專利名稱：：Exendin4多肽片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及Exendin4截短的多肽片段，該多肽具有降低血糖的作用，可用于治療II型糖尿病。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?00510040823.8(Exendin4多肽片段，申請(qǐng)日2005.6.29)的分案申請(qǐng)。由于現(xiàn)代的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式，世界各國(guó)糖尿病患者人數(shù)逐年增多，目前中國(guó)有5000萬患者，印度有6000萬，美國(guó)有1800萬，日本有600萬。糖尿病分為兩種，胰島素依賴型糖尿病(I型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(II型糖尿病)，其中11型糖尿病占糖尿病患者的卯％以上。II型糖尿病患者表現(xiàn)了許多特征，如餐后胰島素分泌量不足、胰島素分泌時(shí)間滯后、高血糖等。肥胖II型糖尿病患者周邊細(xì)胞胰島素受體敏感性降低，從而產(chǎn)生血糖高、血液中胰島素水平也高的情況，糖化血紅蛋白HbAlc在8%以上(健康人為4-6%)。接著就會(huì)產(chǎn)生糖尿病并發(fā)癥，如心臟病及腎功能衰退等。降低血糖水平就成為有效治療II型糖尿病的關(guān)鍵。如今，控制糖尿病有六大類藥物，包括促胰島素分泌類磺酰脲類和melitioneds，非促胰島素分泌藥物胰島素，a-葡萄糖苷酶抑制劑，雙胍類及Thioagolinediones。然而，根據(jù)英國(guó)UKPDS對(duì)數(shù)千名1I型糖尿病患者的6年跟蹤研究報(bào)告，上述六類藥物對(duì)II型糖尿病患者皆無能為力，不能遏制胰臟e細(xì)胞不斷進(jìn)行性的惡化，不能降低HbAlc水平，也不能阻止糖尿病的并發(fā)癥如心臟病、腎衰竭的發(fā)生。因此需要研究新的II型糖尿病治療藥物。1995年，美國(guó)專利第5424286號(hào)公開了一種從南美產(chǎn)巨蜥蜴(Gilamonster,HelodeSuspectum)的唾液中分離的Exendin4多肽。該肽由39個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)與腸激素胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)在氨基酸序列上有40%的同源性。研究表明，Exendin4作為GLP-1的類似物能夠與GLP-1的受體相結(jié)合。Exendin4能促進(jìn)胰島素原的合成，促胰島素分泌，能降低血糖，當(dāng)血糖正常之后不再持續(xù)作用，因而不產(chǎn)生低血糖昏迷、休克，安全有效。它能降低HbAic，增加e細(xì)胞量，增加II型糖尿病患者胰島素受體敏感性，抑制胰高血糖素分泌等作用。2005年4月，商品名Byetta的Exendin4獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。(參見Diabetes(1997)處433-439;ibid(1995)必1249-1258;Ibid(2002)2796-2803;Ibid(1994)2397-2403;DiabetesCare(2002)21330-336;Ibid(2000)2164-69;ibid(2004)2_2623-2635;JAMA(2002)巡373-379;N.Engl.J.Med.(2002)巡393-436;Lanced(1998)M2837-853;DiabetesEndocrinology(2005)巡(4)2069-2070;J.Clin.EndocrinologyMetab(2004)3469-3473.)許多研究人員積極對(duì)Exendin4肽進(jìn)行改造，以期望獲得可供更多選擇的、更有效的、更方便生產(chǎn)的Exendin4變體。CN1227567A公開了一種截短的Exendin4肽，其由30個(gè)氨基酸殘基組成，C末端為Arg或Tyr。美國(guó)禮來公司研究了一系列GLP-1類似物，其能長(zhǎng)期安全地用于治療糖尿病(參見WO02047716A)。而且，這些結(jié)果都是離體實(shí)驗(yàn)得到的，以GLP-1受體結(jié)合能力的大小、促胰島瘤細(xì)胞分泌胰島素的多少和cAMP的形成量來評(píng)價(jià)，具有局限性(參見J.Biol.Chem(1997)21221201-21206;RegulatoryPeptides(2003)Hi153-158;TrendinPharmacologicalSci.(2003)24377-383;WO03011892A)。為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明人經(jīng)過艱苦的努力，獲得了一種新的C端截短的并且C末端為Pro的Exendin4多肽片段。令人驚訝的是，具有這種結(jié)構(gòu)的多肽不但縮短了Exendin4肽約1/4的肽鏈長(zhǎng)度，大大方便了生產(chǎn)實(shí)踐，為治療糖尿病提供了一種新選擇，而且這種肽能有效地抵抗羧肽酶的作用，持久地保持降血糖的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一個(gè)方面提供了具有式(I)結(jié)構(gòu)的Exendin4多肽片段及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯HGEGTX,TSDLSKQX2EEEAVX3LFIEWLKNGX4PXs(I)其中，表示Phe或Tyr，X2表示Met、lie或Leu,X3表示Lys，X4表示Gly或缺失，X5表示Arg或缺失。式(I)中Exendin4多肽片段第6位的氨基酸殘基(X!)優(yōu)選為Tyr。鑒于藥代動(dòng)力學(xué)研究的方便，將分子中的一個(gè)Phe換成Tyr，有利于125碘的標(biāo)記。式(I)中Exendin4多肽片段第14位的氨基酸殘基(X2)可以是Met、Ile或Leu中任意一個(gè)，優(yōu)選為Met。式(I)中Exendin4多肽片段第30位的氨基酸殘基(X4)優(yōu)選缺失。更優(yōu)選的多肽片段為:Xi是Tyr，X2是Met，Xs是Lys，X4缺失,Xs表示Arg或缺失。在本文中，"本發(fā)明的Exendin4多肽片段"指的是本發(fā)明中截?cái)嗟腅xendin4多肽，其具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)。在本文中，這種多肽可以簡(jiǎn)稱為"E4(f)"、"多肽片段"或"本發(fā)明的多肽"。式(I)多肽的N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)可以不進(jìn)行修飾，也可以在基本上不影響本發(fā)明多肽的活性的前提下進(jìn)行修飾，如形成"藥學(xué)上可接受的酯"。對(duì)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括但不限于賴氨酸e-氨基基團(tuán)的?；?，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷的脫?；饔谩末端氨基基團(tuán)的修飾包括但不限于脫-氨基、N-低級(jí)烷基、N-二低級(jí)烷基和N-?；揎?。C末端羧基基團(tuán)的修飾包括但不限于酰胺、低級(jí)垸基酰胺、二垸基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。優(yōu)選末端基團(tuán)用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的保護(hù)性基團(tuán)保護(hù)起來，如乙?；?、三氟乙酰基、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C,.6烷基、C2.8烯基、C7.9芳垸基等。本發(fā)明優(yōu)選不對(duì)式(I)多肽N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，即N末端的化學(xué)基團(tuán)仍舊為第一個(gè)氨基酸(His)上的ci-氨基(-NH2)，C末端的化學(xué)基團(tuán)是C末端Pro的羧基(-COOH)。本發(fā)明也優(yōu)選對(duì)C末端Pro的羧基進(jìn)行酰氨化，即是-CONH2。本文中所使用的多肽及氨基酸和化學(xué)基團(tuán)的表示方法均為所屬領(lǐng)域公認(rèn)的表示方法。其中氨基酸的縮寫可參照表1中定義。在本文中，若不特別指出，氨基酸一般指L-型的氨基酸。表1氨基酸縮寫表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>"藥學(xué)上可接受的鹽"指一些小分子酸性或堿性化合物與多肽形成的鹽，一般能夠增加多肽的溶解性，所形成的鹽基本上不改變多肽的活性。例如，通常能與本發(fā)明多肽形成鹽的酸有鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、馬來酸、檸檬酸等；能與本發(fā)明多肽形成鹽的堿有堿金屬或堿土金屬的氫氧化物、銨、碳酸鹽等。本發(fā)明多肽的降糖作用可以通過所屬領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證，如細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，為了克服離體實(shí)驗(yàn)的局限性，優(yōu)選通過糖尿病動(dòng)物模型來鑒定多肽的降糖作用。如db/dbll型糖尿病小鼠、GotoKokizakiII型糖尿病大鼠、KK糖尿病小鼠、四氧嘧啶(alloxan)人工誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠。通過這些動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所涉及的式(I)Exendin4多肽片段都具有持續(xù)的體內(nèi)降糖作用，能夠用于糖尿病的治療。因此，本發(fā)明的另一方面提供了含有上述具有式(I)結(jié)構(gòu)的Exendin4多肽片段的藥物組合物，其可以用于治療糖尿病，尤其是治療II型糖尿病。該組合物可以含有本發(fā)明的Exendin4多肽片段中的一種或多種，優(yōu)選僅含一種Exendin4多肽片段。該組合物可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膜劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋設(shè)形式)、粉劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑和乳液劑、消毒的注射用溶液或懸浮液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、針劑、自動(dòng)注射裝置或栓劑。例如，以片劑或膠囊口服給藥，上述活性藥物組分可以與一種口服的無毒的藥物學(xué)可接受的惰性載體組合在一起，如乙醇，甘油，水或其組合。WO2004035754A和WO2004036186A分別公開了一種可用于包括Exendin4多肽的緩釋劑型，本發(fā)明式(I)的活性多肽優(yōu)選使用這種劑型(WO2004035754A和WO2004036186A的全文納入本文參考)。本發(fā)明還提供了上述化合物或藥物組合物在制備治療糖尿病的藥物中的用途，優(yōu)選用于治療II型糖尿病。本發(fā)明的藥物組合物可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥方式來進(jìn)行給藥，例如口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥。本發(fā)明的的藥物組合物優(yōu)選胃腸道外給藥，如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。本發(fā)明的藥物能夠調(diào)節(jié)胰島素從而持久地保持血糖水平。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時(shí)間以及治療對(duì)象的情況而有所變化，實(shí)際治療所需的量可以由醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對(duì)于一般的成人，每日需要給藥0.1-100昭的量，優(yōu)選l-20嗎的范圍內(nèi)，更優(yōu)選5-10嗎。劑量也可以參考已經(jīng)商品化的exendin-4多肽藥品的劑量來確定。另外，本發(fā)明還提供了一種化學(xué)合成上述多肽的方法。通過化學(xué)方法合成已知結(jié)構(gòu)的多肽對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。詳細(xì)的方案可參照以下文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行，如用固相法合成多肽可參考J.M.Steward和J.D.Young的《SolidPhasePeptideSynthesis》，第二版(PierceChemicalCo.,Rockford,IUinois(1984))禾口J.Meienhofer的《HormonalProteinsandPeptides》，第2巻(AcademicPress,紐約(1973));用液相法合成多肽可參考E.Schroder和K.Lubke的《ThePeptides》，第1巻(AcademicPress,紐約(1965))(這些文獻(xiàn)的全文納入本文參考)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，優(yōu)選通過固相法合成本發(fā)明的多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種編碼具有式(II)序列的多肽的核酸HGEGTX!TSDLSKQX2EEEAVX3LFIEWLKNGX4PX5(II)其中，Xj表示Phe或Tyr，X2表示Met、lie或Leu，X3表示Lys，X4表示Gly或缺失，Xs表示Arg或缺失。E4(f)多肽片段的基因采用E.Coli的偏好密碼子。例如，如果用大腸桿菌表達(dá)該編碼本發(fā)明多肽的核酸，則該核酸的密碼子優(yōu)選是大腸桿菌的偏好密碼子。本發(fā)明還提供了一種用基因工程方法制備上述多肽的方法。該方法包括a),發(fā)酵能表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞；b)，分離提純表達(dá)產(chǎn)物。該方法可進(jìn)一步包括裂解所述表達(dá)產(chǎn)物的步驟?；蚬こ谭椒ㄉa(chǎn)中等程度多肽(20-60個(gè)氨基酸殘基)時(shí)，由于表達(dá)水平低，并且表達(dá)之后容易降解，所以，一般是將多肽基因連結(jié)在載體蛋白上，以融合蛋白方式進(jìn)行表達(dá)，然后以化學(xué)或酶的方法將融合蛋白裂解，分離，純化得到目的多肽。這種方法產(chǎn)量低，工藝繁雜。另一種方法是根據(jù)多肽的氨基酸序列，將表達(dá)基因多個(gè)串聯(lián)起來，用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子進(jìn)行表達(dá)，然后將串聯(lián)多肽裂解，制備目的多肽。用這種方法已經(jīng)有許多成功生產(chǎn)多肽的例子，如生產(chǎn)人胰島素(Proc，Natl，Acad，Sci，USA，1984M4627-4631)、降鈣素(JP62-226998)、GLP-1(W095/17510)。這種方法產(chǎn)量高。本發(fā)明優(yōu)選采用上述基因串聯(lián)方法表達(dá)本發(fā)明的多肽。在串聯(lián)多肽裂解方面，可以使用所屬領(lǐng)域的常用方法，如將Lys殘基用擰康酸酐(CitraconicAnhydride)保護(hù)后，用胰蛋白酶從串聯(lián)多肽中間的Arg處將肽鏈切斷，再經(jīng)酸處理脫去檸康酸(Citraconicacid)基團(tuán)(參見J.D.Baxter.等，Nature1980456-461;JP62-226998)。如圖1所示，在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，該方法可以包括a)，發(fā)酵能表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)菌細(xì)胞；b)，收集菌體；C),破碎細(xì)胞；d)，提取串聯(lián)多肽；e)，對(duì)獲得的多肽進(jìn)行復(fù)性；f)，裂解；g),用高壓液相層析提純最終的多肽產(chǎn)品。由于多肽類(20-60個(gè)氨基酸殘基)的基因工程表達(dá)必須與載體蛋白質(zhì)連結(jié)，否則得不到表達(dá)產(chǎn)物，一個(gè)融合蛋白質(zhì)分子中只有一個(gè)多肽分子，約占融合蛋白質(zhì)分子的十分之一，產(chǎn)量很低，這樣的融合蛋白質(zhì)裂解后多肽的種類很多，目的多肽分離純化困難。本發(fā)明將使多個(gè)多肽基串聯(lián)后進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子中全部都是目的多肽，裂解后多肽的種類單一，產(chǎn)量為前者的十倍以上，并且分離純化容易。本發(fā)明的X3為L(zhǎng)yr，融合蛋白裂解時(shí)只切斷串聯(lián)分子中間的Arg，這樣就保持E4(f)分子的完整。E4(f)C-端為Pro抵抗羧肽酶A、B的作用，有利于保持分子的穩(wěn)定性。E4(f)Arg作為E4(f)的中間體，事實(shí)上E4(f)Arg在血液中迅速被羧肽酶B類水解除去形成E4(f)，二者皆可應(yīng)用。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多修改對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。另外，本申請(qǐng)引用的所有參考文獻(xiàn)都納入本文參考。圖1.用基因工程法發(fā)酵生產(chǎn)Exendin4多肽片段的生產(chǎn)工藝流程。圖2.Exendin4多肽片段的持續(xù)降血糖作用與Exendin4的比較。圖3.Exendin4多肽片段對(duì)db/dbll型糖尿病小鼠的降血糖作用。圖4.Exendin4多肽片段對(duì)GotoKokizakiII型糖尿病大鼠的餐后降血糖作用。曲線l表示空白對(duì)照組，曲線2表示給藥組。圖5.Exendin4多肽片段對(duì)四氧嘧啶(alloxan)人工糖尿病模型小鼠的降血糖作用。圖6.Exendin4多肽片段的促胰島素分泌作用。線條1表示給藥組，線條2表示空白對(duì)照組。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1固相合成Exendin4變體多肽在購(gòu)自MultiSynTech公司的多重自動(dòng)肽合成儀SyRoII上通過固相方法合成。氨基酸的a氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)；并對(duì)氨基酸進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)對(duì)Asp、Glu、Ser及Thr的側(cè)鏈保護(hù)基為叔丁基，對(duì)Asn、Gln及His的為三苯甲基(Trt)，對(duì)Lys及Trp為叔丁氧羰基(Boc)，對(duì)Arg為2，2，5,7，8,-5-甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)。以1^,^[-二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑作為活化試劑，使保護(hù)的氨基酸依次偶聯(lián)，偶聯(lián)每次40分鐘。在15%乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(1:1:lv/v/v)存在的情況下，肽與三氟乙酸(85%)在室溫反應(yīng)120分鐘，從而從聚合體支持物上切割下來，同時(shí)脫除保護(hù)基。接著用無水乙醚沉淀肽，然后用無水乙醚多次洗滌，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(1:l)中沉淀，冷凍干燥，得到粗肽。粗肽在30分鐘內(nèi)以反向HPLC純化，以37-42%乙晴/0.9XTFA梯度進(jìn)行。洗脫液濃縮，凍干，得到純度》97%的白色固體。實(shí)施例2Exendin4變體多肽的基因工程生產(chǎn)工藝1),化學(xué)合成以下4個(gè)基因片段(博彩生物公司):(1)5，AATTCCAGATCTATGCGTCACGGCGAAGGCACCTACACCAGCCATCTGAGCAAACAG(2)5'ATGGAAGAAGAAGCGGTTAAACTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGCGTGGATCCTAG;(3)5,TCGCTAGGATCCACGCGGGCCGCCGTTTTTCAGCCATTCGATGAACAGTTTAAC:CGCTTCTTCT;(4)5,TCCATCTGTTTGCTCAGATCGCTGGTGATGGTGCCTTCGCCGTGACGCATAGATCTGG。2)，連接基因片段-將四個(gè)合成的基因片段(A26加n^2)(1)、(2)、(3)、(4)中各加水5(^1，取(l)、(4)各2^1混合于一支試管中，另一支加(2)、(3)各2^1混合。加10X多聚核苷酸激酶緩沖液lfil、ATP(0.1mol/L)及T4噬菌體多聚核苷酸激酶1^1，37'C保溫30分鐘，然后在水浴中95°C維持5分鐘。降至室溫，將二支試管的內(nèi)容物混合，加10X連接酶緩沖液2pl、ATP(O.lmol/L)lnl及T4連接酶2^1。于16'C保持12小時(shí)。然后用DNA分離試劑盒(博彩生物公司，promega公司)分離連接的片段，然后DNA片段用EcoRI、Sall雙酶切，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)驗(yàn)證。3)，克隆取質(zhì)粒pUC18(博彩生物公司)l嗎，力tU0X內(nèi)切酶緩沖液1^1，加EcoRI、Sall各1^1。37"C維持30分鐘，用氯仿-酚試劑處理，離心取水層，再用氯仿洗滌一次，離心除去氯仿后加60%異丙醇沉淀，離心，干燥備用。將步驟2)中獲得的EcoRI、SalI雙酶切的DNA片段加入到上述雙酶切的質(zhì)粒中，力卩IOX連接酶緩沖液1^1、ATPlpl及T4連接酶2^1，于16i:維持12小時(shí)。將EcoliJM109按常規(guī)方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將上述連接的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒。4)，串連將步驟3)獲得的克隆了變體多肽基因的質(zhì)粒經(jīng)BglII+SalI雙酶解，提取含有變體多肽的DNA基因片段。另外將步驟3)獲得的質(zhì)粒用BamHI+SalI雙酶解，然后與含有變體多肽的DNA基因片段相連接，得含有二個(gè)變體多肽串聯(lián)基因片段的質(zhì)粒。繼續(xù)將含二個(gè)串連的變體多肽基因片段的質(zhì)粒經(jīng)過BglII+SalI雙酶切，得2個(gè)基因串連的片段，含二個(gè)串聯(lián)基因的質(zhì)粒經(jīng)BamHI+SalI雙酶切后再與這2個(gè)基因串聯(lián)的片段連接形成4個(gè)基因串連的質(zhì)粒。如此繼續(xù)可得8個(gè)串聯(lián)基因或16、32個(gè)基因串聯(lián)的質(zhì)粒。5)，轉(zhuǎn)化將克隆變體多肽的質(zhì)粒在冰浴中與感受態(tài)EcoliJM109混合，在冰浴中維持30分鐘，移至42'C水浴中保持2分鐘，冰浴中冷卻，涂板(含1%瓊脂糖，50嗎氨芐青霉素/ml)，37°C過夜。挑取菌落，轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)液搖瓶中(含50嗎氨芐青霉素/ml)，37'C振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)液0.7ml加50%甘油(無菌)0.31111，充分混含，保在于-85t)冰箱中備用。6)，發(fā)酵生產(chǎn)變體多肽的工藝發(fā)酵生產(chǎn)工藝如圖1所示。首先，LB培養(yǎng)液1000ml(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCI10g)于12(TC滅菌30分鐘，冷卻后加入氨芐青霉素(最終濃度達(dá)到100pg/ml)，接種步驟5)獲得的貯藏的甘油管lml，37'C振蕩培養(yǎng)過夜。5000rpm離心收集菌體，低溫-35'C凍結(jié)，融化后，加6M鹽酸胍，均漿提取串聯(lián)多肽，18000rpm離心收集上清液。將此上清液以緩沖液(10mMpH7.2磷酸緩沖液，0.1%巰乙醇)透析復(fù)性。離心分離串聯(lián)多肽。然后按J.D.Baxter等的方法(Nature1980456-461)進(jìn)行裂解，即將串聯(lián)多肽溶于水中，加Na2C03粉末，維持PH8.5，滴加檸康酸酐使包涵體(InclusionBody)完全溶解，維持pH8.5,室溫繼續(xù)攪拌2小時(shí)，然后，加胰蛋白酶及羧肽酶B。37'C保持2小時(shí)，得多肽，然后加3N鹽酸調(diào)至pH3，攪拌4小時(shí)，脫去檸康酸保護(hù)基，全過程以HPLC進(jìn)行監(jiān)控，最后得純化的本發(fā)明的Exendiri4多肽片段。實(shí)施例3Exendin4多肽片段的持續(xù)降血糖作用取體重50g的KKII型糖尿病小鼠(中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心)，禁食2小時(shí)，分成四組，兩組注射Exendin4，另兩組注射本發(fā)明的Exendin4多肽片段(簡(jiǎn)稱E4(f))各2嗎，于0，30分，l小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)，6小時(shí)分別取20nl血液后用血糖測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海生物制品研究所)測(cè)定持續(xù)降血糖作用。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例4Exendin4多肽片段對(duì)db/dbII型糖尿病小鼠的降血糖作用取體重50g的db/dbII型糖尿病小鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心和揚(yáng)州大學(xué))，禁食2小時(shí)，皮下注射Exendin4多肽片段2嗎，分別于0,30，60，120分鐘各取血2(Hd，以血糖測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海生物制品研究所)測(cè)定持續(xù)降血糖效果。結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例5Exendin4多肽片段對(duì)GotoKokizakiII型糖尿病大鼠的餐后降血糖作用取5個(gè)月齡的體重470g的GotoKokizaki糖尿病大鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心)，禁食2小時(shí)，腹腔注射20%葡萄糖lml，皮下注射Exendin4多肽片段5tig，對(duì)照組只注射葡萄糖。分別于0,30，60，120，分鐘各取血20nl，以血糖測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海生物制品研究所)測(cè)定其餐后耐糖。結(jié)果如圖4所示，注射了Exendin4多肽片段的給藥組的血糖始終維持在較低水平上，顯著區(qū)別于沒有給藥的對(duì)照組。曲線l表示空白對(duì)照組，曲線2表示給藥組。實(shí)施例5Exendin4多肽片段對(duì)四氧嘧啶(alloxan)人工糖尿病模型小鼠的降血糖作用取8周齡體重20g的小白鼠，分成五組，通過尾靜脈注射四氧嘧啶(16mg/ml)O.lml，48小時(shí)后，皮下注射Exendin4變體多肽片段2嗎，分別于0，30，60，120分鐘各取血20W，以血糖測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海生物制品研究所)測(cè)定降血糖作用。五組均顯示了良好的降血糖效果，結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例6，Exendin4多肽片段促胰島素的分泌作用取6個(gè)月齡、體重470g的GotoKokizakiII大鼠，皮下注射Exendin4多肽片段5嗎，對(duì)照組只注射生理鹽水，于0，3,5，10，15，30，45分鐘取血20^1，應(yīng)用ELISA試劑盒(Di肌osticSystemlab.Imc.(U.S.A))測(cè)定促胰島素的分泌作用。結(jié)果如圖6所示，注射了Exendin4多肽片段的給藥組恢復(fù)了第一相的胰島素分泌作用。權(quán)利要求1.具有式(I)結(jié)構(gòu)的多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽或酯HGEGTX1TSDLSKQX2EEEAVKLFIEWLKNGX4PX5(I)其中，X1表示Phe或Tyr，X2表示Met、Ile或Leu，X4表示Gly或缺失，X5表示Arg或缺失。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的&是Tyr。3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的X2是Met。4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的X4是缺失的。5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的X!是Tyr,X2是Met，X4缺失，Xs是Arg或缺失。6.—種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽。7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其還含有藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述的載體是乙醇、甘油和水中的一種或多種。9.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽在制備治療糖尿病的藥物中的用途。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中糖尿病是II-型糖尿病。全文摘要本發(fā)明涉及一種Exendin4多肽片段，其特征是多肽序列為HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVKLFIEWLKNGX₄PX₅，其中X₁表示Phe或Tyr；X₂表示Met、Ile或Leu；X₄表示Gly或缺失；X₅表示Arg或缺失。該多肽具有降低血糖的作用，可用于治療II型糖尿病。本發(fā)明還涉及Exendin4多肽片段的制備方法。文檔編號(hào)A61P3/00GK101280009SQ200810008419公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2005年6月29日優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日發(fā)明者奚紹祁,兵王,馬曉鵬申請(qǐng)人:常州制藥廠有限公司