專利名稱：：提高牛性控精液超排受精率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及胚胎工程領(lǐng)域，特別是涉及牛性控胚胎的產(chǎn)業(yè)化過程中，提高性控精液受精率的方法。技術(shù)背景牛性控胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的基本原理是應(yīng)用奶牛超數(shù)排卵技術(shù)和分離精液(X精子或Y精子)生產(chǎn)性別控制胚胎，結(jié)合胚胎移植(ET)技術(shù)快速擴(kuò)繁高產(chǎn)奶牛(母牛)，增加高產(chǎn)奶牛數(shù)量。奶牛超數(shù)排卵動(dòng)物的精子與卵子結(jié)合后形成動(dòng)物胚胎。在母牛出生時(shí)其卵巢上有6—10萬個(gè)卵母細(xì)胞，隨著年齡的增長(zhǎng)，數(shù)量進(jìn)一步減少，能夠發(fā)育成熟并排出的卵母細(xì)胞是極少數(shù)的。奶牛為單胎動(dòng)物，一個(gè)發(fā)情周期僅排卵l枚，懷孕期間不發(fā)情排卵，在實(shí)際生產(chǎn)中，由于妊娠、哺乳乏情、冬季休情等因素的影響及母牛實(shí)際利用年限的限制，多數(shù)母牛一生僅排幾十個(gè)卵子，不足卵巢卵母細(xì)胞數(shù)的0.1%，有99.9%的卵母細(xì)胞都沒有發(fā)育成熟，沒有起到應(yīng)有的作用。超數(shù)排卵技術(shù)即利用生殖激素刺激卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育，可使奶牛排出較正常多幾倍、十幾倍的卵母細(xì)胞，在人工授精后形成奶牛胚胎。超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)技術(shù)對(duì)于挖掘優(yōu)秀母畜的繁殖潛力意義重大。性別控制決定哺乳動(dòng)物的性別的基因是Y染色體上的一個(gè)核心區(qū)基因，即SRY(Sex-determiningregionoftheYChromosome)基因。對(duì)于奶牛，人們希望得到雌性奶牛，用于更快的擴(kuò)繁種群和產(chǎn)奶。對(duì)于進(jìn)行性別控制的方法，目前科學(xué)界一致認(rèn)為最理想的方法是對(duì)精子進(jìn)行分離，分離X-精子或Y-精子,分離的精子用于人工授精、體外受精和超數(shù)排卵結(jié)合胚胎移植獲得已知性別的后代，這是一種最經(jīng)濟(jì)、最實(shí)用的性別控制的方法。由于著色量與DNA量成正比，因此X精子發(fā)出的熒光比Y精子強(qiáng)，由于光的強(qiáng)弱它們帶有不同的電荷，X精子和Y精子通過高壓的電場(chǎng)后便可發(fā)生偏轉(zhuǎn)，分別流入不同的收集器內(nèi)而得到分離的精液，分離的準(zhǔn)確率90%以上。胚胎移植胚胎移植是將一頭良種奶牛配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭同種的生理狀態(tài)相同的奶牛體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體的技術(shù)。由于牛經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，屬單胎動(dòng)物，產(chǎn)仔數(shù)量少，繁殖周期長(zhǎng)，用胚胎移植技術(shù)進(jìn)行純種擴(kuò)群繁殖和黃牛改良效果好，速度快。普通精液的有效精子約為1000萬個(gè)，經(jīng)分離處理后，性控精液的有效精子約為200萬一300萬個(gè)，這樣就導(dǎo)致超數(shù)排卵所得到的未受精率較高。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述領(lǐng)域中的不足，本發(fā)明提供一種提高牛性控精液超排受精率的方法，對(duì)荷斯坦奶牛應(yīng)用超數(shù)排卵技術(shù)生產(chǎn)奶牛性別控制胚胎，提高了性控精液的受精率。提高牛性控精液超排受精率的方法，其特征在于對(duì)牛性控精液進(jìn)行活化離心處理，所述活化離心處理是將性控精液放在含有咖啡因的mTyrode's液里離心處理。所述咖啡因的終濃度為0.3mM。所述離心處理時(shí)，離心轉(zhuǎn)速1500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間8分鐘。所述精液輸入時(shí)間為牛發(fā)情后10-15小時(shí)開始第一次輸精，每隔8-12小時(shí)作第二次輸精。較常規(guī)的超排配種時(shí)間延后2-3h。所述第二次輸精時(shí)，同時(shí)注射促排三號(hào)(PGF2a)400ug/頭。所述精液輸入部位為子宮角。常規(guī)的超排配種部位在子宮頸口。上述方法生產(chǎn)得到的胚胎可用率較常規(guī)處理高，可用率達(dá)到80—85%，每頭次超數(shù)排卵所得到的可用胚胎數(shù)為4一6枚，較常規(guī)方法降低了成本，提高了效率。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例11試劑1.1新潔爾滅1.2鹽酸利多卡因1.3PBS1.45%靜松靈1.50.9%生理鹽水1.6酒精棉球1.7青霉素(160萬單位)1.8鏈霉素(IOO萬單位)1.9PG0.2mg/2ml/支1.10FSH10mg/瓶1.11促排三號(hào)200IU/支1.12胚胎水(WaterforembryotransferSIGMAW1503)1.13咖啡因(CaffeineSIGMAC-0750)1.14氯化鈉(Sodiumchloride北京化工廠)1.15氯化鉀(Potassiumchloridie北京化工廠)U6氯化鈣(Calciumchloride北京化工廠)1.17氯化鎂(Magnesiumchloride北京化工廠)2實(shí)驗(yàn)器材2.1超排所需器材2.1.1沖卵管(16#)2丄2直剪18cm2.1.3彎止血鉗18cm2丄4剪毛剪(18cm)2.1.5通芯2.1.6燒杯500ml2丄7濾器2丄8輸液架2丄910ml注射器2丄10三通管2.1.11乳膠管2丄12夾子2丄13lml注射器2.1.14洗瓶500ml2丄15架盤天平JPF-52丄16尖頭離心管10ml2.1.17載玻片7.6X2.1X0.5cm3儀器3.1液氮罐3.2胚胎移植車3.3B超儀3.4生物顯微鏡XSZ-G3.5離心機(jī)JAISHILIXINJI80-2B4操作步驟54.1供體母牛的選擇4丄1年齡在18月齡以上，肉牛達(dá)到成熟體重的65%-70%，奶牛要在產(chǎn)后2個(gè)月以上。母牛營(yíng)養(yǎng)全面平衡，膘情達(dá)到中上等為宜。4丄2發(fā)情周期正常。至少2-3個(gè)情期正常，每個(gè)發(fā)情周期18-24天之間。4丄3無生殖器官疾病，無傳染性疾病，超排前2-3個(gè)月以內(nèi)最好不注射各類疫苗；供體牛無對(duì)激素及其他藥品的過敏史。4丄4卵巢要求有彈性、質(zhì)地好、無卵泡囊腫和黃體囊腫；卵巢系膜及卵巢與腹腔無粘連現(xiàn)象;子宮角質(zhì)地柔軟、無炎癥、硬腫現(xiàn)象；直腸要求無炎癥、過肥、緊縮現(xiàn)象。4丄5卵巢要求在上次超數(shù)排卵后，雖有退化黃體，但要求質(zhì)地柔軟、有彈性；卵巢發(fā)育靜止時(shí)不能做超排；高產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶高峰時(shí)產(chǎn)奶量不低于25公斤不做超排。連續(xù)兩次以上沖胚效果不好的牛，要査找原因，暫不用于超排，可進(jìn)行配種，使其妊娠。4.2精子處理(采用市售的性控精液)解凍精液后檢査活力低限為0.3?；盍细窈髮⑹Ｓ嗑和迫氲胶?mlmTyrode's液+0.3mM咖啡因的離心管中，離心1500轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘。離心后去上清液混勻裝管備用。4.3配種牛發(fā)情后10-15小時(shí)開始第一次輸精，每隔8-12小時(shí)作第二次。在第二次輸精時(shí)可注射促排三號(hào)(PGF2a)400ug/頭。4.4注意事項(xiàng)4.4.1激素劑量準(zhǔn)確無誤。4.4.2輸精時(shí)要穩(wěn)、準(zhǔn)、避免對(duì)卵巢強(qiáng)烈剌激。4.4.3輸精部位在子宮角。4.4.4凍精解凍后精子活力要求0.35以上。4.5沖胚方法4.5.1沖胚時(shí)間以發(fā)情當(dāng)天為0天，于第7d-7.5d開始沖胚。4.5.2沖胚前準(zhǔn)備4.5.2.1每頭牛沖兩側(cè)子宮角，共需1000mlPBS。4.5.2.2凡所用器械均需事先高壓滅菌消毒(金屬高壓、塑料制品氣體滅菌)4.5.2.3將器械車放于牛的左側(cè)，上面擺好(剪毛剪、持針鉗、鑷子)各一把，沖洗瓶一個(gè)，500ml燒杯一個(gè)(蓋上濾器)、或集卵杯、通芯、導(dǎo)管、酒精棉球，輸液架立于六柱欄旁掛上PBS，吊瓶連接硅膠管并與濾器相連接。4.5.2.4將供體牛牽入保定架，保定確實(shí)。4.5.3方法4.5.3.1清除糞便后將牛的肛門及附近沖洗消毒，操作者指甲剪短，手臂用清水洗凈并消毒，佩帶一次性塑料長(zhǎng)臂手套，涂少量潤(rùn)滑油。4.5.3.2不要用力過猛，要緩慢，依腸腔向前伸入。努責(zé)和直腸擴(kuò)張時(shí)，手在直腸內(nèi)暫時(shí)不動(dòng)。不能過度刺激腸粘膜。4.5.3.3沖胚前10分鐘進(jìn)行薦尾椎間隙或第一、二尾間間隙硬膜外麻醉，注射6ml2M鹽酸利多卡因。4.5.3.3.1首先用手抬舉尾根，用手觸摸間隙部位，在薦尾椎用剪毛剪剪毛，碘酒消毒，再用酒精脫碘。4.5.3.3.2然后將利多卡因吸入10ml注射器，用9號(hào)針頭呈45度左右方向刺入皮內(nèi)，再刺入硬膜。4.5.3.3.3最后在針頭上滴一滴利多卡因看是否下滲，若下滲即可注入。4.5.3.4用0.01%新潔爾滅消毒外陰部，用滅菌生理鹽水沖洗后，吸水紙拭干。4.5.3.5沖卵管用酒精消毒后沖卵液沖洗，檢査氣囊是否完好。4.5.3.6將通芯插入沖卵管，一手通過直腸把握子宮頸，另一手將沖卵管通過子宮頸進(jìn)入一側(cè)子宮角大彎部。4.5.3.7根據(jù)子宮頸粗細(xì)沖入一定量氣體，抽出通芯。4.5.3.8開始注入30ml左右PBS，再將子宮角提高并輕輕按摩，使PBS回流到濾器中，反復(fù)五次左右，然后每次注入量加到50ML左右，每側(cè)沖洗總量為500mlPBS，一側(cè)子宮角沖卵后，立既將回收液送實(shí)驗(yàn)室檢胚。4.5.3.9沖完一側(cè)子宮角，抽出沖卵管，用生理鹽水沖洗干凈。4.5.3.10按上述方法沖另一側(cè)子宮角。4.5.3.11沖完后肌注PG0.4mg/頭，青霉素(160萬單位/支)鏈霉素(100萬單位/支)每頭牛各兩支注入子宮。4.5.3.12沖胚結(jié)束后應(yīng)將沖卵管立即泡入清水中進(jìn)行清洗。4.6注意事項(xiàng)4.6.1插導(dǎo)管時(shí)要輕，防止損傷子宮頸或子宮角內(nèi)膜。4.6.2注PBS時(shí)不能多、快、猛。4.6.3遇沖卵管插不進(jìn)去時(shí)，不要強(qiáng)行，檢查通芯是否穿出管外。4.6.4宮頸粘液較多時(shí)，可用粘液吸取管先將黏液清除后再進(jìn)行沖胚。放栓為O天，第4天開始注射FSH，第7天撤栓。第4天早6:0070mg晚18:0070mg第5天早6:0060mg晚18:0060mg第6天早6:0040mg晚18:0040mg第7天早6:0030mg+PG0.4mg晚18:0030mg+PG0.4mg+撤栓第8天不處理(發(fā)情)第9天晚18:00AI第10天早8:00AI第17天沖胚+PG0.4mg+青霉素(160萬單位/支)第24天PG0.4mg實(shí)施例2:本發(fā)明方法與常規(guī)方法對(duì)照，對(duì)照組的性控精液未經(jīng)過活化離心處理，其它操作相同，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。從中可以看出，改進(jìn)后方法得到的胚胎可用率明顯提高，未受精率顯著下降，且在統(tǒng)計(jì)上差異顯著(P<0.05)。說明經(jīng)過改進(jìn)后，利用性控精液超排受精的效率顯著提高，可以達(dá)到84.2%。改進(jìn)后生產(chǎn)的胚胎與常規(guī)方法得到的胚胎移植后妊娠率與出生活后代率均沒有差異(P>0.05)。權(quán)利要求1、提高牛性控精液超排受精率的方法，其特征在于精液輸入前對(duì)牛性控精液進(jìn)行活化離心處理，所述活化離心處理是將性控精液放在含有咖啡因的mTyrode’s液里離心處理。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述咖啡因的終濃度為0.3mM。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述離心處理時(shí)，離心轉(zhuǎn)速1500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間8分鐘。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述精液輸入時(shí)間為牛發(fā)情后10-15小時(shí)開始第一次輸精，每隔8-12小時(shí)作第二次輸精。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述第二次輸精時(shí)，同時(shí)注射PGF2a400ug/頭。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述精液輸入部位為子宮角。全文摘要本發(fā)明涉及“提高牛性控精液超排受精率的方法”，屬胚胎工程領(lǐng)域。采用將性控精液放在含有咖啡因的mTyrode’s液里進(jìn)行超活化離心處理的方法，提高精子的活性，從而提高受精率，并確定精液在超排時(shí)的輸精時(shí)間，進(jìn)一步提高精子的受精率。文檔編號(hào)A61K35/52GK101259042SQ20081010428公開日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日發(fā)明者晶安,張家新,張紅霞,剛王,月王,海王,敏郭,郭麗麗申請(qǐng)人:北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司