專利名稱：：重組fn肝素結合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，尤其屬于重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用。
背景技術：
：纖維連接蛋白，fibronectim以下簡稱FN;侵襲轉移是惡性腫瘤的生物學特征。腫瘤的侵襲轉移中，腫瘤細胞與腫瘤細胞、腫瘤細胞與血管內皮細胞及細胞外基質之間的粘附和解離在轉移擴散屮起重要作用。近年來腫瘤中細胞外基質成分如何影響腫瘤細胞粘附、遷移，從而影響腫瘤侵襲、轉移，已成為研究熱點。FN是細胞外基質(ECM)的重要成份，為—種具有多種功能的糖蛋白大分子，能與肝素、膠原、纖維蛋白以及整合素家族的細胞表面受體結合，它與細胞表面的受體結合可改變細胞的粘附性能，在腫瘤的侵襲和轉移事件中起重要作用。大量研究表明FN具有抗腫瘤侵襲轉移的作用，但從血漿分離FN存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題，同時由于FN分子量大，全分子表達又存在技術上的難題。因此利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，以代替FN的抗腫瘤侵襲轉移作用不失為一種可行的方法。FN分子結構中有二個與肝素結合的結構域，一個位于FN的N端，由五個I型的同源結構組成，該結構域的分子量為29kDa，由237個氨基酸組成。另一個位于FN的C端，由第12,13，14三個m型的同源結構組成，該結構域的分子量為36kDa，由272個氨基酸組成。重組FNN端及C端肝素結合域兩種多肽對惡性腫瘤的侵襲、轉移能力的影響的研究不曾報道。因此，在前期成功制備重組FN的N端及C端肝素結合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)(制備方法與申請?zhí)枮?00710009192.2所公開方法相同)基礎上，以下本發(fā)明將研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽對惡性腫瘤(以B16細胞)粘附能力及惡性腫瘤(以B16細胞為例)相關粘附基因mRNA表達的影響，繼而以惡性腫瘤(以B16細胞為例)在C57小鼠體內建立移植瘤和轉移瘤動物模型，研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽對小鼠黑色素瘤B16細胞侵襲轉移能力的影響，并探討此兩種多肽抑制腫瘤侵襲轉移能力的分子機制。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提出一種重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用。本發(fā)明所采用的技術方案是所述的二種重組纖維連接蛋白N和C端肝素結合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五個I型同源結構組成，含有從Ser46-Gly282的237個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長711bp，PCR擴增片斷長741bp，雙酶切后片斷長729bp;由酵母表達的多肽分子量為28.52kDa，纖維連接蛋白N端肝素結合域多肽(簡稱rhFN麗-29)。所述的另一種重組纖維連接蛋白C端肝素結合域多肽，其特征在于是由FN分子中的III-12、111-13、III-14三個in型同源結構組成，含有從Tyrl720-Tyrl991的272個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長816bp，PCR擴增片斷長835bp，雙酶切后片斷長828bp，由酵母表達的多肽分子量為36.09kDa，纖維連接蛋白C端肝素結合域多肽(簡稱rhFNHC-36)。本發(fā)明的重組FNN端肝素結合域和重組FNC端肝素結合域多肽酵母表達載體的構建及多肽的制備根據FNcDNA序列及與FN分子結構中的氨基酸序列進行比對，確定纖維連接蛋白N端或C端肝素結合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，結合酵母表達載體的酶切特點，設計rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR擴增引物和酶切位點。利用所設計和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。將rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆至pGEM-T載體上。將重組的pGEM-T-FN麗-29(rhFNHC-36)載體轉染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定。正確的克隆進一步擴增，提取重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體中。將重組的pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，DNA序列測定和雙酶切鑒定，提取陽性克隆的重組。六08155^4-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pPIC9K整合型酵母表達載體上。重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定和雙酶切鑒定。正確的克隆進一步擴增，提取重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒。用BglII酶切重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒，使其線性化。將線性化的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉染GS115酵母細胞，進行篩選，挑選陽性克隆進行小規(guī)模誘導培養(yǎng)、鑒定rhFNHN-29(riiFNHC-36)多肽的表達量，挑選高水平表達的菌株進行大規(guī)模的表達。發(fā)酵液先用80%硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上S-100柱和SP柱純化rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽。對純化的rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽進行SDS-PAGE分析，并經凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計算其分子量。通過斑點雜交和Westernblot方法，檢測多肽結合肝素能力和FN的抗原性。本發(fā)明成功構建了重組rhFNHN-29和rhFNHC-36酵母表達載體，并在酵母細胞中表達及制備了rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽。制備的rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽經SDS-PAGE電泳分離，在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測定分子量，rhFNHC-36多肽分子量為36.09kDa,rhFN朋-29多肽分子量為28.52kDa。斑點雜交實驗證明兩多肽均能與肝素結合，但都不能與FN抗體結合。說明所合成的多肽在體外具有結合肝素的能力而沒有FN的抗原性。說明利用酵母表達系統(tǒng)表達FN肝素結合域多肽是可行的。本發(fā)明所述的重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結合域多肽，經試驗證明能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中得到應用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明是利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，以代替FN的抗腫瘤侵襲轉移作用。FNN端和C端的兩個肝素域是目前深受研究人員關注的區(qū)域。1)本發(fā)明的重組FN的肝素結合域具有下述多種生物學功能l.是血管內皮生長因子的結合區(qū)域，增強了血管內皮生長因子的活性,促進血管的生成；同時通過與血管內皮細胞表面的肝素硫酸蛋白聚糖結合促進了血管內皮細胞表達更多有活性的血管內皮生長因子；2.增強了FN細胞結合域介導的細胞黏附與增殖；3.通過下調MMP-9和a5g3的表達抑制肝癌的生長和轉移；4.通過抑制p53和c-myc基因調節(jié)細胞的凋亡；5.能夠與細菌表面的蛋白結合，從而發(fā)揮其抗微生物活性；6.參與調節(jié)造血干細胞的增殖與分化。7.具有刺激組織纖溶酶原激活劑激活纖溶酶的活性；8.與淋巴細胞表面的CD44結合，參與免疫的調節(jié)；9.能誘導NO的產生和金屬蛋白酶的合成。2)本發(fā)明的重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結合域兩種多肽進行對以小鼠黑色素瘤為例的腫瘤的侵襲、轉移能力的影響的實驗研究。本發(fā)明通過不同的細胞粘附實驗研究重組FN多肽對B16細胞與基底膜及B16細胞相互間的粘附力的影響，結果顯示B16細胞與重組FN多肽的粘附力和天然全長纖維連接蛋白基本一致；在各時相內，經過重組FN多肽干預的B16細胞與人工基質基底膜的粘附力明顯增高，經過重組FN多肽干預的B16細胞之間的粘附力明顯增高，經0.02%乙二胺四乙酸處理后，重組FN多肽干預組脫落的B16細胞數目明顯減少，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽可以增強B16細胞與基底膜及B16細胞之間的粘附能力，減弱B16細胞從基底膜及周圍細胞脫落的能力。本發(fā)明的重組FN多肽通過增加細胞表面FN表達，繼而增強FN和細胞表面整合素受體的結合力，從而增強細胞間及細胞與基底膜的粘附力。3)整合素是細胞表面的一種重要的粘附分子，主要介導細胞與細胞及細胞與細胞外基質之間的相互粘附，并介導細胞與細胞外基質之間的雙向信號傳導，調控細胞粘附、增殖、轉移、凋亡，其中整合素av33是整合素家族中的一種重要分子，與腫瘤的侵襲轉移有關。整合素avP3是血液中腫瘤細胞和血管內皮細胞結合，進而侵入內皮下基質的關鍵因子。而血液中的纖維蛋白原是整合素avP3的天然配體之一，可以促進腫瘤細胞和血管內皮細胞的粘附，然后腫瘤細胞通過ave3和內皮下基質結合，開始侵襲組織。同時，纖維蛋白原在整合素中只結合ave3，并能促進腫瘤細胞與avP3的其他配體結合，進而增強侵襲能力。本發(fā)明通過RT-PCR檢測重組FN多肽處理后B16細胞整合素av、e3基因的mRNA表達，結果顯示B16細胞經重組FN多肽作用后，整合素av、e3基因的mRNA表達明顯降低。同時通過細胞粘附實驗檢測重組FN多肽對B16細胞與纖維蛋白原粘附力的影響，結果顯示經過重組FN多肽處理后，B16細胞與纖維蛋白原的結合能力明顯減弱。腫瘤細胞和纖維蛋白原的結合能力減弱，可使具有高活性的avP3細胞減少。提示重組FN多肽不僅干擾整合素av、基因的表達，而且抑制整合素ave3和其他配體的結合，進而抑制腫瘤的侵襲轉移。這是重組FN多肽抗B16腫瘤細胞血行轉移的分子機制之一。4)細胞與ECM粘附可誘導一些重要的功能基因的表達，目前對于粘附誘導基因表達的機理還不清楚，推測可能通過整合素相關的信號轉導來實現，這一信號轉導的一個重要中間分子是粘附斑激酶(FAK)。FAK是一非受體型蛋白酪氨酸激酶，是介導細胞間、細胞與胞外基質信號轉導的胞內重要分子，參與多條信號轉導通路，在胞內與FN-整合素-細胞骨架跨膜信息系統(tǒng)相結合，調節(jié)AP-1、PI-3K等多種信號通路，參與細胞增殖、轉化等多種生物學過程。細胞ECM粘附可誘導整合素分子聚集，并激活FAK，磷酸化細胞骨架蛋白，引起細胞骨架重建，且可通過RAS-MAPK通路影響基因表達。通過上述作用，粘附不僅可影響MMP基因表達及侵襲性質，而且還可調節(jié)多種細胞功能，如錨定依賴性生長性質和分化。本發(fā)明通過RT-PCR檢測重組FN多肽處理后B16細胞FAK基因的mRNA表達，結果顯示B16細胞經重組FN多肽作用后，FAK基因的mRNA表達顯著降低。重組FN多肽可明顯抑制FAK基因的mRNA表達，提示重組FN多肽可以阻止FN-整合素-細胞骨架跨膜信息系統(tǒng)的信號轉導，抑制腫瘤的侵襲轉移能力。5)腫瘤侵襲是指惡性腫瘤細胞離開原發(fā)生長部位，突破基底膜和細胞外基質構成的屏障，侵犯毗鄰的正常組織。侵襲是貫穿腫瘤轉移全過程的重要步驟，如能早期預防和抑制侵襲將可減少或預防轉移的發(fā)生。本發(fā)明通過皮下接種B16黑色素瘤細胞建立皮下腫瘤侵襲轉移模型，結果顯示B16瘤細胞在小鼠皮下生長迅速，70%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，20%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生肺臟轉移。經過重組FN多肽干預后，小鼠皮下腫瘤的生長受到明顯的限制，rhFNHN-29多肽干預組只有10%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，未見肺臟轉移；而rhFNHC-36多肽干預組只有20%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，未見肺臟轉移，兩種多肽與對照組的差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽不僅可以明顯抑制皮下腫瘤的生長，還可以減弱皮下腫瘤向腹腔侵襲及向肺臟轉移的能力。在轉移過程的早期步驟中，粘附可以使細胞不易脫離瘤體，實際上降低了轉移率。因此重組FN多肽能通過增強B16細胞與基底膜及細胞之間的粘附能力，減弱B16細胞從基底膜及周圍細胞脫落的能力，從而使皮下腫瘤局限生長，最終減少了腫瘤的侵襲和轉移。6)腹腔接種瘤細胞后形成腫瘤結節(jié)依據大小可分為大結節(jié)(》lram)和小結節(jié)(<lmra)。本發(fā)明研究發(fā)現，結節(jié)形成初期，都是小結節(jié)，隨著腫瘤組織的生長，大結節(jié)的數量逐漸增加，而小結節(jié)的數量卻逐漸停止增加，這可能與大腫瘤組織分泌腫瘤血管生長抑制因子有關。腹腔內微小腫瘤結節(jié)具有更強的侵襲轉移能力，而較大的腫瘤結節(jié)一般局限生長。本發(fā)明通過腹腔接種B16黑色素瘤細胞建立腹腔侵襲模型，結果顯示B16瘤細胞在腹腔內形成大量的微小腫瘤結節(jié)(<lmm)，分布于腸系膜靜脈網及腹腔大血管周圍，具有很強的侵襲轉移能力。經過重組FN多肽干預后，B16瘤細胞在腹腔內局限生長，腹腔內微小腫瘤結節(jié)明顯減少，其中，rhFNHN-29多肽對腹腔腫瘤結節(jié)的抑制率為62.7X，而rhFNHC-36多肽對腹腔腫瘤結節(jié)的抑制率為54.5%;重組FN多肽干預組與對照組相比，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽對微小腫瘤結節(jié)的增加具有較強的抑制作用，可抑制小鼠黑色素瘤在腹腔的侵襲生長。7)腫瘤轉移指惡性腫瘤細胞借助血管、淋巴管等途徑，在遠離腫瘤原發(fā)生長部位的器官內形成繼發(fā)瘤的過程。人工血行轉移模型集中體現了腫瘤細胞進入血液循環(huán)以后癌轉移的幾個步驟。因此，本發(fā)明通過尾靜脈接種B16黑色素瘤細胞建立黑色素瘤人工血行轉移模型，結果顯示B16瘤細胞通過尾靜脈進入小鼠血液循環(huán)后，最終100%小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉移。經過重組FN多肽干預后，rhFNHN-29多肽干預組只有50X小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉移，而rhFNHC-36多肽干預組只有40X小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉移，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示重組FN多肽能明顯減少荷瘤小鼠肺臟轉移。由于重組FN多肽和腫瘤細胞表面的整合素受體具有很強的粘附力，故我們認為，重組FN多肽可和血管內皮細胞"競爭"腫瘤細胞表面的整合素受體，使腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的粘附性減弱，腫瘤局限在血流中，不易突破基底膜侵入其他器官，從而減少肺臟及其他部位轉移灶的產生。人工血行轉移模型是通過尾靜脈注射瘤細胞建立，大量腫瘤細胞通過血行而到達相應器官形成轉移癌，重組FN多肽有一定效果。綜上所述，本發(fā)明重組FN多肽通過影響整合素ave3的功能，進而干擾B16細胞與細胞外基質粘附能力，并減弱粘附斑激酶的激活，從而起到抑制腫瘤侵襲轉移的作用。因此本發(fā)明的重組FN肝素結合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用，從小鼠黑色素瘤細胞B16細胞注射到小鼠的動物實驗數據可知本發(fā)明的重組FN肝素結合域多肽具有抑制惡6性腫瘤侵襲轉移的作用，能作為藥物；而且制備方法簡單，能替代從血漿分離FN，克服存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題。圖1-1為本發(fā)明的rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定圖。圖中1、pUC8;2、rhFNHC—36:3、rhFNHN-29圖1-2為本發(fā)明的重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BaraH雙酶切鑒定圖。圖中1、pUC18;2、pAo815SM-FNHN-29載體；3、空載體對照圖1-3為本發(fā)明的bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定圖。圖中1、PCR鑒定；2、雙酶切鑒定；3、pUC8圖1-4為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的正向測序圖。圖1-5為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的反向測序圖。圖l-6為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的正向測序圖。圖1-7為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的反向測序圖。圖1-8為本發(fā)明的FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析圖。圖1-9為本發(fā)明的純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析圖。圖中1、純化的FNHC-36多肽；2、M圖1-10為本發(fā)明的rhFNHC-36多肽的分子量測定圖。圖1-11為本發(fā)明的rhFNHN-29多肽分子量測定圖。圖1-12為本發(fā)明的多肽結合肝素斑點雜交放射顯影圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖1-13為本發(fā)明的多肽結合肝素斑點雜交酶聯反應顯色圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖2為本發(fā)明的C57BL/6小鼠皮下腫瘤腹腔侵襲模型圖(接種后第30天)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組圖3為本發(fā)明的C57BL/6小鼠皮下腫瘤照片(接種后第30天)。圖中上對照組；中rhFNHC-36多肽組；下rhFNHN-29多肽組。圖4為本發(fā)明的C57BL/6小鼠腹腔腫瘤移植侵襲模型圖(接種后第7天)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組圖5為本發(fā)明的C57BL/6小鼠接種瘤細胞后第30天全肺照片圖(每組顯示3只小鼠全肺)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細描述下面以小鼠黑色素瘤細胞B16細胞注射到小鼠為例說明重組FN肝素結合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用。(一)材料與試劑1.主要試劑天然全長纖維連接蛋白(FN):采用明膠親和層析法從正常人血漿純化。重組FN多肽重組FNN端肝素結合域多肽(rhFNHN-29)、重組FNC端肝素結合域多肽(rhFNHC-36):本發(fā)明構建FN1^端和<:端兩個肝素結合域多肽的酵母表達載體01〔9}(-rhFNHN-29、pPIC9K-rhFNHC-36，并篩選出高表達的酵母表達菌株，表達、純化出rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽。RPMI-1640培養(yǎng)液購自GIBC0L公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，引物、Trizol均購自Invitrogen公司，AMV逆轉錄試劑盒購自Promega公司(編號:A3500)，PCR試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司，DNAMarker購自北京天為時代公司，MatrigelMatrix購自BD公司，纖維蛋白原、四甲基偶氮唑藍購自Sigraa公司，96孔、6孔細胞培養(yǎng)板購自Costar公司。2.細胞株小鼠黑色素瘤細胞B16細胞由福建醫(yī)科大學藥學院惠贈，置于含10M小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37°C、5WC02混合氣體培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。3.動物C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重(19士0.6)g，雄性，由中國醫(yī)學科學院上海實驗動物繁育中心提供[為清潔級動物，合格證SCXX(滬)-2003-003],在SPF層流柜中詞養(yǎng)。4.主要儀器臺式低溫離心機為Beckman公司產品(型號J2-21)，紫外分光光度儀為Beckman公司產品(型號DU—640)，酶標儀為Stat公司產品(型號Fax-2100)，PCR擴增儀為美國AB公司產品(型號AB2720)，凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO-RAD公司產品(型號GelDOClOOO)，細胞培養(yǎng)箱為服ALFORCE公司產品，超凈工作臺為AIRTECH公司產品，微量加樣器為Eppendorf公司產品，水平電泳槽為北京東方儀器廠產品，電子天平為Ohaus公司產品，光學顯微鏡為01ympus公司產品。(二)重組FN肝素結合域多肽酵母表達載體的構建及多肽的制備本發(fā)明將FN的C端的肝素結合域多肽基因和FN的N端的肝素結合域多肽基因克隆至酵母表達載體，并在GS115酵母細胞中進行表達。1.1)FNC端和FNN端肝素結合域多肽基因PCR擴增引物設計根據FNcDNA序列，及與FN分子結構中的氨基酸序列進行比對，確定纖維連接蛋白C端肝素結合域多肽(rhFNHC-36)和N端肝素結合域多肽(rhFNHN-29)的克隆位置，結合酵母表達載體的酶切位點，設計重組rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR引物和酶切位點。FNN端肝素結合域多肽是由FN分子中N端的五個I型同源結構組成，含有237個氨基酸(Ser46-Gly282)。編碼該多肽的DNA序列長711bp(403bp-1113bp)，PCR擴增片斷長741bp,雙酶切后片斷長729bp,該多肽命名為rhFNHN-29。其目的基因片斷PCR擴增的引物如下上游引物5-ATGCTc4cGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCAGTCAMGCMGCCCGGTTGTTA-3下游引物5-ACGTAG丄AATTCTCCGCTCGATGTGGTCTGCA-3上游酶切位點XhoI，下游酶切位點EcoRI。FNC端肝素結合域多肽是由FN分子中的111-12、111-13、III-14三個III型同源結構組成，含有272個氨基酸(Tyrl720-Tyrl991)。編碼該多肽的DNA序列長816bp(5428bp-6244bp)，PCR擴增片斷長835bp,雙酶切后片斷長828bp，該多肽命名為rhFNHC-36。其目的基因片斷PCR擴增的引物如下上游弓I物5-ATGCTC—CGAGAAAAGAGAGGCTGAAGGCACCAACTGAC-3下游引物5-ACGTAGiMTTCTCCGCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3上游酶切位點XhoI，下游酶切位點EcoRI。1.2)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR擴增及純化回收PCR擴增體系FNcDNA0.1u1(50ng),IOX緩沖液5ul,dNTP1p1，pfu1"1(3U)，上下游引物各lul(lOpmol)，雙蒸水41u1，構成50u1反應體系。PCR擴增條件94X:5分鐘預變性，94。C30秒，63°C(rhFNHN-29，66'C)40秒，72°C40秒，25個循環(huán)，72'C10分鐘。PCR擴增產物經1%低溶點膠電泳，割取含目的基因的低溶點膠，用膠回收試劑盒回收純化目的基因片斷，加雙蒸水溶解，測OD值。1.4)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接至酵母表達載體1.4.1)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接到pGEM-T載體rhFNHN-29和rhFNHC-36基因末端加A。反應體系20pl:PCR回收產物12.4ul,MgCL21.6u1，ATP2u1,10X緩沖液2ul，Taq酶2ul，在72。C連接30分鐘。rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接pGEM-T載體。反應體系20u1:pGEM-T載體2w1，末端加A的rhFNHN-29基因6ul，2X緩沖液10ul，T連接酶2ul,4'C連接16小時。1.4.2)陽性重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)載體的選擇10u1連接產物加入到50ulDH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，加150u1LB(AMP—)，37。C225rpm振搖1小時。100u1的轉染液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過夜。挑選單個菌斑至5nilAMP+的LB中37'C225rpm振搖6小時，提取質粒進行DNA測序和酶切鑒定。1.4.3)rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體將以上挑選鑒定正確的陽性菌斑進一步振搖擴增，用UNIQ-200柱式質粒大量抽提試劑盒提取pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)陽性質粒。操作按說明書進行。重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒的Xhol酶切重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒20ul(lul含100ng),10X緩沖液20ul，10XBSA20ul，Xhol1.5yl,雙蒸水138.5ul，200ul體系，37。C酶切2小時。酶切產物分兩管，分別用95%乙醇沉淀，一管加10ul雙蒸水，電泳觀察酶切效果。若已酶切徹底，另一管再用EcoRI酶切。重組pGEM-T-FNHN-29質粒的EcoRI酶切另一管繼續(xù)EcoRI酶切，上述酶切沉淀質粒，IOX緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30iil.40nl體系，37°C2小時。1%低溶點瓊脂糖回收FNHN-29(rhFNHC-36)基因片斷，加10H1雙蒸水溶解。pAo815SM載體的酶切。取pAo815SM質粒，用Xhol酶切，酶切體系pAo815SM質粒20u1(lu1含100ng)，10X緩沖液20ul，10XBSA20ul，XhoI1.5ul，雙蒸水138.5Ul,200wl體系，37。C酶切2小時，瓊脂糖電泳檢測酶切效果，酶切完全后用95%乙醇沉淀，加10ul雙蒸水溶解。得到的產物再用EcoRI酶切，酶切體系上述酶切沉淀質粒，10X緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30ul.40ul體系，37°C2小時。1%低溶點瓊脂糖回收pAo815SM線性質粒，加10ii1雙蒸水溶解。連接反應以上rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因酶切回收產物2ul，IOX緩沖液1.5u1,T連接酶lul，酶切回收的pAo815SM載體l"l，雙蒸水10p1，15.5ul體系，14°C連接過夜。1.4.4)重組pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒轉染DH5a感受態(tài)細胞選擇陽性克隆以上15.5u1的連接產物加入到50u1DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42'C熱休克90秒，力H150u1LB(AMP—)，37。C225rpm振搖1小時。每100u1轉染后的DH5a菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37。C培養(yǎng)過夜。從轉化平板上挑出5個單菌落分別到5mlAMF的LB中，37°C225rpni振搖過夜。用質粒提取試劑盒提取質粒，EcoRI酶切驗證。選出陽性克隆繼續(xù)下一步試驗。pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒雙酶切(EcoRI):pAo815SM-FNHN-29質粒30jil，10X緩沖液(M)6iil,10XBSA6iil，EcoRI2iil,BamHI2nl雙蒸水14n1，60ii1體系，37'C酶切3小時。瓊脂糖電泳檢測酶切充分后，酶切物用2%瓊脂糖和1%低溶點膠回收rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因。雙蒸水溶解。1.4.5rhFNHN-29基因(rhFNHC-36)連接到酵母表達載體pPIC9KpPIC9K質粒雙酶切(EcoRI和BamH):pPIC9K空質粒用EcoRI和BamH在37。C酶切3小時。瓊脂糖電泳檢測酶切充分后，用2%瓊脂糖和1%低溶點膠回收pPIC9K線性質粒，雙蒸水溶解。連接反應EcoRI和BamH雙酶切回收的FNHN-29(rhFNHC-36)基因6u1，EcoRI和BamHI雙酶切的pPIC9K1u1,T4緩沖液1u1，T4連接酶1u1，雙蒸水1u1，10iil體系，14。C連接16小時。1.4.6重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒轉染DH5a感受態(tài)細胞選擇陽性克隆lu1重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體加入到50li1DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，力B150ia1LB(AMP—)，37°C225rpm振搖2時。每lOOlU轉染后的菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過夜。挑單菌斑至5mlAMP+的LB中37°C325rpm振搖6小時，測序和提取質粒并進行酶切鑒定。測序正確的質粒進一步擴增，在100mlLB(AMP+)中振搖6時，測0D值，在對數生長期中，用大柱提取質粒，按說明書進行操作，所提取的質粒溶于50ul雙蒸水中。1.5)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽在酵母細胞中的表達1.5.3)重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒轉染酵母細胞及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表達線性質粒的準備取20ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質粒進行酶切。酶切體系質粒20ul，10X緩沖液40ul，10XBSA40ul,BglII6ul，雙蒸水294u1，400ixl體系。37。C酶切過夜。酶切物用氯仿按1:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，上清用95%乙醇沉淀，70%乙醇清洗一次，真空抽干，加雙蒸水10ul溶解，得到重組的pPIC9K-FNHN-29線性質粒(pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)/BglII)，-20'C保存?zhèn)溆谩＞€性質粒轉染酵母細胞取2ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)線性質粒轉染GS115感受態(tài)細胞，轉染的GS115細胞涂布于RDB平板上，28。C培養(yǎng)4-5日，挑取10單菌斑至2mlYPD中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。取100u1菌液加100u130%甘油混合，-8(TC冰箱保存。剩余菌液全部倒入20mlB匿中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。再誘導48小時培養(yǎng)，早晚各補加0.25%甲醇誘導，48小時后，4'C中，離心取上清，4X緩沖液上樣電泳，鑒定是否表達及表達的量。挑選出表達最好的菌種，并保存菌種于-8(TC中。將表達量最高的菌液150u1接種到3mlYPD中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜的3ml菌液全部再接種到200mlBMGY中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜的菌液再按1:20比例接種到BMMY中，早晚各補加0.25%甲醇誘導，誘導48小時.誘導結束后，4°C中，6000rpm離心5分鐘，取40p1上清做SDS-PAGE電泳分析，鑒定是否表達及表達的1.5.4)rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的分離純化酵母發(fā)酵液的沉淀分離80%硫酸胺沉淀酵母發(fā)酵液上清(以4000ml為單位)，調Ph至7.3，放置30分鐘，2(TC，10000rpm離心20分鐘，去上清，沉淀物再用200ml去離子水溶解，離心，去上清，150ml去離子水再溶解，40u1做SDS-PAGE電泳分析。S-IOO柱的分離純化將以上沉淀分離的樣品液50ml，上樣至980ml的FFS-100柱子上。用平衡液進行洗脫純化，平衡液為10mmNaCl，20咖Tris-Cl，Ph8.5。洗脫純化過程中，收集各個峰洗脫液體，并做SDS-PAGE電泳分析，以確定rhFNHN-29多肽所在的峰。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，再進行SP柱純化。SP柱的分離純化從S-100純化中收集的第二個峰洗脫液調Ph值至7.0，稀釋一倍后再上SP柱進一步純化。A液10mMNaCl，20mMTris-Cl,Ph7.0;B液200mMNaCl，ZOmMTris-CLPl^CK洗脫純化過程樣品上柱平衡好后，60%B液洗脫。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，并進行SDS-PAGE電泳分析、分子量測定、含量測定、濃縮處理。1.6)純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的生物學特性分析1.6.1)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的含量測定用Bradford試劑盒測定純化液中目的蛋白的含量，按說明書操作，在酶標儀(354型，thermoLabSystems)上測590nm光密度值(OD值)，計算待測樣品濃度，再用透析袋透析濃縮。1.6.2)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽分子量測定將純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳凝膠在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測定多肽的分子量，以低分子量標準蛋白為參照。1.6.3)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽結合肝素活性與FN抗原性rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽是FN分子中的肝素結合區(qū)域。在完整的FN分子中該區(qū)域具有結合肝素的活性，為了驗證在昆蟲細胞中表達的rhFNHC-36多肽和在酵母細胞中表達的rhFNHN-29多肽是否保留結合肝素的能力及是否具有FN抗原性的特性，特設計了Westernblot和斑點雜交實驗。Westernblot:按SDS-PAGE常規(guī)方法制膠，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為3%膠大小為10cmX10c邁，20ulrhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽樣品(40ug)，力Q20ul2X上樣緩沖液，煮沸5分鐘，上樣電泳(上樣時以相同的排列順序上樣兩處，中間以一空泳道相隔，以便制成兩張相似的膜，一張用于酶聯顯色，一張用于放射顯影)，電泳條件為濃縮膠8mA穩(wěn)流電泳30分鐘，分離膠18mA穩(wěn)流電泳2小時，電泳結束后，小心將膠移至轉膜儀上，在膠的上方放上一張同樣大小的硝酸纖維素膜，在穩(wěn)壓30V狀態(tài)下過夜轉膜。次日將轉好的膜切成兩張(一張用于酶聯顯色，一張用于放射顯影)，將硝酸纖維素膜置1%BSA的TBS緩沖液中封閉1小時，再將膜置含肝素鈉(625單位/ml)的TBS緩沖液中，室溫孵育l小時，TBS緩沖液漂洗二次后，將膜置于含大鼠抗肝素抗體(2iig/nil)的TBS緩沖液，室溫孵育1小時，TBS緩沖液漂洗后，加入辣根酶標記山羊抗大鼠IgG(H+L)，室溫孵育l小時，顯色液顯色。另一張進行放射顯影將膜放在保鮮膜上，于暗室中用化學發(fā)光工作液WesternBlot—tingLuminolReagent(SantaCruz)按每2cm2膜各力卩顯色液A，B0.5ml，均勻覆蓋NC膜，蓋上保鮮膜，室溫反應5分鐘。然后移入X射線膠片盒中，在預先裁減好的X射線膠片(KODAK)上爆光，時間為2分鐘、5分鐘。FN抗原性檢測的一抗為鼠抗人FN單抗，二抗為羊抗鼠IgG-HRP(斑點雜交相同)。斑點雜交取20ul的rhFNHC-36、rhFNHN-29多肽樣品(40Pg)直接點在硝酸纖維素膜上(同時處理兩張膜，一張用于酶聯顯色，一張用于放射顯影)，待樣品稍干后，封膜、結合肝素、結合抗肝素抗體、結合二抗和顯色同Westernblot。另一張膜進行放射顯影，方法同前。結果1目的基因在重組載體上的鑒定1.1rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定見圖1-11pUC8;2rhFNHC-36:3rhFNHN-291.2重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BamH雙酶切鑒定見圖1-21pUC18;2pAo815SM-FNHN-29載體；3空載體對照1.3重組pAo815SM-FNHC-36載體的BamHI和HindIII雙酶切鑒定見圖1-3bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定1、PCR鑒定；2、雙酶切鑒定；3、pUC81.5重組pGEM-T-FNHN-29載體中目的基因的DM序列測定見圖1-4rhFNHN-29基因的正向測序圖見圖1-5rhFNHN-29基因的反向測序圖1.4重組bacmid/FNHC-36載體中目的基因的DNA序列測定見圖1-6rhFNHC-36基因的正向測序圖見圖l-7rhFNHC-36基因的反向測序圖2.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽SDS-PAGE分析見圖1-8FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析見圖1-9純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析1、純化的FNHC-36多肽；2、M2.2rhFNHN-29多肽的分子量測定rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳圖，經凝膠圖象分析儀掃描分析。見圖1-10rhFNHN-29多肽分子量測定2.3rhFNHC-36多肽的分子量測定rhFNHC-36多肽經SDS-PAGE電泳，在凝膠圖像分析儀中掃描分析。見圖1-11rhFNHC-36多肽的分子量測定2.4斑點雜交斑點雜交法檢測rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽與肝素及FN抗體結合的能力，用酶聯顯色和放射顯影法，結果兩多肽均能與肝素結合，均不能與FN抗體結合。多肽結合肝素斑點雜交放射顯影圖，見圖1-12左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽12多肽結合肝素斑點雜交酶聯反應顯色圖，見圖1-13左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽討論本發(fā)明將纖維連接蛋白N端和C端的肝素結合域多肽基因片斷克隆至酵母表達載體中，成功獲得了重組的含纖維連接蛋白N端和C端肝素結合域多肽基因片斷的酵母表達載體pPICK-FNHN-29(FNHC-36),并在GS115酵母細胞中表達多肽。本發(fā)明在用Westernblot法檢測多肽結合肝素能力時，多肽未能與肝素結合，可能的原因是在Westernblot檢測中，多肽在SDS-PAGE電泳時其空間結構被破壞，故不能與肝素結合。而在用FN抗體結合時，多肽同樣未能與FN抗體結合。多肽結合肝素的能力在斑點雜交實驗中得到了確認。在斑點雜交實驗中多肽仍不能與FN抗體結合，提示多肽不具有FN的抗原性。以上結果顯示利用酵母表達系統(tǒng)表達FN肝素結合域多肽是可行的。表達的多肽具有相應的結合肝素的活性。(三)實驗方法一、重組FN多肽對B16細胞粘附能力及B16細胞相關粘附基因niRNA表達的影響1.細胞粘附能力的測定[1]不同濃度的天然全長纖維連接蛋白及rhFNHN-29多肽、rhFNHC-36多肽包被96孔板，第l孔包被濃度為80ug/ml，對倍稀釋至第7孔(共4排)，4'C過夜；0.02XPBS液洗滌3次，加lXBSA封閉lh。包被孔中每孔加入B16細胞5X107ml，100ul/孔。置培養(yǎng)箱中溫育2h后，0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔再加入無血清培養(yǎng)液100ul，MTT20ul，37。C繼續(xù)孵育4h。吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150nlDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630ran雙波長吸光值(OD值)。2.細胞-基質粘附實驗[1]5mg/ral的MatrigelMatrix包被96孔板，4。C過夜，0.02XPBS液洗滌3次，力卩1XBSA封閉lh。在B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20"g/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入細胞5X107ml，100ul/孔，37。C培養(yǎng)20、40、60、80及100分鐘。0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔加入無血清培養(yǎng)液100ul，MTT20yl，37。C繼續(xù)孵育4h。吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150ulDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630nm雙波長吸光值(OD值)。3.同質性粘附實驗[1]B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20iig/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，同時設立空白組(空白組的細胞不加重組FN多肽干預)。將重組FN多肽干預組、對照組及空白組的細胞分別接種于普通的96孔板中；待其長滿單層不留空隙后，重組FN多肽干預組和對照組分別加入5X107ml同種細胞，每孔100ul，空白組不加入細胞；37t搖床孵育，40r/fflin，分別于孵育20、40、60、80、IOO分鐘，吸出含有未粘附細胞的培養(yǎng)液，用O.25%胰蛋白酶消化粘附的細胞并計數細胞數。4.細胞分離實驗[1]B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20yg/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于普通的6孔板中，每孔加入細胞5X107ml，lml/孔，使其長滿單層不留空隙；再加入0.02X乙二胺四乙酸lml，37。C搖床孵育，40r/min，分別于孵育2、4、6、8、IO分鐘，吸出含有未粘附細胞的培養(yǎng)液，計數上述培養(yǎng)液中的細胞數得出脫落細胞數。5.B16細胞粘附纖維蛋白原活性的檢測w625ng/ml的纖維蛋白原包被96孔板，4。C過夜，0.02XPBS液洗滌3次，力Q1^BSA封閉lh。在B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20ug/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入細胞5X105/1111，100ul/孔。置培養(yǎng)箱中溫育2h后，0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔加入無血清培養(yǎng)液lOOii1,MTT20ul，37。C繼續(xù)孵育4h，吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150ylDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630nm雙波長吸光值(OD值)。6.B16細胞相關粘附基因mRNA表達的檢測B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20lig/ni1，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，兩組各取1X1(T個細胞，抽提RNA，RT-PCR檢測av、P3、FAK基因的mRNA表達。6.1總RNA提取收集重組FN多肽干預組及對照組細胞，用0.02MPBS(ra7.4)洗滌后用RNA提取液(Trizol，Lifetechology)，氯仿、異丙醇、75%乙醇，分步分離提取、沉淀，步驟詳見Trizol試劑說明書。RNA沉淀加20-40ul經O.1WDEPC處理的無菌去離子水溶解。所提取RNA經紫外分光光度計定量0D260:OD280》1.8，取lng用于l.0%瓊脂糖凝膠(含1!xg/ml溴化乙錠)電泳，IOOV，15分鐘，用UV紫外分析儀分析結果。提取RNA所用的器具均為一次性無菌塑料制品，電泳緩沖液經O.1WDEPC處理，高壓無菌，電泳槽用O.1WDEPC水浸泡后使用。6.2cDNA合成在0.2mlEP管中按順序加入下列逆轉錄成分各組總RNAl.OugMgCl2(25mM)4,On110XBuffer2.On1d證Mix(10mM)2.On1Oligo(dT)Primer1.On1RNasin0,5u1AMV(20U/u1)0.625u1加ddH20至總體積20ti1混勻后，置PCR儀42'C60分鐘，99。C5分鐘滅活AMV。cDNA作為PCR反應模板，-2(TC保存。6.3PCR擴增引物濃度均為25pmol/y1，加樣體積如下10XPCRbuffer(含鎂離子)5.Oul14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>引物序列、擴增片段長度、PCR反應條件等參數見表1表l引物名稱、擴增長度及PCR反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.4PCR產物分析取5ylPCR產物加lul上樣緩沖液，2.0%瓊脂糖凝膠(含1111GoldView染料)電泳，IOOV，15分鐘，用UV紫外分析儀分析結果。測定各組B16細胞av、03、FAK和g-actin基因mRNA表達的光密度值，求出各組B16細胞相關粘附基因mRNA表達和P-actin基因mRNA表達的光密度相對比值。二、重組FN多肽對小鼠黑色素瘤細胞侵襲轉移能力的影響1.重組FN多肽抑制B16瘤細胞皮下生長的實驗收集指數增殖期B16細胞，經0.25%胰蛋白酶消化，置于無血清的培養(yǎng)液中，輕輕搖動，細胞懸液經計數、錐蟲藍染色，檢測細胞活力在95%以上，調整細胞濃度為1X107ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠右側腋下皮膚，取上述瘤細胞懸液接種于小鼠右腋皮下，每只接種2X107ml細胞(0.2ml);然后隨機分成對照組和rhFNHN-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組10只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)接種部位注射7天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)接種部位注射7天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況及皮下腫瘤生長情況，第30天解剖未死亡小鼠，觀察小鼠皮下腫瘤生長情況，剝離皮下腫瘤并稱重；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉移，觀察腹腔內有無腫瘤結節(jié)形成。2.重組FN多肽抑制抑制B16細胞腹腔內腫瘤結節(jié)形成的實驗上述方法收集B16黑色素瘤細胞，調整細胞濃度為lXl07ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，取上述瘤細胞懸液接種于小鼠腹腔，每只接種2X107ml細胞(0.2ml);然后隨機分成對照組和rhFN麗-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組IO只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)腹腔注射4天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)腹腔注射4天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況，第7天每組各解剖8只小鼠，觀察其腹腔腫瘤生長情況，計數腹腔內腫瘤結節(jié)數；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉移。觀察各組剩余小鼠的生活情況，觀察其腹腔腫瘤生長情況，計數腹腔內腫瘤結節(jié)數；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉移。3.重組FN多肽抑制小鼠黑色素瘤人工血行轉移的實驗上述方法收集B16黑色素瘤細胞，調整細胞濃度為lX107ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠尾部皮膚，通過小鼠尾靜脈注射1.5Xl(f瘤細胞(0.15ml);然后隨機分成對照組和rhFNHN-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組10只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)尾靜脈注射7天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)尾靜脈注射7天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況，第30天解剖未死亡小鼠，觀察其肺部腫瘤生長情況，計數肺臟腫瘤結節(jié)數。觀察心、肝、脾、腎、腹腔有無腫瘤轉移。三、統(tǒng)計學分析體外實驗均重復3次。應用SPSS13.0軟件包，采用t檢驗和卡方檢驗整理數據。(三)結果一、重組FN多肽對B16細胞粘附能力及B16細胞相關粘附基因mRNA表達的影響1.重組FN多肽對B16細胞粘附能力的影響OD值隨著FN及重組FN多肽的濃度增高而增加，FN及重組FN多肽濃度為40yg/ml時，OD值的增加達到平臺期。提示B16細胞與FN及重組FN多肽的粘附力均呈濃度依賴性；FN的ED50為23wg/ml，rhFNHN-29多肽的ED50為18ug/ml，rhFNHC-36多肽的ED50為20ug/ml，重組FN多肽的ED50和FN基本一致，提示B16細胞與rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽的粘附黏附力和FN基本一致。2.重組FN多肽對B16細胞與人工基底膜粘附力的影響OD值隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組的B16細胞與人工基質基底膜的粘附力均呈時間依賴性；在各時相內，重組FN多肽干預組B16細胞與人工基質基底膜的粘附力明顯高于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);rhFNHN-29多肽組B16細胞與人工基質基底膜的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.013.重組FN多肽對B16細胞之間粘附力的影響粘附細胞數隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組的B16細胞之間的粘附力均呈時間依賴性；在各時相內，重組FN多肽干預組B16細胞之間的粘附力明顯高于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001);rhFNHN-29多肽組B16細胞之間的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.0014.重組FN多肽對B16細胞相互間分離的影響脫落細胞數隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組脫落的B16細胞數目隨著時間的推移而逐漸增多；在各時相內，重組FN多肽干預組脫落的B16細胞數目明顯低于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);rhFNHN-29多肽組脫落的B16細胞數目和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.015.重組FN多肽對B16細胞與纖維蛋白原粘附力的影響rhFNHN-29多肽組及rhFNHC-36多肽組的0D值明顯小于對照組，提示重組FN多肽組B16細胞與纖維蛋白原的粘附力明顯低于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05);rhFNHN-29多肽組0D值和rhFNHC-36多肽組基本一致，提示rhFNHN-29多肽組B16細胞與纖維蛋白原的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.056.重組FN多肽對B16細胞相關粘附基因mRNA表達的影響從總RNA電泳圖可知，各組總RNA均顯示28S和18S清晰的兩條rRNA帶，經UV紫外分析儀分析28S和18S的比值都在1.82.O之間，說明提取的總RNA完整性較好。實驗表明重組FN多肽處理3天后，B16細胞的av、P3和FAK基因的mRNA表達受到明顯抑制。重組FN多肽干預組B16細胞相關粘附基因mRNA表達的光密度相對比值明顯低于對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示重組FN多肽對B16細胞的av、P3和FAK基因mRNA表達具有明顯的抑制作用；rhFNHN-29多肽組B16細胞相關粘附基因mRNA表達的光密度相對比值低于FNCHBD多肽，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示rhFNHN-29多肽對B16細胞的av、和FAK基因mRNA表達的抑制作用強于rhFNHC-36多肽。二、重組FN多肽對小鼠黑色素瘤細胞侵襲轉移能力的影響1.重組FN多肽對B16瘤細胞皮下生長的影響接種當天小鼠生活習性均未見明顯改變，但18天后對照組小鼠乏力、活動減少、呆滯及厭食漸明顯，死亡3只(分別死于接種后第19天、接種后第21天和接種后第23天)，解剖發(fā)現腹腔內長有大量黑色結節(jié)，其中2只小鼠可見肺臟表面長有黑色結節(jié)；重組FN多肽干預組部分小鼠出現乏力、活動減少、呆滯及厭食，rhFNHN-29多肽組于接種后第25天死亡l只小鼠，rhFNHC-36多肽組于接種后第24天死亡1只小鼠，解剖均發(fā)現腹腔內長有大量黑色結節(jié)，但未見肺臟及其他部位出現黑色結節(jié)。接種后第30天解剖各組未死亡小鼠，對照組4只小鼠腹腔內長有大量黑色結節(jié)，未見肺臟及其他部位出現黑色結節(jié)；rhFNHC-36多肽組l只小鼠腹腔內長有大量黑色結節(jié)，未見肺臟及其他部位出現黑色結節(jié)；rhFNHN-29多肽組未見17腹腔、肺臟及其他部位出現黑色結節(jié)。對照組腹腔侵襲率為70%(7/10)，rhFNHN-29多肽組為10%(1/10)，rhFNHC-36多肽組為20X(2/10)，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);對照組小鼠死亡率為30%(3/10),rhFNHN-29多肽組為10X(1/10)，rhFNHC-36多肽組為10X(1/10)，與對照組相比，差別均無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)(見圖2)。rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽均可明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長，rhFNHN-29多肽組和rhFNHC-36多肽組皮下腫瘤的平均重量明顯輕于對照組，差別均有統(tǒng)計學意義(<0.05)(見圖3)。2.重組FN多肽對B16細胞腹腔內腫瘤結節(jié)形成的影響接種當天小鼠生活習性均未見明顯改變。接種后第7天每組各解剖8只小鼠，對照組腫瘤細胞開始在腹腔內中呈侵襲性生長，腹腔內可見大量的微小黑色結節(jié)(<lmra),分布于腸系膜靜脈網及腹腔大血管周圍，肝臟、脾臟及腎臟表面可見大量黑色結節(jié)，肺臟及心臟表面未見黑色結節(jié)；而重組FN多肽干預組腫瘤細胞局限生長，腹腔內微小黑色結節(jié)明顯減少，肝臟和脾臟表面可見少量黑色結節(jié)，腎臟、肺臟及心臟表面未見黑色結節(jié)。對照組腹腔腫瘤總結節(jié)數為(106.9±12.8)個，FNN朋DrhFNHN-29多肽組為(39.9±6.4)個，抑制率達62.7%，rhFNHC-36多肽組為(48.6±11.1)個，抑制率達54.5%。重組FN多肽對〈4咖的腫瘤結節(jié)的抑制作用較強，對^4mm的腫瘤結節(jié)沒有抑制作用(表2、圖4)。12天后對照組和干預組未解剖小鼠均有明顯乏力、活動減少、呆滯、厭食表現，最終死亡，解剖后發(fā)現系腫瘤巨大或數目較多和(或)腫瘤轉移至肺或肝等而導致小鼠衰竭死亡。表2重組FN多肽對B16細胞腹腔內腫瘤結節(jié)形成的影響組別鼠數腹腔腫瘤結節(jié)數目〈lrarn1_4咖》4,總數對照組1075.2±5.828.1±8.73.6±1.9106.9±12.8rhFNHC-36多肽組1032.0±7.014.2±5,12.4±1.748.6±11,1rh卿N-29多肽組1016.6±5.321.5±2.71.8±0.739.9±6.43.重組FN多肽對小鼠黑色素瘤人工血行轉移的影響接種后1一3小時，l只小鼠出現活動減少和暈厥樣表現，后漸好轉。15天后對照組小鼠乏力、活動減少、呆滯及厭食漸明顯，死亡8只(其中接種后第15天死亡3只小鼠，接種后第19天死亡1只小鼠，接種后第27天死亡4只小鼠)，解剖發(fā)現肺臟表面長滿黑色結節(jié)和(或)肝臟等腹腔部位長有黑色結節(jié)；rhFNHN-29多肽組部分小鼠出現乏力、活動減少、呆滯及厭食，死亡5只(其中接種后第25天死亡3只小鼠，接種后第27天死亡2只小鼠)，解剖發(fā)現肺臟表面局部長有黑色結節(jié)(其中l(wèi)只小鼠左肺及右肺前葉、中葉、后葉、心葉均長有黑色結節(jié)，2只小鼠右肺前葉、中葉、后葉均長有黑色結節(jié)，2只小鼠左肺長有黑色結節(jié))，其他部位未見黑色結節(jié)；rhFNHC-36多肽組部分小鼠出現乏力、活動減少、呆滯及厭食，死亡4只(均在接種后第27天死亡)，解剖發(fā)現肺臟表面局部長有腫瘤結節(jié)(其中l(wèi)只小鼠左肺及右肺前葉、中葉、后葉、心葉均長有黑色結節(jié)，l只小鼠右肺前葉、中葉、后葉均長有黑色結節(jié)，2只小鼠左肺長有黑色結節(jié))，其他部位未見黑色結節(jié)。接種后第30天解剖各組未死亡小鼠，對照組小鼠肺臟表面均長滿黑色結節(jié)，未見腹腔及其他部位長有黑色結節(jié)，rhFNHN-29多肽組和rhFNHC-36多肽組小鼠肺臟表面未見明顯的黑色結節(jié)。對照組小鼠黑色素瘤肺轉移率為100%(10/10)，rhFNHN-29多肽組為50%(5/10)，rhFNHC-36多肽組為404/10)，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組肺臟腫瘤結節(jié)平均數目為(96.4±4.6)/只，rhFNHN-29多肽組為(20.5±19.6)/只，rhFNHC-36多肽組為(19.1±25.6)/只，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);對照組小鼠死亡率為80%(8/10)，rhFNHN-29多肽組為50%(5/10)，rhFNHC-36多肽組為40%(4/10)，與對照組相比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖5)。(四)結論1、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤細胞皮下生長，減弱皮下腫瘤腹腔侵襲的能力。2、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤細胞在腹腔形成微小腫瘤結節(jié)的能力。3、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制小鼠黑色素瘤人工血行轉移的能力。4、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽通過影響整合素ave3的功能起到抑制腫瘤侵襲轉移的作用。因而，重組FN肝素結合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用。參考文獻1、高進，章靜波主編.癌的侵襲與轉移一基礎與臨床.北京:科學出版社.2003.5:236-239權利要求1、一種重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結合域多肽，其特征在于在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組FN肝素結合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中應用，由FN分子中N端的五個I型同源結構組成，含有從Ser46-Gly282的237個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長711bp，PCR擴增片斷長741bp，雙酶切后片斷長729bp；由酵母表達的多肽分子量為28.52kDa。由FN分子中的III-12、III-13、III-14三個III型同源結構組成，含有從Tyr1720-Tyr1991的272個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長816bp，PCR擴增片斷長835bp，雙酶切后片斷長828bp，由酵母表達的多肽分子量為36.09kDa。經試驗證明本發(fā)明能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉移的藥物中得到應用。文檔編號A61P35/00GK101596307SQ20081007117公開日2009年12月9日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權日2008年6月5日發(fā)明者鄒起練,陳元仲,陳顯凌,濤黃申請人:福建醫(yī)科大學附屬協和醫(yī)院