專利名稱：：治療性疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療性疫苗制劑，具體涉及增強(qiáng)疫苗免疫原性的疫苗佐劑及用于腫瘤治療的疫苗制劑，屬于分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人民生命和健康的疾病，腫瘤的預(yù)防和治療已成為全球性的醫(yī)藥衛(wèi)生工作的重要任務(wù)，人類對腫瘤的治療研究也一直在不懈的努力。腫瘤疫苗成為繼手術(shù)、放療和化療之后的腫瘤治療方法，腫瘤疫苗作為主動(dòng)特異性免疫治療，在臨床中起到越來越重要的作用，人們開始嘗試?yán)枚喾N方法制備腫瘤疫苗并利用其促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答，從整體細(xì)胞，分子水平調(diào)控機(jī)體對腫瘤的免疫。疫苗的本質(zhì)是將某一免疫原組份作用于生物體，從而激發(fā)機(jī)體對該免疫原或免疫原載體的免疫保護(hù)，腫瘤疫苗正是根據(jù)這一免疫原理將自身腫瘤細(xì)胞經(jīng)物理因素的處理，改變或消除其致瘤性，保留其免疫原性。且常與佐劑聯(lián)合應(yīng)用，增強(qiáng)其免疫原性。這是以腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗，也是第一類腫瘤疫苗。第二類腫瘤疫苗是以腫瘤相關(guān)抗原為基礎(chǔ)的疫苗，包括肽和蛋白質(zhì)疫苗、重組病毒疫苗、DNA疫苗等。第三類腫瘤疫苗是以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗，它利用了樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)強(qiáng)的抗原呈遞能力，捕獲免疫原，并將信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了增強(qiáng)腫瘤疫苗的免疫原性，常常與佐劑聯(lián)合應(yīng)用，從而引發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。佐劑主要可分為兩種一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌(結(jié)核分枝桿菌)以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。我們熟知的弗氏佐劑是目前最常用的。在19世紀(jì)，紐約的外科醫(yī)生WilliamColey注意到細(xì)菌的提取物對腫瘤具有治療作用，后來人們發(fā)現(xiàn)其中的有效成分是含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。CpG0DN是人工合成的含有未甲基化的CpG基序的寡脫氧核苷酸，它能模擬原核生物DNA刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，激活多種免疫細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，有誘導(dǎo)激活抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，可以單獨(dú)應(yīng)用治療腫瘤。同時(shí)，CpGODN也是一種有效的Thl型免疫佐劑，可促進(jìn)蛋白類免疫原誘發(fā)特異性CTL應(yīng)答，比弗氏完全佐劑更強(qiáng)，因此，成為腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。乳劑是指互不相溶的兩種液體混合，其中一相液體以液滴狀態(tài)分散于另一相液體中形成的非均相液體分散體系。乳劑由水相、油相和乳化劑組成，根據(jù)乳化劑的種類性質(zhì)及相體積比形成水包油或油包水型。根據(jù)乳滴的大小乳劑分為普通乳、亞微乳、納米乳。乳劑中液滴的分散度很大，藥物吸收和藥效的發(fā)揮很快，生物利用度高。油性藥物制成乳劑能保證劑量準(zhǔn)確，而且使用方便；水包油型乳劑可以掩蓋藥物的不良?xì)馕叮⒖杉尤氤C味劑；外用乳劑能改善對皮膚、黏膜的滲透性，減少刺激性；靜脈注射乳劑注射后分布較快、藥效高、有靶向性；靜脈營養(yǎng)乳劑時(shí)高能營養(yǎng)輸液的重要組成部分。目前，已經(jīng)有多種疫苗以乳劑形式在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如赫利歐等人制備的HIV疫苗TAB9即為以ISA720為油相和佐劑的乳劑疫苗，目前正在進(jìn)行臨床研究(赫利歐托爾多等，多表位多肽聯(lián)合MontanideISA720作為佐劑在非HIV-1感染志愿者中的I期臨床試驗(yàn).疫苗，2001年19期，4328-4336頁.HerioToledoetal.AphaseIclinicaltrialofamulti-epitopepolypeptideTAB9combinedwithMontanideISA720adjuvantinnon—HIV-1infectedhumanvolunteers.Vaccine19(2001)4328-4336)。以乳劑形式上市的疫苗包括葛蘭素史克公司的油包水乳劑乙肝疫苗Fendrix(2005年，歐洲上市)和Chiron公司水包油乳劑的流感亞單位疫苗(1997年歐洲上市)。美國專利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687公開了通過產(chǎn)生抗胃泌素抗體，用于控制患者G17和G34水平的免疫原和免疫原性組合物，這些組合物即是以腫瘤相關(guān)免疫原為基礎(chǔ)的肽類疫苗，它們也是以乳劑的形式在進(jìn)行研究。本發(fā)明治療性疫苗涉及美國專利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687中公開的抗G17肽類疫苗，本發(fā)明治療性疫苗還涉及中國專利CN101050236中公開的抗G17肽類疫苗以及中國專利CN100999548中公開的載體蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤治療的疫苗制劑。本發(fā)明的疫苗制劑，包括一種本身具有免疫原性的免疫原物質(zhì)、具有免疫增強(qiáng)劑活性的人用疫苗佐劑、適合于油包水乳劑的油相介質(zhì)和作為水相的緩沖液。所述的具有免疫原性的免疫原物質(zhì)是多肽免疫原或多肽免疫原與大分子蛋白的交聯(lián)物。上述多肽免疫原或多肽免疫原與大分子蛋白的交聯(lián)物可采用現(xiàn)有技術(shù)，例如美國專利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687、中國專利CN101050236中公開的免疫原、免疫原與蛋白的交聯(lián)物。上述具有免疫增強(qiáng)劑活性的人用疫苗佐劑為含有至少一個(gè)非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸；該寡聚脫氧核苷酸長度為15-35個(gè)核苷酸，優(yōu)選長度為20-30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長度為20-25個(gè)核苷酸。優(yōu)選的，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為下列之一5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'55'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'更優(yōu)選的是，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為下列之一5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，其中優(yōu)選的，所述寡聚脫氧核苷酸是硫代修飾的。上述硫代寡聚脫氧核苷酸的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如可以采用固相亞磷酰胺三酯法化學(xué)合成。本發(fā)明所涉及治療性疫苗制劑還包含其它佐劑，如ISA720(法國SEPPIC公司)、MF59(諾華公司)、氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。本發(fā)明中所涉及的免疫原物質(zhì)具體是一種具有刺激腫瘤生長活性的多肽免疫原或此多肽免疫原通過由7個(gè)氨基酸組成的間隔肽借助于雙功能交聯(lián)劑與載體蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物，該交聯(lián)產(chǎn)物如G17CRM197、G17DT、G17BSA、G17P64K等。其中，所述的多肽免疫原的氨基酸序列如下pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu其中，所述間隔肽氨基酸序列如下Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys所述雙功能交聯(lián)劑為e-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS);所述載體蛋白包括白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)毒素(TT)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、白喉毒素突變體CRM197以及腦膜炎球菌P64K蛋白；其中優(yōu)選白喉類毒素和CRM197。本發(fā)明所述的交聯(lián)物優(yōu)選G17CRM197以及G17DT，采用中國專利申請CN101050236(200610043442.X)和美國專利申請US5468494中所述方法制備。本發(fā)明所述的適合于油包水乳劑的油相介質(zhì)選自注射用大豆油、角鯊烯、ISA720(法國SEPPIC公司)、ISA51(法國SEPPIC公司)，其中優(yōu)選ISA720(法國SEPPIC公司)。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的治療性疫苗制劑為一種油包水乳劑，每劑疫苗(250ul為一劑)含有具有免疫活性的免疫原10ug-lmg，優(yōu)選50ug-0.5mg;含有寡聚脫氧核苷酸佐劑10ug-10mg，優(yōu)選25ug-5mg;含有油相介質(zhì)ISA720為0.05-lml，優(yōu)選O.1-0.5ml。其中，上述優(yōu)選的油包水乳劑中還含有緩沖液作為水相介質(zhì)，這些緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、Tris鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液等生理上可接受的水相介質(zhì)。本發(fā)明所述制劑通過下述主要步驟制備(1)將一定量的免疫原與免疫佐劑加入至緩沖液中制成適宜濃度的免疫原佐劑溶液;(2)稱取處方量的油相介質(zhì)置適宜容器中作為油相；(3)取處方量的免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，以較低轉(zhuǎn)速進(jìn)行均質(zhì)，再以較高轉(zhuǎn)速均質(zhì)，制成均一、穩(wěn)定的油包水乳劑；(4)用粒度儀測定乳劑粒徑。采用動(dòng)物免疫試驗(yàn)的方法來測定所制備的乳劑刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體的情況，按照常規(guī)的方法進(jìn)行免疫，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測產(chǎn)生的抗體滴度。本發(fā)明的腫瘤治療性疫苗制劑作為抗消化道腫瘤的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的腫瘤治療性疫苗制劑適合于肌肉內(nèi)注射或皮下注射。用所制備的乳劑免疫小鼠，定期采集抗血清。對所采集的血清進(jìn)行純化得到抗體，并將所得到的抗體進(jìn)行體外藥效學(xué)評價(jià)。體外實(shí)驗(yàn)所采用的腫瘤細(xì)胞為胃癌細(xì)胞MKN45、BGC823和大腸癌細(xì)胞L0V0、SW480。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用荷瘤大鼠進(jìn)行，將適量乳劑注射入大鼠體內(nèi)，通過檢測腫瘤的大小來評價(jià)本發(fā)明治療性疫苗制劑對腫瘤的作用。通過體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及大鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明治療性疫苗制劑對胃癌及大腸癌有明顯的治療作用。具體內(nèi)容將在實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說明。以本發(fā)明免疫原與佐劑的組合物作為治療性疫苗的有效成分制成的乳劑可直接用于人體注射。此免疫原在人體內(nèi)能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗胃泌素抗體，此抗體可中和消化道腫瘤患者體內(nèi)過多的胃泌素，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本發(fā)明中用于增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(簡稱CpG-0DN)，這種佐劑通過免疫細(xì)胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)針對疫苗免疫原的特異性免疫應(yīng)答。本制劑中的免疫原在所述的佐劑CpG-0DN存在的情況下與未加佐劑或加入其他佐劑的制劑相比較，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的抗體，對體內(nèi)移植瘤模型的抑制效果更加明顯。另外，由于本制劑中油相介質(zhì)的加入，使得用本發(fā)明所提供的方法制備的油包水型乳劑能夠在體內(nèi)持續(xù)不斷地刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，應(yīng)用本發(fā)明疫苗制劑來免疫動(dòng)物，所產(chǎn)生的抗體滴度遠(yuǎn)高于單獨(dú)應(yīng)用未加佐劑的疫苗的抗體滴度，即本發(fā)明所涉及的免疫原與佐劑的組合物具有更高的免疫原性。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所涉及的免疫原與佐劑的組合物相比于單獨(dú)使用疫苗具有更明顯的腫瘤抑制效果。圖1為利用本發(fā)明所制備的治療性疫苗制劑的動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明以CpG為佐劑能大大增強(qiáng)免疫原的免疫原性。A組空白對照組，只注射磷酸鹽緩沖液；B組CpG佐劑組(G17CRM197為免疫原，CpG-ODN為佐劑，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相);C組鋁佐劑組(G17CRM197為免疫原，氫氧化鋁為佐劑，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相)；D組無佐劑組G17CRM197為免疫原，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相)。圖2為不同CpG-ODN對G17CRM197免疫原的免疫增強(qiáng)能力對比，表明不同CpG-0DN能夠增強(qiáng)兔子對G17CRM197疫苗的免疫應(yīng)答。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限于實(shí)施范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例l:本發(fā)明治療性疫苗制劑的制備1.1精密稱取2mg免疫原G17CRM197與lmg免疫佐劑CpG—起溶于3.3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取6.7ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.2精密稱取10mg免疫原G17DT與15mg免疫佐劑CpG—起溶于3.3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取6.7ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.3精密稱取40mg免疫原G17BSA與100mg免疫佐劑CpG—起溶于10ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取20ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.4精密稱取2.5mg免疫原G17CRM197與0.5mg免疫佐劑MF59—起溶于3.3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取6.7ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.5精密稱取4rag免疫原G17CRM197與10mg免疫佐劑氫氧化鋁一起溶于3.3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取6.7ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.6精密稱取5mg免疫原G17CRM197溶于3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取7ml油相介質(zhì)ISA720置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.7精密稱取2.5mg免疫原G17CRM197與0.5mg免疫佐劑CpG—起溶于3ml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取7ml油相介質(zhì)ISA51置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以lOOOOrpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。1.8精密稱取2.5mg免疫原G17CRM197與0.5mg免疫佐劑CpG—起溶于lml磷酸鹽緩沖的鹽水中，制成免疫原佐劑溶液。精密量取9ml注射用大豆油置適宜容器中作為油相。5000rpm轉(zhuǎn)速下，將免疫原佐劑溶液緩慢加入油相中，均質(zhì)2分鐘，再以10000rpm轉(zhuǎn)速乳化3分鐘，制成外觀均一、穩(wěn)定的油包水乳劑。實(shí)施例2:本發(fā)明治療性疫苗制劑的家兔免疫實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例中所使用免疫原為G17CRM197，也可以選擇其它免疫原如G17DT、G17BSA、G17P64K、G17TT。按照專利CN101050236中所描述的方法制備G17CRM197，按照本發(fā)明實(shí)施例1.4的方法制備疫苗制劑。其中，本實(shí)施例中所使用的CpG-ODN序列如下5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'，由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法進(jìn)行人工合成，并進(jìn)行全鏈硫代修飾。8本實(shí)施例使用的免疫動(dòng)物為新西蘭大白兔。將兔子分為4組，每組5只。4組分別為A:空白對照組，只注射磷酸鹽緩沖液；B:CpG佐劑組(G17CRM197為免疫原，CpG-0DN為佐劑，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相)；C:鋁佐劑組(G17CRM197為免疫原，氫氧化鋁為佐劑，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相)；D:無佐劑組G17CRM197為免疫原，ISA720為油相，磷酸鹽緩沖液為水相)。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)按照如下過程進(jìn)行(1)將制備的疫苗制劑分別在0、21、42天免疫新西蘭大白兔。免疫方法采用兔后腿肌肉注射，第一次注射右腿，第二次注射左腿，第三次注射右腿，注射點(diǎn)略高于第一次注射點(diǎn)。第一次免疫劑量為lmg，后兩次的免疫劑量為0.5mg。(2)分別在第14、35、56天采集兔血進(jìn)行抗體效價(jià)檢測。其中前兩次為家兔耳緣靜脈采血，第三次為頸動(dòng)脈采血，采集的血清室溫下放置1小時(shí)，凝固后置4'C過夜，析出血清，2000rpm離心，分離血清。血清保存于-4。C，2周內(nèi)備用。本發(fā)明所使用的抗血清效價(jià)檢測方法為ELISA法。具體為將免疫原G17BSA用包被液(Na2C03-NaHC03，pH9.6)稀釋至0.lug/ml，包被聚苯乙烯96孔板，50ul/孔，4。C培育過夜。洗板三次后用封閉液(2%BSA-PBS)封閉，50ul/孔，37°C，2小時(shí)。加抗血清，將采集的抗血清做如下倍數(shù)稀釋2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000，每孔50ul，37'C培育2小時(shí)。以注射生理鹽水的兔血清為陰性對照，以商品抗白喉毒素抗體為陽性對照，同時(shí)與以注射G17DT的兔子產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行比較。洗滌三次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，1:4000稀釋，37'C孵育1小時(shí)。洗板10次后加底物顯色，37'C孵育40分鐘后終止反應(yīng)，測定A491值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖l所示。從圖中結(jié)果可以看出，在第一次動(dòng)物免疫后第14天即可檢測到抗G17抗體產(chǎn)生，第56天時(shí)抗體滴度達(dá)到最高值。同時(shí)可以看出，利用本發(fā)明所制備的疫苗制劑(B組)在三次檢測中抗體滴度均大大高于C組和D組，C組抗體滴度低于B組但高于D組。這說明，本發(fā)明所制備的含有CpG佐劑的制劑不但能大大增強(qiáng)免疫原G17CRM197的免疫原性，而且其免疫增強(qiáng)能力高于其他佐劑。實(shí)施例3:不同CpG-ODN能夠增強(qiáng)兔子對G17CRM197免疫原的免疫應(yīng)答按照與實(shí)施例2相同的方法對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫并檢測抗G17抗體滴度，以測定不同CpG-ODN序列在兔子中對G17CRM197疫苗的免疫效果的影響，不同之處在于使用如下Cl-C6所示的CpG-ODN序列。Cl5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'C25'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'C35'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'C45，-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA--3，C55'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG--3'C65，-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA--3'圖2所示為免疫后56天采血檢測到的抗G17抗體滴度，與使用氫氧化鋁佐劑的對照組相比，上述任意一種CpG-ODN均可使特異性抗體滴度大幅度增加。說明使用上述序列的CpG-ODN佐劑與其他佐劑相比能大大提高疫苗制劑的免疫原性。實(shí)施例4:本發(fā)明治療性疫苗制劑的小鼠免疫對比實(shí)驗(yàn)G17CRM197疫苗制劑小鼠免疫對比實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠；普通級(jí)；年齡6-8周齡；雌雄兼用；體重20g土2g。普通環(huán)境，溫度18—26匸，相對濕度40_70%。飼養(yǎng)籠具為塑料鼠盒，籠具每周替換2次。分組情況分為三組，每組10只小鼠。第一組以G17CRM197為免疫原，以弗氏佐劑為佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相；第二組以以G17CRM197為免疫原，不加佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相；第三組以G17CRM197為免疫原，以CpG-ODN為佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相。動(dòng)物的免疫給藥劑量G17C脂197免疫原量為50ug/只，本發(fā)明涉及的CpG-0DN佐劑為10ug/只；免疫途徑為肌肉注射；免疫時(shí)間為第0、21天；免疫方法為后腿肌肉兩點(diǎn)注射?？寡逯苽湟约翱贵w純化按下述操作進(jìn)行(1)采血時(shí)間第21、42天(免疫當(dāng)天先采血后免疫)。(2)制備血清采用鼠眼眶靜脈采血，約取0.25ml,將采集血液置于離心管中靜止30分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，分離血清。(3)血清的保存置于-2(TC冰箱中保存。(4)抗體的純化采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法對抗血清進(jìn)行純化，如硫酸銨沉淀法、正辛酸沉淀法以及ProteinA親和層析法。所制備的抗體經(jīng)SDS-PAGE檢測純度大于97%。抗體滴度的檢測根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2所述方法進(jìn)行抗體滴度檢測。ELISA檢測抗體滴度結(jié)果如下表所示表1第二次免疫后21天采血檢測結(jié)果第一組第二組第三組鼠12560001280002048000鼠2256000256000512000鼠31280001024000512000鼠41280001024000512000鼠5102400064000512000鼠6640001280001024000鼠764000256000512000鼠864000256000512000鼠964000512000512000鼠10128000256000512000幾何平均滴度137187276495630346由上表結(jié)果可見，本發(fā)明所述疫苗制劑能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度抗體?？贵w滴度不但高10于無佐劑組，且遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的弗氏佐劑組。證明本發(fā)明所述疫苗制劑具有更高的免疫原性。G17DT疫苗制劑小鼠免疫對比實(shí)驗(yàn)按照本專利實(shí)施例4.2所述的方法進(jìn)行小鼠免疫對比實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用G17DT代替實(shí)施例4.2中的G17CRM197。分組情況分為三組，每組10只小鼠。第一組以G17DT為免疫原，以弗氏佐劑為佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相；第二組以以G17DT為免疫原，不加佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相；第三組以G17DT為免疫原，以CpG-0DN為佐劑，以ISA720為油相，以磷酸鹽緩沖液為水相。ELISA檢測抗體滴度結(jié)果如下表所示表2第二次免疫后21天采血檢測結(jié)果第一組第二組第三組鼠12560002560002048000鼠2256000256000512000鼠3128000512000512000鼠41280001024000512000鼠5102400064000256000鼠664000128000256000鼠7128000128000512000鼠8128000256000512000鼠964000256000512000鼠10128000512000512000幾何平均滴度157586256000512000由上表結(jié)果同樣可以看出，本發(fā)明所述疫苗制劑能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度抗體?？贵w滴度不但高于無佐劑組，且遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的弗氏佐劑組。證明本發(fā)明所述疫苗制劑具有更高的免疫原性。實(shí)施例5本實(shí)施例旨在闡明用本發(fā)明所述的疫苗制劑免疫小鼠后所分離出的抗G17抗體在體外對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。向生長良好的腫瘤細(xì)胞中加入實(shí)施例4中所制備的抗G17抗體，通過MTT法測定不同處理組(加胃泌素17組、加抗體組、空白對照組)的細(xì)胞活力，以確定抗體對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。所選用的腫瘤細(xì)胞為胃癌細(xì)胞MKN45和大腸癌細(xì)胞SW480。腫瘤細(xì)胞株體外細(xì)胞培養(yǎng)，10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中分別加入無菌的G17和抗G17抗體，分成三組空白對照組、胃泌素17組(25ug/ml)抗體組(30ug/ml)。細(xì)胞活力的測定應(yīng)用噻氮唑藍(lán)(MTT)比色分析法測定細(xì)胞活力，取100ul含細(xì)胞的培養(yǎng)液(細(xì)胞濃度為105/ml)，接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼璧后吸去培養(yǎng)液；按上述11分組分別加入培養(yǎng)液、G17和抗體，各組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)66小時(shí)后每孔加MTT(5mg/ml)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心棄上清，每孔加20%SDS100ul，震蕩5分鐘，置室溫半小時(shí)后在酶標(biāo)儀上測定570nm波長處的光吸收值。各組A570值間接反映活細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果表明不論是胃癌細(xì)胞MKN45還是大腸癌細(xì)胞SW480，胃泌素組活細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P〈0.01),而抗G17抗體組細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例6本實(shí)施例旨在闡明用本發(fā)明所述疫苗制劑免疫荷瘤小鼠后，小鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況。腫瘤動(dòng)物模型的建立取含有MKN45細(xì)胞和SW480細(xì)胞的培養(yǎng)液70ul(細(xì)胞數(shù)107)，接種于小鼠右腋背交界處皮下層內(nèi)成瘤，瘤塊反復(fù)接種2次，形成腫瘤動(dòng)物模型，將小鼠隨機(jī)分成三組，每組六只；傳代的腫瘤在放大鏡下剪成大小一致的立方體狀瘤塊，約8mm3大小，以套管針分別接種于小鼠右前腋背交界處皮下。各組均自瘤塊接前一周開始進(jìn)行第一次免疫，第一次免疫后第21天進(jìn)行第二次免疫。其中，對照組每只小鼠每次后腿肌肉注射PBS加油相ISA720200ul，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠每次后腿肌肉注射本發(fā)明所述G17CRM197疫苗制劑200ul。第40天將小鼠處死，稱重瘤塊重量，計(jì)算抑瘤率，同時(shí)檢測抗體滴度。對照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重抑瘤率％=------------X100%對照組平均瘤重結(jié)果瘤塊接種第5天后腫瘤生長明顯，測量各組腫瘤面積，大小相近，無顯著性差異(P>0.05)，表明腫瘤生長的均一性較好，從瘤塊接種第七天開始實(shí)驗(yàn)組腫瘤面積較對照組縮小。特別是在第二次免疫后一周，實(shí)驗(yàn)組腫瘤面積明顯開始小于對照組，差異有顯著性(P<0.05);第40天時(shí)實(shí)驗(yàn)組腫瘤面積較對照組更小。根據(jù)腫瘤的重量變化計(jì)算，本發(fā)明所述治療性疫苗制劑的抑瘤率對于兩種腫瘤的抑瘤率分別達(dá)到30%左右。腫瘤重量變化情況如下表所示。表4體內(nèi)腫瘤重量變化表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由此可見，本發(fā)明所述治療性疫苗制劑具有明顯的腫瘤抑制作用。序列表〈110〉齊魯制藥有限公司〈120〉治療性疫苗制劑〈160〉14<170>PatentIn3.1〈210〉1〈211〉25〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3，〈210〉2〈211〉29〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'〈210〉3〈211〉20<212>寡聚脫氧核苷酸5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'〈210〉4〈211〉25〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3，<210>5<211〉21〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，〈210〉6<211>30〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'<210〉7<211〉25〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'<210〉8〈211〉29<212>寡聚脫氧核苷酸5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'〈210〉9〈211〉20〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉10〈211〉25〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉11〈211〉30〈212〉寡聚脫氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉12〈211〉9<212>多肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu〈210〉13〈211〉7<212〉多肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro—Cys1權(quán)利要求1、一種治療性疫苗制劑，包括一種本身具有免疫原性的免疫原物質(zhì)、具有免疫增強(qiáng)劑活性的人用疫苗佐劑、適合于油包水乳劑的油相介質(zhì)和作為水相的緩沖液；所述的具有免疫原性的免疫原物質(zhì)是多肽免疫原或多肽免疫原與大分子蛋白的交聯(lián)物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性疫苗制劑，其特征在于，具有免疫增強(qiáng)劑活性的人用疫苗佐劑為含有至少一個(gè)非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸；該寡聚脫氧核苷酸是硫代修飾的，其長度為15-35個(gè)核苷酸，優(yōu)選20-30個(gè)核苷酸。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤治療性疫苗制劑，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為下列之一5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3，5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3，5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5;-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5，-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療性疫苗制劑，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為下列之一5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3，5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5，-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3，；其中優(yōu)選5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性疫苗制劑，其特征在于，免疫原物質(zhì)是一種具有刺激腫瘤生長活性的多肽免疫原或此多肽免疫原通過由7個(gè)氨基酸組成的間隔肽借助于雙功能交聯(lián)劑與載體蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物；所述的多肽免疫原氨基酸序列為pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu;所述的間隔肽氨基酸序列為Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys;所述的雙功能交聯(lián)劑為e-馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療性疫苗制劑，所述載體蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、白喉類毒素(DT)、白喉毒素突變體CRM197、破傷風(fēng)毒素、腦膜炎球菌P64K蛋白；其中優(yōu)選白喉毒素突變體CRM197或白喉類毒素。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的治療性疫苗制劑，其特征在于還包含其他適合于人用的疫苗佐劑，這些疫苗佐劑選自ISA720、MF59、氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述的治療性疫苗制劑，其特征在于，適合于油包水乳劑的油相介質(zhì)為可注射用油，包括大豆油、角鯊烯、ISA720、ISA51，其中優(yōu)選ISA720。9、根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的治療性疫苗制劑，其特征在于每劑疫苗含有具有免疫活性的免疫原10ug-lmg，優(yōu)選50ug-0.5mg;含有寡聚脫氧核苷酸佐劑lOug-10mg，優(yōu)選25ug-5mg;含有油相介質(zhì)ISA720為0.05-lml,優(yōu)選O.1-0.5ml。10、權(quán)利要求1所述的治療性疫苗制劑作為抗消化道腫瘤藥物的應(yīng)用，適于肌肉內(nèi)注射或皮下注射。全文摘要本發(fā)明涉及一種治療性疫苗制劑。該制劑包含一種具有免疫活性的免疫原，包含至少一個(gè)非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸作為主要佐劑，另外還含有一種或多種油相介質(zhì)和緩沖液作為水相介質(zhì)。本發(fā)明中用于增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(簡稱CpG-ODN)，這種佐劑通過免疫細(xì)胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)針對疫苗免疫原的特異性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的制劑為一種油包水型乳劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其在體內(nèi)能持續(xù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高滴度抗體，對胃腸道腫瘤具有較強(qiáng)的抑制能力。文檔編號(hào)A61K9/107GK101675994SQ200810139858公開日2010年3月24日申請日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日發(fā)明者張明會(huì),楊清敏,王晶翼,王棟海,娥趙,玉郭申請人:齊魯制藥有限公司