝鈩?dòng)力學(xué)直徑(D空氣動(dòng)力學(xué)J和幾何直徑(D，)之間的關(guān)系是D空氣動(dòng)力學(xué)等于D，乘以顆粒密度的平方根。具有非常低的質(zhì)量密度(大約0.1g/cm3)的顆?？梢员憩F(xiàn)出小的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(0.5到3微米)，同時(shí)具有相對(duì)高的幾何直徑(5到10微米)。另一種方法是產(chǎn)生具有相對(duì)低的孔隙度的顆粒，在本公開的情況下，顆粒具有上面提出的范圍內(nèi)的密度，更一般情況下接近1g/cm3。因此，這樣的無孔致密顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑接近于它們的幾何直徑。上面提出的本發(fā)明的用于顆粒形成的方法，提供了使用或不使用賦形劑時(shí)的顆粒形成。使用很少或不使用非聚合性陽(yáng)離子之外的添加劑從核酸本身制造小的顆粒，為在肺部投送中的使用提供了卓越的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼮檩^大的藥物有效載荷、增加的安全性和減少的所需吸入的次數(shù)，提供了選擇。H.實(shí)施例下面的章節(jié)提供了用于制備本公開的核酸顆粒的方法和組合物的實(shí)施例。本文公開的工藝方法的可放大性，使用不同材料的各種不同尺寸的容器進(jìn)行了證明，這些容器包括1.5ml微量離心管、5ml玻璃管、15ml聚丙烯管、10ml夾套玻璃容器、50ml夾套玻璃容器和100ml夾套玻璃容器。本公開的示例性核酸微粒從含有溶解的核酸、非離子聚合物和非聚合性陽(yáng)離子的溶液制備。這些溶質(zhì)的相對(duì)濃度可以被調(diào)整，以使核酸微粒的某些特性，例如粒徑、形狀(例如微粒有多圓)、以及表面光滑度最適化。非聚合性陽(yáng)離子的摩爾濃度典型情況下在0.01M到5M之間的范圍內(nèi)，例如0.05M、O.IM、0.2M0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0掘、0.9M、1M、I.IM、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2掘、2.9M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3掘、3.9M、4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5M，或在任何兩個(gè)這些值之間的范圍內(nèi)。非離子聚合物的重量體積比濃度典型情況下為5%到50%，例如8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，或在任何兩個(gè)這樣的值之間的范圍內(nèi)。核酸與非聚合性陽(yáng)離子的摩爾比典型情況下為l:20到1:50,000，例如1:20、1:30、1:40、1:50、h60、1:70、1:80、h卯、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、h950、1:1,000、h1,500、1:2,000、1:3，000、1:。4,000、1:5，000、1:6,000、1:7,000、1:8，000、1:IO，OOO、1:15，000、1:20,000、h30，000、h40,000，或在任何兩個(gè)這樣的值之間的范圍內(nèi)，或本文描述的其它比例。本發(fā)明的實(shí)施例提供了用于制備如本文描述的可以用于肺部使用的微粒的方法和組分。這些說明性的實(shí)施例提供了不含聚合的聚陽(yáng)離子的微粒。此外，本文制備的微粒可溶于水和/或水性溶液，這個(gè)特點(diǎn)使得當(dāng)微粒被給藥到預(yù)定位點(diǎn)、例如肺中的區(qū)域時(shí)，能夠快速釋放微粒的核酸成分。微粒的空氣動(dòng)力學(xué)特征、例如尺寸和直徑，可以被操縱，用于定向投送到例如肺中的各種不同預(yù)定區(qū)域。優(yōu)選情況下，本文中制備的微粒典型地具有低的水分含量(通過KarlFisher測(cè)量)，例如水分含量低于8%。此外，微粒的非聚合性陽(yáng)離子含量(通過原子吸收測(cè)量)，為微粒組合物總量的3%或以上。得到的微粒干粉與核酸起始重量的重量比是大約1或以上(例如，對(duì)于72Ca-反義微粒來說，比典型為1.03)。實(shí)施例1:用于制備示例性微粒的材料下面的材料用于制備本公開的示例性微粒。盡管為示例性實(shí)施例提供了具體的核酸和siRNAs,但使用其它核酸和寡核苷酸也可以制備類似的微粒。所有的水性溶液使用高溫高壓滅菌并通過0.2微米濾器無菌過濾過的無核酸酶的去離子水制備。核酸溶液以大約15mg/ml的濃度制備在水中。在本文描述的方法中使用的示例性反義寡核苷酸(抗-CD40，抗-CD80,抗-CD86)是可商購(gòu)的HPLC純化的冷凍干燥制備物。這些寡核苷酸在寡核苷酸骨架上被硫代磷酸酯化，可以從IntegratedDNATechnologies公司(Coralville,IA)獲得。在本文中制備的微粒中使用了各種不同的siRNA組合物。siRNA分子由未修飾的雙鏈體構(gòu)成，可選地具有一條用熒光染料標(biāo)記的鏈。雙鏈體由兩條21-mer的RNA寡核苷酸，通過堿基配對(duì)退火在一起，每個(gè)21-mer具有兩個(gè)核苷酸長(zhǎng)的3'-突出端。熒光染料DY547標(biāo)記的SCR-027、NT-2和NT2被用作陰性對(duì)照，熒光染料DY547標(biāo)記的活性siRNA分子針對(duì)eGFP。這些siRNA分子的HPLC純化并冷凍干燥的制備物可以從Dharmacon公司(Dharmacon,Lafayette,CO)商購(gòu)。非聚合性陽(yáng)離子儲(chǔ)液通過將非聚合性陽(yáng)離子的鹽(無水或水合物的形式)以1M到10M的濃度溶解在水中來制備。儲(chǔ)液的pH被調(diào)整到pH接近中性到酸性(例如3到7.5)。非離子聚合物溶液A由酸性pH(例如5.6)下的0.1M乙酸鈉緩沖液中的12.5%(w/v)PEG3350(平均MW3409D)禾D12.5%(w/v)PVP(平均MW40kD)構(gòu)成。非離子聚合物溶液B由酸性pH(例如5.6)下的0.1M乙酸鈉緩沖液中的25%(w/v)PEG3350構(gòu)成。非離子聚合物溶液C由24%(w/v)泊洛沙姆188(平均MW8400，LutroKDF68，來自BASF)構(gòu)成，pH5.6(用乙酸調(diào)整)。-非離子聚合物溶液D由酸性pH(例如5.6)下的0.167M乙酸鈉緩沖液中的50%(w/v)PEG3350構(gòu)成。在使用非離子聚合物溶液D的反應(yīng)混合物中聚合物的終濃度典型為20%(w/v)PEG3350在0.067M乙酸鈉緩沖液中。實(shí)施例2:使用<^2+作為陽(yáng)離子制備的示例性反義寡核苷酸微粒下面的實(shí)施例提供了兩種示意性的工藝方法，用于制備本公開的含有C^+的基于反義寡核苷酸的微粒。制備工藝方法1:在本工藝方法中，制備了一系列6種反應(yīng)混合物，其中每種反應(yīng)混合物含有非離子聚合物、鹽溶液和核酸溶液。簡(jiǎn)單來說，將非離子聚合物溶液A的等份試樣分散到容器中，使得每個(gè)最終反應(yīng)混合物的三分之二是溶液A。將鹽溶液(5MCaCl2儲(chǔ)液，pH5.5)和水加入到非離子聚合物等份試樣中，使得最終反應(yīng)混合物中的Ca濃度分別為O.IM、0.17M、0.33M、0.67M、1M禾口1.25M。制備反義核酸溶液的等份試樣，使得當(dāng)這些核酸溶液的等份試樣加入到最終反應(yīng)混合物中時(shí)，每種最終反應(yīng)混合物中反義核酸的濃度將為0.206mM。將鹽/聚合物反應(yīng)混合物和核酸等份試樣預(yù)熱，然后組合以形成最終反應(yīng)混合物。將最終反應(yīng)混合物都在大約同樣的溫育溫度溫育5分鐘。使用一系列反應(yīng)混合物進(jìn)行的反應(yīng)在不同的溫度下進(jìn)行重復(fù)(例如6(TC，65匸或7(TC)。所有的反應(yīng)混合物，除了含有1.25MCa的反應(yīng)混合物之外，在混合后一開始變得渾濁，到溫育結(jié)束時(shí)都轉(zhuǎn)為目測(cè)透明(即表明反應(yīng)混合物是均勻的、單相的溶液)。含有1.25M和lMCa的反應(yīng)混合物，即使在進(jìn)一步加熱到75'C時(shí)，也保持渾濁。將反應(yīng)混合物以受控的速度(在0.1'C/min到5°C/min的范圍內(nèi))冷卻到4°C。Ca-反義微粒分散在所有反應(yīng)混合物中，可以用光學(xué)顯微鏡觀察到。通過離心和上清液傾析/吸取，從分散體系中收集Ca-反義微粒。收集到的微粒用二氯甲烷重復(fù)地離心洗滌，以除去非離子聚合物，并冷凍干燥成干粉。制備工藝方法2:在本工藝方法中，Ca-反義微粒如下制備制備非離子聚合物溶液A的等份試樣，使得每個(gè)試樣占最終反應(yīng)混合物(包括非離子聚合物溶液、鹽溶液和核酸溶液)的總體積的三分之二。制備鹽的等份試樣，使得當(dāng)與核酸等份試樣直接混合時(shí)，將具有0.1M、0.3M、1M、2M、3M和4.18M的中間鹽濃度。將鹽的等份試樣和核酸等份試樣預(yù)熱，組合以形成中間混合物，并溫育30分鐘，這都在大約相同的溫度下進(jìn)行(70°C)。非離子聚合物的等份試樣也進(jìn)行預(yù)熱，然后與中間混合物組合以形成反應(yīng)混合物，溫育30分鐘，這都在大約相同的溫度下進(jìn)行(70°C)。通過將反應(yīng)混合物暴露于-l(TC的冷卻介質(zhì)30分鐘，將反應(yīng)混合物冷卻到大約-l(TC。Ca-反義微粒分散在所有反應(yīng)混合物中，可以用光學(xué)顯微鏡觀察到。使用離心和上清液傾析/吸取，從分散體系中收集Ca-反義微粒。將微粒用1.5MCaCl2溶液在4匸重復(fù)地離心洗滌，然后用0.2MCaCl2溶液在4'C重復(fù)地離心洗滌。然后將洗滌過的Ca-反義微粒冷凍干燥成干粉。在可選的洗滌過程中，將收集到的Ca-反義微粒用50%(w/v)PEG3350溶液在4r重復(fù)地離心洗滌，并冷凍干燥以除去水和揮發(fā)性鹽。然后將這些冷凍干燥的制備物重新懸浮，用二氯甲垸/甲醇混合物重復(fù)地離心洗滌，然后用單獨(dú)的二氯甲烷洗滌，以除去PEG和PVP，然后重新冷凍干燥以除去二氯甲烷。結(jié)果在其它條件相同的情況下，Ca-反義微粒的冷卻速度與微粒的平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑相關(guān)(圖1A-1E，以及圖2A-B和圖11)，對(duì)微粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑分布沒有影響(在0.34到0.43的范圍內(nèi))。從圖1A-1E和圖2A-B可以看出，Ca-反義微粒的直徑隨著冷卻速度的增加而減小。但是，在任何給定的反應(yīng)混合物中，Ca-微?？?cè)旱钠骄睆椒植蓟颈３植蛔??？諝鈩?dòng)力學(xué)直徑分布由空氣動(dòng)力學(xué)直徑分布范圍與微粒的平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑的比來度量，其中空氣動(dòng)力學(xué)直徑分布范圍，是對(duì)應(yīng)于第95%的顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(即95%的顆粒等于或小于該空氣動(dòng)力學(xué)直徑)與對(duì)應(yīng)于第10%的'顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(即10%的顆粒等于或小于該空氣動(dòng)力學(xué)直徑)之間的差值。對(duì)于Ca-反義微粒來說，空氣動(dòng)力學(xué)直徑分布小于0.7，典型情況下在0.3到0.6的范圍內(nèi)。Ca-分子微粒的示例性空氣動(dòng)力學(xué)直徑分布(第10%為1.836微米，平均為2.294微米，第95°/。為2.954微米)和下一代沖擊器(NGI)特征圖形(MMAD為2.6微米到2.9微米，GSD為1.5，噴射劑量為73%到77%，F(xiàn)PF(小于8微米)為噴射劑量的78%到82%或以上)，分別顯示在圖3A-B禾P4A-B中。在其它條件相同的情況下，反應(yīng)混合物中非聚合性陽(yáng)離子與梭酸的摩爾比，與在給定反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的微粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(圖5A-B)、以及在冷卻過程中微粒形成時(shí)的溫度(圖6)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于rC/min的冷卻速度。更具體來說，正如可以從圖5A-B看到的，微粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑隨著非聚合性陽(yáng)離子與核酸的摩爾比的增加而降低。在圖6中可以看到，顆粒形成時(shí)的溫度隨著非聚合性陽(yáng)離子與核酸的摩爾比的增加而增加。Ca-反義微粒的平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑為l-3微米。典型情況下，在任何給定的反應(yīng)中，至少85%的微粒分布在大約0.8-4微米的狹窄范圍內(nèi)。Ca-反義微粒的水分含量在3。/。到7。/。的范圍內(nèi)，更具體來說水分含量在3.6%至1」6.1%之間。最后，Ca-反義微粒的非聚合性陽(yáng)離子含量在4%或以上的范圍內(nèi)，典型情況下，非聚合性陽(yáng)離子含量在微粒的4.1%到4.3°/。的范圍內(nèi)。如圖12中所示，核酸微粒形成的工藝方法不降解實(shí)施例2的核酸。實(shí)施例3:用Zr^+作為陽(yáng)離子制備的示例性反義寡核苷酸微粒在本工藝方法中，制備了一系列7種反應(yīng)混合物，其中每種反應(yīng)混合物含有非離子聚合物溶液、鹽溶液和核酸溶液。簡(jiǎn)單來說，將非離子聚合物溶液A的等份試樣分配到容器中，使得每個(gè)最終反應(yīng)混合物的三分之二含有溶液A。制備反義核酸溶液的等份試樣，使得當(dāng)這些核酸溶液的等份試樣加入到最終反應(yīng)混合物中時(shí)，每種最終反應(yīng)混合物中反義核酸的濃度將為0.206mM。使用4MZnCl2儲(chǔ)液(pH4)，通過用水稀釋制備鹽溶液的等份試樣，使得當(dāng)?shù)确菰嚇蛹尤氲椒磻?yīng)混合物中時(shí)，起始的鹽和核酸混合物中的Zn濃度將分別為O.IM、0.33M、1M、2M和3M。將鹽等份試樣和核酸等份試樣預(yù)熱，然后組合以形成中間混合物。將這些中間混合物都在大約同樣的溫度(70°C)溫育30分鐘。所有的中間混合物在混合后變得渾濁，可以目測(cè)觀察到濁度隨著Zn濃度的增加而增加。將也已經(jīng)預(yù)熱的非離子聚合物的等份試樣與中間混合物組合，以形成最終組合的反應(yīng)混合物。將最終組合的反應(yīng)混合物都在大約同樣的溫度(7(TC)溫育30分鐘。所有的最終反應(yīng)混合物在混合后保持渾濁，通過目測(cè)檢測(cè)可以看到濁度隨著Zn濃度的增加而增加。按照本工藝方法制備的Zn-反義微粒分散在所有反應(yīng)混合物中，可以用光學(xué)顯微鏡觀察到。通過將反應(yīng)混合物暴露于-l(TC的冷卻介質(zhì)30分鐘，將反應(yīng)混合物冷卻到大約-l(TC。冷卻后，通過光學(xué)顯微鏡重新檢査Zn-反義微粒，可以看到分散在所有反應(yīng)混合物中。使用離心和上清液傾析/吸取，從分散體系中收集Zn-反義微粒。將收集到的Zn-反義微粒用1.5MZnCl2溶液在4匸重復(fù)地離心洗滌。然后將洗滌過的Zn-反義微粒用0.2MZnCl2溶液在4'C重復(fù)地離心洗滌，最后冷凍干燥成干粉。在可選的洗漆程序中，將收集到的Zn-反義微粒用50%(w/v)PEG3350溶液在4'C重復(fù)地離心洗滌，并冷凍干燥以除去水和揮發(fā)性鹽。然后將冷凍干燥的Zn-反義微粒重新懸浮，用二氯甲烷重復(fù)地離心洗漆以除去PEG3350，然后重新冷凍干燥以除去二氯甲垸。從含有0.33^Zn的反應(yīng)混合物制備的Zn-反義微粒具有400nm的平均粒徑。這些Zn-反義微粒的；電位是-17mV(在lmMKCl中，pH-7.1，PALS;電位分析儀3.29版，BrookhavenInstrumentsCorp.)。在這些Zn-反義微粒中的反義核酸載量是48。/。(以微粒的重量計(jì)，使用電泳測(cè)定并定量)。實(shí)施例4:使用M^+作為陽(yáng)離子制備的示例性反義寡核苷酸微粒使用與實(shí)施例3中描述的用于形成Zn-反義微粒的工藝方法相同的方法來形成Mg-反義微粒，不同之處在于用MgCb儲(chǔ)液(4.09M，pH4.5)代替Zn鹽儲(chǔ)液，以及反應(yīng)混合物中Mg的終濃度分別為0.033M、0.1M、0.33M、0.67M和1M。在將鹽溶液和核酸溶液混合后，含有0.033MMg的中間反應(yīng)混合物顯示出目測(cè)透明，而所有其它中間混合物在混合后變得渾濁。中間反應(yīng)混合物的渾濁度隨著Mg濃度的增加而增加。當(dāng)中間反應(yīng)混合物與非離子聚合物溶液A混合時(shí)，含有0.033MMg的反應(yīng)混合物保持透明，含有O.IM和0.33MMg的反應(yīng)混合物保持渾濁，含有0.67MMg的反應(yīng)混合物變?yōu)橥该鳎?MMg的反應(yīng)混合物沉淀出聚集體，沉積在反應(yīng)容器的底部。將反應(yīng)混合物在70'C溫育30分鐘，使所有反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)變成均勻的、單相的溶液。冷卻后，所有反應(yīng)混合物變得渾濁，其中含有0.67M和lMMg的反應(yīng)混合物具有足夠密度的成分，在冷卻后微粒沉積在反應(yīng)混合物中。Mg-反義微粒分散在所有反應(yīng)混合物中，可以通過光學(xué)顯微鏡觀察。使用離心和上清液傾析/吸取，從分散體系中收集Mg-反義微粒，并用1.5MMgCl2溶液在4'C重復(fù)地離心洗滌。然后將洗滌過的Mg-反義微粒沉淀用0.2MMgCb溶液在4'C重新重復(fù)地離心洗滌，最后冷凍干燥成干粉。在可選的洗滌程序中，將收集到的Mg-反義微粒用50%(w/v)PEG3350溶液在4t:重復(fù)地離心洗滌，并冷凍干燥以除去水和揮發(fā)性鹽。然后將冷凍干燥的Mg-反義微粒用二氯甲垸重復(fù)地離心洗滌以除去PEG3356，然后重新冷凍干燥以除去二氯甲垸。實(shí)施例5:使用Na+作為陽(yáng)離子制備的示例性反義寡核苷酸微粒為了制備Na-反義微粒，進(jìn)行了與上面實(shí)施例3中描述的用于形成Zn-反義微粒的工藝方法基本相同的方法，不同之處在于用NaCl儲(chǔ)液(5.3M，pH6.7)代替Zn鹽儲(chǔ)液。使用了6種反應(yīng)混合物，其中反應(yīng)混合物中鈉的終濃度分別為0.033M、0.1M、0.33M、0.67M、1M和1.47M。除了含有1.47MNa的反應(yīng)混合物是渾濁的之外，所有其它中間混合物都是目測(cè)透明的?；旌虾?，所有反應(yīng)混合物變得渾濁。將反應(yīng)混合物在70。C溫育30分鐘，使所有反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)變成透明均勻的、單相的溶液。冷卻后，含有0.033M、O.IM和0.33MNa的反應(yīng)混合物保持透明，含有0.67M和1MNa的反應(yīng)混合物變得渾濁，含有1.47MNa的反應(yīng)混合物保持渾濁。當(dāng)加熱到環(huán)境溫度時(shí)，含有0.67M和lMNa的反應(yīng)混合物再次變得目測(cè)透明，但是冷卻后再次變得渾濁，這證明在冷卻和加熱時(shí)，微粒分別可逆地形成和分解。實(shí)施例6:使用Ca^作為陽(yáng)離子制備的示例性siRNA微粒使用上面實(shí)施例2中描述的用于形成Ca-反義微粒的工藝方法1來制備Ca-siRNA微粒，不同之處在于用本實(shí)施例中的siRNA溶液代替實(shí)施例2的核酸溶液，使得每種反應(yīng)混合物中siRNA的濃度為0.151mM。設(shè)置了7種獨(dú)立的反應(yīng)混合物，包含的Ca濃度分別為0.033M、O.IM、0.17M、0.5M、0.67M、0.74M禾P1M。使用非離子聚合物溶液A、以及使用非離子聚合物溶液B和C，制備了Ca-siRNA微粒的例子。反應(yīng)的預(yù)熱溫度可變。使用預(yù)熱溫度58r、60。C和7(TC設(shè)置了反應(yīng)。在預(yù)熱溫度下將核酸溶液與非離子聚合物/鹽溶液混合后，所有的反應(yīng)混合物變得渾濁，并在5分鐘的溫育期結(jié)束時(shí)保持渾濁。反應(yīng)混合物的渾濁度隨著反應(yīng)混合物中Ca濃度的增加而增加。在冷卻和溫育后，將從分散體系收集(使用離心和上清液傾析/吸取)的Ca-siRNA微粒用適合的洗滌介質(zhì)在4"C重復(fù)地離心洗滌，并冷凍干燥成千粉。實(shí)施例7:使用M^+作為陽(yáng)離子制備的示例性siRNA微粒使用上面實(shí)施例6中描述的用于形成Ca—siRNA微粒的工藝方法來制備Mg-siRNA微粒，不同之處在于在本實(shí)施例中用MgCl2儲(chǔ)液(5M，pH5.6)代替實(shí)施例6中的鹽儲(chǔ)液。設(shè)置了2種反應(yīng)混合物，在反應(yīng)混合物中包含的Mg濃度分別為0.78M和1.15M。在預(yù)熱溫度(70°C)下將核酸溶液與非離子聚合物/鹽溶液混合后，所有的反應(yīng)混合物目測(cè)透明(即反應(yīng)混合物是均勻的單相溶液)，并在5分鐘的溫育期.結(jié)束時(shí)保持透明。在冷卻和溫育后，將從分散體系收集(使用離心和上清液傾析/吸取)的Mg^^^八微粒用適合的洗滌介質(zhì)在4°(:重復(fù)地離心洗滌，并冷凍干燥成干粉。在存在非離子聚合物溶液B和C的情況下，在1.15MMg濃度下形成了Mg-siRNA微粒。實(shí)施例8:Mg-siRNA微粒按照上面公開的方法，使用下表中列出的配方和反應(yīng)條件制備了Mg-siRNA微粒。所有的siRNAs商購(gòu)自Dharmacon公司。圖7A-B、8A-B、9A-B、10A-B和13是這些微粒的SEM圖像。如圖14所示，核酸微粒形成的工藝方法不降解實(shí)施例8的核酸。如圖15和16所示，實(shí)施例8的核酸微粒具有適合于肺部投送的空氣動(dòng)力學(xué)特征(例如，以數(shù)量和體積計(jì)95%的群小于3微米，高FPF)。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實(shí)施例9:Mg-siRNA微粒按照上面公開的方法，使用NT-2siRNA作為核酸，非離子聚合物溶液D作為儲(chǔ)液，pH5.6，預(yù)熱溫度65'C，冷卻速度0.5tV分鐘，冷卻終端溫度4°C，以及下表中列出的不同聚合物終濃度和不同陽(yáng)離子終濃度，制備了Mg-siRNA微粒。所有反應(yīng)都導(dǎo)致球形核酸微粒的形成。反應(yīng)編號(hào)w離子終濃度聚合物終濃度[陽(yáng)離子]:[核酸]的摩爾比顆粒形成溫度11.228M16.7%(w/v)8251:15'C21.8M16.7%(w/v)12094:15°C2.2M16.7%(w/v)14782:165°C41.228M20.0%(w/v)825h121°C1.8M20.0%(w/v)12094:122。C62.2M20.0%(w/v)14782:165'C71.228M23.7%(w/v)8251:128'C81.8M23.7%(w/v)12094:165'C92.2M23.7%(w/v)14782:165。C實(shí)施例10:具有膽固醇修飾的siRNA的微球的生產(chǎn)將無核酸酶的水性溶液(水從Ambion獲得，目錄號(hào)9930，是去離子和無核酸酶的，并另外進(jìn)行高溫高壓滅菌和0.2pm無菌過濾)加熱到37'C,該水性溶液中含有如圖17所示溶解在其中的膽固醇結(jié)合的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP，Dha謹(jǐn)con/Th醒ofisher)siRNA。將緩沖的聚合物/陽(yáng)離子溶液加熱到65°C，該溶液中含有全部溶解在其中的水溶性聚乙二醇3500(PEG3350，Spectrum,目錄號(hào)P0125;溶液由46°/。PEG,用0.245MNaOAc緩沖，在無核酸酶的水中，pH5.6，在最終制劑中稀釋到12.5%PEG和67mMNaOAc)、水溶性鹽MgCl2(100mMMgCl2溶液(pH5.6)，在0.2|im過濾過的水中)和乙酸鈉緩沖液(Spectrum,目錄號(hào)S0104)。在65。C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，使膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、12.5%(w/v)、25mM和67mM。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA之間的摩爾比是176:1。將反應(yīng)混合物在65t:溫育，在此期間混合物變得透明，然后將透明的混合物以0.8'C/每分鐘的速度冷卻到0°C，在此期間形成的膽固醇修飾的siRNA微球?qū)⑼该鞯幕旌衔镛D(zhuǎn)變成乳白色。通過在0。C離心收集微球，用冷卻到0'C的50°/。2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成干粉。82得到的微球是固體、球形的，粒徑是單分散的。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>實(shí)施例11:膽固醇修飾的SiRNA在用于肺部投送的標(biāo)準(zhǔn)微球制劑中的應(yīng)用將如圖17所示的含有溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37。C。按照上面的描述，將含有水溶性PEG3350的用乙酸鈉緩沖的溶液與MgCl2溶液進(jìn)行混合，并加熱到65°C。在65。C下，將siRNA溶液的等份試樣加入到聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣中，使膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、16.7%或20%(w/v)、1.173M和67mM。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA之間的摩爾比是8251:1。在該陽(yáng)離子濃度下，反應(yīng)立即變成乳白色，在65'C溫育5分鐘，在此期間混合物保持乳白色。將混合物以0.5。C/每分鐘的速度冷卻到0°C，混合物保持乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成干粉。得到的微球是固體、球形的，粒徑是多分散的，并混有非球形的微粒，正如通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡所觀察的。實(shí)施例12:具有降低的陽(yáng)離子濃度以受控相分離的微球制劑將圖17中所示的含有溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37"C。將PEG3500聚合物溶液如上所述與多種不同濃度的MgCl2溶液混合，然后加熱到65"C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣加入到聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣中，使膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、16.7%(w/v)、陽(yáng)離子范圍1.173M到0M(1.173M、587mM、293mM、147mM、73mM、25mM和0mM)和67mM。各反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的最終摩爾比分別為8251:1、4126:—1、2061:1、1031:1、516:1、176:l和0:1。所有的混合物，除了0mM陽(yáng)離子溶液不形成沉淀之外，都立即變成乳白色，并且都在65'C溫育大約5分鐘，在此期間混合物保持乳白色。然后將所有混合物冷卻到0°C，除了0mM陽(yáng)離子混合物之外所有混合物保持乳白色。在每個(gè)這些工藝過程中形成了微球，它們變成乳白色，但是形成不是通過CPS類的反應(yīng)。因此，確定了在這些條件下，為了發(fā)生CPS類反應(yīng)，陽(yáng)離子的濃度需要低于25mM。實(shí)施例13:具有降低的陽(yáng)離子濃度以受控相分離的其它微球制劑將圖17中描述的其中溶解有膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37°C。將用乙酸鈉緩沖的PEG3500聚合物溶液與各種濃度的不同MgCl2溶液混合，并加熱到65'C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣加入到聚合物/陽(yáng)離子溶液中，使膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、16.7。/?；?0。/。(w/v)、陽(yáng)離子范圍15mM至10mM(10mM、12.5mM、15mM，或12.5mM與單一的20。/。PEG制劑)和67mM。各種混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比是分別為70:1、80:1、106:1或80:1。將反應(yīng)混合物在65。C溫育10分鐘，在此期間70:1和80:1比例的反應(yīng)保持透明。106:1比例的反應(yīng)輕微模糊，80:1比例的反應(yīng)模糊。將混合物以0.5°。/分鐘的速度冷卻到0°C，在此期間形成的siRNA微球?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)變成乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成干粉。得到的微球是固體、球形的，粒徑是單分散的，并混有一些非球形的微粒，正如通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡所觀察的。實(shí)施例14:鈣陽(yáng)離子在微球制劑中的使用將圖17中描述的含有溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37°C。將每種用乙酸鈉緩沖的含有PEG3350或PEG3350與PVP的組合的聚合物溶液，與不同濃度的CaCl2溶液混合，并加熱到65'C。在65"C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液混合。產(chǎn)生CPS類反應(yīng)的條件是，其中膽固醇修飾的siRNA的濃度為0.142mM，聚合物為16.7%或20%PEG(w/v)或PEG和PVP各8.3%的組合，陽(yáng)離子為10mM或7.5mM或25mM，緩沖液為67mM。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比分別是70:l或50:l或176:1。所有三種反應(yīng)在65。C溫育的大約5分鐘期間，保持透明，正如在各50^11體積中目測(cè)確定的。然后將每種混合物冷卻到0°C,在冷卻過程中，通過受控的相分離類的反應(yīng)明顯形成了微球。實(shí)施例15:具有提供受控相分離的鎂和較少聚集的其它微球制劑根據(jù)上面獲得的結(jié)果，進(jìn)行了小規(guī)模的篩選實(shí)驗(yàn)，以便降低MgCl2制劑的聚合物含量，確定能產(chǎn)生CPS類反應(yīng)的條件，并提供能夠用于Aerosizer分析、具有較少聚集的微球。將含有圖17中描述的溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37。C。將用乙酸鈉緩沖的PEG3350聚合物溶液，與含有不同量的MgCl2的兩種溶液混合，并加熱到65'C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，使膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、12.5%(w/v)、20mM或25mM、以及67mM。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比分別是141:1或176:1。將反應(yīng)混合物在65'C溫育IO分鐘，在此期間，混合物保持透明。然后將混合物冷卻到0'C，在此期間，形成的膽固醇修飾的siRNA的微球，通過受控的相分離類的反應(yīng)，將混合物轉(zhuǎn)變成乳白色。實(shí)施例16:用于微球表征的放大制劑上面描述的結(jié)果引出了一組放大實(shí)驗(yàn)，以篩選將產(chǎn)生CPS類的反應(yīng)的制劑，用于生產(chǎn)可以進(jìn)行表征的微球。將圖17中描述的溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37'C。將都用乙酸鈉緩沖的含有PEG3350或PEG3350與PVP的組合的聚合物溶液，與不同濃度的MgCl2或CaCl2陽(yáng)離子溶液混合，并加熱到65°C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，分別提供了膽固醇修飾的siRNA的終濃度為0.142mM，PEG的終濃度為12.5%(w/v)、MgCl2的終濃度為20mM或25mM，以及緩沖液的終濃度為67mM。這些反應(yīng)混合物中Mg+1日離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比分別是141:1或176:1。對(duì)于PEG與CaCl2的反應(yīng)來說，終濃度為0.142mMsiRNA、16.7%或20%(w/v)PEG、10mM或7.5mMCaCl2、以及67mM緩沖液，反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的最終摩爾比分別是70:l或53:1。對(duì)于PEG/PVP與CaCl2的反應(yīng)來說，終濃度為0.142mMsiRNA、PEG和PVP各8.3%(w/v)、25mMCaCl2、以及67mM緩沖液。該反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA之間的摩爾比是176:1。將每種反應(yīng)混合物在65'C溫育5分鐘，在此期間，與PEG和MgCb的混合物保持透明，與CaCl2的混合物變得輕微模糊。在溫育5分鐘后，將所有混合物以0.75'C/分鐘的速度冷卻到0'C，在此期間，形成的微球?qū)⑼该鞯幕蜉p微模糊的混合物轉(zhuǎn)變成乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，并冷凍干燥成干粉。從12.5%PEG-25mMMgCl2、16.7%PEG/10mMCaCl2禾020%PEG/7.5mMCaCl2的反應(yīng)得到的微球是固體、球形的，粒徑是單分散的，8.3。/。PEG/PVP-25mMCaCl2微球是固體和球形的，具有稍微寬一些的尺寸分布，12.5%PEG/20mMMgCl2反應(yīng)產(chǎn)生了較小和輕微聚集的微球。通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察了所有獲得的微球。實(shí)施例17:在設(shè)定的聚合物濃度下使用增加的鎂陽(yáng)離子的微球制逝根據(jù)上述的結(jié)果，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來研究增加的MgCl2陽(yáng)離子含量對(duì)12.5%PEG制劑的影響。將圖17中描述的含有溶解的膽固醇修飾的siRNA的水性溶液加熱到37°C。將用乙酸鈉緩沖的含有PEG3350的聚合物溶液，與含有22.5mM到32.5mM范圍內(nèi)的MgCl2溶液的溶液混合，并加熱到65°C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，終濃度為0.142mMsiRNA，12.5%(w/v)聚合物，22.5mM、25mM、27.5mM、30mM或32.5mMMgCl2，以及67mM緩沖液。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比分別是158:1、176..1、193:1、211:1和229:1。將反應(yīng)混合物在65T:溫育10分鐘，混合物保持透明。然后將混合物以0.75匸/分鐘的速度冷卻到0°C，在此期間，微球?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)變成乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成干粉。從每種反應(yīng)得到的微球是固體、球形的，顆粒是單分散的，正如通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡所觀察到的，只有含有22.5mMMgCl2的反應(yīng)例外，它由于某些未知的原因，不能產(chǎn)生許多微球。實(shí)施例18:用于生物學(xué)表征的制劑的選擇上面的結(jié)果引出了包含各種MgCl2和CaCl2制劑的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以選擇一種用于生物學(xué)表征研究的陽(yáng)離子濃度。將圖17中描述的含有溶解的膽固醇修飾的siRNA的水性溶液加熱到37°C。將用乙酸鈉緩沖的PEG3500溶液，與含有特定濃度的CaCl2或MgCl2的溶液混合，并加熱到65'C。在65'C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，對(duì)于PEG與MgCl2的反應(yīng)來說，終濃度為0.142mMsiRNA,12.5%(w/v)聚合物，25mM或32.5mMMgCl2，以及67mM緩沖液，混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的最終摩爾比分別是176:1或229:1。對(duì)于PEG與CaCl2的反應(yīng)來說，終濃度為0.142mMsiRNA，16.7%或12.5%(w/v)聚合物，9mMCaCl2，以及67mM緩沖液。這些反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比是63:1。將每種反應(yīng)混合物在65'C溫育10分鐘，混合物保持透明。然后將混合物以0.8"C/分鐘的速度冷卻到-5°C，在此期間微球形成，將混合物轉(zhuǎn)變成乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成干粉。得到的微球是固體、球形的，粒徑是單分散的，正如通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡所觀察到的。Aerosizer分析顯示，本實(shí)驗(yàn)中基于CaCl2的制劑與MgCl2制劑相比，被證明發(fā)生更多的聚集。實(shí)施例19:用于生物學(xué)表征的微球的生產(chǎn)上述的結(jié)果提供了用于生物學(xué)表征研究的微球的產(chǎn)生方法。將圖17中描述的含有溶解的膽固醇修飾的eGFPsiRNA的水性溶液加熱到37t:。將用乙酸鈉緩沖的PEG3500聚合物溶液與MgCl2溶液混合，并加熱到65'C。在65。C下，將siRNA溶液的等份試樣與聚合物/陽(yáng)離子溶液的等份試樣混合，膽固醇修飾的siRNA、聚合物、陽(yáng)離子和緩沖液的終濃度分別為0.142mM、12.5%(w/v)、25mM和67mM。反應(yīng)混合物中多價(jià)陽(yáng)離子與膽固醇修飾的siRNA的摩爾比是176:1。將反應(yīng)混合物在65。C溫育IO分鐘，混合物保持透明。溫育后，將混合物以0.8'C/分鐘的速度冷卻到-5'C，在此期間微球形成，將混合物轉(zhuǎn)變成乳白色。通過離心收集微球，用50%2-甲基-2-丙醇和50%水(w/v)的二元溶液洗滌3次，重新懸浮在二元溶液中，冷凍，并冷凍干燥成千粉。得到的微球是固體、球形的，粒徑是單分散的，正如通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡所觀察到的。Aerosizer分析也顯示出適合于投送到肺的單分散的粒徑。實(shí)施例20:膽固醇修飾的siRNA的體內(nèi)投送將如圖X所示的含有膽固醇修飾的eGFPsiRNA的微球，用在修飾過的在人類泛素C(UBC)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠中，以確定微球敲落GFP蛋白表達(dá)的效能。表達(dá)UBC-GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠描述在Palliser等，Nature(2006)439:89-94和Swenson等，StemCells(2007)25:2593-2600中。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將2nmol按照上面實(shí)施例19中所述制備的膽固醇修飾的eGFPsiRNA微粒，陰道內(nèi)給藥小鼠，在72小時(shí)后，評(píng)估陰道粘膜中的GFP表達(dá)。2nmol的劑量相當(dāng)于大約1mg/kg的劑量。陰性對(duì)照是微球懸浮緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照是eGFPsiRNA和寡核苷酸轉(zhuǎn)染胺(OIigofectamine)(Invitrogen)。GFP的表達(dá)使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的技術(shù)檢測(cè)和定量。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，使用陽(yáng)性對(duì)照時(shí)GFP表達(dá)被基本上消除了(圖18)。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照不是膽固醇修飾的siRNA。結(jié)果還顯示，在給藥膽固醇修飾的eGFPsiRNA微球后，與陰性對(duì)照相比，GFP表達(dá)顯著降低了，由此證明了概念驗(yàn)證。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，使用按照上面實(shí)施例19中的描述制備的膽固醇修飾的siRNA微球，在肌動(dòng)蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(Guo等，TransgenicResearch(2007)16:829-834)中敲落GFP的表達(dá)，顯示出是劑量依賴性的。簡(jiǎn)單來說，對(duì)小鼠陰道內(nèi)給藥0、0.5、1、2和4nmolsiRNA微球，并在陰道粘膜中評(píng)估GFP蛋白的表達(dá)。隨著膽固醇修飾的GFPsiRNA的量的增加，觀察到了對(duì)GFP表達(dá)敲落的增加，在最高量siRNA下發(fā)現(xiàn)的敲落程度，與使用同等量的沒有在微球制劑中的膽固醇修飾的GFPsiRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的，基本上相同(圖19A-F)。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)UBC-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)給藥2nmol膽固醇修飾的EGFPsiRNA微球，并在14天的時(shí)期內(nèi)，在第l、3、5、7和14天時(shí)評(píng)估陰道粘膜中GFP表達(dá)的敲落。結(jié)果顯示，正如在前面的實(shí)驗(yàn)中觀察到的，EGFP表達(dá)的敲落可以持續(xù)超過72小時(shí)的一段時(shí)間。事實(shí)上，在單次給藥后大約5到7天，觀察到了敲落。實(shí)施例20:膽固醇修飾的siRNA的體內(nèi)投送在上述實(shí)施例中生產(chǎn)的微粒的核酸載量分析中，通過測(cè)量260nm處的吸光度，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)使用CaCl2形成時(shí)，反義DNA寡核苷酸占微粒的大約65°/。到大約75%，當(dāng)使用MgCb形成時(shí)，未修飾的siRNA占微粒的大約70%到大約95%，當(dāng)使用MgCb形成時(shí)，膽固醇修飾的siRNA占微粒的大約55%到大約90%。權(quán)利要求1.含有多個(gè)核酸微粒的組合物，該核酸微粒含有一種或多種核酸和一種或多種非聚合性陽(yáng)離子，其中微粒是基本上球形的，在環(huán)境溫度下溶于水，并具有0.5微米到5微米的平均粒徑，其中微粒不含聚合性聚陽(yáng)離子。2.權(quán)利要求l的組合物，其中不含非核酸基質(zhì)和非核酸核心。3.權(quán)利要求1的組合物，其中不含非核酸基質(zhì)、非核酸核心和非核酸外殼。4.權(quán)利要求1的組合物，所述微粒含有大約4重量％到大約10重量％之間的非聚合性陽(yáng)離子。5.權(quán)利要求4的組合物，其中無機(jī)陽(yáng)離子選自Ca2+、Zn2+、Mn2+、Na+、Ba2+、K+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、A卩+和Li+。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述核酸是反義寡核苷酸。7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述核酸是siRNA。8.權(quán)利要求l的組合物，其中所述微粒在所述組合物中是單分散的。9.含有多個(gè)核酸微粒的組合物，該核酸微粒含有一種或多種核酸和一種或多種非聚合性陽(yáng)離子，其中微粒是基本上球形的，固體的，在環(huán)境溫度下溶于水，并具有0.5微米到5微米的平均粒徑，其中所述微粒含有少于10重量°/。的一種或多種非聚合性陽(yáng)離子，以及大于50重量％的一種或多種核酸。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述微粒含有少于6重量％的一種或多種非聚合性陽(yáng)離子，以及大于60重量％的一種或多種核酸。11.制造核酸微粒的方法，包括a)將反義硫代磷酸酯化的核酸溶液，與濃度為0.1M到5M的選自CaCl2、NaCl、MgCl2、MnCl2、ZnCl2、LiCl的聚合性陽(yáng)離子溶液混合.b)將步驟(a)的混合物溫育足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許從所述混合物形成透明的溶液；c)將步驟(b)的溶液冷卻到大約1到大約IO'C的溫度，直到含有核酸和非聚合性陽(yáng)離子的基本上球形的微粒群形成。12.權(quán)利要求11的方法，還包括向步驟(a)或步驟(b)的混合物中加入含有l(wèi):1比的12.5%聚乙二醇PVP的聚合物溶液的步驟。13.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(b)中的所述溫育溫度是從大約25。C到大約90°C。14.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(b)中的所述溫育時(shí)間是從大約1分鐘到大約1小時(shí)。15.權(quán)利要求I1的方法，還包括(e)分離步驟(d)的微粒。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述微粒使用離心通過沉降來分離。17.權(quán)利要求16的方法，還包括(f)將所述分離的微粒重新懸浮在水性聚合物溶液中，然后使用離心進(jìn)行微粒的沉降。18.權(quán)利要求17的方法，還包括(e)沉降和(f)重新懸浮的一個(gè)或多個(gè)步驟。19.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的方法，包括重新懸浮所述被沉降的微粒，并將所述重新懸浮的微粒冷凍干燥，以產(chǎn)生凍干的微粒。20.權(quán)利要求ll的方法，其中所述方法產(chǎn)生了含有基本上球形的微粒的微球群。21.權(quán)利要求ll的方法，其中所述方法產(chǎn)生了在環(huán)境溫度下基本上溶于水的微球群。22.權(quán)利要求U的方法，其中所述方法產(chǎn)生了平均粒徑在大約0.5微米到大約3微米之間的微粒群。23.權(quán)利要求11的方法，其中所述方法產(chǎn)生了含有至少55重量％的核酸的微粒。24.權(quán)利要求II的方法，其中所述方法產(chǎn)生了含有大約55重量％到大約85重量％之間的核酸的微粒。25.權(quán)利要求II的方法，其中所述方法產(chǎn)生了含有大約55重量％到大約90重量％之間的核酸的微粒。26.權(quán)利要求11的方法，其中所述方法產(chǎn)生了含有大約55重量％到大約95重量％之間的核酸的微粒。27.權(quán)利要求11的方法，其中所述微粒含有大約4重量％到大約10重量％之間的非聚合性陽(yáng)離子。28.權(quán)利要求11的方法，其中用于形成微粒的溶液的pH范圍在大約3到大約10之間。29.權(quán)利要求11的方法，其中所述非聚合性陽(yáng)離子溶液是CaCl2溶液。30.權(quán)利要求11的方法，其中所述非聚合性陽(yáng)離子溶液是ZnCl2溶液。31.權(quán)利要求ll的方法，其中所述非聚合性陽(yáng)離子溶液是MgCl2溶液。32.權(quán)利要求11的方法，其中所述非聚合性陽(yáng)離子溶液是NaCl溶液。33.權(quán)利要求29的方法，其中所述CaCh以1.25M的濃度提供，溫育溫度是75X:，產(chǎn)生的微粒具有l(wèi)-2微米之間的尺寸。34.權(quán)利要求29的方法，其中所述CaCl2以1M的濃度提供，溫育溫度是75'C，產(chǎn)生的微粒具有1.3-2.3微米之間的尺寸。35.權(quán)利要求29的方法，其中溫育溫度是7(TC。36.權(quán)利要求35的方法，其中當(dāng)CaCl2濃度是大約0.67M時(shí)，形成的微粒具有大約2到2.6微米之間的尺寸。37.權(quán)利要求35的方法，其中當(dāng)CaCl2濃度在大約0.15M到0.75M之間時(shí)，形成的微粒具有大約2到2.6微米之間的尺寸。38.按照權(quán)利要求11的方法制備的微粒組合物。39.含有權(quán)利要求1的組合物或權(quán)利要求38的組合物的氣溶膠組合物。40.對(duì)需要的對(duì)象進(jìn)行治療的方法，包括給所述對(duì)象施用權(quán)利要求36的氣溶膠組合物。41.含有一種或多種核酸和一種或多種非聚合性陽(yáng)離子的核酸微粒，其中微粒不含聚陽(yáng)離子性的聚陽(yáng)離子，不含非核酸的基質(zhì)、核心或夕卜殼。42.制造核酸微粒的方法，包括形成含有一種或多種核酸、一種或多種非聚合性陽(yáng)離子、以及一種或多種非離子聚合物的溶液或分散體系；以及將溶液或分散體系冷卻以形成多個(gè)基本上球形的核酸微粒，其中微粒不含聚合性聚陽(yáng)離子，不含非核酸的基質(zhì)、核心或外殼。43.權(quán)利要求42的方法，其中一種或多種核酸被修飾以包含疏水部分。44.權(quán)利要求43的方法，其中疏水部分是膽固醇。45.權(quán)利要求42的方法，其中一種或多種非聚合性陽(yáng)離子與一種或多種核酸的摩爾比是50,000:l或以下。46.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟以0.5°C/min的速度進(jìn)行。47.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟以0.75°C/min的速度進(jìn)行。48.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟以0.8°C/min的速度進(jìn)行。49.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約4'C。50.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約O'C。51.權(quán)利要求42的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約-5'C。52.制造核酸微粒的方法，包括將膽固醇修飾的核酸、水溶性聚合物和多價(jià)陽(yáng)離子的混合物進(jìn)行溫育，以及以足以形成微粒的速度將混合物冷卻一段時(shí)間。53.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟以0.5'C/min的速度進(jìn)行。54.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟以0.75°C/min的速度進(jìn)行。55.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟以0.8T:/min的速度進(jìn)行。56.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約4t:。57.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約O'C。58.權(quán)利要求52的方法，其中冷卻步驟結(jié)束在大約-5'C。59.權(quán)利要求52的方法，其中核酸是抑制性RNA分子。60.權(quán)利要求59的方法，其中核酸是siRNA。61.權(quán)利要求52的方法，其中多價(jià)陽(yáng)離子如權(quán)利要求3中的陳述。62.權(quán)利要求52的方法，其中多價(jià)陽(yáng)離子是Mg++或Ca++。63.權(quán)利要求52的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇。64.權(quán)利要求52的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)與聚乙烯吡咯垸酮(PVP)的混合物。65.權(quán)利要求52的方法，其中混合物在室溫溫育。66.權(quán)利要求52的方法，其中混合物在37'C溫育。67.權(quán)利要求52的方法，其中混合物在65'C溫育。68.權(quán)利要求52的方法，其中溫育步驟執(zhí)行大約5分鐘到大約10分鐘。69.權(quán)利要求52的方法，其中水溶性聚合物在混合物中以大約12.5%(w/v)到大約25%(w/v)存在。70.權(quán)利要求69的方法，其中水溶性聚合物在混合物中以大約12.5°/。(w/v)存在。71.權(quán)利要求69的方法，其中水溶性聚合物在混合物中以大約16.7%(w/v)存在。72.權(quán)利要求69的方法，其中水溶性聚合物在混合物中以大約20%(w/v)存在。73.權(quán)利要求52的方法，其中多價(jià)陽(yáng)離子在混合物中以大約7.5mM到大于1M存在。74.權(quán)利要求73的方法，其中多價(jià)陽(yáng)離子在混合物中以大約10mM到大約20mM、到大約25mM、或到大約35mM存在。75.權(quán)利要求73的方法，其中多價(jià)陽(yáng)離子在混合物中以大約25mM存在o76.通過權(quán)利要求42到75任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的微粒。77.將微粒投送到靶粘膜的方法，包括以有效穿透并作用于所述耙粘膜上或中的量，將耙粘膜與權(quán)利要求76的微粒相接觸的步驟。78.權(quán)利要求77的方法，其中靶粘膜選自頰粘膜、食管粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、支氣管粘膜、子宮粘膜和子宮內(nèi)膜。全文摘要本發(fā)明涉及微粒組合物，其中微粒由核酸和非聚合性陽(yáng)離子制成，所述組合物適于施加到潮濕或水性的靶位(例如肺組織)，在那里，基本上呈球形的核酸微粒通過溶解釋放出核酸，使得釋放出的核酸與靶細(xì)胞自由地相互作用。文檔編號(hào)A61K9/12GK101686939SQ200880020654公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日發(fā)明者拉里·R·布朗,邁克爾·加洛,金伯利·A·吉利斯申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司;巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司