專利名稱：：結(jié)合至c5和c5a但不阻止c5b形成的補體途徑抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種炎癥抑制劑，其結(jié)合至補體C5和C5a，但不會抑制C5b和CSb-9膜攻擊復(fù)合物(MAC)的形成。
背景技術(shù)：
：補體系統(tǒng)在免疫復(fù)合物之清除中及在對于傳染因子、外來抗原、病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中起著主要作用。然而，補體系統(tǒng)的不恰當(dāng)或過量的活化由于嚴(yán)重的炎癥和引起的組織破壞，而可導(dǎo)致有害的且甚至可能危急生命的后果。這些后果臨床表現(xiàn)為各種病癥，包括敗血癥休克、心肌以及腸缺血/再灌注損傷(r印erfusioninjury)、移植排斥、器官衰竭、腎炎、病理炎癥和自身免疫性疾病。舉例而言，敗血癥是引起死亡率的一個主要原因，僅在美國每年可導(dǎo)致超過200,000人死亡。雖然過去幾年在嚴(yán)重感染中的治療中取得了重大進步，但是由敗血癥引起的發(fā)病率及死亡率仍在增長。因此，抑制補體級聯(lián)過量或不受控制的活化可為具有此等疾病和疾患的病人提供臨床受益。補體系統(tǒng)由一組蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)通常以不活動狀態(tài)存在于血清中。此補體系統(tǒng)的活化主要包含兩條截然不同的途徑，分別指定為經(jīng)典途徑及替代途徑(V.M.Holers，在67&j'ca〗i"鵬〃/7o^^7;尸"./7ci/2a朋c/7^rac"ce中，由R.R.Rich編輯，MosbyPress出版；1996，363-391)。此經(jīng)典途徑是依賴碳/鎂的級聯(lián)，其通常是通過形成抗原-抗體復(fù)合物而被激活。其也可以通過使復(fù)合有配位基的c-反應(yīng)蛋白質(zhì)相結(jié)合，并通過包括革蘭氏陰性細(xì)菌的諸多病原體，而以不依賴抗體的方式被激活。此替代途徑是依賴鎂的級聯(lián)，其通過c3在特定易感表面(例如酵母及細(xì)菌的細(xì)胞壁多糖類、以及特定的生物聚合材料)上的沉積和活化而被激活。最新研究顯示，補體也可以通過植物凝血素途徑而被激活，其涉及甘露糖結(jié)合植物凝血素的初始結(jié)合以及隨后的c2和c4的活化，這與經(jīng)典途徑是共同的(Matsushita,M.等人著，J.ifec/.176:1497-1502(1992);Suankratay，C.等人著，/.i"順朋o丄160:3006-3013(1998))。積累的跡象表明這種替代途徑參與了經(jīng)典途徑和植物凝血素途徑兩者的活性的擴大(Suankratay，C，j'&'力Parries，T.C.等人著，/鵬〃/o丄27:1155-1161(1990))。補體途徑的活化生成了補體蛋白質(zhì)的生物活性片段，例如C3a、C4a及C5a過敏毒素以及C5b-9膜攻擊復(fù)合物(mac)，其通過白血球趨化作用的涉及、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、血小板細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增大了的血管通透性、細(xì)胞溶解作用以及組織損傷來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。補體C5是補體系統(tǒng)最有效的促炎調(diào)節(jié)因子之一。C5a是C5的活化形態(tài)。補體C5(190kD，分子量)以大約80iig/ml存在于人體血清中(Kohler，P.F.等人著，,/層/。丄99:1211-1216(1967))。它是由兩條多肽鏈a和p組成，這兩條多肽鏈分別具有大約115kD和75kD的分子量(Tack，B.F.等人著，Biochemistry18:1490-1497(1979))。經(jīng)生物合成作為單鏈前分子(single-chainpro-molecule),C5在處理和分泌過程中經(jīng)過酶化作用被分裂成雙鏈結(jié)構(gòu)。在分裂之后，這兩種鏈通過至少一個二硫鍵以及非共價相互作用而結(jié)合在一起(Ooi，Y.M.等人著，7/卿〃/o義124:2494-2498(1980))。從cDNA定序數(shù)據(jù)可獲得人及鼠C5的一級氨基酸結(jié)構(gòu)(Wetsel，R.A.等人著，Biochemistry27:1474-1482(1988);Haviland，D.L.等人著，J.Immunol.146:362-368(1991);Wetsel，R.A.等人著，Biochemistry26:737-743(1987))。所推斷出的前體人的前C5(pre-pro-C5)的氨基酸序列具有1676種氨基酸。成熟C5的a和|3鏈分別具有999和655種氨基酸。C5在C5的a鏈(尤其在殘基64處的天門冬酰胺)中被糖基化。C5在補體途徑的活化過程中被分裂成C5a和C5b片段。負(fù)責(zé)C5活化的轉(zhuǎn)化酶是具有用于經(jīng)典途徑的C4b、C2a以及C3b和用于替代途徑的(C3b)2、Bb以及P的多子單元復(fù)合物(multi-subunitcomplex)(Goldlust,M.B.等人著，J.工咖imol.113:998-1007(1974);Schreiber，R.D.等人著，Proc.Waff.Acad.Scl.75:3948-3952(1978))。C5通過在a鏈中的位置74-75(Arg-Leu)處分裂而被激活。在活化之后，11.2kD的74氨基酸肽C5a被從a鏈的氨基末端部分釋放。此C5a肽的過敏毒素特性與由C3a所展示的過敏毒素特性相類似，但是在摩爾基礎(chǔ)上其在引發(fā)炎癥反應(yīng)中比C3a更有效100倍。C5a和C3a兩者都是嗜中性細(xì)胞及單核細(xì)胞的激活劑(stimulator)(Schindler，R.等人著，Blood76:1631-1638(1990);Haeffner-Cavaillon，N.等人著，丄Immunol.138:794-700(1987);Cavaillon，J.M.等人著，Eur.J.Immunol.20:253-257(1990))。此外，最新在小鼠模型中顯示，C3a受體對于防止由內(nèi)毒素誘發(fā)的休克十分重要(Kildsgaard，J.等人著，J.Immunol.165:5406-5409(2000))。除了其過敏毒性特性之外，C5a會誘發(fā)以下細(xì)胞的趨化遷移(chemotacticmigration):嗜中性細(xì)胞(Ward,P.A.等人著，J.Immunol.102:93-99(1969))、嗜曙紅細(xì)胞(eosinophil)(Kay，A.B.等人著，Immunol.24:969-976(1973))、嗜堿細(xì)胞(Lett-Brown,M.A.等人著，J.Immunol.117:246-2521976))、及單核細(xì)胞(Snyderman，R.等人著，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.138:387-3901971))。C5a的活性經(jīng)血漿羧肽酶(plasmaenzymecarboxyp印tidase)N(E.C.3.4.12.7)調(diào)理，血漿羧肽酶N從C5a移除羥基末端精氨酸形成C5adesArg衍生物(Goetzl，E.J.等人著，J.Clin.Invest.53:591-599(1974))。在摩爾基礎(chǔ)上，人C5adesArg展示了僅如未改質(zhì)的C5a的1%的過敏性活性(Gerard,C.等人著，Proc.Natl.Acad.Sci.78:1833-1837(1981))及多形核趨化活性(Chenoweth，D.E.等人著，Mo/.Immunol.17:151-161(1980))。C5a和C5b-9兩者均激活內(nèi)皮細(xì)胞，以表達(dá)用于分隔己激活的白血球所必需的粘附分子，其會介導(dǎo)組織炎癥及損傷(Foreman,K.E.等人著，J.Clin.Invest.94:1147-1155(1994);Foreman,K.E.等人著，Intammation20:l-9(1996);Rollins,S.A.等人著，Transplantation69:1959-1967(2000))。通過引起平滑肌收縮、增加血管通透性、誘發(fā)嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞的脫粒并誘發(fā)溶酶體蛋白酶和氧化游離基的釋放，C5a也會介導(dǎo)炎癥反應(yīng)(Gerard,C.等人著，Ann.Rev.Immunol.12:775-808(1994))。此外，C5a可調(diào)整肝的急性相基因表達(dá)(acute-phasegeneexpression)并通過增加TNFa、IL-1P、IL-6以及IL_8的生產(chǎn)來擴大整體的免疫反應(yīng)(Lambris，J.D.等人著，在TheHumanComplementSysteminHealthandDisease中^Volanakis，J.E.編,MarcelDekker，紐約，第83-118頁)。人C5a受體(C5aR)已經(jīng)被克隆(Gerard,N.P.等人著，Nature349:614-617(1991);Boulay，F(xiàn).等人著，Biochemistry30:2993-2999(1991))。它屬于七跨膜區(qū)(seven-transmembrane-domain)G蛋白偶聯(lián)受體超家族。C5aR被表達(dá)在嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞、以及腎小球組織上(Van-Epps，D.E.等人著，J.Immunol.132:2862-2867(1984);Havlland，D.L.等人著，J.Immunol.154:1861-1869(1995);Wetsel，R.A.，Immunol.Lett.44:183-187(1995);Buchner，R.R.等人著，J.Immunol.155:308-315(1995);Chenoweth，D.E.等人著，Proc.Natl.AcadScl.75:3943-3947(1978);Zwirner，J.等人著，Mo/.Immunol.36:877-884(1999))。C5aR結(jié)合了配位基的部位是復(fù)雜的且由至少兩個在物理上可分離的結(jié)合區(qū)組成。一個結(jié)合了C5a氨基末端(氨基酸1-20)和由二硫鍵連接的核心(氨基酸21-61)，而另一個結(jié)合了C5a羥基末端(氨基酸62—74)(Wetsel，R.A.，Curr.Opin.Immunol.7:48—53(1995))。C5a在炎癥及組織損傷中起重要作用。在心肺分流術(shù)(cardiopulmonarybypass)禾口血液透析中，當(dāng)人體血液與人工心月巿機或人工腎臟透析機的表面接觸時，由于替代補體途徑的活化而產(chǎn)生C5a(Howard,R.J.等人著，Arch.Surg.123:1496-1501(1988);Kirklin，J.K.等人著，J.Cardlovasc.Surg.86:845-857(1983);Craddock，P.R.等人著，N.Engl.J.Med.296:769-774(1977))。C5a導(dǎo)致增加的毛細(xì)管通透性和浮腫、支氣管收縮、肺血管收縮、白血球和血小板活化以及組織(尤其肺部)的浸潤(infiltration)(Czermak，B.J.等人著，J.Leukoc.Biol.64:40-48(1998))。己顯示了抗C5a單克隆抗體的投藥，以減少由心肺分流術(shù)及心麻痹誘發(fā)的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞異常(coronaryendothelialdysfunction)(Tofukuji，M.等人著，J.Thorac.Cardlovasc.Surg.116:1060—1068(1998))。C5a又涉及急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及多器官衰竭(M0F)(Hack,C.E.等人著，Am.J.Med.1989:86:20—26;HammerschmidtDE等人著，Lancet1980;1:947-949;HeidemanM.等人著，J.Trauma1984;4:1038-1043)。C5a擴大了兩種重要的前炎癥細(xì)胞因子(pro-inflammatorycytokine)TNFa禾口IL-1的單核細(xì)胞生產(chǎn)。而且在敗血癥休克的動物模型中已經(jīng)顯示了C5a在發(fā)展組織損傷，且尤其肺損傷中起重要作用。(SmedegardG等人著J瓜//^Mo丄1989;135:489-497)。在使用大鼠、豬以及非人類靈長類的敗血癥模型中，在利用內(nèi)毒素或大腸桿菌(E.coli)治療之前向這些動物所施的抗C5a抗體會導(dǎo)致減少的組織損傷，以及減少的IL-6之生產(chǎn)(Smedegard，G.等人著，Am.J.Pathol.135:489-497(1989);Hopken，U.等人著，Eur.J.Immunol.26:1103-1109(1996);Stevens,J.H.等人著，J.Clin.Invest.77:1812-1816(1986))。更重要的是，利用抗C5a抗體來阻斷C5a已經(jīng)顯示出顯著提高了大鼠中具有敗血癥的盲腸綁扎/穿刺模型的存活率(Czermak，B.J.等人著，WatMed.5:788-792(1999))。此模型與人的敗血癥臨床表現(xiàn)的許多方面具有共同之處。(Parker,S.J.等人著，fir.J.Surg.88:22-30(2001))。在相同的敗血癥模型中，顯示了抗C5a抗體可抑制胸腺細(xì)胞的凋亡(Guo，R.F.等人著，J.Clin.Invest.106:1271-12802000)，并防止MOF(Huber-Lang，M.等人著，J.Immunol.166:1193-1199(2001))?？笴5a抗體也在大鼠中具有肺損傷的眼鏡蛇毒因子模型中以及在免疫復(fù)合物誘發(fā)的肺損傷中有保護作用(Mulligan,M.S.等人著，J.Clin.Invest.98:503-512(1996))。C5a在免疫復(fù)合物介導(dǎo)的肺損傷中的重要性后來在小鼠身上得到肯定(Bozic，C.R.等人著，Science26:1103-1109(1996))。我們發(fā)現(xiàn)，C5a在心肌缺血-再灌注損傷中為主要調(diào)節(jié)因子。補體消耗(complementd印letion)減小了小鼠中的心肌梗塞面積(Weisman，H.F.等人著，Science249:146-151(1990))，且利用抗C5a抗體治療減小了具有下肢缺血-再灌注的大鼠模型中的損傷(Bless,N.M.等人著，Am.J.Physiol.276:L57-L63(1999))。也顯著減小了接受單克隆抗C5aIgG再治療的豬在心肌梗塞中的再灌注損傷(Amsterdam,E.A.等人著，Am.J.Physiol.26B:H448-H457(1995))。一種重組體人C5aR對抗劑減小了外科再血管化的豬科模型中的梗塞面積(Riley，R.D.等人著，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.120:350-358(2000))。在具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病人身上增加補體的含量。C5a含量關(guān)系到疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度(Jose，P.J.等人著，j/m.朋證"j's.49:747-752(1989);Porcel，J.M.等人著，67j'/lT"順畫丄i"順""o/a^o丄74:283-288(1995))。因此，抑制C5a禾口/或C5a受體(C5aR)可有利于治療這些慢性疾病。C5aR表達(dá)被上調(diào)到發(fā)炎的人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的反應(yīng)性星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞上(Gasque，P.等人著，Am.丄Pethol.150:31-41(1997))。C5a可能與神經(jīng)退化病(如Alzheimer病)有關(guān)(Mukherjee,P.等人著，J.Neuroi薩unol.105:124—130(2000))。神經(jīng)元(neuronal)C5aR的活化可誘發(fā)細(xì)胞凋亡(FarkasI等人著，J.Physiol.1998;507:679-687)。因此，抑制C5a和/或C5aR也可有利于治療神經(jīng)退化病。現(xiàn)已知牛皮癬(psoriasis)是T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病(Gottlieb,E.L.等人著，Nat.Med.1:442-447(1995))。然而，嗜中性細(xì)胞及肥大細(xì)胞也可能與疾病的發(fā)病機理有關(guān)(Terui，T.等人著，Exp.Dermatol.9:1-10;2000);Werfel，T.等人著，Arch.Dermatol.Res.289:83-86(1997))。在牛皮癬鱗片(psoriaticscale)中發(fā)現(xiàn)有高含量的C5adesArg，表明與補體活化有關(guān)。T細(xì)胞及嗜中性細(xì)胞被C5a化學(xué)吸引(Nataf,S.等人著，J.I醒nol.162:4018-4023(1999);Tsuji，R.F.等人著，J.Immunol.165:1588-1598(2000);Cavaillon，J.M.等人著，Eur.J.Immunol.20:253-257(1990))。因此C5a可為治療牛皮癬的重要醫(yī)療目標(biāo)。含免疫球蛋白G的免疫復(fù)合物(IC)有助于數(shù)種自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、古德帕斯丘綜合征(Goodpasture'ssyndrome)、以及過敏性肺炎)中的生理病理學(xué)(Madaio,M.P.著，Semin.N印hrol.19:48-56(1999);Korganow，A.S.等人著，Immunity10:451-459(1999);Bolten，W.K.著，KidneyInt.50:1754-1760(1996);Ando，M.等人著，Curr.Opin.Pulm.Med.3:391-399(1997))。經(jīng)典動物模型在這些IC疾病中的炎癥反應(yīng)是阿圖斯氏反應(yīng)(Arthusreaction),其特點是多形核細(xì)胞的浸潤、出血以及血漿滲出(Arthus，M.著，C.R.Soc.Biol.55:817-824(1903))。最新研究顯示C5aR不足的小鼠可免于由IC誘發(fā)的組織損傷(Kohl，丄等人著，/鵬朋o丄36:893-903(1999);Baumann，U.等人著，//順朋o丄164:1065-1070(2000))。結(jié)果符合以下的發(fā)現(xiàn)小分子肽抗C5aR對抗劑可抑制由IC沉積所引起的炎癥反應(yīng)(Strachan，A.J.等人著，/.164:6560-6565(2000))。C5a連同其受體在IC疾病的發(fā)病機理中起重要作用。C5a和C5aR的抑制劑可有用于治療這些疾病。W001/15731A1討論對C5a使用抗體來治療敗血癥的組合物及方法。這些抗體僅與C5a肽的N末端區(qū)域反應(yīng)，而不與C5交叉反應(yīng)。W086/05692討論利用特別用于C5a的抗體或其desArg衍生物來治療成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)。它還揭示通過投藥此抗體來治療敗血癥。此抗體應(yīng)C5adesArg衍生物而產(chǎn)生，因為它更容易產(chǎn)生免疫性，但是將引出可與C5a交叉反應(yīng)的抗體。美國專利第5，853，722號討論了可阻斷C5活化并因此阻斷C5a和C5b形成的抗C5抗體。美國專利第6，074，642號討論了將抗C5抗體用于治療腎小球腎炎。這些抗體也阻斷C5a和C5b的生成，抑制C5a和C5b_9之形成的效應(yīng)。美國專利第5，562，904號討論了可完全阻斷MAC形成的抗C5抗體。在抗C5抗體的其它討論中，所揭示的抗體可阻斷C5的活化并阻斷其分裂成C5a和C5b(Vakeva，A.P.等人著，Circulation97:2259-2267(1998);Thomas,T.C.等人著，Mol.Immunol.33:1389-1401(1996);Wang，Y.等人著，ProcNatlAcadSci.93:8563-8568(1996);Kroshus，T.等人著，Transplantation60:1194-1202(1995);Frei，Y.等人著，Mol.CellProbes1:141-149(1987))。已經(jīng)報導(dǎo)有可與C5、C5a或C5adesArg交叉反應(yīng)的單克隆抗體(Schulze，M.等人著，Complement3:25-39(1986);Takeda，J.等人著，J.Immunol.Meth.101:265-270(1987);Inoue，K.，ComplementInfla,.6:219-222(1989))。也已有報導(dǎo)可與C5和C5a交叉反應(yīng)的單克隆抗體抑制了C5a介導(dǎo)的ATP從豚鼠血小板的釋放(Klos，A.等人著，J.Immunol.Meth.111:241-252(1988);0ppermann，M.等人著，ComplementInfla咖.8:13-24(1991))。
發(fā)明內(nèi)容C5活化通常會導(dǎo)致C5分裂成C5a和C5b。本發(fā)明的抑制劑分子以高親和力(affinity)與C5和C5a結(jié)合，不會抑制C5的活化作用，且不會防止C5b的形成或抑制C5b的活性。這種抑制劑的一個實例是被稱為MAb137-26的單克隆抗體，其結(jié)合至人C5和C5a上的共同表位。會產(chǎn)生單克隆抗體137-26的雜交瘤已在2001年8月17號，以AccessionNo.PTA-3650韋皮儲存在美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection),10801UniversityBivd.，馬納薩斯，VA20110-2209。本發(fā)明的抑制劑分子還包括(i)以高親和力結(jié)合至C5和C5a，但是不會抑制C5的活化且不會防止C5b的形成或抑制C5b活性的其它抗體或其片段、肽、低核苷酸、或擬肽，或者(ii)可結(jié)合至與單克隆抗體137-26相同的表位的任何抗體?？贵w片段包括Fab、F(ab')2、Fv、或單鏈Fv,，且本發(fā)明的單克隆抗體及片段包括嵌合的Deimraimized^被人化的或人的抗體及片段，以及其它可被接受來用于人的其它形式?？蓪⑦@些抑制劑分子包括作醫(yī)藥組合物的一部分。本發(fā)明的抑制劑分子有利于治療涉及過量的或不受控制的C5a生產(chǎn)的疾病和疾患，或具有偵測C5a的存在或其定量的診斷用途。圖1顯示了在ELISA中，MAb137-26(抗C5a，實心方塊)及Mab137-76(抗C5(3鏈，空心圓)與純化的人C5a的結(jié)合。一種同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體被用作陰性控制(negativecontrol)。Y軸代表被表達(dá)成在450nm的光密度(OD)的MAb與C5a的反應(yīng)性，且X軸代表MAb的濃度。MAb137-26與人C5a反應(yīng)，而MAb137-76及不相關(guān)的控制抗體未與人C5a反應(yīng)。圖2顯示了在ELISA中，Mab137-26(實心方塊)及MAb137-76(空心圓)與純化的人C5的結(jié)合。一種同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體被用作陰性控制。Y軸代表被表達(dá)成在450nm的光密度(OD)的MAb與C5的反應(yīng)性，且X軸代表單克隆抗體的濃度。MAb137-26和MAb137-76兩者均與人C5反應(yīng)，而不相關(guān)的抗體未與人C5反應(yīng)。圖3顯示了抗C5aMAb137-26不能抑制補體介導(dǎo)的敏化的雞紅細(xì)胞通過經(jīng)典途徑(CP)的溶血?？笴2MAb175-62有效地抑制了溶血作用。一種同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體不起作用。Y軸代表溶血抑制的百分比，此在文章中將進行進一步描述。X軸代表單克隆抗體的濃度。圖4顯示了抗C5aMAb137-26不能通過替代途徑(AP)來抑制補體介導(dǎo)的敏化的兔紅細(xì)胞的溶血作用。對抗因子DMAb166-32有效地抑制了溶血作用。一種同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體不起作用。Y軸代表溶血抑制的百分比，此在文章中將進行進一步描述。X軸代表單克隆抗體的濃度。圖5顯示了抑制放射性碘標(biāo)記的(1251)人C5a與純化的人體嗜中性細(xì)胞的結(jié)合。陽性控制(純化的重組體人體C5a(rHuC5a))抑制了此結(jié)合。一種同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體未顯示任何作用。Y軸代表^I-C5a結(jié)合的抑制百分比，此在文章中將進行進一步描述。X軸代表競爭齊!J(competingagent)的濃度。圖6顯示了通過將合成肽重迭在纖維素膜上而繪出的在人體C5a上的抗原MAb137-26的結(jié)合表位。圖7A顯示了在重組水蛭素防止凝血的全血模型中，在經(jīng)調(diào)理過的大腸桿菌刺激的人體嗜中性細(xì)胞上的CDllb表達(dá)?？笴5/C5aMabl37-26(實心圓)比抗C5aMAb561(Dr.JurgKohl,實心方塊)和抗C5MAM37-30(實心三角)更有效地抑制了CDllb表達(dá)。后者抗體抑制了C5活化。不相關(guān)的MAb(實心倒三角)未起到任何作用。Y軸代表由免疫熒光血細(xì)胞計數(shù)法(Immunofluorocytometry)測量到的平均熒光強度(MFI)。X軸代表抗體濃度(pg/ml)。T-O二在時間O分鐘的基線全血樣本。T-10H又利用PBS培養(yǎng)10分鐘而不具有大腸桿菌的全血。其它樣本，無論是否具有抑制劑，都添加了大腸桿菌。圖7B顯示了在重組水蛭素防止凝血的全血模型中，在經(jīng)調(diào)理過的大腸桿菌刺激的人體嗜中性細(xì)胞上的CDllb表達(dá)。抗C5/C5aMAbl37-26(實心圓)比肽C5aR對抗劑(Dr.StephenTaylor)(實心方塊)更有效地抑制了CDllb表達(dá)。不相關(guān)的肽未起到任何作用(實心倒三角)。Y軸代表由免疫熒光血細(xì)胞計數(shù)法(Immunofluorocytometry)測量到的平均熒光強度(MFI)。X軸代表抗體/肽的濃度(pg/ml)。T-0二在時間0分鐘的基線全血樣本。T-10=僅利用PBS培養(yǎng)10分鐘而不具有大腸桿菌的全血。其它樣本，無論是否具有抑制劑，都添加了大腸桿菌。圖7C顯示了在重組水蛭素防止凝血的全血模型中，經(jīng)調(diào)理過的大腸桿菌刺激的人體嗜中性細(xì)胞的氧化爆發(fā)(oxidativeburst)。抗C5/C5aMAbl37-26(實心圓)和抗C5MAM37-30(實心三角)兩者都比抗C5aMab561(實心方塊)更有效地抑制了氧化爆發(fā)。不相關(guān)的抗體(實心倒三角)未起到任何作用。Y軸代表由免疫熒光血細(xì)胞計數(shù)法(Immunofluorocytometry)測量到的平均熒光強度(MFI)。X軸代表抗體的濃度(pg/ml)。T-0二在時間0分鐘的基線全血樣本。T-10H又利用PBS培養(yǎng)10分鐘而不具有大腸桿菌的全血。其它樣本，無論是否具有抑制劑，都添加了大腸桿菌。圖7D顯示了在重組水蛭素防止凝血的全血模型中，經(jīng)調(diào)理過的大腸桿菌刺激的人體嗜中性細(xì)胞的氧化爆發(fā)(oxidativeburst)。抗C5/C5aMAM37-26(實心圓)比肽C5aR對抗劑(實心方塊)更有效地抑制了氧化爆發(fā)。不相關(guān)的肽未起到任何作用。Y軸代表由免疫熒光血細(xì)胞計數(shù)法(Immunofluorocytometry)測量到的平均熒光強度(MFI)。X軸代表以nM表示的抗體濃度。T-0二在時間0分鐘的基線全血樣本。丁-10=僅利用PBS培養(yǎng)10分鐘而不具有大腸桿菌的全血。其它樣本，無論是否具有抑制劑，都添加了大腸桿菌。圖8顯示了在重組水蛭素防止凝血的全血模型中，MAC介導(dǎo)的奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseriameningitides)的殺死。通過人全血在存在抗C5/C5aMAbl37-26(實心圓)、不相關(guān)的MAb(實心三角)、或PBS(空心圓)的情況下的培養(yǎng)來有效地殺死細(xì)菌。相反，當(dāng)以會抑制C5活化且因此抑制MAC形成的抗C5MAbl37-30(空心菱形)來處理全血時，細(xì)菌不會被殺死。Y軸代表在血瓊脂上，經(jīng)37°C下24小時培養(yǎng)的每IO(VI的全血的集落形成單位(colonyformingunit,CFU)。X軸代表從全血培養(yǎng)實驗中血樣采集的不同時點。具體實施例方式1.本發(fā)明的優(yōu)勢本發(fā)明的抑制劑(包括單克隆抗體MAbl37-26)優(yōu)于已知的用于治療補體介導(dǎo)的炎癥及組織損壞的單克隆抗體抑制劑。MAb137-26能在其被激活之前與C5結(jié)合。在C5被激活以形成C5a之后，抗體可中和C5a，C5a是過敏毒素。通常，一旦C5a已經(jīng)形成，其就會迅速與細(xì)胞上的C5aR結(jié)合，由此觸發(fā)會導(dǎo)致炎癥的信號傳導(dǎo)級聯(lián)(signaltransductioncascade)。MAb137-26并不抑制C5分裂以形成C5a和C5b，但是C5a在其產(chǎn)生之后保持與MAb137-26結(jié)合，并抑制C5a結(jié)合至C5aR。然而，C5b-9的形成并未受到影響，且由于MAC的形成需要C5b-9(其與殺死細(xì)菌有關(guān))的緣故，因而保持C5b-9的產(chǎn)生對于保護性免疫反應(yīng)來說是重要的。MAb137-26可有效地中和C5a的發(fā)炎效應(yīng)，但是仍允許補體級聯(lián)的其它組份(包括C3和C5b-9)來介導(dǎo)抗菌作用。此藥理特性對于治療細(xì)菌性敗血癥、慢性IC疾病以及牛皮癬而言格外重要。2.制造并使用本發(fā)明A.單克隆抗體可利用由Kohler等人在Nature,256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制造單克隆抗體，或者可通過重組DNA方法(美國專利第4，816，567號)來制造單克隆抗體。在雜交瘤方法中，使小鼠或其它合適的動物宿主受到如上文所述的免疫，以引出可產(chǎn)生或能產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特定結(jié)合至為免疫所用的蛋白質(zhì)。還可利用DNA構(gòu)造(DNAconstruct)來使動物免疫，以表達(dá)活體內(nèi)用于誘發(fā)特異抗體(specificantibody)的編碼蛋白質(zhì)(encodingprotein)。或者，可在活體外使淋巴細(xì)胞免疫。然后，利用合適的熔合劑(如聚乙二醇)，讓淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞熔合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding著，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103頁(AcademicPress,1986))。如此制得的雜交瘤細(xì)胞被播種且在合適的培養(yǎng)介質(zhì)中生長，所述培養(yǎng)介質(zhì)較佳包含一種或多種可抑制未熔合的親本骨髓瘤細(xì)胞的生長或成活的物質(zhì)。例如，如果母本骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)禾多酶(hypox肌thineguaninephosphoribosyltransferase,HGPRT或HPRT)，那幺用于這些雜交瘤的培養(yǎng)介質(zhì)通常將包括次黃嘌呤、氨蝶呤、及胸腺嘧啶核苷(HAT介質(zhì))，這些物質(zhì)防止了缺乏HGPRT的細(xì)胞的生長。較佳的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效熔合的、支持由所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的穩(wěn)定且高產(chǎn)量的抗體生產(chǎn)、且對例如HAT介質(zhì)的介質(zhì)敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在這些骨髓瘤細(xì)胞系(MyelomaCellLine)中的是鼠科骨髓瘤系，如從可自美國加利福尼亞州圣地亞哥市SalkInstituteCellDistributionCenter獲得的M0PO21及MPC-11鼠科腫瘤、以及可自美國馬里蘭州羅克維爾市AmericanTypeCultureCollection獲得的SP2/0或X63-Ag8-653細(xì)胞衍生出來的那些骨髓瘤系。我們也已經(jīng)描述了將人骨髓瘤和鼠-人的雜骨髓瘤細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體((Kozbor，J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等人著，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63頁(MarcelDekker，Inc.，NewYork,1987年))。也可以使用所述的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO(EuropeanCollectionofCellCultures:Salisbury,WiltshireUK)。分析在其中雜交瘤細(xì)胞得以生長的培養(yǎng)介質(zhì)來用于生產(chǎn)針對抗原的單克隆抗體?？赏ㄟ^免疫沉淀反應(yīng)或通過活體外結(jié)合分析(如反射性免疫分析(radioimmunoassay,RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme—linkedimmunoabsorbentassay,ELISA))來測定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。在鑒定出雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生了具有所要的特異性、親和力和/或活性的抗體之后，這些克隆可通過限制稀釋過程被亞克隆(subclone)并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長(Goding著，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103頁(AcademicPress,1986))。適用于此目的的培養(yǎng)介質(zhì)包括(例如)D-MEM或RPMI-1640介質(zhì)。此外，這些雜交瘤細(xì)胞也可在活體內(nèi)生長，如動物體內(nèi)的腹水腫瘤。通過慣用的免疫球蛋白純化過程，將由這些亞克隆體所分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)介質(zhì)、腹水流體、或血清中分離開來，所述的免疫球蛋白純化過程諸如(例如)蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(proteinA-S印harose)、羥磷灰石層析法(hydroxyl即atitechromatography)、凝膠電泳、透析法、或親禾口力層析法(affinitychromatography)。利用慣用的過程容易將編碼單克隆抗體的DNA進行單離及排序(InnisM.等人著，InPCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications.Academic,SanDiego，CA(1990)，Sanger,F.S，等人著，Proc.Nat.AcadSci.74:5463-5467(1977))。這些雜交瘤細(xì)胞用作這種DNA的源。一經(jīng)單離，這種DNA就可被置于表達(dá)載體(expressionvector)中，這些表達(dá)載體接著被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(如不會另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵槽(CH0)細(xì)胞(Chinesehamsterovarycell)、或者骨髓瘤細(xì)胞)中，以獲得單克隆抗體在重組宿主細(xì)胞中的合成。下面將更加詳細(xì)地描述抗體的重組生產(chǎn)。在另一實施例中，可將抗體或抗體片段從利用在McCafferty等人所著的Nature348:552-554(1990)中所描述的技術(shù)而生成的抗體噬菌體庫(antibodyphage1ibrary)單離出來。Clackson等人所著的Nature352:624-628(1991)和Marks等人所著的J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分別描述了利用噬菌體庫的鼠和人抗體的單離。后來的出版物描述了通過鏈改組(chainshuffling)(Marks,等人著，^z'o/7ec//7oA^y10:779-783(1992))的高親和力(nM范圍)人抗體的產(chǎn)生，以及組合感染(combinatorialInfection)和活體內(nèi)重組，作為用于構(gòu)造非常大的噬菌體庫的策略(Waterhouse，等人著，M/c.Jci血.TPes.21:2265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)是用來單離單克隆抗體的傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代選擇。舉例而言，也可通過用編碼序列(codingsequence)替代人的重鏈和輕鏈恒定域(constantdomain)而不是同源鼠類序列(homologousmurinesequence)(美國專利第4,816,567號；Morrison,等人著，Proc.Nat.Acad.Sci.USA81:6851(1984))，或者通過將全部或部分的非免疫球蛋白多肽的編碼序列共價結(jié)合到免疫球蛋白編碼序列，來讓DNA改質(zhì)。通常，用這些非免疫球蛋白多肽來替代抗體的恒定域，或用它們來替代抗體的一個抗原組合位點的可變域(variabledomain)以形成一種嵌合二價抗體(chimericbivalentantibody),其包含一個具有用于一種抗原的特異性的抗原結(jié)合位點和另一個具有用于不同的抗原的抗原結(jié)合位點。另一個替代選擇是，使用電熔合(electricalfusion)而非化學(xué)熔合來形成雜交瘤。此技術(shù)是非常確實的。除了熔合，我們還可以利用(例如)EpsteinBarrVirus、或變形基因來讓B細(xì)胞變形以使其永生(immortal)。(參見例如〃ContinuouslyProliferatingHumanCellLinesSynthesizingAntibodyofPredeterminedSpecificity,〃Zurawaki，V.R.等人著，在MonoclonalAntibodies書中，由KennettR.H.等人編，PlenumPress,N.Y.1980，第19-33頁。)B.人化及人抗體一種人化抗體具有由一非人源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人體氨基酸殘基通常被稱作"輸入"殘基，其通常是取自一"輸入"可變域?；旧峡砂凑誛inter及其共事者的方法(Jones等人著，Nature321:522-5ZS(1986);Riechmann等人著，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen，等人著，Science,239:1534-1536(1988))，通過用嚙齒動物的CDR或CDR序列來替代人抗體的對應(yīng)序列，來執(zhí)行人化過程。因此，在這些"人化"抗體中，大體上毫不受損(lessthanintact)的人類可變域(humanvariabledomain)已經(jīng)被來自非人物種的對應(yīng)序列所取代。實際上，人化抗體通常是其中某些CDR殘基或有可能某些FR殘基被來自嚙齒動物抗體中的同源位點所取代的人抗體。將用于制造人化抗體的人可變域(輕的和重的)的選擇對于減小抗原性十分重要。根據(jù)所謂的"最適合的"方法，相對于已知的人類可變域序列的整個庫來篩選嚙齒動物抗體的可變域的序列。然后將最接近于嚙齒動物序列的人類序列視作人化抗體的人類(human)骨架(FR)(Sims等人著，J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人著，J.Mol.BioL，196:901(1987))。另一方法使用了從輕或重鏈的特定亞群的所有的人抗體的交感序列衍生出的特定骨架。相同的骨架可用于幾種不同的人化抗體(Carter等人著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992);Presta等人著，J.Immunol.,151:2623(1993))。更重要的是抗體應(yīng)被人化成保持抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)成此目的，根據(jù)一較佳方法，利用母體和人化序列的三維模型，通過分析親本序列(parentalsequence)和各種概念的人化產(chǎn)物的過程，來制備人化抗體。三維免疫球蛋白模型是普遍可獲得的，且為所屬
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的技術(shù)人員所熟悉?？色@得說明并展示所選擇的候選免疫球蛋白序列(candidateimmunoglobulinsequence)的可倉b的三維構(gòu)造結(jié)構(gòu)(conformationalstructure)的計算機程序。對這些顯示的檢測允許對殘基在候選免疫球序列的作用中的可能的角色分析，意即，對可能影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基的分析。以此方式，可從接受和輸入序列中選擇并組合FR殘基，以達(dá)成所要的抗體特征，如(多個)目標(biāo)抗原的增加的親和力。一般而言，這些CDR殘基可直接且最實質(zhì)地巻入到影響抗原結(jié)合中?；蛘?，所屬
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的研究者可生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，它們在免疫時，能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)的情況下產(chǎn)出人抗體的所有組成部分(fullr印ertoire)?？蓮募永Ｄ醽喼莞ダ锩商厥械腁bgenix，Inc.、以及新澤西州安南達(dá)爾市的Medarex，Inc.獲得這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠。己經(jīng)描述了在嵌合且種系突變的小鼠中的抗體重鏈結(jié)合區(qū)(joiningregion,JH)基因的純合缺失(homozygousdeletion)會導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。在這樣的種系突變小鼠中的人類種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將會導(dǎo)致在抗原激發(fā)(antigenchallenge)時產(chǎn)生人抗體。參見例如Jakobovits等人所著，Proc.Natl.Acad.Scl.USA90:2551(1993);Jakobovits等人所著，Nature362:255-258(1993);Bruggermann等人所著，YearinImmunol.7:33(1993);及Duchosal等人所著，Nature355:258(1992)。還可從噬菌體展示庫中衍生出人抗體(Hoogenboom等人著，J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks等人著，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Vaughan等人著，NatureBiotech14:309(1996))。C.DelmmunisedTM抗體Delmmunised抗體是其中潛在的T細(xì)胞表位已經(jīng)被排除的抗體，如國際專利申請案PCT/GB98/01473中所述。因此，當(dāng)將它們施用于活體內(nèi)時，我們期望能消除或大體上減小人體中的免疫原性。此外，例如，可通過共價共軛作用于聚合物來化學(xué)地改質(zhì)抗體，以增加其循環(huán)半衰期(circulatinghalf-life)。在美國專利第4，766，106、4，179，337、4，495，285以及4，609，546中顯示了較佳的聚合物和將其粘著到肽的方法，該等專利的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。較佳聚合物是聚氧乙烯多元醇(polyoxyethytatedpolyol)和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下可溶于水，且其平均分子量較佳在1000到40,000之間，更佳在2000到20，000之間，最佳在3000到12，000之間。D.抗C5/C5aMAb的生成可通過在本
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內(nèi)所熟知的傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)來生成本發(fā)明的抗體。簡言之，用從人體血清提純的C5作為免疫原，在完全弗氏佐劑(completeFreund'sadjuvant)中乳化，并進行皮下地或月復(fù)j漠內(nèi)地注射10-100Ug范圍的量，來使小鼠免疫。十到十五天之后，利用在不完全弗氏佐劑(incompleteFreund'sadjuvant)中乳化的額外的C5來增強動物免疫。此后以每周到每兩周的免疫進程來周期性地增強小鼠免疫。為每次熔合，從免疫過的小鼠的脾中制備單細(xì)胞懸浮液(singlecellsuspension),并將其用來與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞熔合。使SP2/0細(xì)胞(lxl08)和脾細(xì)胞(lxlO8)在含有50%的聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak,Rochester,NY)和5%的二甲亞砜(dimethylsulfoxide)(SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0)的介質(zhì)中熔合。然后將這些細(xì)胞調(diào)整成在DMEM介質(zhì)(Gibco，GrandIsland,NY)中每毫升的懸浮液含有1.7X105的脾細(xì)胞的濃度，補充有5%的牛胎兒血清和HAT(10mM的次黃嘌呤鈉，40uM的氨蝶呤，以及1.6mM的胸腺嘧啶核苷)。將兩百五十微升的細(xì)胞懸浮液添加到大約50個96孔微量培養(yǎng)板(microtestplate)的每個孔中。在大約十天之后，抽取上層培養(yǎng)液(culturesupernatant)以用來篩選(screenfor)與由ELISA純化的人C5的反應(yīng)性。用0.1iig/ml(50y1/孔)的人體C5來隔夜涂鋪I腿ulonII(DynatechLaboratories,Chantilly，VA)微量培養(yǎng)板的孑L。然后，通過以200ul的含5%BLOTTO(無脂干奶)在磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-bufferedsaline,PBS)進行培養(yǎng)1個小時，使這些孔中的非特異性結(jié)合位點飽和。然后用PBST緩沖液(含0.05%的TWEEN20的PBS)對這些孔進行沖洗。在室溫下，將來自每個熔合孔的五十微升的上層培養(yǎng)液與50u1的BLOTTO—起添加到涂鋪過的孔1個小時。用PBST對這些孔進行沖洗。然后，通過與稀釋的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)共軛的羊抗鼠IgG(Fc特異)(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove，PA)在室溫下反應(yīng)~^^J、時，來檢測所結(jié)合的抗體。然后，用PBST對這些孔進行沖洗。將含有0.1%3，3，5，5，四甲基聯(lián)苯胺(Sigma,StLouis,MO)禾口0.003%過氧化氫(Sigma，St.Louis，M0)的0.1M乙酸鈉pH6.0的過氧化物酶底物溶液添加到這些孔中，用來彩色顯影30分鐘。通過向每個孔添加50u1的2MH2S04來終止此反應(yīng)。利用ELISA讀取器(DynatechLaboratories,Chantilly，VA)在450nm下讀取光密度(OD)。通過極限稀釋法來單細(xì)胞克隆孔中對C5反應(yīng)性呈陽性的雜交瘤。然后，擴大單克隆雜交瘤并收集上層培養(yǎng)液用來通過蛋白質(zhì)A層析法進行純化。然后，經(jīng)純化的抗體的特征在于能通過ELISA與人C5和C5a反應(yīng)，能通過BIAcore來測定親和力及動力結(jié)合常數(shù)，能通過經(jīng)典和替代途徑對補體介導(dǎo)的溶血作用起作用，并能抑制125I-C5a與純化的人體嗜中性細(xì)胞結(jié)合。也可以通過淘洗(panning)那些結(jié)合C5的人scFv庫來選擇抗體(Griffiths等人著，EMB0J.12:725-734(1993))。可通過使用己知的分析法(Griffiths等人、Clarkson等人著，Nature,352:642-648(1991))來評估特定克隆體的特異性和活性。在第一淘洗步驟之后，我們獲得了含有多種不同的展示在更好的結(jié)合了C5的噬菌體上的單鏈抗體的噬菌體庫。接下來的淘洗步驟提供了具有更高結(jié)合親和力(bindingaffinity)的額外庫。當(dāng)親合力(avidity)效應(yīng)成為問題時，可使用單價噬菌體展示庫，其中小于20%、小于10%或小于小于1%的噬菌體將抗體的不止一個復(fù)本展示在噬菌體表面上?？赏ㄟ^使用噬粒(phagemid)和輔助噬菌體(helperphage)來完成單價顯示。合適的噬粒包括M13、fl和fd絲狀噬菌體。具有病毒外殼蛋白的熔合蛋白質(zhì)顯示也已為我們所知，并可用于本發(fā)明中。進一歩說明以可比的親和力結(jié)合了C5和C5a的MAb137-26的特征。MAb137-26并不抑制C5活化作用，但是可以非常高效能地抑制在純化的人體嗜中性細(xì)胞上C5a與C5aR的結(jié)合。在下面的實例中將進一步解釋證明這些特性的實驗。為篩選結(jié)合到相關(guān)抗原(例如，阻斷本文所揭示的任何抗體與C5結(jié)合的那些表位)上的特定表位的抗體，可執(zhí)行例行交叉阻斷分析(routinecross-blockingassay)(例如在Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,由Harlow禾口DavidLane編輯(1988)中所述)?；蛘?，可進行表位作圖(印itopemapping)(例如，如在Champe等人所著的J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)中所述)以測定抗體是否結(jié)合了相關(guān)的表位。E.制造本發(fā)明的其它抑制劑可通過慣用的手段將適用于本發(fā)明的其它分子從化合物庫中單離或篩選出來，例如通過測定它們是否結(jié)合至C5/C5a，并接著進行功能篩選(functionalscreen)以測定它們是否抑制C5b的活性。一種用于生成并篩選化合物庫的自動系統(tǒng)在美國專利第5,901,069及5，463，564中有描述。更引人注意的方法涉及相對于Mab137-26的競爭性篩選，或制造結(jié)合位點的三維模型，且然后制造適合于此模型的分子家族。然后，從中篩選出那些具有最理想的結(jié)合特征的分子。此外，通過對與MAbl37-26具有相同特性的抑制劑的競爭分析或功能篩選，可鑒別出其它分子。F.使用本發(fā)明的抑制劑本發(fā)明的分子可通過數(shù)個路線中的任何一個來投藥，并按所指示或為所尋求的目的在治療上有效的濃度來投藥。為達(dá)成此目的，可利用所述
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知的各種可接受的賦形劑而讓抗體成形。通常，通過注射來投藥抗體。所述
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的技術(shù)人員已知用以完成此投藥的方法。也可能獲得可局部投藥或口服、或可能夠穿過黏膜傳輸?shù)慕M合物。投藥的劑量和方式將取決于個體和將被投藥的藥劑。可通過臨床試驗中的例行式實驗或從抗體奏效的動物模型中外推來確定劑量。可將本發(fā)明的抗體用于治療由過量或不受控制的C5a生產(chǎn)而介導(dǎo)的疾病和疾患。下面陳述本發(fā)明的抑制劑在治療這些疾病和疾患中的用途的證據(jù)。實例1:MAbl37-26與人C5和C5a的反應(yīng)性測試MAbl37-26與純化的人體C5和重組C5a的反應(yīng)性(Sigma，StLouis，M0)。上文已描述ELISA的過程。MAbl37-26以劑量依賴的方式高效能地與C5結(jié)合(圖1)。另一種特別用于人體C5的e鏈的抗C5MAbl37-76不會結(jié)合C5a，因為C5a在C5的a鏈上。一種被用作陰性控制的同種型匹配的不相關(guān)的抗體也不會與C5a反應(yīng)。另一方面，MAbs137-26和137-76都會與C5結(jié)合(圖2)。也通過BIAcore設(shè)備(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala，Sweden)來測定MAb137-26與C5a和C5的親和力平衡常數(shù)和結(jié)合動力常數(shù)(締合或離解)。所有的結(jié)合測量都在25。C下在HEPES緩沖鹽水(HBS)(10mM的HEPES，pH7.4,150mM的NaCl,3.4mM的EDTA，0.005%的表面活性劑P20)中進行。為測量C5和C5a與MAbl37_26的結(jié)合率常數(shù)，通過利用N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)和N-乙基-N'-(3-二乙基胺基丙基)陽基環(huán)二酰亞胺(N-ethyl-N，-(3-diethylaminopropyl)cardodiimide)進行胺偶合，將兔抗鼠IgG(Fc)抗體固定到CM5傳感器芯片上不動，MAbl37-26然后就在注射不同濃度的C5之前被捕獲到涂鋪過的傳感器芯片上。表1中總結(jié)了這些數(shù)據(jù)。MAbl37-26具有對液相C5a和C5的較高結(jié)合親和力。結(jié)果還表明了MAbl37-29與C5a和C5所共享的表位相結(jié)合。表1結(jié)合至MAbl37-26的C5和C5a的動力常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>K。n，動力締合常數(shù)k。ff，動力離解常數(shù)kD，平衡離解常數(shù)=^/K。n實例2補體介導(dǎo)的溶血為研究MAb137-26在人體血清中C5的活化上的作用，測試抗體對由經(jīng)典和替代補體途徑介導(dǎo)的溶血的抑制作用。為經(jīng)典途徑實驗，在4°C利用8ug/ml的純化的兔抗雞RBC(Inter-CellTechnologies,Hoperwell，NJ)免疫球蛋白，來激活在含有0.5raM的MgCl2和0.15mM的CaCl2的凝膠體/佛羅那緩沖鹽水(GVB")中的雞RBC(5x1()7個細(xì)胞/ml)15分鐘。然后利用GVB"對細(xì)胞進行沖洗。讓沖洗過的細(xì)胞重新懸浮在1.7x108個細(xì)胞/1111的相同緩沖液中。在圓底96孔微量培養(yǎng)板的每個孔中，將50ul的正常人血清(5.2%)與連續(xù)稀釋的MAbl37-26或抗C2MAb175-62的50y1的GVB—混合，作為陽性控制。然后，將30u1的沖洗過的激活的雞RBC懸浮液添加到含有這些混合物的孔。使五十微升的正常人血清(5.2%)與80ul的GVB"混合，以提供血清色彩背景(serumcolorbackground)。將一種同種型匹配抗HIV-lgpl20MAb用作陰性控制。所使用的最終人血清濃度為2%。在37°C下培養(yǎng)混合物30分鐘。在微量培養(yǎng)板搖動器上將板搖動15秒。然后，在300xg下對板進行離心作用3分鐘。收集上層液(80并將之轉(zhuǎn)移到圓底96孔微量培養(yǎng)板中的孔，以利用ELISA板讀取器在405nm下進行測量。溶血抑制的百分比定義如下100X[(OD無MAb—0D血清色彩背景)一(0D有MAh一OD血清色彩背景)]/(OD無MAb—0D血清色彩背景).圖3顯示了MAW37-26和不相關(guān)的控制MAbG3-519未抑制激活的雞RBC的經(jīng)典途徑溶血，而陽性控制抗C2MAbl75-62有效地抑制了溶血。C2特別涉及經(jīng)典補體途徑。為此替代途徑，未激活的兔RBC被用含有2nM的MgCl2和1.6mM的EGTA凝膠體/佛羅那緩沖鹽水(GVB/Mg-EGTA)沖洗三次。10mM濃度的EGTA被用以抑制經(jīng)典途徑(K.Whaley等人著，在A.W.Dodds(編)，ComplementAPracticalApproach.OxfordUniversityPress,Oxford,1997，第19-47頁)。分析過程類似于上述的經(jīng)典途徑溶血分析的過程。在此分析中所使用的人血清的最終濃度是10%。將抗因子DMAbl66-32用作陽性控制。將上述的相同的同種型匹配不相關(guān)的抗HIV-1gp120Mab用作陰性控制。圖4顯示了MAbl37-26不抑制未激活的兔RBS的替代途徑溶血，而抗因子DMAbl66-32強烈地抑制了溶血作用。因子D特別用于替代補體途徑。陰性控制抗體不起作用?？傊?，這些結(jié)果證實了MAb137-26未抑制C5活化作用，且因此不會抑制C5a和C5b-9的形成。MAb137-26不會抑制替代和經(jīng)典補體途徑的活化。實例3:通過MAb137-26抑制1251-C5a結(jié)合至純化的人體嗜中性細(xì)胞從人全血中提純?nèi)梭w嗜中性細(xì)胞并用DextranT-500/鹽水溶液進行稀釋。在室溫下培養(yǎng)混合物約20分鐘或直到出現(xiàn)清楚界定的表面層。將此表面層轉(zhuǎn)移到50ml的聚丙烯離心管。在離心作用之后，讓細(xì)胞顆粒(cellpellet)懸浮于30ml的冷PBSB(在PBS中1%的BSA)中。使細(xì)胞懸浮液在50-ml的聚丙烯離心管中10ml的Histopaque-1077(Sigma,St.Louis，M0)上成層。在又一次離心作用之后，則讓細(xì)胞顆粒再次懸浮于20ml的冷0.2%NaCl中30秒，以溶解(lyse)RBC。然后，向細(xì)胞懸浮液中添加20ml的冷1.6%NaCl，再次離心，并讓嗜中性細(xì)胞再次懸浮于PBSB中。在冰上保持這些嗜中性細(xì)胞，直到用于125I-C5a結(jié)合。用結(jié)合緩沖液(1%BSA于RPMI1640介質(zhì)中)在1.5mlEppendorf離心管中連續(xù)稀釋MAbl37-26，以獲得在640nM到0.04nM范圍內(nèi)的最終濃度。將4微升的4nM1251-C5a(NENLifeScienceProducts,Inc.，Boston,MA)添加到36Pi的稀釋MAbl37-26，以用于在室溫下培養(yǎng)15分鐘。將純化的重組人C5a(Sigma,St.Louis，MO)用作陽性控制，而將同種型匹配的不相關(guān)的單克隆抗體用作陰性控制。為達(dá)成125I-C5a的最大結(jié)合，取而代之使用36"1的不含抗體或C5a的結(jié)合緩沖液。向每只管添加五十微升的嗜中性細(xì)胞懸浮液，用來在冰上進行培養(yǎng)。在40分鐘的培養(yǎng)期間結(jié)束時，將來自每只管的混合物轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管中的800y1的分離緩沖液(6%BSA于PBS中)中。然后，在室溫下以2000xg對這些管進行離心作用3分鐘。在吸出上層液之后，讓細(xì)胞顆粒再次懸浮于0.5ml的去離子水(de-ionizedwater)中，以溶解細(xì)胞。接著，讓細(xì)溶胞解產(chǎn)物(celllysate)與3ml的用于方夂射性計i(的UltimaGold閃^樂$夜(scintillationfluid)(PackardInstrument,Meriden，CT)混合。125I-C5a結(jié)合的百分比抑制定義如下一[Cpmca一Cpmhks]/[Cpm,一Cpmbk|Jx100其中Cpm,ax=無競爭劑時每分鐘的最大計數(shù)；Cpnw二未添加125I-C5a時的背景cpm;以及Cpnw二有競爭劑時的cpm。圖5顯示了放射性碘標(biāo)記(125I)人C5a與純化的人體嗜中性細(xì)胞的結(jié)合的抑制。在對125I-C5a與純化的人體嗜中性細(xì)胞的結(jié)合的抑制中，MAbl37-26比未標(biāo)記的C5a更有效。用于的50%抑制(ID50)的MAb137-26的劑量是0.45nM，與之相比的是30nM的C5a。實例4:通過在纖維膜上的SPOT肽來繪制MAbl37-26在人體C5a上的結(jié)合表位通過利用由SigmaGenosys(theWoodlands,TX)合成的SPOT肽技術(shù)，來繪制MAbl37-26在人體C5a上的結(jié)合表位。包圍整個人體C5a的重迭肽(12-mer)被合成于纖維膜上。在分析法中，首先在室溫下利用阻斷溶液(blockingsolution)TBSTB(10mM的三氯化物(Tris液TBST(10mM的三氯化物，250mM的氯化鈉和0.05%的TWEEN20)來對膜進行徹底地沖洗。然后用HRP共軛的羊抗鼠IgG(Fc)抗體(以1:5，000稀釋于阻斷緩沖液中)(Jacksonimmunoresearch，WestGrove,PA)對膜進行處理。然后，再次沖洗此膜。通過利用SupersignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(chemilluminescentsubstrate)(Pierce,Rockford，工L)進行培養(yǎng)，來檢測MAbl37-26與C5a的個體SPOTs肽的結(jié)合。接著，通過曝光于KodakX-0MATAR膠巻(Rochester,NY)來檢測化學(xué)發(fā)光的強度。圖6顯示了由MAbl37-26所結(jié)合的表位序列。實例5:用于研究補體介導(dǎo)的炎癥的體外(exvivo)人全血模型MAbl37-26在由大腸桿菌引起的嗜中性細(xì)胞活化上和殺死奈瑟氏腦膜炎菌上的效果為調(diào)查補體在復(fù)雜炎癥網(wǎng)絡(luò)中的作用，必需存在所有潛在的細(xì)胞和流體相(fluid-phase)介質(zhì)并因此能同時相互作用。為在活體外設(shè)計此一實驗，則應(yīng)使用人全血。在此模型中，使用凝血酶特異性的水蛭素模擬物l印lrudin(REFLUDAN)替代肝素來作為抗凝劑。與肝素不同，重組水蛭素不會干擾補體活化作用。在此模型系統(tǒng)中，MAb137-26阻斷了由于通過大腸桿菌引起的補體活化而形成的C5a的發(fā)炎效應(yīng)?？贵w未抑制MAC介導(dǎo)的奈瑟氏腦膜炎菌死亡。因此，MAbl37-26中和C5a而不會抑制C5活化和隨后MAC的形成。這是本發(fā)明的單克隆抗體的一個重要特點。在含有重組水蛭素(50ug/ml)的聚丙烯試管中收集全血。在37°C下用PBS或抗C5抑制劑來預(yù)先培養(yǎng)抗凝血的全血4分鐘。為了研究在嗜中性細(xì)胞上的CDllb表達(dá)和氧化爆發(fā)，在37°C下將調(diào)理過的大腸桿菌菌株LE392(ATCC33572)加入全血樣本10分鐘。大腸桿菌濃度在CDllb實驗中是lxl07ml血，而在氧化爆發(fā)實驗中是lxl07ml。立即處理T-0基線樣本。在培養(yǎng)之后，100ul的樣本被用來通過免疫熒光血細(xì)胞計數(shù)法測量在嗜中性細(xì)胞上的CDUb表達(dá)。利用底物二氫羅得明123(dihydrorhodamine123)來測量激活的嗜中性細(xì)胞的氧化爆發(fā)，并按在爆發(fā)測試過程(ORPEGENPharma，Heidelberg,Germany)中的描述來執(zhí)行。圖7A-7D描繪了對嗜中性細(xì)胞活化進行的CDllb表達(dá)和氧化爆發(fā)的流式細(xì)胞計數(shù)分析(flowcytometricassay)的結(jié)果?？笴5/C5aMAbl37-26有效地抑制了在具有炎癥的人全血模型內(nèi)由大腸桿菌誘發(fā)的嗜中性細(xì)胞活化。在這些分析中，MAbl37-26比抗C5aMAb561(Dr.JurgKohl)和肽C5aR對抗劑(Dr.StephenTaylor)更加有效。在殺菌試驗中，奈瑟氏腦膜炎菌H44/76-1隔夜生長于BHI瓊脂上，繼代培養(yǎng)(subculture)并經(jīng)4小時成長進入對數(shù)期(log-phase)。將5000—10000個集落形成單位(CFU)添加到1.lml的利用PBS或抗體預(yù)先培養(yǎng)了5分鐘的重組水蛭素抗凝血的全血樣本中。在每個時期，將100u1的全血播種在含有血瓊脂的微生物培養(yǎng)皿(Petridish)上并在37°C培養(yǎng)24小時。細(xì)菌生長被表達(dá)成所添加的CRJ/100u1的全血。在添加細(xì)菌之后立即獲得T-0樣本。圖8顯示了MAbl37-26未抑制MAC介導(dǎo)的奈瑟氏腦膜炎菌的死亡。相反，MAbl37-30通過人全血抑制了奈瑟氏腦膜炎菌的死亡。此抗體抑制了C5活化。應(yīng)該了解，在上述部分中所使用的術(shù)語和表達(dá)式只是例示性的而非限制性的，而且本發(fā)明的范圍僅由隨后的權(quán)利要求書來界定，并包括這些權(quán)利要求的標(biāo)的物的所有均等物。序列表<110>建南德克公司<120>結(jié)合至C5和C5A但不阻止C5B形成的補體途徑抑制劑<130>TNX01-06<140>PCT/US02/26074<141>2002-08-17<150>US60313137<151>2001_08-17<160>7<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>74<212>PRT<213>類人<220><221>肽<222>(1)..(74)<223>人類C5a<400>1ThrLeuGinLysLyslieGluGlulieAlaAlaLysTyrLysHisSer151015ValValLysLysCysCysTyrAspGlyAlaCysValAsnAsnAspGlu202530ThrCysGluGinArgAlaAlaArglieSerLeuGlyProArgCys工le354045LysAlaPheThrGluCysCysValValAlaSerGinLeuArgAlaAsn505560lieSerHisLysAspMetGinLeuGlyArg65<210>2<211>1270<212>PRT<213>類人<220><221>肽<222>(1)…(12)<223>人類C5a片段從aa29至aa40<400>2AsnAsnAspGluThrCysGluGinArgAlaAlaArg1510<210>3<211>12<212>PRT<213>類人<220><221>月太<222>(1)…(12)<223>人類C5a片段從aa32至aa43<400>3GluThrCysGluGinArgAlaAlaArglieSerLeu1510<210>4<211>12<212>PRT<213>類人<220><221>肽<222>(1)…(12)<223>人類C5a片段從aa35至aa46<400>4GluGinArgAlaAlaArg工leSerLeuGlyProArg1510<210>5<211>12<212>PRT<213>類人<220><221>肽<222>(1)..(12)<223>人類C5a片段從aa38至49<糊>5AlaAlaArglieSerLeuGlyProArgCyslieLys1510<210><211><212><213>612PRT類人<220><221><222><223>肽(1)..(12)人類C5a片段從aa41至aa52<400>6lieSerLeuGlyProArgCyslieLysAlaPheThr1510<210><211><212><213>712PRT類人<220><221><222><223>肽(1)(12)人類C5a片段從aa44至aa55<400>7GlyProArgCyslieLysAlaPheThrGluCysCys1510權(quán)利要求1.一種抑制劑在制備用于體外檢測C5或C5a存在或用于體外定量C5或C5a的組合物中的用途，其中所述的抑制劑結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5和C5a表位，但是并不抑制C5的活化且不阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該抑制劑是抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該抑制劑是單克隆抗體。4.抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于體外檢測C5或C5a存在或用于體外定量C5或C5a的組合物中的用途，其中所述的抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5和C5a的表位，但是其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段以與C5相同或更好的親和性結(jié)合至游離的C5a。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制C5a結(jié)合到C5aR。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該抗原結(jié)合片段是選自由Fab、F(ab')2、Fv和單鏈Fv所組成的組。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該抗體是單克隆的、嵌合的、去免疫的、人化的或人抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該抗體從由ATCC保藏并被命名為PTA-3650的雜交瘤中產(chǎn)生的單克隆抗體137-26。10.根據(jù)權(quán)利要求1或4的用途，其中該C5a是重組C5a。11.一種體外檢測C5存在的方法，包括將抗體或其抗原結(jié)合片段加入包括C5的組合物，并檢測抗體或其抗原結(jié)合片段對C5的結(jié)合，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5的表位，但是其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。12.—種體外檢測C5a存在的方法，包括將抗體或其抗原結(jié)合片段加入包括C5a的組合物，并檢測抗體或其抗原結(jié)合片段對C5a的結(jié)合，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5的表位，但是其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。13.—種體外定量組合物中C5的含量的方法，所述方法包括將抗體或其抗原結(jié)合片段加入包括C5的組合物，并測量抗體或其抗原結(jié)合片段對C5的結(jié)合，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5的表位，但是其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。14.一種體外定量組合物中C5a的含量的方法，所述方法包括將抗體或其抗原結(jié)合片段加入包括C5a的組合物，并測量抗體或其抗原結(jié)合片段對C5的結(jié)合，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到與單克隆抗體137-26相同的C5的表位，但是其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。15.根據(jù)權(quán)利要求1K12或13或14的方法，其中該抗體是單克隆抗體137-26.16.根據(jù)權(quán)利要求11或13的方法，其中該C5a是重組C5a。全文摘要本發(fā)明涉及一種結(jié)合至C5和C5a的抑制劑，但其并不抑制C5的活化且不會阻止C5b的形成或抑制C5b的活性。此抑制劑分子的一個實例是由MAb137-26指定的單克隆抗體，其結(jié)合至人C5與C5a所共享的表位(epitope)?？蓪⑦@些抑制劑用以在治療由于過量的或不受控制的C5a生產(chǎn)而介導(dǎo)的疾病及疾患中抑制C5a的活性。也可將這些抑制劑分子用于診斷檢測C5或C5a的存在/不存在或C5或C5a的量。文檔編號A61P13/12GK101387646SQ20081009162公開日2009年3月18日申請日期2002年8月17日優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日發(fā)明者C·孫,M·S·C·馮,M·陸,W·孫申請人:建南德克公司