專利名稱：：一種重組蛋白在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及--種重組蛋白(人前胸腺素(x原)，尤其是涉及一種重組蛋白的制備方法及其在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人們生活水平的提高，高糖、高脂和高膽固醇食物的長(zhǎng)期攝入將造成人體肥胖，而肥胖和超重已經(jīng)成為世界性的流行病之一，人們己經(jīng)意識(shí)到過多食用精加工的碳水化合物造成能量過剩是引起肥胖的一個(gè)重要原因，因?yàn)檫^多的碳水化合物攝入后會(huì)轉(zhuǎn)化為脂肪沉積在體內(nèi)，同時(shí)長(zhǎng)期高碳水化合物食品還會(huì)造成空腹血糖升高，增加胰島的負(fù)荷，糖耐量作用降低，長(zhǎng)期積累將大大增加患II型糖尿病的危險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期喂養(yǎng)高糖、高脂和高膽固醇食物的小鼠和兔子4周后其空腹血糖，血脂明顯比喂養(yǎng)正常飼料的動(dòng)物高，出現(xiàn)血糖和血脂代謝紊亂，并且發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)高糖、高脂和高膽固醇食物的動(dòng)物肝臟，腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肝臟糖原合成發(fā)生異常，并且發(fā)生脂肪堆積，胰腺中的胰島數(shù)量減少，胰島細(xì)胞也相應(yīng)減少。人前胸腺素a原(prothymosina)是一個(gè)小的酸性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量13,000，最初由大鼠的胸腺分離得到。雖然胸腺素是由胸腺分泌的，伹是在體內(nèi)許多組織都有胸腺素原a的表達(dá)，而且是不含內(nèi)含子的一種保守的DNA序列。胸腺肽的臨床應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代中期，其最主要的貢獻(xiàn)是對(duì)胸腺依賴性疾病的治療，它對(duì)于維持原發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫疾病和癌癥患者的免疫反應(yīng)性，刺激其特異性淋巴細(xì)胞的活性起著主要作用，因此廣泛應(yīng)用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞氏綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥感染、支氣管哮喘、急慢性肝炎和腫瘤等疾病。另外，由于人類的老化明顯地反映胸腺組織的萎縮和功能的衰竭，胸腺肽可以推遲一些老年性疾病的出現(xiàn)，因此應(yīng)用胸腺肽抗衰老也有著極其廣闊的前景。人ProTa由109個(gè)氨基酸殘基組成，它對(duì)提高機(jī)體免疫力、抗機(jī)會(huì)感染以及促進(jìn)淋巴細(xì)胞的成熟與分化，對(duì)IL-2和IL-2R的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，甚至于發(fā)現(xiàn)它對(duì)腫瘤也有一定治療作用。近年來，糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)理研究表明氧化應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)(1、曹文彬等，抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素防治糖尿病的研究進(jìn)展，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(2):73-74)，為了防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展，人們對(duì)一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)它們通過表達(dá)不同的機(jī)制與作用環(huán)節(jié)打斷氧化侵襲引致胰島P細(xì)胞損害的惡性循環(huán)，從而為天然抗氧化治療糖尿病提供了一個(gè)新的策略。Nrf2(NF-E2-relatedfactor2)是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下它與胞漿蛋白伴侶分子Keapl(Kelch-likeECH—associatedproteinl)結(jié)合使活性處于相對(duì)抑制狀態(tài)。在氧化應(yīng)激源作用下,Nrf2與Keapl解偶連后與抗氧化反應(yīng)元件ARE(antioxidantresponseelement)上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)ARE調(diào)控的第II相解毒酶及抗氧化酶基因表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。Nrf2-Keapl系統(tǒng)在細(xì)胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機(jī)制中有重要地位(2、DinkovaKostovaAT,etal.DirectevidencethatsulfhydrylgroupsofKeaplarethesensorsregulatinginductionofphase2enzymesthatprotectagainstcarcinogensandoxidants.ProcNatlAcadSciUSA，2002,99(18):11908—11913;3、ZhangDD,HanninkM，DistinctcysteineresiduesinKeaplarerequiredforKeapl-dependentubiquitinationofNrf2andforstabilizationofnrf2bychemopreventiveagentsandoxidativestress[J].MolCellBiol，2003，23(22):8137-5151;4、GeoffreyF.Kelso,etal.PreventionofMitochondrialOxidativeDamageUsingTargetedAntioxidants.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.2002,959:263-274)。Nrf2缺失和激活障礙與包括化合物致癌、藥物性肝損傷、炎癥修復(fù)延遲、細(xì)胞凋亡等病變過程相關(guān)。目前認(rèn)同的Nrf2激活機(jī)制包括Nrf2與Keapl的解偶連、蛋白酶對(duì)Nrf2的降解減弱、Nrf2磷酸化等。隨著對(duì)Nrf2-Keapl在細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)、損傷修復(fù)等諸多方面作用認(rèn)識(shí)的深入及作用機(jī)制的了解,Nrf2-Keapl將為抗腫瘤、抗炎癥治療提供新的思路(5、RoloAP,PalmeiraCM.Diabetesandmitochondrialfiuiction:roleofhy-perglycemiaandoxidativestress[J].ToxicolApplPharmacol,2006,212(2):167-178;6、OlgaV.Markova,etal.ProthyomosinalphainteractionwithKEAP1doesn'tleadtoprothymosinalphaubiquinationanddegradation，MolBiol(Mosk).2007,41(5):868-75)。最新研究表明(7、RubenN.Karapetian,etal.NuclearOncoproteinProthymosinIsaPartnerofKeapl:ImplicationsforExpressionofOxidativeStress-ProtectingGenes,MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY,Feb.2005,1089—1099)。ProTa能夠與Nrf2-Keapl復(fù)合物中的Keapl相結(jié)合，使Nrf2從由Keapl抑制狀態(tài)脫離出來，Nrf2與Keapl的解偶連。脫離了束縛的Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)，與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識(shí)別并與ARE,合,啟動(dòng)第II相解毒酶和抗氧化應(yīng)激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ProTa與Nrf2-Keapl復(fù)合物中的Keapl結(jié)合是特異性的，突變的ProTa(MProTa)無法行使該功能。廣泛存在的ProTa為細(xì)胞內(nèi)恒定的抗氧化基因的基本水平的表達(dá)，以達(dá)到防止細(xì)胞被氧化損傷的目的發(fā)揮了重要作用。以上研究結(jié)果揭示了ProTa的另一個(gè)功能，即有利于氧化應(yīng)激保護(hù)基因的表達(dá)。前胸腺素a原具有調(diào)節(jié)平衡免疫功能的作用，能夠使過激的免疫功能下調(diào)，避免自身免疫疾病的發(fā)生，最近研究(8、Malicet,C，etal,.P8andprothymosinalpha:unityisstrenthe.Cellcycle,2006，5(8):829-830)還表明，ProTa與細(xì)胞凋亡因子P8能夠形成復(fù)合體，共同起到抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分裂的功能。此夕卜，最近研究(9、Mallo,G.V.,etal.cloningandexpressionontheratp8cDNA,anewgenepancreasduringtheacutephaseofpancreatitis,pancreasdevelopment,andregeneration,andwhichpromostescelluarproduction.J.Biol.Chem.1997，272(51):32360-32369)還證明，P8能夠刺激胰島素(3細(xì)胞細(xì)胞增殖，因此，推測(cè)ProTa不僅能夠保護(hù)胰島細(xì)胞避免自身免疫細(xì)胞的攻擊，同時(shí)能夠促進(jìn)胰島細(xì)胞的分裂，從而增加胰島素的分泌功能。早在20世紀(jì)80年代Tabata,T(10、Tabata，T.，etal.pretectionbythymosinfraction5fromstreptozotocininducediabetesinmice.Cellularandmolecularbiology1989，35(2):121-127)采用從豬的胸腺分離到的肽腺因子進(jìn)行抵抗STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生，有一定的效果，但所用的是含有多種成分的復(fù)合物。質(zhì)量和穩(wěn)定性無法保證，尋找其中單一有效成分將更有助于開發(fā)出在臨床上有重要治療和預(yù)防功效的臨床用藥。本申請(qǐng)人在公開號(hào)為CN101096384的中國發(fā)明專利申請(qǐng)中公開一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用，根據(jù)ProTa的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物P1和P2，Pl引入Bamffl酶切位點(diǎn)，P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)。用RT-PCR方法得前胸腺素a原全長(zhǎng)基因cDNA，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)7個(gè)單克隆基因序列和參考的proTa的基因序列比對(duì)。用EcoRI和BamHI雙酶切ProTaPCR產(chǎn)物，將ProTa基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX6P-l中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，離心取上清電泳，得GST-Proa融合蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是在原先構(gòu)建的pGEX6P-l-ProTa基礎(chǔ)上將pGEX-6p-l-ProTa中的融合蛋白中的PP酶切位點(diǎn)改成EK酶切位點(diǎn)，因此分別重新合成ProTa上游引物和下游引物如下上游引物5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA-3;下游引物3pGEXSequencingPrimer(24bp):5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3經(jīng)過PCR及酶切后將ProTa基因片斷插入原核表達(dá)載體pGEX6P-1中，再經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白，融合蛋白經(jīng)過EK酶酶切將融合蛋白中的GST切除并經(jīng)過一系列過柱純化后獲得本發(fā)明所使用的重組ProTa蛋白。將該蛋白通過口服途徑證明該蛋白在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中具備重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明所述的重組蛋白為重組人前胸腺素a原，其經(jīng)過上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序其基因序列和相應(yīng)蛋白氨基酸組成如下1MetSerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrGluAsp161ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCGAGGAC4817LeuLysGluLysLysGlyValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAsp3249TTAAAGGAGAAGAAGGGAGTTGTGGAAGAGGCGGAAAATGGAAGAGAC9633AlaProAlaHisGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluProGluAla4897GCCCCTGCTCACGGGAATGCTAATGAGGAAAATGGGGAGCCGGAGGCT14449AspAsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGly64145GACMCGAGGTAGATGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGGGAGGAAGAAGGT19265AspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlyAlaGluSerAla80193GATGGTGAGGAAGAGGATGGAGATGAAGATGAGGGAGCTGAGTCAGCT24081ThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsnAspValAspThr96241ACGGGCAAGCGGGCAGCTGAAGATGATGAGGATAACGATGTCGATACC28897GinLysGinLysThrAspGluAspAsp禱289CAGAAGCAGAAGACCGACGAGGATGACTAG106318本發(fā)明所述重組蛋白可通過以下方法制備(制備過程包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化)重組ProTa的構(gòu)建及蛋白表達(dá)將pGEX-6p-l-ProTa中的融合蛋白中的PP酶切位點(diǎn)，改成EK酶切位點(diǎn)，因此分別合成ProTa上游引物和下游引物如下上游引物5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA-3;下游弓I物3pGEXSequencingPrimer(24bp):5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3表達(dá)構(gòu)建1)目的片斷的PCR反應(yīng)，載體與目的片斷的酶切回收，連接，轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子酶切鑒定，融合蛋白表達(dá)，融合蛋白純化參照分子克隆手冊(cè)和專利文獻(xiàn)(申請(qǐng)人為廈門大學(xué)，專利申請(qǐng)?zhí)枮?00710009083.0);2)蛋白酶切酶切緩沖體系為30mMTris-HClpH8.0，lmMCaCl，0.1%Tween-20GST-ProTa蛋白溶度為lmg/ml，50ml;EK酶特寶生物公司提供(1IU/ml);酶切溫度22°C;按照EK酶蛋白=1:30(w/w)，取lul的酶加入30ul的上述樣品中，混勻，于22匸酶切；3)酶切后目的蛋白的捕獲與純化GlutathioneSepharose4B柱；平衡緩沖液PBS;洗脫緩沖液10mMglu，50mMTris-HClpH8.0;上樣樣品酶切后樣品；GlutathioneSepharoseTM4B掛住GST和未被酶切的GST-ProTa融合蛋白，將目標(biāo)蛋白ProTa穿透，收集穿透，待用。QSepheroseF.F.柱；平衡緩沖液25mMpBNapH6.4;洗脫緩沖液25mMpBNapH6.4，1MNaCl;上樣樣品將GlutathioneSepharose4B柱收集的穿透用平衡緩沖液平衡柱子5-10個(gè)柱體積后上樣，之后再用平衡液沖平5-10個(gè)柱體積，30%洗脫液繼續(xù)沖平，60%洗脫液將目的蛋白洗脫下來。-本發(fā)明所述的重組蛋白通過口服在血脂和血糖代謝方面具有重要調(diào)節(jié)功能，可用于制備預(yù)防糖尿病口服藥物。通過給動(dòng)物喂養(yǎng)高糖、高脂和高膽固醇食物的同時(shí)口服重組蛋白ProTa(prothymosina，ProTa)，對(duì)照組口服相同體積的生理鹽水做對(duì)照，證明該重組蛋白經(jīng)過口服途徑能夠有效防止空腹血糖升高，明顯提高糖耐量作用，在防止血脂代謝紊亂，保護(hù)肝臟、腎臟和胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用。通過檢測(cè)用藥組動(dòng)物血清抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，能夠明顯增強(qiáng)機(jī)體SOD，GSH-PX的水平，同時(shí)顯著降低MDA水平，表現(xiàn)出明顯的抗氧化功能。通過口服途徑用藥達(dá)到提高機(jī)體抗氧化功能，保護(hù)并促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，增強(qiáng)胰島素的分泌水平，降低空腹血糖，增強(qiáng)糖耐量，調(diào)節(jié)血脂和血糖代謝，保護(hù)肝臟和胰腺等重要器官的目的。該蛋白藥物是采用基因工程手段，從健康人獲得人ProTacDNA，并經(jīng)過重組技術(shù)在原核細(xì)胞中高效表達(dá)并經(jīng)過有效純化獲得的基因工程藥物，人前胸腺素a原重組蛋白。將開發(fā)出該蛋白的一個(gè)新的用途。該蛋白單體的制備以及該單體蛋白通過口服途徑，在維持正常血糖代謝，增強(qiáng)糖耐量作用以及在喂養(yǎng)高糖高脂高膽固醇詞料動(dòng)物中防止血脂和血糖代謝紊亂和保護(hù)肝，胰島結(jié)構(gòu)，同時(shí)提高機(jī)體抗氧化功能方面的重要作用的應(yīng)用。圖l為ProTaPCR產(chǎn)物檢測(cè)圖譜。在圖1中，l為ProTaPCR產(chǎn)物，2為PucMix8:分子量標(biāo)準(zhǔn)，bp:堿基對(duì)；1116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分別代表不同大小DNA。圖2為ProTa和pGEX-6p-l(EcoRI+BamHI)酶切圖譜。在圖2中，l為PucMix8:分子標(biāo)準(zhǔn)；2為含ProTa質(zhì)粒五co及I+5awHI酶切；3為pGEX-6p-l五coiI+5"wHI酶切；1116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分別代表不同大小DNA。圖3為pGEX-6p-l-ProTa(EcoRI+BamHI)酶切鑒定圖譜。在圖3中，1，2，3為酶切圖譜；4為分子量標(biāo)準(zhǔn)；bp為堿基對(duì)單位；116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分別代表不同大小DNA。圖4為融合蛋白GST-ProTa表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜。在圖4中，結(jié)果證明在預(yù)計(jì)的位置有目的蛋白的高表達(dá)(箭頭所指)。(1，2，3，4，5分別為IPTG誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)lh，誘導(dǎo)2h，誘導(dǎo)3h,誘導(dǎo)4h,菌體蛋白電泳圖；6為Marker:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖5為GST-ProTa滲透休克實(shí)驗(yàn)樣品SDS-PAGE電泳圖譜。在圖5中，l為Marker:蛋白分子量，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；2為滲透樣品對(duì)照；3為低滲樣品；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖6為GST-ProTaGlutathioneSepharose4B柱色譜圖。在圖6中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(min),縱坐標(biāo)為吸光值(u);吸脫峰代表樣品出峰特征圖，UV280檢測(cè)代表紫外波長(zhǎng)。圖7為GST-Bs42EKGlutathioneSepharose4B純化樣品電泳圖譜。在圖7中，l為Marker:蛋白分子量，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；2為上樣對(duì)照；3為穿透；4為洗脫樣品；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖8為GST-ProTa(EK酶)酶切圖譜。在圖8中，l.酶切前對(duì)照，2.酶切l(wèi)h，3.酶切2h，4.Marker，5應(yīng)切3h，6.酶切4h，箭頭所指為ProTa蛋白(KD，蛋白分子量單位，千道爾頓)；16kDa,14kDa,10kDa,8kDa,分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖9為ProTa酶切后過GlutathioneSepharose4B柱樣品電泳圖譜。在圖9中，13為ProTa酶切洗脫；46為酶切穿透；79為酶切對(duì)照；10為Marker:標(biāo)準(zhǔn)，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖10為ProTaQFF柱純化樣品電泳圖譜。在圖10中，l為Marker蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；23為樣品ProTa樣品；KD代表蛋白質(zhì)分子量，千道爾頓；16kDa,14kDa,10kDa，8kDa，6kDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖ll為Bs42EKdot-blot實(shí)驗(yàn)。在圖11中，l為陰性對(duì)照；23為樣品。圖12為口月艮ProTa對(duì)動(dòng)物空腹血糖和糖耐量的作用。在圖12中，橫坐標(biāo)為檢測(cè)時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)為血糖值(mmol/L);令為高糖高脂詞料，參為5嗎，A為10嗎，X為常規(guī)飼料。圖13為口服ProTa對(duì)動(dòng)物肝臟的影響。在圖13中，A，B，C組每天喂養(yǎng)高糖高脂飼料，D組喂養(yǎng)常規(guī)飼料，B，C組分別口服ProTa5ng/d和lOpg/d,—天兩次；A，D組口服相同體積的磷酸緩沖；XIOO，X200，X400分別代表放大100，200和400倍。圖14為口服ProTa對(duì)動(dòng)物胰島的影響。在圖14中，A，B，C組每天喂養(yǎng)高糖高脂飼料，D組喂養(yǎng)常規(guī)料，B，C組分別口服ProTa5嗎/d和10ng/d，一天兩次；A，D組口服相同體積的磷酸緩沖液；XIOO，X200，X400分別代表放大100，200和400倍。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所述的的重組蛋白單體由廈門伯賽基因轉(zhuǎn)錄有限公司制備和提供。實(shí)施例所采用的材料與方法說明如下。1.實(shí)驗(yàn)取材質(zhì)粒pGEX-6p-l，BL21、重組菌株pGEX-6p-l-ProTa，DH5a-7、BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室周克夫保存，ProTa基因克隆及重組菌株pGEX-6p-l-ProTa的構(gòu)建方法見中國專利200710009083.0。專利發(fā)明人周克夫，李俊燕。試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，SPF級(jí)，(20士2)g,67周齡，雄性，廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)0501452。高糖高脂飼料由江蘇雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料有限公司配制，配方基礎(chǔ)料60%，豬油10%蔗糖10%，奶粉5%，膽固醇3%，雞蛋10%，麻油2%。2.實(shí)施方法，重組ProTa的構(gòu)建及蛋白表達(dá)將pGEX-6p-l-ProTa中的融合蛋白中的PP酶切位點(diǎn)，改成EK酶切位點(diǎn)，因此分別合成ProTa上游引物和下游引物如下上游引物5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA-3;下游弓I物3pGEXSequencingPrimer(24bp):5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3表達(dá)構(gòu)建1)目的片斷的PCR反應(yīng)，ProTaPCR產(chǎn)物檢測(cè)圖譜見圖l。載體與目的片斷的酶切回收，連接，轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子酶切鑒定，見圖2和圖3。融合蛋白表達(dá)，融合蛋白純化方法參照分子克隆手冊(cè)和專利(200710009083.0)表達(dá)結(jié)果見圖4。融合蛋白滲透及GlutathioneSepharose4B柱過柱純化見圖57。2)蛋白酶切酶切緩沖體系30mMTris-HClpH8.0，lmMCaCl，0.1%Tween-20GST-ProTa蛋白溶度約lmg/ml，50ml。EK酶特寶生物公司提供(1IU/ml)。酶切溫度22°C。按照EK酶蛋白=1:30(w/w)，取lul的酶加入30ul的上述樣品中，混勻，于22'C酶切。融合蛋白酶切后圖譜見圖8。3)酶切后目的蛋白的捕獲與純化GlutathioneSepharose4B柱平衡緩沖液PBS洗脫緩沖液10mMglu，50mMTris-HClpH8.0上樣樣品酶切后樣品GlutathioneSepharoseTM4B掛住GST和未被酶切的GST-ProTa融合蛋白，將目標(biāo)蛋白ProTa穿透，收集穿透，待用。ProTa酶切后過GlutathioneSepharose4B柱樣品電泳圖譜。見圖9。QSepheroseF.F.柱平衡緩沖液25mMpBNapH6.4洗脫緩沖液25mMpBNapH6.4，1MNaCl上樣樣品將GlutathioneSepharose4B柱收集的穿透用平衡緩沖液平衡柱子5-10個(gè)柱體積后上樣，之后再用平衡液沖平5-10個(gè)柱體積，30%洗脫液繼續(xù)沖平，60%洗脫液將目的蛋白洗脫下來。ProTaQFF柱純化樣品電泳圖譜見圖10。5)純化蛋白ProTa的dotblot分析取純化ProTa樣品用于dot-blot實(shí)驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用一抗為鼠抗人anti-ProTaMab(human)的單克隆抗體(購自ALEXIS公司)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自KPL公司)。ProTadot-blot結(jié)果見圖ll。動(dòng)物分組'80只小鼠按如下方法進(jìn)行喂食，A，B，C組每天喂養(yǎng)高糖高脂詞料，D組喂養(yǎng)常規(guī)詞料，每只定量5g/d,同時(shí)B組，C組分別口服ProTa5和l(Hig/d，分上，下午口服。A組，D組口服相同體積的PBS。每5天測(cè)血糖一次。連續(xù)30天。血清生化指標(biāo)檢測(cè)由貝克曼全自動(dòng)生化檢測(cè)儀完成，具體方法如下血糖檢測(cè)采用葡萄糖氧化酶方法，膽固醇采用酶比法，甘油三脂采用酶比法，高密度脂蛋白采用酶比法，低密度脂蛋白采用演算法。血清SOD，GSH-PX，MDA檢測(cè)采用南京建成生物有限公司相應(yīng)試劑盒檢測(cè)。組織器官病理切片，HE染色及PAS染色均參考文獻(xiàn)，按常規(guī)方法進(jìn)行固定、包埋和染色處理。糖耐量實(shí)驗(yàn)按以下公式計(jì)算AUC=0.25x(BSvalueat0hour+4xBSvalueat0.5hours+3xBSvalueat2hours)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS(version13.0,SPSSInc.)軟件進(jìn)行分析處理，口服ProTa對(duì)動(dòng)物空腹血糖和糖耐量的作用參見表l，糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和圖12。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*，與A組相比，P<0.05，差異顯著；**，C，D與A組相比，P<0.01，差異極顯著；a^A與D組相比，P<0.05，差異顯著；b,A與D組相比，P<0.01，差異極顯著。從表1和圖12的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)高糖高脂高膽固醇飼料的A，B，C組一個(gè)月后空腹血糖均比喂養(yǎng)正常飼料的D組高，差異顯著(P<0.05)，0.5h后A，B，D組血糖均明顯升高，而高劑量組C則升高不明顯，差異極顯著(P<0.01)，lh后，用藥組B，C血糖值均比A，D組低，差異極顯著(P<0.01);2h后，用藥組和D組均明顯下降，與A組存在極顯著差異(P<0.01)。AUC值怎么用藥組與A組間存在極顯著差異(P<0.01)，D組與A組存在極顯著差異(P<0.01)?？诜roTa對(duì)動(dòng)物血脂的影響參見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*與對(duì)照組相比，差異顯著，(P<0.05)從表2看出，口服ProTa能夠降低血清中的膽固醇，甘油三脂的水平，與對(duì)照組A組有顯著差異，此外能夠提高高密度脂蛋白水平，差異顯著，低密度脂蛋白口服ProTa組比對(duì)照組低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有達(dá)到顯著差異。重組胸腺素a原對(duì)小鼠抗氧化功能的影響參見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*:與A組相比，差異顯著;pO.05;":與A組相比，差異極顯著p<0.01本發(fā)明成功地采用基因工程表達(dá)純化的重組人前胸腺素a原(ProTa)單體蛋白通過口服的途徑用藥,證明即使動(dòng)物同時(shí)喂養(yǎng)高糖，高脂和高膽固醇食物，能夠有效抑制血糖和血脂代謝紊亂，保護(hù)肝臟，胰島結(jié)構(gòu)，降低空腹血糖，增強(qiáng)糖耐量的功能。對(duì)預(yù)防II型糖尿病的發(fā)生具有重要的應(yīng)用價(jià)值?？诜roTa對(duì)動(dòng)物肝臟的影響見圖13。由圖13中各組肝臟器官病理切片和PAS染色發(fā)現(xiàn)，高劑量組C組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，細(xì)胞內(nèi)脂肪成分少，PAS染色與正常D組接近。說明肝糖原轉(zhuǎn)化正常，胰島素分泌水平和功能接近正常，低劑量組B組肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有脂肪成分分布，PAS染色糖原分布不均勻；對(duì)照組A組肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量空泡狀的脂肪成分，并且PAS染色顏色明顯比B，C，D組淡，說明由血糖轉(zhuǎn)化成肝糖原途徑受到影響，可能與胰島素的分泌水平降低有關(guān)。口服ProTa對(duì)動(dòng)物胰島的影響見圖14。由圖14中各組胰島組織結(jié)構(gòu)和數(shù)量的病理切片(HE染色)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A胰島數(shù)量明顯少，總數(shù)在12±2.5個(gè)，每個(gè)胰島面積也小，其中的細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少。用藥組中的B，C組中的胰島數(shù)量明顯比對(duì)照組A組多，B組胰島數(shù)量為18±3.6個(gè)，C組胰島數(shù)量為19士2.6個(gè)，并且每個(gè)胰島面積大，胰島細(xì)胞數(shù)量也較多。正常組D組胰島數(shù)量在23±4.6個(gè)。序列表基因序列和相應(yīng)蛋白氨基酸組成如下1MetSerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrGluAsp161ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCGAGGAC4817LeuLysGluLysLysGlyValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAsp3249TTAAAGGAGAAGAAGGGAGTTGTGGAAGAGGCGGAAMTGGAAGAGAC9633AlaProAlaHisGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluProGluAla4897GCCCCTGCTCACGGGAATGCTAATGAGGAAMTGGGGAGCCGGAGGCT14449AspAsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGly64145GACMCGAGGTAGATGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGGGAGGAAGAAGGT19265AspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlyAlaGluSerAla80193GATGGTGAGGAAGAGGATGGAGATGAAGATGAGGGAGCTGAGTCAGCT24081ThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsnAspValAspThr96241ACGGGCAAGCGGGCAGCTGAAGATGATGAGGATAACGATGTCGATACC28897GinLysGinLysThrAspGluAspAsp***106289CAGAAGCAGAAGACCGACGAGGATGACTAG318合成ProTa上游引物和下游引物如下上游引物5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA下游弓I物3pGEXSequencingPrimer(24bp):5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-權(quán)利要求1.一種重組蛋白在預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用，所述重組蛋白為重組人前胸腺素α原，其基因序列和相應(yīng)蛋白氨基酸組成如下1MetSerAspAlaAlaValAspThrSerSerGluIleThrThrGluAsp161ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCGAGGAC4817LeuLysGluLysLysGlyValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAsp3249TTAAAGGAGAAGAAGGGAGTTGTGGAAGAGGCGGAAAATGGAAGAGAC9633AlaProAlaHisGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluProGluAla4897GCCCCTGCTCACGGGAATGCTAATGAGGAAAATGGGGAGCCGGAGGCT14449AspAsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGly64145GACAACGAGGTAGATGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGGGAGGAAGAAGGT19265AspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlyAlaGluSerAla80193GATGGTGAGGAAGAGGATGGAGATGAAGATGAGGGAGCTGAGTCAGCT24081ThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsnAspValAspThr96241ACGGGCAAGCGGGCAGCTGAAGATGATGAGGATAACGATGTCGATACC28897GlnLysGlnLysThrAspGluAspAsp***106289CAGAAGCAGAAGACCGACGAGGATGACTAG318。全文摘要一種重組蛋白在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用，涉及一種重組蛋白。提供一種重組蛋白在制備預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。重組蛋白為重組人前胸腺素α原，其制備包括重組ProTα的構(gòu)建及蛋白表達(dá)和表達(dá)構(gòu)建。所述的重組蛋白通過口服在血脂和血糖代謝方面具有重要調(diào)節(jié)功能，可用于制備預(yù)防糖尿病口服藥物。文檔編號(hào)A61K38/16GK101428136SQ20081007208公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年11月7日優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日發(fā)明者劉升發(fā),吳漢州,周克夫,王世媛,偉韓申請(qǐng)人:廈門大學(xué);廈門伯賽基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)有限公司