專利名稱：LSECtin及其融合蛋白在制備抑制癌細胞向肝轉移藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及LSECtin及其融合蛋白在制備抑制癌細胞向肝轉移藥物中的應用。
背景技術：
90%以上的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉移或復發(fā)。侵襲性生長和轉移潛能是惡 性腫瘤的頑固性和難治性的根本原因。目前人類對腫瘤的認識水平和常規(guī)治療手段尚無法 從根本上清除惡性腫瘤，因此，挖掘抑制腫瘤轉移的藥物仍是當今急需解決的問題。
腫瘤轉移指惡性腫瘤細胞脫離其原發(fā)部位，通過各種渠道轉運到不連續(xù)的靶組 織，繼續(xù)增殖生長成同樣性質(zhì)腫瘤的過程。據(jù)統(tǒng)計，60%以上的惡性腫瘤患者于初次診斷 時已發(fā)現(xiàn)有轉移。惡性腫瘤的轉移途徑主要有血道轉移和淋巴道轉移①血道轉移癌細 胞若進入血管，部分死亡，部分仍然存活，活的癌細胞可隨血液流到身體任何一處停留并生 長，發(fā)生血行轉移。②淋巴道轉移癌細胞很容易侵入淋巴管，被淋巴液帶到淋巴結而生成 轉移瘤；癌細胞在淋巴結緣竇時，淋巴結不腫大，肉眼所見大致正常；癌細胞逐漸在淋巴結 內(nèi)生長造成淋巴結的腫大而堅硬；局部淋巴結轉移后，癌細胞又可沿其側枝逐步擴散，轉移 至遠隔部位之淋巴結。腫瘤的侵襲轉移是一個多步驟、多因素參與的極其復雜的過程，其中 腫瘤細胞的粘附性在腫瘤侵襲和轉移中起著極為重要的作用，因此抗粘附治療在抗腫瘤侵 襲轉移方面必將有著十分廣闊的應用前景。美國FDA批準的臨床I期新抗體CNT095(aV整 合素的人源性單抗)，在體外實驗中可阻斷人黑色素瘤細胞的粘附、移動和侵襲。在黑色素 瘤異種移植的裸鼠體內(nèi)，CNT095不但可抑制腫瘤血管生成，并且可以有效抑制腫瘤的生長。
LSECtin(Xiver and lymph node Sinusoidal Endothelial Cells lectin)為
賀福初等在國際上率先克隆并研究的一種新的c-型凝集素，在肝臟和淋巴結中特異表
達，其基因與已知的C-型凝集素DC-SIGN、 DC-SIGNR和CD23基因緊密成簇排列于染色 體19pl3. 3區(qū)域，同屬于II型C-型凝集素家族(Liu， W. et al. Characterization of a novel C-type lectin-like gene， LSECtin :demonstrationof carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells ofliver and lymph node. J Biol. Chem. 279，18748-18758， 2004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種LSECtin及其融合蛋白的新用途。 本發(fā)明提供的新用途是LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制備抑制癌細胞向 肝轉移的藥物中的應用。所述含有LSECtin的融合蛋白為LSECtin與人IgG的融合蛋白。 所述LSECtin具體為序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；所述含有LSECtin的融合蛋
白具體為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
所述含有LSECtin的融合蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)的DNA分子
1)其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的
DNA分子。 上述嚴格條件可為在6 X SSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS和1 X SSC， 0. 1 % SDS各洗膜一次。
所述癌細胞具體可為結腸癌細胞。 本發(fā)明還提供了一種抑制結腸癌肝轉移的藥物，其活性成分為LSECtin或含有 LSECtin的融合蛋白。所述含有LSECtin的融合蛋白為LSECtin與人IgG的融合蛋白。 所述LSECtin具體為序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；所述含有LSECtin的融合蛋
白具體為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
所述含有LSECtin的融合蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)的DNA分子
1)其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的
DNA分子。 上述嚴格條件可為在6 X SSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS和1 X SSC， 0. 1 % SDS各洗膜一次。
所述癌細胞具體可為結腸癌細胞。 實驗證明LSECtin蛋白及其融合蛋白與結腸癌細胞LS174T、 LoVo、 SW480結合， 而且識別其表面的特異糖鏈；結腸癌細胞株LS174T在體外與肝竇內(nèi)皮細胞上的粘附可被 LSECtin蛋白及其融合蛋白阻斷；結腸癌細胞株LS174T在體內(nèi)與肝臟的粘附可被LSECtin 蛋白及其融合蛋白阻斷；整體實驗進一步證明LSECtin蛋白及其融合蛋白能阻斷LS174T往 肝臟的轉移丄SECtin蛋白及其融合蛋白能粘附結腸癌細胞、抑制結腸癌細胞往肝臟的歸巢 性遷移，可能用作制備預防和/或治療結腸癌肝轉移的藥物。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為實施例1的HE染色標記檢測結果。
圖2為實施例1的癌胚抗原標記檢測結果。 圖3為注射LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白后結腸癌肝轉移小鼠的 存活率；(a)為LSECtin蛋白，(b)為可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
4
圖4為LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞與肝竇 內(nèi)皮細胞體外粘附的影響。 圖5為LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞與肝竇 內(nèi)皮細胞體內(nèi)的粘附的影響。 圖6為LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與結腸癌細胞的粘附。
圖7為不同濃度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與LS174T結腸癌 細胞的粘附;(a)為LSECtin蛋白，(b)為可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
圖8為LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與LS174T結腸癌細胞粘附的 抑制劑；(a)為LSECtin蛋白，(b)為可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
以下實施例中所用到的實驗材料如下 CHO，中國倉鼠卵巢癌細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞中心)；Fc-FITC抗體 (Sigma， HP-6017) ;Lipofectamine 2000Reagent (Invitrogen) ;Imm皿oPureImmobilized Protein A/G (Pierce) ;LS174T、 LoVo、 DLD-l、 SW480結腸癌細胞株(中科院上海細胞庫)； CFSE (Sigma) ;LSECtin蛋白(購自于R&D公司)。 BalB/c雌鼠體重20±2克，6_8周，購自維通利華動物中心； BalB/c SPF級裸鼠體重20±2克，6-8周，購自維通利華動物中心。PBS溶液135mM NaCl、2. 7mM KC1、1. 5mM KH2P04、8mM K2HP04 ;pH7. 2。 實施例2至實施例8中所用的LSECtin蛋白溶液均是用PBS溶液稀釋LSECtin蛋
白得到的，所用的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白溶液，均是用PBS溶液稀釋實施例1得到的
純化后的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白得到的。 實施例1 、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的獲得 1、可溶性LSECt in-Fc融合蛋白表達載體(pIG-sLSECt in)的構建 pIG-sLSECtin含有可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(氨基酸序列見序列表的序列2)
的編碼序列(見序列表的序列3) 。 pIG-sLSECt in的構建方法如下 (l)pET-28-sLSECt in表達載體的構建 設計LSECtin膜外部分的特異性引物F1 :5 ' _CGG GGATCCAAGGCCTCCACGGAGCGC-3'，(畫線部分為BamHI酶切位點)和Rl :5' -ACGCGTCGACT CAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3'(畫線部分為Sail酶切位點)，以流產(chǎn)的人胎肝cDNA為模板， PCR擴增LSECtin的膜外部分。PCR反應條件為先94°C 5min ;然后94°C 45s，58°C lmin， 72°C lmin，30個循環(huán)；再72°C lOmin。 PCR產(chǎn)物用BamH I和Sal 137。C雙酶切過夜。同時， 質(zhì)粒pET-28a(invitrogen公司)也用BamH I和Sal I雙酶切。酶切產(chǎn)物純化、連接，轉染 JM109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定重組子并測序驗 證，將得到的重組表達載體命名為pET-28-sLSECtin。
(2) pIG-sLSECtin表達載體的構建 以F2 :5 ' -CGGAAGCTTAAGGCCTCCACGGAGCGC-3 '(畫線部分為Hind 111酶切位 點)和R2 :5' -ACGCTCTAGATCAGCAGTTGTGCCTTTTCTC-3'(畫線部分為Xba I酶切位點)為引物，以上述步驟(1)構建的重組表達載體pET-28-sLSECtin為模板，PCR擴增LSECtin 的膜外部分可溶性LSECtin (其氨基酸序列是GenBank AccessionNumber AAR84185的自氨 基末端第55至293位氨基酸)。 PCR反應條件為先94。C5min變性；再94°C 45s， 58°C lmin，72。C lmin，30個循環(huán)； 最后72。C，10min。 PCR產(chǎn)物用Hind III和Xba I 37。C雙酶切過夜。同時，Signal pIGplus 質(zhì)粒(invitrogen公司)也用Hind III和XbaI雙酶切。酶切產(chǎn)物純化、連接，轉染JM109 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，HindIII和Xbal雙酶切鑒定重組子并測序驗證，將 得到的重組表達載體命名為pIG-sLSECtin。 將該質(zhì)粒進行測序，結果表明，pIG-sLSECtin含有序列3所示的核苷酸序列，該核
苷酸序列編碼序列2所示的氨基酸序列。 2、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白的表達與純化 將pIG-sLSECtin質(zhì)粒用Lipofectamine 2000Reagent轉染到CHO中國倉鼠卵巢 癌細胞，轉染后48小時，用含G418的DMEM完全培養(yǎng)基(lmg/ml)培養(yǎng)，兩周后，挑選單細胞 克隆轉入24孔板培養(yǎng)， 一周后擴大培養(yǎng)。從每一株單克隆細胞中分別取少許細胞在24孔 板中培養(yǎng)，24小時后換為無血清培養(yǎng)基(將匿EM完全培養(yǎng)基中的血清去除得到的培養(yǎng)基) 繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收上清，以LSECtin抗體(購自R&D公司)為一抗進行Western Blot檢 測。將強陽性的細胞株繼續(xù)擴大培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后，收集上清，用Imm皿oPure Immobilized Protein A/G進行純化，純化后進行Western Blot鑒定，鑒定結果表明得到了 純化的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白。 實施例2、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞株在 肝臟形成轉移灶的影響 取純系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半。隨機分為3組，每組10只。 取純系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，隨機分為3組，每組10只。第一組裸鼠體內(nèi)
注射0. lml LSECtin蛋白(5 y g/ml);第二組裸鼠體內(nèi)注射0. lml可溶性LSECtin-Fc融合
蛋白(5iig/ml);第三組裸鼠體內(nèi)注射O. lml PBS。 12小時后將結腸癌細胞(1 X 107/只)
經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)。分別于試驗后第7天、第14天、第21天每組各殺死3只老鼠，取
其肝臟固定、石蠟包埋，分別采用H&E染色和癌胚抗原免疫組化染色，觀察LS174T的肝轉移
情況、分析腫瘤轉移率。 服E染色標記檢測結果見圖1。結果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融 合蛋白均能明顯減少肝臟內(nèi)腫瘤轉移灶的形成。癌胚抗原標記檢測結果見圖2。結果表明， LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能明顯減少肝臟內(nèi)腫瘤轉移灶的形成。
實施例3、 LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對結腸癌肝轉移小鼠存活 的影響 取純系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，隨機分為3組，每組10只。第一組裸鼠體內(nèi) 注射0. lml LSECtin蛋白(5 y g/ml);第二組裸鼠體內(nèi)注射0. lml可溶性LSECtin-Fc融合 蛋白(5iig/ml);第三組裸鼠體內(nèi)注射O. lml PBS。 12小時后將結腸癌細胞(1 X 107/只) 經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)。連續(xù)觀測小鼠的存活率。 結果見圖3。結果表明，在相同天數(shù)的條件下，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc 融合蛋白能明顯提高小鼠存活率。
6
實施例4、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞與肝 竇內(nèi)皮細胞體外粘附的影響 取BalB/c雌鼠30只，分別制備肝組織冰凍切片，將30張冰凍切片分為3組，每組 10張。分別檢測LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞與肝竇 內(nèi)皮細胞體外粘附的影響，具體操作如下 取正常小鼠肝組織冰凍切片，第一組切片用LSECtin蛋白和LS174T結腸癌細胞孵 育，第二組切片用可溶性LSECtin-Fc融合蛋白和LS174T結腸癌細胞孵育，第三組切片用 PBS和LS174T結腸癌細胞孵育，作為對照。l小時后，檢測結腸癌細胞是否黏附到小鼠肝組 織冰凍切片上及黏附部位。結合結腸癌細胞后的冰凍切片用戊二醛固定，H&E染色。顯微 鏡下照相保存，并分析細胞黏附結果。 結果見圖4。 LS174T細胞能夠容易地黏附到肝臟上，其黏附位置為肝竇內(nèi)皮細胞。
LS174T細胞與肝竇內(nèi)皮細胞的黏附能被LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白阻斷。 實施例5、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白對LS174T結腸癌細胞與肝
竇內(nèi)皮細胞體內(nèi)的粘附的影響 —、 LS174T結腸癌細胞熒光標記 用活體染料CFSE (Sigma)標記LS174T結腸癌細胞。具體操作為將1 X 106LS174T 結腸癌細胞在lml PBS和5uM CFSE中37t:孵育10min，然后加入lml冷卻的PBS停止反應， 被標記的細胞立即清洗并計數(shù)。
二、體內(nèi)粘附實驗 取純系BalB/c裸鼠30只，雌雄各半，隨機分為3組，每組10只。第一組裸鼠體內(nèi) 注射0. lml LSECtin蛋白(5 y g/ml);第二組裸鼠體內(nèi)注射0. lml可溶性LSECtin-Fc融合 蛋白(5yg/ml);第三組裸鼠體內(nèi)注射O. lml PBS。 12小時后注射熒光標記的結腸癌細胞 (1 X 107只)，12小時后處死小鼠，制備肝細胞懸液，用流式細胞技術檢測肝內(nèi)轉移的腫瘤 細胞數(shù)。 結果見圖5。結果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白能明顯減少 腫瘤細胞往肝臟的轉移。 實施例6、 LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與各種結腸癌細胞的粘附
分別檢測LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與4種結腸癌細胞(LS174T、 LoVo、DLD-l、SW480)的粘附性；PBS溶液作為對照；具體方法如下
(1)PBS洗滌癌細胞，4500rpm，3min，棄上清； (2)癌細胞與LSECtin蛋白(或可溶性LSECtin-Fc融合蛋白共孵育)，孵育體系 中，癌細胞的濃度為5X107ml、蛋白的濃度為lOii g/ml，室溫放置lh ;
(3) PBS洗滌，4500rpm， 3min，棄上清；
(4)力B LSECtin抗體，冰上放置lh ;
(5) PBS洗滌，4500rpm， 3min，棄上清； (6)加FITC標記二抗(購自Santa Cruz)，暗處冰上放置lh ;
(7)PBS洗滌，4500rpm，3min，棄上清； (8)加100iaPBS、400iil4^多聚甲醛固定，流式細胞儀分析。 結果見圖6。結果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白均能結合結腸
7癌細胞SW480、 LoVo和LS174T。 實施例7、不同濃度的LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與LS174T結腸 癌細胞的粘附 分別檢測不同濃度的LSECtin蛋白(0、 1、2、5、 10 ii g/ml)、不同濃度的實施例1制 備的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白(0、 1、2、5、 10 y g/ml)與LS174T結腸癌細胞的粘附性; PBS溶液作為對照；具體方法同實施例6。 結果見圖7。結果表明，結果表明，LSECtin蛋白、可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與 結腸癌細胞LS174T的結合均隨著蛋白濃度的增加而升高。 實施例8、LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與LS174T結腸癌細胞粘附 的抑制劑 將10 ii g/ml的LSECtin蛋白(或10 y g/ml的可溶性LSECtin-Fc融合蛋白)分 別與EDTA(10mM)、甘露醇糖(Mannan) (10mM)、巖藻糖(Fucose) (10mM) 、 N_乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) (10mM)或PBS(對照)等體積混合，孵育30分鐘。然后檢測LSECtin蛋白(或可 溶性LSECtin-Fc融合蛋白)與LS174T結腸癌細胞的粘附性，具體方法同實施例6。
結果見圖8。結果表明，LSECtin蛋白和可溶性LSECtin-Fc融合蛋白與結腸癌細 胞LS174T的結合能不同程度的被EDTA、甘露醇糖、巖藻糖和N_乙酰氨基葡萄糖所抑制。序列表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所〈120〉LSECtin及其融合蛋白在制備抑制癌細胞向肝轉移藥物中的應用
〈130〉CGGNARY81876〈160>3〈210>1〈211>293〈212>PRT〈213〉人屬人(Homo sapiens)〈400>1MetAspThrThrArgTyrSerLysTrpGlyGlySerSerGluGluVal151015ProGlyGlyProTrpGlyArgTrpValHisTrpSerArgArgProLeu202530PheLeuAlaLeuAlaValLeuValThrThrValLeuTrpAlaVallie354045LeuSerlieLeuLeuSerLysAlaSerThrGluArgAlaAlaLeuLeu505560AspGlyHisAspLeuLeuArgThrAsnAlaSerLysGinThrAlaAla65707580LeuGlyAlaLeuLysGluGluValGlyAspCysHisSerCysCysSer859095GlyThrGinAlaGinLeuGinThrThrArgAlaGluLeuGlyGluAla
100105110Gin AlaLysLeuMetGluGinGluSerAlaLeuArgGluLeuArgGlu115120125Arg ValThrGinGlyLeuAlaGluAlaGlyArgGlyArgGluAspVal130135140Arg ThrGluLeuPheArgAlaLeuGluAlaValArgLeuGinAsnAsn145150155160Ser CysGluProCysProThrSerTrpLeuSerPheGluGlySerCys165170175Tyr PhePheSerValProLysThrThrTrpAlaAlaAlaGinAspHis180185190Cys AlaAspAlaSerAlaHisLeuVallieValGlyGlyLeuAspGlu195200205Gin GlyPheLeuThrArgAsnThrArgGlyArgGlyTyrTrpLeuGly210215220Leu ArgAlaValArgHisLeuGlyLysValGinGlyTyrGinTrpVal225230235240Asp GlyValSerLeuSerPheSerHisTrpAsnGinGlyGluProAsn245250255Asp AlaTrpGlyArgGluAsnCysValMetMetLeuHisThrGlyLeu260265270Trp AsnAspAlaProCysAspSerGluLysAspGlyTrplieCysGlu275280285Lys ArgHisAsnCys290〈210>2〈211>482〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2Met LysCysPheLeuTyrLeuAlaPheLeuPhelieGlyValAsnCys151015Glu PheThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyPro202530Ser ValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer354045Arg ThrProGluValThrCysValValVal Asp Val Ser His Glu Asp90152]505560
0153]ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn
0154]65707580
0155]AlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgVal
0156]859095
0157]ValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu
0158]100105110
0159]TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys
0160]115120125
0161]ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThr
0162]130135140
0163]LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeuThr
0164]145150155160
0165]CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGlu
0166]165170175
0167]SerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu
0168]180185190
0169]AspSerAspGlyProPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys
0170]195200205
0171]SerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu
0172]210215220
0173]AlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerProGly
0174]225230235240
0175]LysSerArgLysAlaSerThrGluArgAlaAlaLeuLeuAspGlyHis
0176]245250255
0177]AspLeuLeuArgThrAsnAlaSerLysGinThrAlaAlaLeuGlyAla
0178]260265270
0179]LeuLysGluGluValGlyAspCysHisSerCysCysSerGlyThrGin
0180]275280285
0181]AlaGinLeuGinThrThrArgAlaGluLeuGlyGluAlaGinAlaLys
0182]290295300
0183]LeuMetGluGinGluSerAlaLeuArgGluLeuArgGluArgValThr
0184]305310315320
0185]GinGlyLeuAlaGluAlaGlyArgGlyArgGluAspValArgThrGlu
0186]325330335
0187]LeuPheArgAlaLeuGluAlaValArgLeuGinAsnAsnSerCysGlu
0188]340345350
0189]ProCysProThrSerTrpLeuSerPheGluGlySerCysTyrPhePhe
0190]355360365
100191:
0192:0193:0194:0195:0196:0197:0198:0199:0200:0201'
Ser
Ala385Leu
Val
Ser
Gly
Val370
Ser
ThrArgLeuArg
Pro Lys Thr ThrAla HisArg Asn
His Leu420Ser Phe435
Glu Asn
Leu Val390Thr Arg405
Gly LysSer HisCys Val
Trp375lie
Gly
Val
Trp
Met
Ala
Val
Arg
Gin
Asn440Met
Ala
Gly
Gly
Gly425Gin
Leu
Ala
Gly
Tyr410Tyr
Gly
His
Gin
Leu395Trp
Gin
Glu
Thr
Asp380Asp
Leu
Trp
Pro
Gly
His
Glu
Gly
Val
Asn445Leu
Cys
Gin
Leu
Asp430Asp
Trp
Ala
Gly
Arg415Gly
Ala
Asn
Asp
Phe400Ala
Val
Trp
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1權利要求
LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制備抑制癌細胞向肝轉移的藥物中的應用。
2. 如權利要求l所述的應用，其特征在于所述含有LSECtin的融合蛋白為LSECtin與 人IgG的融合蛋白。
3. 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述LSECtin為序列表的序列1所示 的蛋白質(zhì)；所述含有LSECtin的融合蛋白為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述含有LSECtin的融合蛋白的編碼基因 為如下1)或2)或3)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
5. 如權利要求1至4中任一所述的應用，其特征在于所述癌細胞為結腸癌細胞。
6. —種抑制結腸癌肝轉移的藥物，其活性成分為LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。
7. 如權利要求6所述的藥物，其特征在于所述含有LSECtin的融合蛋白為LSECtin與 人IgG的融合蛋白。
8. 如權利要求6或7所述的藥物，其特征在于所述LSECtin為序列表的序列1所示 的蛋白質(zhì)；所述含有LSECtin的融合蛋白為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與(a)限定的蛋白具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
9. 如權利要求8所述的藥物，其特征在于所述含有LSECtin的融合蛋白的編碼基因 為如下1)或2)或3)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
10. 如權利要求6至9中任一所述的藥物，其特征在于所述癌細胞為結腸癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了LSECtin及其融合蛋白在制備抑制癌細胞向肝轉移藥物中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白可應用于制備抑制癌細胞向肝轉移的藥物。本發(fā)明還提供了一種抑制結腸癌肝轉移的藥物，其活性成分為LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白。LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附結腸癌細胞、抑制結腸癌細胞往肝臟的歸巢性遷移，因此，很可能成為抗粘附治療腫瘤肝轉移的一個新靶標。本發(fā)明具有巨大的社會意義和經(jīng)濟價值。
文檔編號A61K39/395GK101732715SQ20081022571
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2008年11月7日
發(fā)明者唐麗, 左云飛, 蒯學章, 賀福初 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所