專利名稱：一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于預(yù)防家禽傳染病的疫苗，具體地講涉及一種雞傳染性法氏囊三 聯(lián)滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
雞新城疫俗稱"雞瘟"，是由雞新城疫病毒引起的一種高度接觸性傳染病。主
要經(jīng)呼吸道和消化道感染，各種年齡的雞均可感染，以雛雞最為嚴(yán)重發(fā)病率和
死亡率可達(dá)80%以上。雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起雞的一
種急性、高度接觸性呼吸道疾病，傳播途徑主要是經(jīng)呼吸道感染；發(fā)病多集中
在冬、春季；6周齡死亡率高，可達(dá)20%左右。傳染性法氏囊病(IBD)是一種
急性高度接觸性傳染病，是由雙鏈核糖核酸病毒(IBDV)引起的，能引起雛雞
免疫抑制，破壞法氏囊中B淋巴細(xì)胞的形成，臨床上以法氏囊腫大、腎損害為
主要特征。雛雞或中雛易感性最強(qiáng)，感染率可達(dá)100%,死亡率比較高，嚴(yán)重影
響?zhàn)B雞業(yè)的發(fā)展。為此開(kāi)發(fā)了雞新城疫、傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊三
聯(lián)滅活疫苗，該疫苗具有使用簡(jiǎn)便，接種程序簡(jiǎn)單，減少疫苗的免疫次數(shù)，避
免家禽產(chǎn)生不必要的應(yīng)激。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明公開(kāi)了 一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗 的制備方法，主要預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病的發(fā)生， 工藝方法簡(jiǎn)單，免疫效果優(yōu)良，使用安全，易于保存的優(yōu)點(diǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案-
所述一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下 ①、生產(chǎn)用毒種的制備將NDVLaSota株毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋，將IBVM"株毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲; 選取雞傳染性法氏囊CL01株毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋后接種在已長(zhǎng)成良好 單層的雞胚成纖維細(xì)胞，孵育，收獲；
② 、制苗用病毒液的制備:將NDV La Sota株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水作10—4 稀釋，將IBV Mw株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，同時(shí)接種同一枚易感 雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊CL01株生產(chǎn)毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋， 接種在已長(zhǎng)成良好單層的雞胚成纖維細(xì)胞，孵育，凍融1次后收獲；將收獲后 的NDV La Sota株和IBV N^病毒液分別濃縮3倍，將收獲后的IBDV CL01病毒 液濃縮6倍，滅活；
③ 、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CLOl株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液97 99份(體積份)，吐溫-80 1~3份(體積份)，混合制成水相備用；
④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa磅壓力滅菌后制成油相；將水 相與油相混合，混合之比為1:1.5~2.5 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯(lián) 滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫(kù)。
所述對(duì)病毒液濃縮是指將三種制苗用病毒胚液從冰箱取出，融化后分別在 無(wú)菌條件下用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網(wǎng)的無(wú)菌漏斗濾過(guò)，除去雞 胚液和大的細(xì)胞殘?jiān)捌渌诸w粒雜質(zhì)；然后將粗濾的三種病毒液分別倒入濃 縮裝置的儲(chǔ)缸內(nèi)，反復(fù)過(guò)濾至濃縮后的病毒液達(dá)到設(shè)計(jì)的濃縮終點(diǎn)為止。
所述滅活是指NDV La Sota病毒液采用0. 05 0. 15%甲醛溶液，35 38'C滅 活12 17小時(shí)，IBVM"病毒液采用2-8'C低溫滅活120-145小時(shí)，可使病毒徹底 滅活，而且不影響其免疫原性。本發(fā)明所用的NDV LaSota株毒種、IBV Mu株毒種、雞傳染性法氏囊CLOl 株毒種均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
所述對(duì)成品檢驗(yàn)采用血清學(xué)的方法判定效力，比常規(guī)的攻毒檢測(cè)方法更為 準(zhǔn)確結(jié)果更可靠，使三種抗原間的免疫干擾問(wèn)題得到了很好的解決，采用血清 學(xué)的方法判定步驟方法，具體方法為取一月齡易感雞15只，其中10只各頸 部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接種，作為對(duì)照，21日后采血，分離血清，用 傳染性支氣管炎抗原測(cè)定HI抗體。
由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性-
本發(fā)明在生產(chǎn)工藝中獨(dú)創(chuàng)的將兩種毒珠液同時(shí)接種同一雞胚的方法比起兩 種毒珠液分別接種雞胚,節(jié)省了雞胚的使用數(shù)量，減少了疫苗生產(chǎn)的操作步驟， 避免了毒種污染機(jī)會(huì)，而且省去了疫苗制作中的濃縮環(huán)節(jié)，節(jié)省時(shí)間，提高效率。
本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)最終找到了二種病毒液最佳的接種比例，并解決了兩 種病毒之間的互相干擾問(wèn)題.使一次接種代替以往的二次接種，收獲和滅活也改 兩次完成為一次完成，節(jié)省了生產(chǎn)成本，縮短了生產(chǎn)周期。
本發(fā)明的三聯(lián)滅活疫苗可以簡(jiǎn)化接種程序，使用劑量與單苗相當(dāng)，但其效 力與單苗相同，從而減少接種動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的次數(shù)，此外對(duì)于產(chǎn)蛋雞，尤其是 種雞應(yīng)盡可能避免或減少在產(chǎn)蛋期間做免疫接種，達(dá)到事半功倍的效果。
本發(fā)明采用了纖維膜超濾濃縮法，可提高免疫抗原在疫苗終產(chǎn)品的濃度達(dá)3 倍以上。纖維膜超濾濃縮裝置，設(shè)有二級(jí)孔徑不同的纖維濾柱。 一級(jí)濾柱的纖 維可濾除部分細(xì)菌和雜質(zhì)。二級(jí)超濾株的中空纖維可截留病毒粒子。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①、生產(chǎn)用毒種的制備將NDVLaSota株毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋， 將IBVM"株毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲; 選取雞傳染性法氏囊CLOl株毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋后接種在已長(zhǎng)成良好 單層的雞胚成纖維細(xì)胞，孵育，收獲；②、制苗用病毒液的制備:將NDVLaSota 株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋，將IBV M"株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水 作10—3稀釋，同時(shí)接種同一枚9~10日齡易感雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊 CL01株生產(chǎn)毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋，接種在已長(zhǎng)成良好單層的雞胚成纖 維細(xì)胞，孵育，凍融1次后將病毒胚液從冰箱取出，融化后分別在無(wú)菌條件下 用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網(wǎng)的無(wú)菌漏斗濾過(guò)，除去雞胚液和大的 細(xì)胞殘?jiān)捌渌诸w粒雜質(zhì)；然后將粗濾的三種病毒液分別倒入濃縮裝置的儲(chǔ) 缸內(nèi)，反復(fù)過(guò)濾至濃縮，使NDVLa Sota株和IBV M"病毒液分別濃縮3倍，將 IBDV CL01病毒液濃縮6倍；然后對(duì)NDV La Sota病毒液采用0. 1%甲醛溶液， 37""C滅活16小時(shí)；對(duì)IBV Mw病毒液采用4""C低溫滅活144小時(shí)，可使病毒徹底 滅活，而且不影響其免疫原性；③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病 毒液1份(體積份)，IBV M^株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1 份(體積份)，混合均勻，取混合病毒液97份(體積份)，吐溫-80 3份(體積 份)，混合制成水相備用；④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、 硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后 制成油相；將水相與油相混合，混合之比為1:1.5 —起乳化，即制得雞傳染性 法氏囊三聯(lián)滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫(kù)。
實(shí)施例2:
一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下 其制備步驟①、步驟②同實(shí)施例1制備步驟①、步驟②；步驟③、④改為③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液l份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CLOl株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液98份(體積份)，吐溫-80 2份(體積份)，混合制成水相備用；
、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:2.0 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫 苗；后分裝，貼簽,裝箱，入庫(kù)。
實(shí)施例3:
一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
其制備步驟①、步驟②同實(shí)施例1制備步驟①、步驟②；步驟③、④改為
③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液99份(體積份)，吐溫-80 l份(體積份)，混合制成水相備用；
、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:2.5 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫 苗；后分裝，貼簽,裝箱，入庫(kù)。
權(quán)利要求
1、一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征是其制備步驟如下①、生產(chǎn)用毒種的制備將NDV La Sota株毒種用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，將IBV M41株毒種用滅菌生理鹽水作10-3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲；選取雞傳染性法氏囊CL01株毒種用滅菌的PBS作10-2稀釋后接種在已長(zhǎng)成良好單層的雞胚成纖維細(xì)胞，孵育，收獲；②、制苗用病毒液的制備將NDV La Sota株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，將IBV M41株生產(chǎn)毒種用滅菌生理鹽水作10-3稀釋，同時(shí)接種同一枚易感雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊CL01株生產(chǎn)毒種用滅菌的PBS作10-2稀釋，接種在已長(zhǎng)成良好單層的雞胚成纖維細(xì)胞，孵育，凍融1次后收獲；將收獲后的NDV La Sota株和IBV M41病毒液分別濃縮3倍，將收獲后的IBDV CL01病毒液濃縮6倍，滅活；③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取混合病毒液97～99份(體積份)，吐溫-801～3份(體積份)，混合制成水相備用；④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，混合后加溫至121℃、103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～2.5一起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫(kù)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法， 其特征是所述對(duì)病毒液濃縮是指將三種制苗用病毒胚液從冰箱取出，融化后 分別在無(wú)菌條件下用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網(wǎng)的無(wú)菌漏斗濾過(guò)， 除去雞胚液和大的細(xì)胞殘?jiān)捌渌诸w粒雜質(zhì)；然后將粗濾的三種病毒液分別 倒入濃縮裝置的儲(chǔ)缸內(nèi)，反復(fù)過(guò)濾濃縮。
全文摘要
一種雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①生產(chǎn)用毒種的制備②制苗用病毒液的制備③取滅活濃縮后的制苗用NDV LaSota株病毒液1份，IBV M₄₁株病毒液1份、IBDV CL01株病毒液1份，混合均勻，取混合病毒液97～99份(體積份)，吐溫-80 1～3份(體積份)，混合制成水相備用；④用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～2.5一起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗；該疫苗具一次接種代替以往的二次接種，節(jié)省了生產(chǎn)成本，縮短了生產(chǎn)周期等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101607085SQ20081005004
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者喬榮岑, 習(xí)向鋒, 孫進(jìn)忠, 榮駿弓 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司