專利名稱：：檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及磷酸酶作用和抑制領(lǐng)域，還涉及與葡萄糖代謝/調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病，如糖尿病和肥胖癥。
背景技術(shù)：
：美福明(Metformin)是已知用于治療糖尿病的雙胍化合物。美福明的標(biāo)靶尚不清楚。美福明可以作為線粒體毒素而發(fā)揮作用。苯乙福明(Phenformin)是突福明的類似物且也是雙胍化合物。苯乙福明已經(jīng)用在糖尿病的治療中。苯乙福明的標(biāo)粑尚不清楚。苯乙福明是強(qiáng)的線粒體毒素。苯乙福明顯示出包括嚴(yán)煮乳酸中毒在內(nèi)的副作用。這可能是致命的，并且已經(jīng)證明是致命的。這些副作用(如乳酸中毒)的存在導(dǎo)致世界上大多數(shù)國(guó)家都已經(jīng)停止將苯乙福明作為糖尿病治療劑來使用。AMP活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase)—直被認(rèn)為是一種細(xì)胞能量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，且己經(jīng)證明其可以被至少兩個(gè)上游激酶LKB1和CaMKK(3所活化。負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶被認(rèn)為是PPM家族蛋白磷酸酶的成員，所依據(jù)的^實(shí)是通過細(xì)菌表達(dá)的PP2Ca能夠降低AMPKfl勺磷酸化狀態(tài)(被AMP抑制的種作片!)，以及關(guān)于岡田酸(okadaicadd)已經(jīng)鑒定出蛋白磷酸酶PPM家族中的許多成員，但是本領(lǐng)域中尚沒有鑒定出負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的PPM家族成員。許多研究己經(jīng)指出抗糖尿病藥美福明通過增加AMPK催化T-環(huán)殘基Thrl72的磷酸化來活化AMPK。類棍明通過AMPK的活化來降低肝葡萄糖的生成并增加葡萄糖的利用，但是美福明活化AMPK的機(jī)理尚不清楚。Koh等(2002CurrentBiologyvol12pp317-321)公開了p21活化的激酶PAK受PP2C家族的一對(duì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶POPX1和POPX2的負(fù)調(diào)節(jié)。WO2006/091701公開了通過存活激酶或死亡激酶或磷酸酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方法和組合物。此文獻(xiàn)列舉了大量由于在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮作用從而可能調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或存活的其它激酶和磷酸酶。本發(fā)明試圖克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雙胍化合物對(duì)磷酸酶活性具有驚人的作用。具體地，已經(jīng)證明通常用于治療糖尿病(如n型糖尿病)和肥胖癥的雙胍化合物實(shí)際上是蛋白磷酸酶活性的抑制劑。特別地，發(fā)明人已經(jīng)將受影響的這類磷酸酶具體定義為ppm型磷酸酶，并已經(jīng)在PPM家族內(nèi)鑒定出哪些酶的活性受到抑制。因此，發(fā)明人首次公開了蛋白磷酸酶(特別是某些PPM磷酸酶)是治療性干預(yù)的耙點(diǎn)。本發(fā)明基于這些驚人的發(fā)現(xiàn)。因此，在廣泛的方而，木發(fā)明涉及雙胍化合物作為蛋白磷酸酶活性抑制劑的應(yīng)用。在另一廣泛的方而，本發(fā)明涉及磷酸酶抑制劑(特別是PPM磷酸酶抑制劑)在治療或預(yù)防葡萄糖調(diào)節(jié)性疾病(如糖尿病禾b/或肥胖癥)的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明涉及鑒定用于糖尿病或肥胖癥的藥物的候選試劑的方法，所述方法包括(i)提供PPM磷酸酶的候選抑制劑，(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一樣品和第二樣品，(iii)使所述候選抑制劑與包含PPM磷酸酶的所述第-一樣品接觸，和(iv)測(cè)試所述第一樣品和第二樣品的PPM磷酸酶活性，其中，如果所述第--樣品屮的PPM磷酸酶活性低于所述第二樣品，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病或肥胖癥的藥物的候選試劑。優(yōu)選地，所述磷酸酶是PPMBIGi(雙胍抑制)家族成員。優(yōu)選地，所述磷酸酶由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PHLPP或PHUPP2基因編碼。優(yōu)選地，所述磷酸酶由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K或PPM1L基因編碼。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶是PPM1E和/或PPM1F;優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶是PPM1E。本文中的術(shù)語"試劑"或"候選抑制劑"可以是單個(gè)實(shí)體，也可以是多個(gè)實(shí)體的組合。所述試劑可以是有機(jī)化合物或其它化學(xué)品。所述試劑可以是來自天然或人工的任何適合來源而獲得的或生產(chǎn)的化合物。所述試劑可以是氨基酸分子、多肽、或其化學(xué)衍生物、或其組合。所述試劑甚至可以是多核苷酸分子，其可以是有義或反義分子。所述試劑甚至可以是抗體。可以從化合物庫中獲得或設(shè)計(jì)所述試劑，該試劑可以包含肽以及其它化合物(如小的有機(jī)分子)。本文詳述了PPM磷酸酶活性試驗(yàn)，在實(shí)施例2具體提供了適合的試驗(yàn)形式的實(shí)例。所述樣品可以是包含PPM磷酸酶的任何適合的樣品。其可以是重組酶的樣品，也可以是純化的酶的樣品，還可以是包含PPM磷酸酶的簡(jiǎn)單提取物或裂解物。顯然，重要的是樣品中包含具有活性的PPM蛋白磷酸酶/包含PPM蛋白磷酸酶活性，否則無法區(qū)別具有抑制效果的試劑與不具有抑制效果的試劑。使用如本文所述的磷-酪蛋白試驗(yàn)(phosphor-caseinassays)可以很容易地對(duì)此進(jìn)行證叨。優(yōu)選地，所述疾病為糖尿病，更優(yōu)選為n型糖尿病。優(yōu)選地，所述候選抑制劑為雙胍；優(yōu)選地，所述候選抑制劑為關(guān)福明或苯乙福明類似物或衍牛物。另一方面，本發(fā)明提供美福明或苯乙福明在抑制PPM型蛋白磷酸酶(PPMtypeproteinphosphatase)屮的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述PPM型蛋白磷酸酶具有本文所述的PPM磷酸酶的一種或多種特性，優(yōu)選具有兩種或多種、優(yōu)選三種或多種、優(yōu)選四種或多種、優(yōu)選木文所述的PPM磷酸酶的全部特性。優(yōu)選地，所述PPM型蛋白磷酸酶為PPMIE或PPM1F。另一方面，本發(fā)明提供了用于抑制PPM磷酸酶的美福明或苯乙福明。另一方面，本發(fā)明提供了美福明或苯乙福明在用作PPM磷酸酶抑制劑的組合物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供美福明或苯乙福明在制備用作PPM磷酸酶抑制劑的組合物屮的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了苯乙福明或其類似物在增強(qiáng)或保持AMPK的磷酸化中的應(yīng)用。另一方面，木發(fā)明提供了PPM1E或PPM1F在AMPK去磷酸化中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了美福明或苯乙福明在p-21活化激酶(PAK)的活化中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了美福明或苯乙福明在抑制Ca^/鈣調(diào)蛋白依賴型激酶II(Ca2+/CalmodulindependentkinaseII，CaMKII)的去磷酸化中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了通過上述方法鑒定的、用作藥物的試劑。另一方面，本發(fā)明提供了上述方法鑒定的試劑在制備糖尿病或肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供由卜:述方法鑒定的、用于糖尿病或肥胖癥治療的試齊'J。另一方面，本發(fā)明提供了糖尿病或肥胖癥的治療或預(yù)防方法，該方法包括對(duì)受試者(subject)施用包含上述藥物的組合物，其屮所述藥物不包括美福明或苯乙福明。另一方面，本發(fā)明提供糖尿病或肥胖癥的治療或預(yù)防方法，該方法包括抑制受試者的PPM磷酸酶。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶選自由以卜組成的組PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PPM1M、PHLPP禾卩PHLPP2。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶選自由以下組成的組PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L或PPM1M。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為PPM1E禾l/或PPM1F。優(yōu)選地，此抑制不是由美福明或苯乙福明產(chǎn)生的。發(fā)明詳述美福明是II型糖尿病治療中的主要藥物之，雖然作ffl機(jī)理尚不淸楚，但其可以增強(qiáng)AMPK的活性。通常AMPK是在響應(yīng)AMP水平的增加而被活化的，并通過(x亞基的催化位點(diǎn)內(nèi)蘇氨酸殘基的磷酸化而完成。川美福明類似物苯乙福明孵育HEK293和HeLa細(xì)胞后，通過蛋白磷酸酶活性試驗(yàn)顯小在對(duì)苯乙福明或關(guān)福明的響應(yīng)中，只有岡田酸抗性的鎂離子依賴型酪蛋白磷酸酶的活性降低約20%。進(jìn)一步的研究顯7』K，在用苯乙福明孵育HEK293后，兩個(gè)緊密相關(guān)的PPM家族蛋白磷酸酶PPM1E和PPM1F的活性也被抑制，這揭示它們可能直接和減間接地被苯乙福明所靶向，并導(dǎo)致AMPK活性的提高。木發(fā)明基于這些驚人的發(fā)現(xiàn)。術(shù)語"試劑"或"候選抑制劑"具有本領(lǐng)域的一般含義，并可以指任何化學(xué)實(shí)體如有機(jī)化合物或無機(jī)化合物或其混合物。優(yōu)選地，所述試劑可以是小分子化學(xué)實(shí)體。優(yōu)選地，所述物質(zhì)可以是大分子如生物大分子，如核酸或多肽。例如，所述試劑可以是天然物質(zhì)，生物大分子，或從生物材料如細(xì)菌、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織獲得的提取物，有機(jī)分子或無機(jī)分子，合成試劑，半合成試劑，結(jié)構(gòu)或功能的模擬物，肽，擬肽，衍生的試劑，從完整蛋白切割的肽，或通過合成得到的肽(例如，使用肽合成儀或通過重組技術(shù)或其組合、重組試劑、抗體、天然或非天然試劑、融合蛋白或其等價(jià)物和突變物、衍生物或其組合)。通常，所述試劑為有機(jī)化合物。優(yōu)選地，所述試劑為水溶性的。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑為美福明類似物或苯乙福明類似物。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑包含用于向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)氖侄位蚬ぞ?means),可以包含用于向線粒體內(nèi)運(yùn)輸?shù)氖侄位蚬ぞ摺８鼉?yōu)選地，本發(fā)明的試劑不被包含在線粒休內(nèi)。美福明/苯乙福明/類似物優(yōu)選地，本發(fā)明的PPM抑制劑為雙胍化合物。實(shí)例包括美福明、苯乙福明或丁福明(buformin)。優(yōu)選地，木發(fā)明的PPM抑制劑包括美福明或其類似物，或苯乙福明或其美福明的類似物包括苯乙福明。在PPM磷酸酶的抑制活性方而，苯乙福明為本發(fā)明的優(yōu)選化合物。苯乙福明為苯乙雙胍。苯乙福明為雙胍類降血糖藥，其性質(zhì)與美福明相似。必需要提到的是在許多管轄區(qū)域內(nèi)，苯乙福明被認(rèn)為與通常導(dǎo)致死亡且具有不能接受的高發(fā)病率的乳酸屮毒冇關(guān)。因此，優(yōu)選不對(duì)人或動(dòng)物受試者施用苯乙福明。閑此，對(duì)于本發(fā)明的醫(yī)學(xué)應(yīng)川，優(yōu)選PPM磷酸酶抑制劑不為苯乙福明。美福明(QHuNs)為l-(二氨基亞甲基)-3,3-二甲基-胍。美福明是雙胍類的抗糖尿病藥物。美福明可以廣泛地獲得，其商品名為如Glucophage、Diabex、Diaformin、Fortamet、Riomet、Glumetza和其它。美福明因其PPM磷酸酶抑制活性和較低的毒性而成為本發(fā)明的優(yōu)選化合物?；瘜W(xué)衍生物本發(fā)明還涉及所述化合物的衍生物，特別是美福明和/或苯乙福明的衍生物。本文所用的術(shù)語"衍生物"包括試劑的化學(xué)修飾。所述化學(xué)修飾的實(shí)例可以是氫被鹵素基團(tuán)、烷基基團(tuán)、酰基基團(tuán)或氨基基團(tuán)替代。鹽/酯木發(fā)明的化合物可以以鹽或酯的形式存在，特別是以藥學(xué)上可接受的鹽或酯的形式存在。本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括其適合的酸加成鹽或堿式鹽(basesalts)。適合的藥學(xué)上的鹽的綜述可以參見Berge等，JPharmSci,66,1-19(1977)。鹽的形成可以通過例如強(qiáng)無機(jī)酸，如礦物酸，如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強(qiáng)有機(jī)羧酸，如未取代或取代的(如被鹵素取代)具有1至4個(gè)碳原子的烷基羧酸，如乙酸；飽和或不飽和的二羧酸，如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、宮馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿幔?羥基羧酸，如抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、^果酸、灑石酸或檸檬酸；氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；苯屮酸；或冇機(jī)磺酸，如未取代或取代的(如被鹵素取代的)(C,-C4)-烷基-磺酸或芳基-磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬?。根?jù)被酯化的宮能團(tuán)，使用有機(jī)酸或醇/氫氧化物形成酯。有機(jī)酸包括羧酸，如未取代或取代的(如被鹵素取代)具有1至12個(gè)碳原子的垸基羧酸，如乙酸；飽和或不飽和的二羧酸，如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?；羥基羧酸，如抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有機(jī)磺酸，如未取代或取代的(如被鹵素取代)(CrC4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬?。適合的氫氧化物包括無機(jī)氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代的(如被鹵素取代的)1至12個(gè)碳原子的烷醇。對(duì)敗異構(gòu)體/互變異構(gòu)休在各個(gè)方面，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的仝部對(duì)映異構(gòu)休和互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可識(shí)別具有光學(xué)性質(zhì)(一個(gè)或多個(gè)手性碳原子)或互變異構(gòu)特性的化合物。相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體可以通過本領(lǐng)域已知的方法來分離/制備。立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體本發(fā)明的一些化合物可以以立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體存在，如它們可以具冇一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心和/或幾何中心，因此它們可以以兩種或多種立體異構(gòu)和/或幾何異構(gòu)的形式存在。本發(fā)明涉及這些抑制劑的所有立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體、及其混合物的應(yīng)用。權(quán)利要求中所用的術(shù)語涵蓋這些形式，條件足所述形式具有適當(dāng)?shù)墓δ芑钚?雖然程度不--定相同)。本發(fā)明還包括所述試劑或其藥學(xué)上可接受的鹽的所有適合的同位素變休。本發(fā)明的試劑或其藥學(xué)上可接受的鹽的問位素變體的定義為其屮的至少一個(gè)原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量不同于向然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量的原子所替代的同位素變體。可以加入到所述試劑和其藥學(xué)上可接受的鹽的同位素的實(shí)例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如分別為4、3H、l3C、'4C、'5N、170、l80、3'P、32P、35S、'8F和36C1。所述試劑和^藥學(xué)上可接受的鹽的某些同位素的變體(如加入放射性同位素如3H或l4C的那些變休)在關(guān)于藥物和/或底物的組織分布的研究屮十分冇用。M(即;m和碳-i4(即14c)問位素l天l它們易于制備和可檢測(cè)性而特別優(yōu)選。此外，用同位素(如氘，即&)進(jìn)行的取代可以提供山更髙的代謝穩(wěn)定性所產(chǎn)生的某些治療優(yōu)點(diǎn)，如體內(nèi)半衰期提高或劑量需求減少，并由此在一些情況中口r以是優(yōu)選的。本發(fā)明的試劑和其藥學(xué)上可接受的鹽的同位素變體通?？梢允褂眠m合試劑的適。同位素變體通過常規(guī)方法來制備。溶劑合物本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的溶劑合物的應(yīng)用。權(quán)利要求中所用的術(shù)語涵蓋這種形式。多品型物本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物的各種晶休形式、多晶型形式和無水/含水形式。在制藥工業(yè)中廣泛使用的方法是，在合成制備所述化合物中，通過略微改變利用溶劑來純化和/或分離的方法，可分離出任何所述形式的化合物。前藥本發(fā)明還包括前藥形式的本發(fā)明化合物。所述前藥通常是一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)己被修飾的本發(fā)明化合物，使得在對(duì)人或哺乳動(dòng)物受試者給藥后所述修飾可以被逆轉(zhuǎn)。雖然為了在體內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，可以將第二試劑與所述前藥一起施用，但是所述逆轉(zhuǎn)通常通過所述受試者中天然存在的酶來完成。所述修飾的實(shí)例包括酯(如上述任何一種酯)，其中逆轉(zhuǎn)可以由酯酶等完成。其它所述體系對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。蛋白磷酸酶的PPM家族蛋白磷酸酶的PPM家族包括一群組絲氨酸磷酸酶/蘇氨酸磷酸酶，其中許多磷酸酶的活件依賴于Mg^或Mn2+。雖然PPP和PPM家族蛋白磷酸酶之間沒有序列同-一性，但是它們?cè)谌S結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理上十分相似。蛋白磷酸酶PPM家族包括至少16個(gè)成員(編碼PPM的16個(gè)基因；一些經(jīng)過選擇性剪切得到不同的蛋白變體(如B1和B2))。雖然這些蛋白磷酸酶在結(jié)構(gòu)上具有很大差異，但是它們具有非常相似的催化機(jī)理。根據(jù)慣例，蛋白和基因的名稱可以不同，如下文所述(如PPM1E基因編碼P0PX1蛋白)。然而，如果通過基因名稱來提及蛋白，則應(yīng)該明白這是指所述基因編碼的磷酸酶(如PPM1E磷酸酶足指PPM1E基因編碼的磷酸酶，即P0PX1蛋白)。PPM1A，也稱作PP2Ca，由兩個(gè)同種型(isoforms)PP2Cal(PPM1A1)和PP2Ca2(PPM1A2)組成，其分子量分別為42kDa和36kDa，且二者均以單體存在。PP2C(x首先表達(dá)于大腸桿菌，已發(fā)現(xiàn)在體外重組的PP2Ccx能夠使AMP活化蛋白激酶(AMPK)去磷酸化。此去磷酸化事件對(duì)岡m酸毒素不敏感且需要Mg21、此外己經(jīng)證明，PP2Ca通過脂肪細(xì)胞屮PI3-激酶活性的宜接活化而作為胰島素敏感性的正調(diào)節(jié)物，并已經(jīng)被提示通過有絲分裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)以及p38MAPK的去磷酸化和失活而作為應(yīng)激反應(yīng)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，可以檢測(cè)到p38和PP2Ca間的直接相互作用。PPM1B，也稱作PP2C卩，由至少兩個(gè)同種型PP2C卩1(PPM1B1)和PP2C卩2(PPM1B2)組成，其分子量分別為43kDa和53kDa，且類似于PP2Ca，這些酶以單體存在。己經(jīng)證明PP2Cp通過p38的去磷酸化而作為應(yīng)激反應(yīng)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物，并也已經(jīng)被提示涉及TAK1(參與活化JNK和MAPK途徑的酶)的去磷酸化。已經(jīng)證明，PP2Q3在細(xì)胞周期蛋白依賴型磷酸酶的去磷酸化中起作用。PPM1G，也稱作PP2Cy或FIN13，是分子量為59kDa的、包含融合膠原蛋白同源結(jié)構(gòu)域的單體蛋白磷酸酶，已經(jīng)證明其能夠通過引起G,/S期細(xì)胞周期停滯來負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。在成體組織中，PPM1G主要表達(dá)于睪丸中，但高表達(dá)于處于增殖的多個(gè)組織中。這些組織包括發(fā)育的胚胎、妊娠期子宮、胎盤和在用己烯雌酚(DES)進(jìn)行卵泡發(fā)育刺激后性未成熟的小鼠的卵巢。PPM1G具有C-末端核定位信號(hào)，并且與PPM家族的其它成w不同，其具有大的內(nèi)部酸性結(jié)構(gòu)域，所述內(nèi)部酸性結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為參與提供對(duì)底物的特異性，因?yàn)镻P2Cy似乎主要偏愛堿性蛋白。已經(jīng)證明PPM1G可被鈣抑制，但由于抑制需要較高的微摩爾濃度，此抑制不可能為調(diào)節(jié)模式。PPM1G涉及剪接體的組裝，并已經(jīng)顯示出與前mRNA剪接因子的組分相互作用。仏/cILKAP(整合素連接激酶1相關(guān)磷酸酶)，也稱作PP2CS，是分子量為43kDa的單體蛋白，在用整合素連接激酶l(ILKO為誘餌的酵母雙雜交篩選中被鑒定出來。ILKAP(而非ILKAP的催化失活的突變體)能夠強(qiáng)烈抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子1刺激的GSK3P在Ser9上的磷酸化，而不影響PKB在Ser473上的磷酸化，提示ILKAP選擇性地影響ILK介導(dǎo)的GSK3(3信號(hào)通路。此外，ILKAP可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的非支持物依賴性生長(zhǎng)，提示1LKAP在細(xì)胞轉(zhuǎn)化屮起關(guān)鍵作用，且ILKAP在致癌性轉(zhuǎn)化的抑制中起重要作用。PPM1D，也稱作Wipl(野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1)，是分子量為66kDa的單體蛋白，在p53靶基因的篩選中首次被鑒定出來。已經(jīng)證明，PPM1D的表達(dá)以p53依賴的方式被電離輻射快速誘導(dǎo)，這提示p53可能通過對(duì)PPM1D的誘導(dǎo)來介導(dǎo)其部分細(xì)胞周期抑制活性。Wipl啟動(dòng)子區(qū)不包含任何傳統(tǒng)的p53響應(yīng)元件，而是包含轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)，所述轉(zhuǎn)錄因子包括NF-kB、E2F、c-Jun和ATF/CREB家族的成員。類似于其它PP2C家族成員，PPMlD能使p38MAPK家族的成員去磷酸化。在被UV照射損傷的細(xì)胞的恢復(fù)期，PPM1D具有下調(diào)p38-p53信號(hào)通路的作用。此外，PPM1D也能被其它環(huán)境脅迫如苘香霉素、過氧化氫和甲磺酸甲酯所誘導(dǎo)。PPM1D的UV誘f-需要p38活性以及p53，且PPM1D通過在p38保守蘇氨酸殘基上的去磷酸化使p38失活，而在有報(bào)道被p38磷酸化的那些殘基上降低UV誘導(dǎo)的p53磷酸化。在對(duì)UV照射的響應(yīng)中，PPM1D的表達(dá)還抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和凋亡。尸P似/E和PPAf/FPPM1E，也稱作POPXl，是包含于融合PAK相互作用的鳥嘌呤核苷交換因子(PIX)纟吉合纟吉構(gòu)域(fusedPAK-interactingguaninenucletideexchangefactorbindingdomain)的83kDa單體蛋白，且已經(jīng)提示其參與PAK的負(fù)調(diào)節(jié)。在使用PIX作為誘餌的雙雜交篩選中，PPM1E被鑒定為與PIX相互作用的蛋白。PPM1F，也稱作POPX2，在同一篩選中被鑒定出，且二者在磷酸酶核心結(jié)構(gòu)域和同源的旁側(cè)序列中呈現(xiàn)66%的相似性。己經(jīng)證明，PPM1E和PPM]F使p21(cdc42/Rac)活化激酶(PAK)去磷酸化和失活，以及具有抑制肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維斷裂和抑制由活性cdc42引起的形態(tài)改變的能力。PPMIF也稱作CaMKIIPase，或hFEM2，已經(jīng)證明，其是負(fù)責(zé)Ca,鈣調(diào)蛋白依賴型蛋白激酶II在其自磷酸化位點(diǎn)(Thr286)去磷酸化的主要磷酸酶。己經(jīng)顯示出PPM1F在休外直接與CaMKII相互作用，這提示PPM1F在其調(diào)節(jié)中起重要作用。尸D尸C7和尸D尸C2PDPC1(丙酮酸脫氫酶磷酸酶復(fù)合物1)和PDPC2分別為分子量為61kDa和60kDa的異二聚體蛋白，并且是位于線粒體基質(zhì)空間內(nèi)的少數(shù)幾種哺乳動(dòng)物磷酸酶中的兩種。已經(jīng)證明，PDPC1在對(duì)Ca^的響應(yīng)中被活化，同時(shí)還證明PDPC2對(duì)(^2+不敏感，而對(duì)與PDPC1沒有作用的生物多胺(精胺)敏感。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物是大的多酶復(fù)合物，其由三個(gè)催化組分組成丙酮酸脫氫酶(El)、二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶(E2)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(E3)。復(fù)合物的構(gòu)建以60個(gè)E2亞基為核心，30個(gè)El亞基和6-12個(gè)E3亞基與所述E2亞基結(jié)合。所述復(fù)合物通過E1組分中三個(gè)絲氨酸殘基的磷酸化而失活，通過PDPC同種型的去磷酸化而被重新活化。在線粒體中，激酶和磷酸酶的活性均為組成型，這決定/在處于非活性態(tài)的PDC的比例。顯然，PDPC1和PDPC2的活性調(diào)節(jié)必須受到非常嚴(yán)格的控制，并且最近的研究提示饑餓和糖尿病可以降低心臟和腎中PDP的水平。令人感興趣的是，已經(jīng)證明胰島素治療可以提高PDPC2的水平，這提示事實(shí)上胰島素可能在丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的長(zhǎng)期調(diào)節(jié)中起作用。W/，PHLPP(PH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸的蛋白磷酸酶)為約140kDa的新型磷酸酶，其在與PH結(jié)構(gòu)域相連的蛋白磷酸酶的人基因組篩選中被鑒定出來，且使PKB上的Thr473去磷酸化。與其在PKB去磷酸化中的作用相-一致，許多結(jié)腸癌細(xì)胞系和膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中PHLPP的水平已經(jīng)降低，且將PHLPP再引入這些細(xì)胞系中吋會(huì)降低其生長(zhǎng)速率。因此，PHLPP具有促進(jìn)凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。人基因組中編碼有PHLPP的第二個(gè)同種型。PHLPP和PHLPP2由于與PKB結(jié)合而并不太受關(guān)注；因此，相應(yīng)地本發(fā)明的磷酸酶不為PHLPP或PHLPP2。PPM1K為PPM絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，其在最近被鑒定出來并被收錄在NCB1和EBI數(shù)據(jù)庫中，ID號(hào)為NP—689755、ENSP00000295908、ENSP00000324761、Q56AN8、Q8IUZ7、Q49AB5?？傊皇鼙揭腋Ｃ?美福明抑制的PPM包括PPMlA、PPM1B(Bl禾口B2)、PPM1G、ILKAP、PPM1D、NERPP-2C、PDPC1禾口PDPC2。優(yōu)選地，PPM為PPMBIGi家族(被雙胍抑制)的成員。BIGi家族成員包括PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PHLPP禾卩PHLPP2基因所編碼的磷酸酶，和被雙胍(如如本文公開中所測(cè)試的美福明和/或苯乙福明)所抑制的任何其它磷酸酶。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶選自由以下組成的組PPME、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L、PPM1M、PHLPP禾卩PHLPP2;優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶選自由以下組成的組PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M，或選自其中的一種或多種磷酸酶的組合；優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為PPM1E或PPM1F;優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為PPME。廳A/翻:成嚴(yán)總茲,基因名稱蛋白名稱Genbank蛋白登錄號(hào)，(mRNA登錄號(hào))Ensembl肽號(hào)，(基因號(hào))PPM1EPOPX1NP—055721,(NM—014906)PP2CHENSP00000312411,(ENSG00000175175)Q8WY54,Q8WY54—2,Q8WY54一1，Q8WY54—3PPM1FPOPX2NP055449，P49593,(畫—014634)CaM-KPaseENSP00000263212,(ENSG00000100034)hFEM2P49593,Q0VGL7，Q6IPCOPPM1JPP2C;NP一005158,(NM—027982)ENSP00000308926;ENSP00000353088,(ENSG00000155367)2同種型Q6DKJ7，Q5JR12PPM1KNP一689755,(NM152452)ENSP00000295908,ENSP00000324761(ENSG00000163644)2同種型Q56AN8,Q8IUZ7,Q49AB5PPM1LPP2CePP2CLNP一640338,(NM—178726)ENSP00000295839,(ENSG00000163590)Q5SGD2，Q2M3J2PPM1MPP2CriQ96MI6PHLPPPHLPPaNP—919431,(畫l94449)SCOPENSP00000262719(ENSG00000081913)PLEKHE1060346PHLPP2PHLPP(3NP—055835,(畫—015020)以下列出所述PPM磷酸酶的優(yōu)選特性優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為鎂(Mg2+)或錳(Mn2+)依賴型磷酸酶，優(yōu)選為錳依賴型。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶具有岡田酸抗性。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶具有酪蛋白(如磷-酪蛋白(phospho-casein))磷酸酶活性。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶包含PIX結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為PPMIF或PPMIE或其混合物。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶為PPMIE。優(yōu)選地，所述PPM磷酸酶具有選自以下的氨基酸序列PPMIE.NP055721EEGAATAAAAPGHSAVPPPPPQLPPLPPLPRPLSERITPRPLSERITREEVF.GESLDLCLQQLYKYNCPSFLAAALARATSDEVLQSDLSAHYIPKETDGTHI)IPCPDLl)WSYKIE^PPMIE.ENSP00000312411SDHLKENNGDSSMVAHKLVASARDAGSSDNITVIVVFLRD固KAVNVSEESDWTENSFQGGQEDGGDDKENHGECKRPWPQHQCSAPADLGYDGRVDSFTDRTSLSPGSQINVLEDPGYLDLTQIEASKPHSAQFLLPVEMFGPGAPKKANLINELMMEKKSVQSSLPEWSGAGEFPTAFNLGSTGEQIYRMQSLSPVCSGLENEQFKSPGNRVSRLSHLRHHYSKKWHRFRFNPKFYSFLSAQEPSHKIGTSLSSLTGSGKRNRIRSSLPWRQNSWKGYSENMRKLRKTHDIPCPDLPWSYKIE兩個(gè)PPM1E序列NP—055721和ENSP00000312411具有98%的同一性。可選擇的方案是，PPMIE序列可以選自Q8WY54—2、Q8WY54—1或Q8WY54一3。Q8WY54—2與以上列出的最適合的序列相比具有額外的EP(MAGCIPEEKTYRRFLELFLGEFRGPCGGGEE…)，Q8WY54—1和Q8WY54一3在氨基酸末端區(qū)域具有其它變化。PPMIF.NP055449和ENSP00000263212PPRSPPMIF.，PCOsRLpVLGRpFPITprjDuNVAHpwD^Q"LALADYIIIpGapKTREsEGGwsG仏MMApTiQEAEGVMQsLAAp±EHRGDtrQsAsADTpA「Tj「丄NFspsHRDEMRRNQRKAKRQ-FTJ……VsFwG/uF則QFAGEpDTpEQRAATHRAADGAEDQREppEMKQGQQsDG麗GAcGGQsGsAADAEGsYpQFDGsTGNwcDMHsFGEGpEwRTApAEwp:3LEswDsRGGQAR9"TpSDHGsEwQLNGG\EHEpQVpDRFTilFFDVMVYDDHEssRPPMIF.Q0VGL7MSSGAPQKSSPMASGAEETPGFLDTLLQDFPALLNPEDPLPWKAPGTVLS卿VEGELAELAMGFLGSRKAPPPLAAALAHEAVSQLXQTDLSEFRKLPRSQRQWLVS1HAIRNTRRKMEDRHVSLPSFNQLFGLSDPVNRAYFAVFDGHGGVDAARYAAVHVHTNAARQPELPTDPEGALREAFRRTDQMFLRKAKRER優(yōu)選地，所述磷酸酶蛋白的序列與這些序列中的一條具有至少80%的同一性，優(yōu)選至少85%的同一性，優(yōu)選至少90%的同一性，優(yōu)選至少95%的同一性，優(yōu)選至少96%的同一性，優(yōu)選至少97%的同一性，優(yōu)選至少98%的同一性，優(yōu)選節(jié)少99%的同一性，前提是在每種情況下磷酸酶蛋白都具有保持的磷酸酶活性。這可以通過使用本文所述的試驗(yàn)容易地得到驗(yàn)證。抑制劑和PPM磷酸酶活性試驗(yàn)關(guān)—r磷酸酶抑制劑，特別是PPM磷酸酶抑制劑，應(yīng)該根據(jù)有關(guān)磷酸酶的教導(dǎo)來解釋，即優(yōu)選磷酸酶抑制劑為鎂或錳依賴型PPM磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選為具有岡田酸抗性的PPM磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選為PPM磷酸酶酪蛋白磷酸酶活性的仰制劑，優(yōu)選為包含PIX結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PPM磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選為PPM1E或PPM1F磷酸酶或其混合物的抑制劑，優(yōu)選為PPM1F磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選為PPM1E磷酸酶的抑制劑。本發(fā)明的磷酸酶抑制劑優(yōu)選為PPM磷酸酶的抑制劑，并優(yōu)選對(duì)PP2A磷酸酶活性沒冇顯著作用，優(yōu)選檢測(cè)不到對(duì)PP2A磷酸酶活性的作用，優(yōu)選當(dāng)如本文所述使用磷酸化酶a作為底物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)檢測(cè)不到對(duì)PP2A磷酸酶活性的作用(特別在使用I-2抑制劑來抑制PP1時(shí)，參見實(shí)施例2)。優(yōu)選PPM抑制劑對(duì)PP1活性沒有顯著作用，優(yōu)選檢測(cè)不到對(duì)PP1活性的作用，優(yōu)選當(dāng)如實(shí)施例2所述進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)檢測(cè)不到對(duì)PP1活性的作用。優(yōu)選PPM抑制劑對(duì)PP5活性沒有顯著作用，優(yōu)選檢測(cè)不到對(duì)PP5活性的作用，優(yōu)選當(dāng)如實(shí)施例2所述進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)檢測(cè)不到對(duì)PP5活性的作用。優(yōu)選通過施用PPM抑制劑來完成對(duì)PPM磷酸酶的抑制。"抑制"還可以包括PPM活性的降低或消除，或?qū)PM磷酸酶的水平進(jìn)行干涉/十?dāng)_。例如，PPM磷酸酶表達(dá)的壓制或抑制，PPM磷酸酶轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的壓制或抑制，或PPM磷酸酶自身的下調(diào)(無論通過調(diào)節(jié)如抑制其活化或引起其失活的酶，或通過加速其降解或其它此類技術(shù))。因此，"抑制"是指減少、消除、去除或壓制或降低PPM磷酸酶活性的其它此類方式。抑制劑優(yōu)選為根據(jù)本文公開的試驗(yàn)所鑒定的抑制劑。可以采用其它方式來抑制PPM磷酸酶。這些方式可以包括對(duì)PPM的活化劑或調(diào)節(jié)物的操作?；蛘哌@些方式可以包括PPM敲減(knock-down),如PPM活性的siRNA敲減。用于抑制PPM活性的siRNA優(yōu)選為PPM1EsiRNA或PPM1FsiRNA。PPM磷酸酶活性試驗(yàn)可以是任何適合的試驗(yàn)。大量可能的形式詳述于實(shí)施例部分。試驗(yàn)所優(yōu)選的特征為該試驗(yàn)包含Mg"離子或Mn&離子，優(yōu)選為Mg^離子；優(yōu)選為MgAc(乙酸鎂)；優(yōu)選為10mMMgAc。由于PPM磷酸酶為Mg/Mn依賴型，因而這對(duì)于酶的活性是有利的。適合地，所述試驗(yàn)包含Mn》離子；適合地為MnCl2(氯化錳)；適合地為2mM氯化錳(11)。適合地，所述試驗(yàn)包含Mg、寫子和Mn&離子。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)包含岡田酸，優(yōu)選為5岡出酸。這對(duì)抑制PP2A有利。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)包含可能對(duì)正在使用的特定底物起作用的其它磷酸酶的一種或多種抑制劑，以便不使結(jié)果發(fā)生混淆，即試圖確保試驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確獲得PPM磷酸酶的活性/抑制，而非其它磷酸酶(如非PPM磷酸酶)的活性/抑制。所述抑制劑和其抑制的磷酸酶是已知的，且在本文，特別是在實(shí)施例部分描述了示例性的抑制劑以及其可能抑制的酶。優(yōu)選地，使用酪蛋白作為底物(磷-酪蛋白)進(jìn)行所述試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述酪蛋白用32P標(biāo)記以便于檢測(cè)被PPM作用去除的磷酸鹽。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)基于FPLC純化的磷酸酶。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)基于PPM磷酸酶，如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或其它異源表達(dá)系統(tǒng)屮表達(dá)的PPM1E/PPM1F磷酸酶，條件是所述磷酸酶具有活性(其根據(jù)本文所述很容易對(duì)其進(jìn)行測(cè)試)。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)基于免疫純化的磷酸酶。優(yōu)選使用抗PPM1E抗體和/或抗PPM1F抗體或抗體片段對(duì)磷酸酶進(jìn)行免疫純化。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)的PPM磷酸酶的活性為PPM1E和/或PPM1F的活性。常,節(jié),銜微使用標(biāo)記有1(xM32P的底物，在30體積和30。C下測(cè)試蛋白磷酸酶。在緩沖液C中分別稀釋"P標(biāo)記的底物和磷酸酶抑制劑/活化劑。在緩沖液B中稀釋蛋白磷酸酶。通過將磷酸酶的10^稀釋液(或含免疫小球(immunopellet)的10(il緩沖液B)與10pl抑制劑/活化劑或緩沖液C混合，并將混合物在30。C下孵育10分鐘來進(jìn)行試驗(yàn)。通過加入32P標(biāo)記的10pl底物來啟動(dòng)試驗(yàn)。隨后在30'C下孵育更長(zhǎng)時(shí)間(5-30分鐘)，并通過加入100(al20%(重量/體積)三氯乙酸終止試驗(yàn)?？焖贉u旋混合物并在14,000xg下離心5分鐘?；厥?00pl上清，并在Wallac1409液體閃爍計(jì)數(shù)器上通過Cerenkovit數(shù)來測(cè)量釋放的32P。對(duì)于免疫小球化的磷酸酶活性(immunopelletedphosphataseactivity)的試驗(yàn)，方法如上所述，不同處在于將清洗的免疫小球重懸于10jil緩沖液B中，且在3(TC、以1200rpm搖動(dòng)下孵育試樣。緩沖液A50mMTris-HClpH7.5、0.1mMEGTA、0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇。緩沖液B包含1mg/mlBSA的緩沖液A。緩沖液C包含0.01%(體積/體積)Brij-35的緩沖液A。32P標(biāo)記的酪蛋白底物是使用蛋白激酶A的催化亞基部分水解的、標(biāo)記有p^P]ATP的牛奶酪蛋白(Sigma,PooleUK)。可以使用其它32P標(biāo)記的底物，條件是感興趣的磷酸酶(如PPM1E和PPM1F)能夠?qū)⑺鼈內(nèi)チ姿峄?。沐?尸/WW驗(yàn)可以在抑制PP1和PP2A類活性的岡田酸存在下，通過測(cè)定從谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶肽底物(GST-(GGGGRRAT[p]VA)3底物)釋放的["P]-正磷酸鹽來測(cè)定PPM磷酸酶活性。磷酸酶可以通過如實(shí)施例10中的免疫小球化來提供，或更常規(guī)地通過如實(shí)施例12中的PPM1E的表達(dá)并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化來提供(如使用與PPM1E多肽融合的純化標(biāo)簽，如6個(gè)組氨酸或GST)。如果需要任何指導(dǎo)，本文中提供了優(yōu)選PPM1E變體的氨基酸序列。通過使用蛋白激酶A(PKA)進(jìn)行磷酸化來制備GST-(GGGGRRAT[P]VA)3磷酸酶底物。在由50mMTris-HClpH7.0、O.lmMEGTA、10%甘油、10mM乙酸鎂、0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇、0.1mM[^P]ATP組成的緩沖液中，丁-30°C、輕柔搖動(dòng)下，將2mg細(xì)菌表達(dá)的GST-(GGGGRRATVA)3與1-2mUPKA孵育過夜。GST-(GGGGRRATVA)3蛋白序列(劃線處為蛋白酶預(yù)切割位點(diǎn))AGGGGRRATVAGGG通過在谷胱甘肽-Sepharose柱上進(jìn)行柱層析和洗脫(洗脫液50mMTris-HClpH7.0，O.lmMEGTA，10%甘油，10mM乙酸鎂，0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇，20mM谷胱甘肽)，從未結(jié)合的放射性核苷酸屮分離標(biāo)記的GST-(GGGGRRATlplVA)3。試驗(yàn)時(shí)，在加入前將GST-(GGGGRRATWVA)3稀釋至1-4(iM。磷酸酶的試驗(yàn)在30°C、持續(xù)搖動(dòng)下，于30jil的總體積中進(jìn)行10分鐘。稀釋于20nl緩沖液中的試樣包含所述磷酸酶，在加入32P標(biāo)記的10|JGST-(GGGGRRAT[pVA)3磷酸酶底物前，在30。C下將其孵育2分鐘。十分鐘后，通過加入100(1120%三氯乙酸終止反應(yīng)。隨后再將試管渦旋1分鐘以確保完全混合，并在室溫下以16,000xg離心5分釗'。從每個(gè)反應(yīng)中轉(zhuǎn)移100…上清節(jié)新的Eppendorf管中，并在液體閃爍計(jì)數(shù)器上通過Cerenkov計(jì)數(shù)測(cè)量。酸-鉬酸鹽提取物具有很小的蛋白酶活性污染。磷酸酶試驗(yàn)組合物(終濃度)50mMTris-HClpH7.00.1mMEGTA10mM乙酸鎂2mM氯化錳(II)5pM岡田酸0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇根據(jù)制備，試驗(yàn)中所用磷酸酶的質(zhì)量通常為10ng-10嗎。微微微IO分鐘試驗(yàn)后(在加入三氯乙酸前)，可以通過向100(il試樣中加入包含10mg/ml鉬酸銨和0.38mg/ml孔雀石綠的150pl1NHC1，對(duì)磷酸鹽的釋放進(jìn)行測(cè)定。室溫.(如18-25。C)進(jìn)行20分鐘后，測(cè)定620nm處的吸光度?？梢岳?50pl體積在平板讀數(shù)器上讀取吸光度。然而，此試驗(yàn)的靈敏度比基于放射性的試驗(yàn)低10-100倍，因此如果需耍可以在試驗(yàn)中使用10-100倍以上的磷酸酶進(jìn)行補(bǔ)償，或在評(píng)定結(jié)果時(shí)可以僅考慮較低的讀數(shù)。用由氨基酸序列KTHDIPCPDLPWSY產(chǎn)生的抗體對(duì)PPM1E進(jìn)行免疫小球化，并在存在10mMMg^或Mr^+離子和5岡田酸并使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物的蛋白磷酸酶試驗(yàn)中，測(cè)定免疫小球中的磷酸酶活性。也可以使用識(shí)別由基因ENSGOOOOO175175編碼的PPM1E蛋白的其它抗休。用由這基酸序列LPSSLPEPETQAPPRS產(chǎn)生的抗體對(duì)PPM1F進(jìn)行免疫小球化，并在存在10mMMg^或M,離子和5岡田酸并使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物的蛋白磷酸酶試驗(yàn)屮，測(cè)定免疫小球中的磷酸酶活性。也可以使用識(shí)別由基因ENSG00000100034編碼的PPM1F蛋白的其它抗體。AMP活化蛋白激酶(AMPK)AMPK起細(xì)胞能量傳感器的作用，切斷消耗ATP的通路，并開啟產(chǎn)生ATP的分解代謝過程。許多不同的分解代謝過程(包括葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡、脂代謝和線粒體的生物發(fā)生)的行為受AMPK的控制。此酶由異三聚體構(gòu)成，包括催化的a亞基和調(diào)節(jié)的(3和y亞基，其中每個(gè)亞基都由多個(gè)基因編碼。每個(gè)亞基存在多個(gè)剪切變體，這表明異三聚體可能有若干種組合。AMPK的a亞基包含催化激酶結(jié)構(gòu)域，以及靠近C末端并必須且足以與(3和Y亞基形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域。(3亞基包含碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其被認(rèn)為參與復(fù)合物與糖元顆粒的結(jié)合。如之前所討論的，AMPK的其中一種生理標(biāo)靶為糖原合成酶，該糖原合成酶也存在于糖原顆粒中，且有越來越多的證據(jù)表明高水平的細(xì)胞糖原導(dǎo)致AMPK活性降低。AMPK的y亞基包含約4個(gè)由60個(gè)殘基組成的重復(fù)基序，稱為CBS結(jié)構(gòu)域。這些基序成對(duì)地起作用，每個(gè)基序以互相排斥的方式結(jié)合一分子AMP或ATP，這與高濃度的ATP抑制由AMP產(chǎn)生的AMPK活化的想法一致。在對(duì)運(yùn)動(dòng)和相關(guān)的ATP利用得到增加的響應(yīng)中，可以活化AMPK。在運(yùn)動(dòng)期間，AMPK抑制消耗ATP的途徑，而活化碳水化合物和脂肪酸代謝途徑以試圖恢復(fù)ATP的水平?？梢酝ㄟ^AMP,以及通過a亞基催化"T環(huán)"中蘇氨酸殘基(Thrl72)的磷酸化，別構(gòu)活化AMPK。已經(jīng)確定AMPK對(duì)細(xì)胞中AMP:ATP比例的變化做出響應(yīng)。腫瘤抑制物激酶LKB1是負(fù)責(zé)體內(nèi)Thrl72磷酸化的酶。LKB1通過與鼠蛋白25(M025)和STE20相關(guān)銜接蛋白(STRAD)的相互作用而被活化；STRAD為假激酶，然而M025可以穩(wěn)定LKB1和STRAD之間的相互作用。此外，M025和STRAD具有在細(xì)胞質(zhì)中定位LKB1的作用。有趣地是，LKB1不受活化AMPK的刺激的調(diào)節(jié)，也不被AMP活化。許多研究人員目前正在研究LKB1的可能調(diào)節(jié)方式。除了活化AMPK，LKB1也能夠在T-環(huán)殘基處活化11個(gè)其它的AMPK相關(guān)激酶。Ca^鈣調(diào)蛋白依賴型蛋白激酶激酶卩(CaMKK(3)也作為體內(nèi)AMPK的上游激酶，確定肌肉收縮和AMPK活化之間的潛在聯(lián)系。盡管證據(jù)有限，但汄?yàn)轶w內(nèi)AMPK的去磷酸化由PP2C類酶完成。AMPK為抗糖尿病藥美福明的間接標(biāo)靶，其可以通過降低肝葡萄糖的產(chǎn)生和增加葡萄糖利用對(duì)2型糖尿病產(chǎn)生益處。美福明能夠在肝細(xì)胞中活化AMPK，并因此可以通過增加Ser79的磷酸化來降低ACC的活性，進(jìn)而增加脂肪酸的氧化，并抑制參與脂肪生成的酶。美福明為雙胍家族藥物的成員，且已經(jīng)顯示出能夠抑制呼吸鏈中的復(fù)合物1。已經(jīng)鑒定出大量的AMPK下游標(biāo)靶，包括乙酰輔酶A羧化酶和GLUT4。最重要的一種作用是作用于糖原合成酶(GS)，使用不具有活性AMPK的動(dòng)物模型證明其為負(fù)責(zé)GS第2位點(diǎn)的磷酸化的主要激酶。己經(jīng)證明，AMPK的非特異性活化劑(5-氨基咪唑-4-甲酰胺-l-!3-D-呋喃核糖苷(AICAR))可以降低GS的活性。當(dāng)在AICAR刺激后檢査時(shí)，在大鼠肌肉內(nèi)GS第2位點(diǎn)上的磷酸化增強(qiáng)，而第3a或3b位點(diǎn)沒有任何影響。相反，用AICAR處理后，小鼠的糖原水平提高，最有可能是由于AICAR增加葡萄糖吸收，并伴有由不依賴磷酸化狀態(tài)的別構(gòu)活化導(dǎo)致的GS活性的增加。在對(duì)運(yùn)動(dòng)的響應(yīng)巾，GS活性增加，且可以認(rèn)為此增加能夠使糖原儲(chǔ)存在一次運(yùn)動(dòng)后快速飽和。然而，在非常強(qiáng)烈的運(yùn)動(dòng)期間，糖原分解可以達(dá)到極高的速度，從而減弱了GS活性增加產(chǎn)生的影響。因?yàn)锳MPK在運(yùn)動(dòng)期間以強(qiáng)度依賴性方式被活化，因此似乎AMPK對(duì)GS的影響依賴于運(yùn)動(dòng)的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度。在表達(dá)負(fù)顯性AMPK的小鼠模型中，通常在對(duì)IO分鐘體外收縮的應(yīng)答中，GS活性增加，這強(qiáng)烈提示在收縮期間的此時(shí)間點(diǎn)上，AMPK對(duì)GS的活化不起主要作用，但是如果繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，GS第2位點(diǎn)的磷酸化增加。第2位點(diǎn)的磷酸化將GS活性維持在基礎(chǔ)水平，直到第3a和3b位點(diǎn)的磷酸化降低。除了其對(duì)AMPK的影響之外，骨骼肌的AICAR治療增加了GLUT4的招募，所述增加與AMPK的活化程度一致。本發(fā)明通過維持或增加AMPK磷酸化及其活化而適用于此類應(yīng)用，由此增加或維持/保持其的下游影響?；罨疉MPK的美福明為2型糖尿病治療中廣泛使用的藥物。認(rèn)為在對(duì)增加的AMP水平的響應(yīng)中，AMPK催化T-環(huán)殘基(Thrl72)的磷酸化的增加是通過AMPK的構(gòu)象改變產(chǎn)生的，使得其能更好地被其上游激酶磷酸化。因此，重要的是理解AMPK去磷酸化i-l'所涉及的機(jī)理，所述機(jī)理公開于本文，并包括鑒定負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶，和這些磷酸酶在AMPK響應(yīng)苯乙福明和其類似物(如美福明)中的作用。PPM1F可以優(yōu)先地與AMPKotl結(jié)合。因此在--,些方而，本發(fā)明涉及PPM1F在AMPKal去磷酸化中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及AMPKal的純化方法，該方法包括富集或純化PPM1F。PPM1E可以優(yōu)先與AMPKa2結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及AMPKa2的純化方法，該方法包括富集或純化PPM1E。PPM1E和PPM1F可以結(jié)合。因此在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及PPM1E的純化方法，該方法包括富集或純化PPM1F。相反地，在一些實(shí)施方案中本發(fā)明涉及PPM1F的純化方法，該方法包括富集或純化PPM1E。更多的應(yīng)用優(yōu)選地，本發(fā)明的應(yīng)用為體外應(yīng)用。更優(yōu)選地，涉及美福明的本發(fā)明的應(yīng)用為體外應(yīng)用。更優(yōu)選地，涉及苯乙福明的本發(fā)明的應(yīng)用為體外應(yīng)用。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可以包括篩選磷酸酶活性活化劑的試劑，在此情況中可以簡(jiǎn)單地顛倒比較PPM磷酸酶活性的步驟(如測(cè)定是否其在本發(fā)明方法的所述第一樣品中的活性比在本發(fā)明方法的所述第二樣品中要低)，因此，當(dāng)所述第一樣品中的活性相對(duì)于所述第二樣品增加時(shí)，可以將此試劑確定為活化劑。特別優(yōu)選地是化合物，如為磷酸酶活性抑制劑的候選試劑。如實(shí)施例所述，適合的試劑為細(xì)胞中(如細(xì)胞裂解物中)磷酸酶活性的抑制劑。對(duì)磷酸酶沽性的作用(如抑制)可以是直接或間接的。試劑可以與磷酸鵬或AMPKIL接結(jié)合或不直接結(jié)合。試劑可以影響磷酸酶和AMPK之間的相互作甩，如通過降低或抑制相互作用或通過促進(jìn)解離。因此，木發(fā)明還涉及對(duì)能夠影響AMPK和磷酸酶之間相互作用的試劑進(jìn)行的試驗(yàn)。這可能是通過如實(shí)施例中所述的在被測(cè)試試劑存在下抑制或促進(jìn)共免疫沉淀，或通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它技術(shù)來進(jìn)行。關(guān)鍵的試驗(yàn)是磷酸酶活性是否在體外受到影響，以及任選地這種影響是否在如細(xì)胞中(如在細(xì)胞裂解物中)被確定。本發(fā)明的目的是鑒定關(guān)鍵磷酸酶的抑制劑，其目標(biāo)是在受試者中抑制這些磷酸酶，以便增加或保持AMPK磷酸化和由此的活性，這在如糖尿病的治疔中卜分有用。適合地磷酸酶為PPM1E。適合地磷酸酶為PPM1F。適合地磷酸酶為PPM1E和PPM1F(如混合物，或包含PPM1E和PPM1F的結(jié)合物或復(fù)合物)。圖1顯示了在未處理的HEK293細(xì)胞中或用10mM苯乙福明處理1小時(shí)的HEK293細(xì)胞中，I型蛋白磷酸酶的分析結(jié)果。A:在4個(gè)未處理和4個(gè)處理的樣品中AMPK在Thrl72上的磷酸化水平。將抗PP5-TPR結(jié)構(gòu)域抗體用作內(nèi)參。分子量(kDa)在圖的左側(cè)標(biāo)出。B:在4nM岡田酸存在下，使用磷酸化酶a作為底物，在處理和未處理的HEK293細(xì)胞裂解物中PP1磷酸化酶磷酸酶的活性。數(shù)據(jù)為一式三份的測(cè)量中四個(gè)樣品的平均值士SEM。C:在200nM1-2存在下，使用磷酸化酶a作為底物，在處理和未處理的HEK293細(xì)胞裂解物中PP2A磷酸化酶磷酸酶的活性。數(shù)據(jù)為一式三份測(cè)量中四個(gè)樣品的平均值土SEM。圖2顯示了在未處理的細(xì)胞裂解物中或用lOmM苯乙福明處理1小時(shí)的細(xì)胞裂解物屮，具有岡田酸抗性的Mg、衣賴型磷酸酶(PPM磷酸酶)的活性。A:在10mMMgAc和5pM岡田酸存在下，使用酪蛋白作為底物，在處理和未處理的HEK293細(xì)胞裂解物中PPM磷酸酶的活性。數(shù)據(jù)是---式兩份測(cè)量中五個(gè)獨(dú)立樣品的平均值士SEM。(p<0.001)。B:在10mMMgAc和5pM岡田酸存在下，使用酪蛋白作為底物，在處理和未處理的HeLa細(xì)胞裂解物中PPM磷酸酶的活性。數(shù)據(jù)是一式兩份測(cè)量中四個(gè)獨(dú)立樣品的平均士SEM。(p〈0細(xì))。圖3顯示了使用酪蛋白作為底物，在與1mM苯乙福明預(yù)孵育后重組的PPM磷酸酶的活性。細(xì)菌表達(dá)的PPM磷酸酶與或不與1mM苯乙福明孵育15分鐘，隨后在10mMMgAc和5pM岡田酸存在下，使用32P酪蛋白作為底物進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)-式二份進(jìn)行。圖4顯示了在未處理的HEK293細(xì)胞中或用苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞中PPM磷酸酶的水平。未處理或用10mM苯乙福明處理1小時(shí)的HEK293細(xì)胞裂解物的免疫印跡。使用針對(duì)所述PPM酶產(chǎn)生的抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡。每次處理給出兩個(gè)代表性的樣品。圓括號(hào)中指明了預(yù)測(cè)的分子量(kDa)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量(kDa)在圖的左側(cè)標(biāo)出。圖5顯示了用FPLC分離后來自處理和未處理的HEK293細(xì)胞裂解物的PPM磷酸酶的活性。將來自對(duì)照或苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞的裂解物用0.45pm和0.22|im過濾器進(jìn)行過濾，并使用HiTrap脫鹽柱進(jìn)行脫鹽。使用HR5/5Source15-Q柱根據(jù)蛋白的凈電荷來分離蛋白。分析各部分的蛋白濃度，且在10mMMgAc和5pM岡田酸存在下，使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物測(cè)定每個(gè)部分中PP2C磷酸酶活性。圖6顯示了在未處理或用苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞中PPM磷酸酶的活性。在未處理或用10mM苯乙福明處理1小時(shí)的HEK293細(xì)胞裂解物中的PPM磷酸酶的活性。從對(duì)照或苯乙福明處理的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出單獨(dú)的同種型，并在10mMMgAc和5nM岡田酸存在下，使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物測(cè)定活性。數(shù)據(jù)為一式三份進(jìn)行的試驗(yàn)的平均活性。圖7顯示了PPM1E和PPM1F的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。保守的區(qū)域以陰影線區(qū)域顯示；黑框代表在所有家族成員中都具有保守性的PP2C特征基序(YFAVFDGHG)，且灰框表示在PPM1中未發(fā)現(xiàn)的--'段酸性殘基。圖8的表顯示/將PPM磷酸酶從FPLC柱上洗脫的鹽濃度。對(duì)用FPLC分離HEK293細(xì)胞裂解物后收集到的餾分進(jìn)行免疫印跡。圖中顯示了各個(gè)酶洗脫的大約鹽濃度，以及所檢測(cè)到的條帶的預(yù)測(cè)分子量(kDa)和觀察分子量(kDa)。圖9顯示了代表未處理或用苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞中PPM磷酸酶活性的條形圖(圖6屮顯示的絕對(duì)數(shù)據(jù)的％比例)。圖10顯示了條形圖。圖11和12分別顯示了免疫印跡的照片?，F(xiàn)以舉例的方式描述本發(fā)明。這些實(shí)施例的目的是說明，而非限制所附帶的權(quán)利要求。實(shí)施例實(shí)施例l:雙胍對(duì)AMPK磷酸化的作用為了測(cè)定蛋白磷酸酶的作用是否部分介導(dǎo)雙胍(如美福明或苯乙福明)的作用，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以研究美福明類似物苯乙福明是否影響可以使AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶的活性，描述了苯乙福明對(duì)蛋白磷酸酶的作用。為了研究苯乙福明對(duì)AMPK活性的作用，在37。C下用10mM苯乙福明刺激血清饑餓的HEK293細(xì)胞1小時(shí)。在包含可以保持AMPK的磷酸化狀態(tài)的l)iM微囊藻毒素-LR的裂解緩沖液中裂解細(xì)胞。使用針對(duì)磷酸肽產(chǎn)生的抗體進(jìn)行免疫印跡，所述磷酸肽對(duì)應(yīng)于AMPK的催化Thrl72殘基周圍區(qū)域。在用苯乙福明刺激后可以觀察到AMPK的Thrl72磷酸化的增加(圖1A，上部)。實(shí)施例2:雙胍對(duì)蛋白磷酸酶活性的作用為了研究雙胍對(duì)蛋白磷酸酶活性的作用，對(duì)未處理或用雙胍(如上所述，此實(shí)施例中為10mM苯乙福明)處理的HEK293細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡，或使用磷酸酶抑制劑和活化劑以及不同磷酸化底物的組合測(cè)定特定蛋白磷酸酶的活性。因?yàn)镠EK293細(xì)胞中PP5的活性很低，所以使用針對(duì)所述蛋白TPR結(jié)構(gòu)域的抗體通過免疫印跡測(cè)試PP5的水平。沒有觀察到苯乙福明應(yīng)答引起的PP5的水平變化(圖1A，下部)。測(cè)定在對(duì)苯乙福明的響應(yīng)中PP1的活性，方法是使用32P標(biāo)記的磷酸化酶a作為底物，連同包含在反應(yīng)物中以抑制PP2A活性的4mM岡田酸和包含在反應(yīng)物中以抑制金屬離子活化的蛋白磷酸酶的EGTA(0.1-2mM)。在未刺激和10mM苯乙福明刺激的細(xì)胞裂解物之間未能檢測(cè)出PP1磷酸化酶磷測(cè)試PP2A的活性對(duì)苯乙福明的響應(yīng)，方法是使用32P標(biāo)記的磷酸化酶a作為底物，但是對(duì)于此試驗(yàn)，包含200nM1-2和抑制金屬離子活化的蛋白磷酸酶的EGTA(0.1-2mM)以抑制PP1。未能檢測(cè)出未刺激和10mM苯乙福明刺激的細(xì)胞裂解物之間存在PP2A磷酸化酶磷酸酶活性的變化(圖1C)。尸/W,吝條微對(duì)PP2C(PPM1)和PPM家族相關(guān)成員的活性進(jìn)行測(cè)試，方法是使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物，連同包含在反應(yīng)物中以抑制PP2A的5)iM岡田酸，和己知是PP2C活性所需的10mM乙酸鎂(IngebritsenandCohen,19835V'/ewc'evol221，pp331-338;Ingebritsen1983五w廠B/0c/2ewvo/132,pp263-274)。與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，在苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞中，具有岡田酸抗性的Mg^依賴型酪蛋白磷酸酶的活性(下文稱為PPM磷酸酶活性)降低了20%(圖2A)，表明苯乙福明在細(xì)胞中(即體內(nèi))對(duì)該活性的抑制作用。在缺少LBK1(AMPK的一種上游活化物)的HeLa細(xì)胞中，苯乙福明不能活化AMPK(Hawley等，2003j:&o/vo/2,p28)。為了測(cè)試苯乙福明在此細(xì)胞系中是否具有相似作用，對(duì)未處理或用lOmM苯乙福明處理的HeLa細(xì)胞中的PPM磷酸酶活性進(jìn)行測(cè)試。同時(shí)，在用苯乙福明處理的細(xì)胞中能夠觀察到PPM磷酸酶活性下降~20%(圖2B)。在此實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量了許多PP2C同種型的活性，且觀察到的20%下降可能代表僅有一種所述同種型的活性有較嚴(yán)重的下降。使用2mM美福明代替lOmM苯乙福明進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。在用美福明處理的細(xì)胞中同樣觀察到PPM磷酸酶活性下降20%。因此，這首次表明雙胍(如苯乙福明和美福明)為PPM磷酸酶活性的抑制劑，Mi以乎是所述活性的特異性抑制劑。實(shí)施例3:雙胍對(duì)PPM家族成員的活性的作用蛋白磷酸酶PPM家族包括至少16個(gè)結(jié)構(gòu)上不同，且具有不同底物特異性的同種亂。為了確定這些磷酸酶中哪些可能因響應(yīng)雙胍而改變了活性，對(duì)細(xì)菌表達(dá)的PPM酶進(jìn)行測(cè)試。在單獨(dú)與緩沖液預(yù)孵育后或與緩沖液和1mM雙胍(:此實(shí)施例中為苯乙福明)-一起預(yù)孵育后，測(cè)試與各個(gè)酶相關(guān)的PPM磷酸酶的活性。在能夠以活性形式農(nóng)達(dá)的這些酶屮(PPM1A、PPM1B、PDPC1、PDPC2和Nerpp)，在對(duì)照樣品中和與苯乙福明預(yù)孵育的樣品中未檢測(cè)出差異。在這樣的試驗(yàn)條件下，細(xì)菌表達(dá)的PPMlF和ILKAP顯示出對(duì)磷-酪蛋白無活性(圖3)。在此實(shí)驗(yàn)中未測(cè)試PPM1D、PPM1E和PPM1G。實(shí)施例4:雙胍對(duì)PPM家族成員水平的作用為了確定雙胍是否能夠?qū)θ魏蜳PM磷酸酶的水平產(chǎn)生作用，使用抗體進(jìn)行免疫印跡。針對(duì)PPM1A、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1F、PPM1G和ILKAP產(chǎn)生的抗體所產(chǎn)生的條帶靠近所述酶的預(yù)測(cè)分子量，盡管PPM1D還產(chǎn)生許多其它條帶。在未處理細(xì)胞中和用雙胍(此實(shí)施例中為苯乙福明)刺激的那些細(xì)胞中未檢測(cè)出這些酶在水平上的差異(圖4)。針對(duì)PPM1E和PDPC1的抗體不產(chǎn)生任何信號(hào)，然而PDPC2和Nerpp分別在錯(cuò)誤的分子大30小處以及一般的染色背景下產(chǎn)生一模糊條帶。實(shí)施例5:在由FPLC分離的處理的和未處理的細(xì)胞裂解物中的PPM的活性為了確定雙胍(如苯乙福明)所抑制的確切的PPM磷酸酶，對(duì)來自未處理的和苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行過濾和脫鹽，然后根據(jù)凈電荷通過FPLC對(duì)其進(jìn)行分離。收集各個(gè)分離部分(每個(gè)500jul)，并測(cè)量每.部分中的總PPM磷酸酶活性?？梢栽谟眉s150mMNaCl和500mMNaCl從FPLC柱上洗脫的未處理樣品和苯乙福明處理樣品之間檢測(cè)到蛋白磷酸,活性上的一些微小差異(圖5)。通過來自FPLC柱的各部分的免疫印跡可以鑒定出一些PPM磷酸酶和它們的洗脫鹽濃度(參見圖8的表)，然而此方法沒有鑒定出圖5中可見的最大峰。在此實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)PPM1G和ILKAP的抗體鑒定出大小不正確的條帶，然而不能檢測(cè)到PPM1D、PPM1E、Nerpp禾卩PDPC1?？赡苁腔钚允鼙揭腋Ｃ饕种频腜PM在約150mMNaCl或500mMNaCl處從FPLC柱上洗脫(圖5)。不受到評(píng).論束縛，此結(jié)果不排除這樣的可能性，即與其中一種PPM同種型結(jié)合約小分子在杵上被洗掉，因此不能檢測(cè)到之前觀察到的活性變化。實(shí)施例6:雙胍對(duì)特定PPM酶的活性的作用為了更確切的測(cè)定受雙胍影響的PPM磷酸酶，對(duì)與各種PPM酶相關(guān)的PPM磷酸,的活性進(jìn)行評(píng)估。在此實(shí)施例中，雙胍為美福明和苯乙福明。使用肽抗休進(jìn)行PPM磷酸酶的免疫沉淀，所述PPM磷酸酶來自于末處理或已經(jīng)用10mM苯乙福明處理的HEK293細(xì)胞裂解物(圖6/圖9;參照?qǐng)D9，比例為容易比較的百分比例，原丙是圖6中的絕對(duì)值可以根據(jù)非實(shí)質(zhì)性實(shí)驗(yàn)因素如32P標(biāo)記的加入水平而改變)。對(duì)于與PPM1A1、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1G、1LKAP、Nerpp、PDPC1或PDPC2相關(guān)的PPM磷酸酶，沒有檢測(cè)到變化。然而，有趣地是在用苯乙福明處理后PPM1E的活性兒乎完全被去除，而密切相關(guān)的PPM1F的活性下降了40G/。(圖6)。在對(duì)來白未處理HEK293細(xì)胞的PPM1E免疫沉淀物進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡后，使用針對(duì)PPM1E的抗體未檢測(cè)到信號(hào)。實(shí)施例7:雙胍對(duì)PPP磷酸酶無作用，但抑制PPM磷酸酶雙胍(如苯乙福明)通過增加a亞基Thrl72殘基的磷酸化引起HEK293細(xì)胞中AMPK的活化。因?yàn)镠eLa細(xì)胞缺少LKBl(AMPK的一種上游激酶)，這種作用在這些細(xì)胞中降低。LKB1自身的活性不受苯乙福明的影響，因此重要的是測(cè)試苯乙福明是否能夠影響負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶的活性。我們認(rèn)為對(duì)岡田酸不敏感的蛋白磷酸酶負(fù)責(zé)完整細(xì)胞中AMPK的去磷酸化，且已經(jīng)報(bào)道的證據(jù)提示金屬離子依賴型PP2C(PPM1)可能負(fù)責(zé)體內(nèi)AMPK的去磷酸化，而在體外PP2A和PP2Ca(PPM1A)都能完成此任務(wù)。用苯乙福明刺激HEK293細(xì)胞對(duì)PP1或PP2A的活性(根據(jù)體外磷酸酶試驗(yàn)測(cè)定)或?qū)P5的水平?jīng)]有作用。然而，在HEK293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞屮，苯乙福明能夠?qū)PM磷酸酶活性抑制約20%。與PPM酶可能是負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的主要磷酸酶的證據(jù)-起，這產(chǎn)生一種可能性，即苯乙福明可能發(fā)揮抑制PPM酶活性的作用，并由此提高AMPK的活性。因?yàn)楸绢I(lǐng)域中尚不知道苯乙福明活化AMPK的確切機(jī)理，所以抑制蛋白磷酸酶活性代表抗糖尿病藥活化AMPK的新機(jī)理。因此，可以證明PPM磷酸酶為所述疾病的治療性干預(yù)標(biāo)靶。實(shí)施例8:雙胍對(duì)PPM酶的作用PPM酶存在多種不同的同種型，且雙胍(如苯乙福明)預(yù)孵育不影響細(xì)菌表達(dá)的多種PPM磷酸酶的酪蛋白磷酸酶活性。能夠表達(dá)并純化PPM1A、PPM1B、PPM1F、PDPC1、PDPC2、ILKAP和Nerpp?？梢栽赑PM1A1、PPM1B、PDPC1、PDPC2和Nerpp的制品屮檢測(cè)到酪蛋白磷酸酶活性，但是其不受1mM濃度的苯乙福明預(yù)孵育的影響，這對(duì)苯乙福明直接結(jié)合并抑制這些酶的作用提出了質(zhì)疑。由于這些純化的酶未顯現(xiàn)出針對(duì)磷-酪蛋白的活性，從此特定實(shí)驗(yàn)中無法對(duì)PPM1F或ILKAP做出結(jié)論。針對(duì)個(gè)休PPM酶的特異性抗體未能檢測(cè)出多種PPM磷酸酶在水平上的仟何變化。這些免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)苯乙福明改變PPM1A1、PPM1B1、PPM1B2、PPM1D、PPM1F、PPM1G或ILKAP水平的作用提出了質(zhì)疑。這些特定的免疫實(shí)驗(yàn)不能確定PPM1E、PDPC1、PDPC2或Nerpp的水平是否受苯乙福明的影響。通過FPLC分離PPM活性產(chǎn)生兩個(gè)主要的磷酸酶活性峰。這提示來自骨骼肌裂解物的兩個(gè)活性峰代表PP2Ca(PPM1A)和PP2C卩(PPM1B)，而在HEK293細(xì)胞中每個(gè)峰包含一個(gè)以上的PPM磷酸酶活性。使用針對(duì)PPM磷酸酶的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀并檢測(cè)與各個(gè)PPM酶相關(guān)的酪蛋白磷酸酶的活性。有趣地是，在雙胍苯乙福明或美福明處理的細(xì)胞中，PPM1E的活性幾乎完全消失，PPM1F的活性減少至未處理細(xì)胞水平的60%。PPM1E和PPM1F是兩種密切相關(guān)的酶，在核心磷酸酶結(jié)構(gòu)域和同源旁側(cè)序列上具有66%的相似性，且均包含融合的PIX結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PPM1E參與p21活化激酶PAK的去磷酸化。已經(jīng)證明，PPM1F能夠使自磷酸化的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴型蛋白激酶II(CaMKII)以及CaMKI和CaMKIV的催化性Thr286殘基去磷酸化。圖10顯示了在用2mM美福明處理或未處理的HEK293細(xì)胞中PPM磷酸酶PPM1A1和PPM1E的活性。在裂解前，用2mM美福明處理HEK293細(xì)胞10分鐘。將來自未處理或類福明處理的HEK293細(xì)胞裂解物的PPM1Al和PPM1E同種型進(jìn)行免疫沉淀(一式三份)，并使用"P標(biāo)記的酪蛋白作為底物，在10mM乙酸鎂和5岡田酸存在下對(duì)活性進(jìn)行測(cè)定。使用免疫前抗體(pre-immuneantibody)對(duì)每種裂解物進(jìn)行一式三份的對(duì)照免疫沉淀，并從PPM磷酸酶免疫沉淀計(jì)算的活性中減去該活性。顯示出相對(duì)于未處理的PM1A1的活性。表明了美福明處理基木上特異性地敲減了PPM1E的活性。在人蛋白、激酉每組(kinome)(http:〃www.kinase.com/human/kinome)中，蛋白激酶被分為許多不同的激酶家族，依據(jù)是其催化結(jié)構(gòu)域序列的相似性、催化結(jié)構(gòu)域外的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)、其已知的生物學(xué)功能和其分類在其它種類中的比較。蛋白激酶AMPK和CaMKK家族均包含在CaMK超家族內(nèi)。AMPK和CaMK的調(diào)節(jié)有趣地相似；兩種酶的別構(gòu)活化均需要通過它們的適當(dāng)配體(AMP用于AMPK，Ca^/鈣調(diào)蛋白用于CaMKK)，隨后在活化環(huán)內(nèi)進(jìn)行蘇氨酸殘基的磷酸化。此處所述的結(jié)果有至少兩種可能含義第，考慮到CaMK和它們的上游激酶CaMKKa和CaMKK卩之間的結(jié)構(gòu)相似性，PPM1E和PPM1F可能起到對(duì)CaMKK同種型去磷酸化的作用，因此降低了它們的活性，并由此降低了AMPK的活性。第二，考慮到上述CaMK和AMPK活化的保守機(jī)制，以及AMPK和CaMKs均位于同一蛋白激酶超家族內(nèi)的事實(shí)，PPM1E和PPM1F可能起到直接對(duì)AMPK去磷酸化的作用。不論哪種設(shè)想都證明雙胍(如苯乙福明)能夠抑制AMPK去磷酸化中涉及的蛋白磷酸酶活性。由此，證明PPM磷酸酶是用于AMPK活性調(diào)節(jié)的有效治療試劑，且PPM磷酸酶抑制劑也同樣為優(yōu)秀的候選治療劑。實(shí)施例9:雙胍對(duì)PPM家族蛋白磷酸酶成員的作用此處顯示的數(shù)據(jù)是鑒定負(fù)責(zé)AMPK去磷酸化的蛋白磷酸酶和抗糖尿病藥(如關(guān)福明和苯乙福明)的標(biāo)靶的研究結(jié)果。這些化合物降低血糖水平的機(jī)制之一是通過增加AMPK的活性；本領(lǐng)域中尚缺乏對(duì)這種作用機(jī)制的了解。我們公開/在對(duì)雙胍化合物的響應(yīng)屮，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PPM家族的一個(gè)或多個(gè)成員參與提高AMPK的活性。PPM家族蛋白磷酸酶PPM1E和PPM1F在對(duì)美福明/苯乙福明的響應(yīng)中發(fā)揮AMPK去磷酸化的作用，這是一個(gè)重要的進(jìn)展。與包含AMPK(n的復(fù)合物相比，包含AMPK&的復(fù)合物對(duì)AMP的依賴性更大，并集中在細(xì)胞核中，推定它們?cè)诖颂帉?duì)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)而使AMPKa2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，但是本領(lǐng)域中對(duì)其發(fā)生的機(jī)理尚不清楚。PPM1E和PPMIF在其磷酸酶結(jié)構(gòu)域上具有64%的同源性，但是PPM1E在N-和C-末端均有較大區(qū)域沒有同源性(圖7)。已經(jīng)鑒定出在PPM1EC-末端具有兩種核定位信號(hào)，并鑒定出對(duì)其功能至關(guān)重要的-些堿性殘基。PPM1F、CaMKI、CaMKIl和CaMKK卩特異性地定位于細(xì)胞質(zhì)，而PPMlE、CaMKIV和CaMKKa特異性地定位于細(xì)胞核，這提不細(xì)胞內(nèi)存在兩個(gè)CaMK調(diào)節(jié)體系，且PPMIE和PPM1F在細(xì)胞內(nèi)可能起互補(bǔ)作用。在使用針對(duì)PPM1E蛋白C-末端殘基產(chǎn)生的抗體(與本研究中所用的抗體相似)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，PPMIE主要大量表達(dá)于腦中。不受任何理論的束縛，可能是該蛋白在其它組織中的表達(dá)較低，也可以解釋在這些特定實(shí)驗(yàn)中通過免疫印跡未檢測(cè)出蛋白。存在于腦屮的多數(shù)PPM1E以在細(xì)胞質(zhì)中最豐富的截短形式存在，這使得PPM1E可能能夠?qū)Π|(zhì)和細(xì)胞核CaMK家族蛋白激酶進(jìn)行去磷酸化的可能性加大。已知美福明可以通過降低肝葡萄糖的生成和增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的吸收來降低葡萄糖和脂類，且AMPK首先被假定為美福明藥物作用的潛在調(diào)節(jié)子，但是美福明活化AMPK的機(jī)理在本領(lǐng)域中一直是個(gè)謎團(tuán)。已經(jīng)證明，美福明能夠抑制呼吸鏈中的復(fù)合物I，并由此可以削弱線粒體的功能和細(xì)胞呼吸，從而抑制肝葡萄糖的生成并提高葡萄糖的利用。美福明主要通過抑制肝糖原的分解來抑制葡萄糖的生成。這與美福明參與提高細(xì)胞內(nèi)AMP:ATP的比例稍有矛盾。已有報(bào)道美福明通過不依賴腺嘌呤核苷酸的機(jī)制活化AMPK，但另一報(bào)道指出將更強(qiáng)的雙胍苯乙福明與多種類型的細(xì)胞孵育可以增加AMP:ATP的比例。由于美福明對(duì)AMP:ATP比例的作用在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)存在但功效較低，閑而對(duì)該功效進(jìn)行檢測(cè)似乎較為困難。美福明對(duì)PPM1E和/或PPM1F活性的抑制以及這種抑制是否依賴于AMP:ATP的比例的變化可能很重要。因?yàn)殁}和鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)CaMK家族的活性并由此調(diào)節(jié)AMPK的活性，所以鈣和鈣調(diào)蛋白也可能對(duì)PPM1E和PPM1F產(chǎn)生作用。在此處顯示的實(shí)驗(yàn)所用的試驗(yàn)條件下，在反應(yīng)混合物中不存在鈣離子。可以使用向反應(yīng)混合物中加入鈣和Z或EGTA的進(jìn)一歩實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)鈣對(duì)這匙酶的活性以及美福明/苯乙福明對(duì)它們的抑制是否具有任何作用。此外為了了解磷酸酶PPM1E和PPM1F是否能夠?qū)aMK蛋白激酶超家族的特定成員進(jìn)行去磷酸化，可以利用比磷-酪蛋白特異性更強(qiáng)的底物。這也可以幫助評(píng)價(jià)在對(duì)未刺激細(xì)胞的提取物進(jìn)行,免疫沉淀后，美福明/苯乙福明對(duì)PPMlE活性的直接作用。利用短千擾RNA(siRNA)的研究可以用于證明是否PPM1E和PPM1F水平的敲減對(duì)AMPK活性具有深切作ffl，以及美福明/苯乙福明在缺少磷酸酶時(shí)是否活化AMPK。所述研究可用于評(píng)價(jià)這些酶中各個(gè)酶在體內(nèi)對(duì)其底物去磷酸化所做的相對(duì)貢獻(xiàn)。實(shí)施例10:試驗(yàn)/篩選本實(shí)施例說明了用于在糖尿病或肥胖癥藥物中的候選試劑的鑒定方法。該方法包括提供PPM磷酸酶的候選抑制劑，提供包含PPM磷酸酶的第一樣品和第二樣品，使所述候選抑制劑與包含PPM磷酸酶的所述第-一樣品接觸，以及測(cè)試所述第一樣品和第二樣品的PPM磷酸酶活性。在此實(shí)施例中，所述PPM磷酸酶是PPM1E。用從氨基酸序列KTHDIPCPDLPWSY得到的抗體對(duì)PPM1E進(jìn)行免疫小球化。在10mMMg^或癒2+離子和5岡田酸存在下使用32P標(biāo)記的酪蛋白作為底物的蛋白磷酸酶試驗(yàn)中，測(cè)定免疫小球中的磷酸酶活性。在此實(shí)施例中，試驗(yàn)按照以下進(jìn)行將清洗的免疫小球重懸于10pl緩沖液B中。在3(TC下和30pl體積中，使用1pM-10"P標(biāo)記的底物進(jìn)行蛋白磷酸酶試驗(yàn)。在此實(shí)施例中，32P標(biāo)記的酪蛋白底物是使用蛋白激酶A的催化亞基部分水解的、標(biāo)記有[y32P]ATP的牛奶酪蛋白(Sigma，PooleUK)，標(biāo)記有["2p]ATP)。將32P標(biāo)記的底物和磷酸酶抑制劑/活化劑分別在緩沖液C中稀釋。通過將10jil緩沖液B中的免疫小球與10|il的抑制劑/活化劑或緩沖液C混合，并將混合物在3CTC下孵育10分鐘來進(jìn)行試驗(yàn)。通過加入10)il"P標(biāo)記的底物來啟動(dòng)試驗(yàn)。隨后在3(TC下以1200ipm將被分析物搖動(dòng)孵育更長(zhǎng)吋間(15分鐘)，并通過加入10020%(重量/體積)三氯乙酸終止反應(yīng)?？焖俚溞旌衔?，并在14,000xg下離心5分鐘?；厥?00pl上清，并在Wallac1409液體閃爍計(jì)數(shù)器t通過Cerenkov計(jì)數(shù)測(cè)量釋放的32P。緩沖液A50mMTris-HClpH7.5、O.lmMEGTA、0.1%(休積/體積)2-巰基乙醇。緩沖液B包含1mg/mlBSA的緩沖液A。緩沖液C包含0.0％(體積/體積)Brij-35的緩沖液A。隨后比較所述第一樣品和所述第二樣品中的PPM磷酸酶活性；當(dāng)所述第一樣品中的活性低于所述第二樣品時(shí)，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病或肥胖癥藥物中的候選試劑。實(shí)施例11:確認(rèn)PPM為標(biāo)耙為了進(jìn)一歩表征本文所討論的信號(hào)通路中元件之間的關(guān)系，且為了提供其它方法以確認(rèn)本發(fā)明方法所鑒定的候選化學(xué)物，我們對(duì)分子間相互作用進(jìn)行了研究。使用共價(jià)偶聯(lián)有AMPKal、AMPKa2、一些PPM和對(duì)照IgG的Sepharose珠子從HEK293細(xì)胞裂解物中免疫吸附其各自的抗原。結(jié)果顯示在表11和表12中。清洗免疫小球(IP)，將其溶解在20plSDS凝膠上樣緩沖液中，并通過SDS-PAGE和所示抗體的免疫印跡進(jìn)行分析。條帶的大小(千道爾頓)示于右手側(cè)。#柳滅在50mMTris-HClpH7.5、lmMEGTA、lmMEDTA、1%(體積/體積)IgepalCA-630(NP-40代替物)、1mM原釩酸鈉、10mM(3-甘油磷酸鈉、50mM氟化鈉、5mM焦磷酸鈉、0.27M蔗糖、5mMN-乙基馬來酰亞胺、"完全"蛋白酶抑制劑混合物(一片/50ml)中裂解HEK293細(xì)胞。在50mMTris-HC1pH7.5、150mM氯化鈉、"完全"蛋白酶抑制劑混合物(一片/50ml)中將裂解物約5倍稀釋至1mg/ml。在含100嗎蛋白的細(xì)胞裂解物稀釋液中加入抗體-Sepharose(由10Sepharose珠子和10嗎抗體制備)，進(jìn)行免疫吸附。在4。C進(jìn)行免疫吸附3小時(shí)后，將免疫小球在13,000xg下離心5分鐘，并用冰冷的50mMTris-HClpH7.5、150mM氯化鈉清洗兩次。親和純化針對(duì)其各自人抗原的抗體，以l嗎/ml的濃度將其用于印跡，并通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)AMPKod(344-CTSPPDSFLDDHHLTR-358)產(chǎn)生的抗AMPKal抗體和針對(duì)AMPKa2(352-CMDDSAMHIPPGLKPH-366)產(chǎn)生的抗AMPKa2抗體來自于D.G.Hardie教授(鄧迪大學(xué))。針對(duì)PPM1A1(369-KNDDTDSTSTDDMW-382)產(chǎn)生的抗PPM1A1抗體、針對(duì)ILKAP(373-KAVQRGSADNVTVMV-387)產(chǎn)生的抗ILKAP抗體、針對(duì)PPM1E(728-RSSLPWRQNSWK-739)產(chǎn)生的抗PPM1E抗體和針對(duì)PPM1F(439-LPSSLPEPETQAPPRS-454)產(chǎn)生的抗PPM1F抗體、針對(duì)PPM1K(359-FSFSRSFASSGRWA-372)產(chǎn)生的抗PPM1K抗體在HilaryMcLauchlan博士和JamesHastie博士(鄧迪大學(xué))管理的DivisionofSignalTransductionTherapy中制備。抗PHLIPP-L抗體來自NovusBiologicals(Littleton,Colorado)。對(duì)照IgG是免疫前IgG片段(pre-immuneIgG)，其來自未產(chǎn)生免疫反應(yīng)的綿羊的血清。圖11顯示內(nèi)源PPM1F存在于內(nèi)源AMPKal(泳道2)而非AMPKa2(泳37道3)的免疫小球中。相反的免疫小球顯示AMPKal(泳道7)而非AMPKa2存在于PPM1F免疫小球中。需要注意在一些情況下PPM1E和PPM1F可以結(jié)合，從而導(dǎo)致PPM1E免疫小球中存在一些PPM1F(泳道6)。內(nèi)源PPM1E的免疫小球顯示存在內(nèi)源AMPKa2的條帶而非AMPKal的條帶(圖12)。與AMPKal和AMPKa2結(jié)合的一些PPM磷酸酶的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>上表顯示了在AMPKal或AMPKa2的IP中存在或缺少指出的PPM磷酸酶。上表中的數(shù)據(jù)列出了實(shí)驗(yàn)中所測(cè)試的不存在于AMPKal的IP中的PPM。此外，有數(shù)據(jù)提示在AMPKal的IP中可發(fā)現(xiàn)PPM1F。在AMPKa2的IP中獲得的PPM1E的信號(hào)很低。不受理論束縛，PPM1E抗體可能不能很好地進(jìn)行IP，因此出于此原因，IP中的AMPKa2可能很低(可由免疫印跡檢測(cè)的)。在任何情況下，都應(yīng)該注意圖11和圖12中所示的IP為內(nèi)源蛋白(而非過表達(dá)蛋白)，這對(duì)操作有技術(shù)上的要求。然而，所顯示的內(nèi)源蛋白的數(shù)據(jù)在科學(xué)上為相互作用提供了非常有力的支持，并因此驗(yàn)證了本文所公開的標(biāo)靶和方法。實(shí)施例12:體外PPM試驗(yàn)證明了用于糖尿病或肥胖癥藥物的候選試劑的鑒定方法。該方法包括提供PPM磷酸酶的候選抑制劑，提供包含PPM磷酸酶的第一個(gè)樣品第二樣品，使所述候選抑制劑與包含PPM磷酸酶的所述第一樣品接觸，以及測(cè)試所述第一樣品和第二樣品的PPM磷酸酶活性。在此實(shí)施例中，所述PPM磷酸酶是PPM1E。在此實(shí)施例中，在大腸桿菌中產(chǎn)生PPM1A1，詳述參見Davis等1995(Davies,S.R，Helps,N.R.,Cohen,P.T.W.和Hardie，D.G.(1995)FEBSLett.377,421-425，5、AMP抑制去磷酸化，并促進(jìn)AMP活化蛋白激酶的磷酸化；研究使用細(xì)菌表達(dá)的人蛋白磷酸酶2Qx和同種的天然牛蛋白磷酸酶2AC。*)。更具體地，除了在15T:誘導(dǎo)表達(dá)外，根據(jù)Davies等GM/.)的教導(dǎo)，在缺少或存在Mi^+時(shí)在大腸桿菌中表達(dá)GST-PPMl(230-755){2/3的羧基末端}和GST-PPM1F(2隱454){全長(zhǎng)}。在存在抑制PP1和PP2A類活性的岡田酸的情況下，通過從谷胱廿肽-S-轉(zhuǎn)移酶肽底物GST-(GGGGRRAT[pjVA)3釋放的，P]-正磷酸鹽來測(cè)定PPM磷酸酶的活性。通過用蛋白激酶A(PKA)進(jìn)行磷酸化來制備GST-(GGGGRRAT[plVA)3磷酸酶底物。在由50mMTris-HClpH7.0、O.lmMEGTA、10%甘油、10mM乙酸鎂、0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇、0.1mM[^P]ATP組成的緩沖液中，將2mg細(xì)齒表達(dá)的GST-(GGGGRRATVA)3與1-2mUPKA在30°C、輕搖下孵育過夜。通過在谷胱t-J:肽-Sepharose柱上進(jìn)行柱層析，并用50mMTris-HClpH7.0、O.lmMEGTA、10。/oLt'油、10mM乙酸鎂、0.1%(體私V體積)2-巰基乙醇、20mM谷胱甘肽洗脫，從未結(jié)合的放射性核苷酸中分離標(biāo)記的GST-(GGGGRRAT[P]VA)3。試驗(yàn)時(shí)，在加入前將GST-(GGGGRRATWVA)3稀釋至1-4(iM。磷酸酷;的試驗(yàn)在30°C、持續(xù)搖動(dòng)下，于30(il的總體積中進(jìn)行10分鐘。所試驗(yàn)的第一樣品和第二樣品包含含所述磷酸酶的20|il緩沖液，并且第一樣品中包含所述候選抑制劑，在加入10^32P標(biāo)記的GST-(GGGGRRAT^VA)3磷酸酶底物前，將所述第-一樣品和第二樣品在30°C下孵育2分鐘。十分鐘后，通過加入100^1120%三氯乙酸終止反應(yīng)。隨后將試管再渦旋1分鐘，以確保完全混合，并在室溫下于16,000xg下離心5分鐘。從每個(gè)反應(yīng)中轉(zhuǎn)移100)il上清至新的Eppendorf管中，并在液體閃爍計(jì)數(shù)器上通過Cerenkov計(jì)數(shù)測(cè)量。酸-鉬酸鹽提取物具有很小的蛋白酶活性污染。磷酸酶試驗(yàn)組合物(終濃度)50mMTris-HClpH7.00.1mMEGTA10mM乙酸鎂2mM氯化錳(II)5岡田酸0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇根據(jù)制備，試驗(yàn)中所用磷酸酶的質(zhì)量通常為10ng-10嗎。隨后比較所述第一樣品和所述第二樣品中的PPM磷酸酶活性；當(dāng)所述第一樣品中的活性低于所述第二樣品，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病實(shí)施例13:高通量試驗(yàn)實(shí)施例10或12的試驗(yàn)可以以高通量形式進(jìn)行。在此實(shí)驗(yàn)中試樣以非放財(cái)性形式讀數(shù)。其它細(xì)節(jié)與實(shí)施例IO或12相同，但以下除外IO分鐘試驗(yàn)后(在加入三氯乙酸前)，可以通過向100^試樣中加入包含10mg/mltJ酸銨和0.38mg/ml孔雀石綠的150pl1NHC1，對(duì)磷酸鹽的釋放進(jìn)行測(cè)定。室溫下(如18-25°0進(jìn)行20分鐘后，測(cè)定620nm處的吸光度。在此形式中，250pl樣品的吸光度可以在平板讀數(shù)器上讀出。隨后比較所述第一樣品和所述第二樣品中的PPM磷酸酶活性；當(dāng)所述第一樣品中的活性低于所述第二樣品，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病或肥胖癥藥物中的候選試劑。以上說明書提到的全部出版物通過引用并入本文。本發(fā)明所述的方面和實(shí)施方案的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，并不脫離本發(fā)明的范圍。雖然本發(fā)明連同優(yōu)選的具體實(shí)施方案-起描述，但是應(yīng)該理解木發(fā)明所要求的權(quán)利不應(yīng)僅限于所述具體實(shí)施方案。實(shí)際上，用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的所述模式的各種修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，其落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、鑒定用于糖尿病或肥胖癥的藥物的候選試劑的方法，所述方法包括(i)提供PPM磷酸酶的候選抑制劑，(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一樣品和第二樣品，(iii)使所述候選抑制劑與包含PPM磷酸酶的所述第一樣品接觸，和(iv)測(cè)試所述第一樣品和第二樣品的PPM磷酸酶活性，其中，所述PPM磷酸酶選自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M組成的組；其中，如果所述第一樣品中的PPM磷酸酶活性低于所述第二樣品，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病或肥胖癥藥物中的候選試劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PPM磷酸酶為PPM1E禾口/或PPM1F。3、根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述疾病為糖尿病。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述糖尿病為n型糖尿病。5、根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利耍求所述的方法，其中所述候選抑制劑為美福明或苯乙福明類似物或衍生物。6、糖尿病或肥胖癥的治療或預(yù)防方法，其包括抑制受試者的PPM磷酸o7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述PPM磷酸酶選自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L禾卩PPM1M組成的組。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述PPM磷酸酶為PPM1E。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述PPM磷酸酶為PPM1F。10、美福明或苯乙福明在抑制PPM型蛋白磷酸酶中的應(yīng)用，其中所述PPM磷酸酶選自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPMlL禾flPPM〗M組成的組。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所述PPM型蛋白磷酸酶為PPM1E或PPM1F。12、用于抑制PPM磷酸酶的美福明或苯乙福明，其中所述PPM磷酸酶選自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L禾卩PPM1M組成的組。13、美福明或苯乙福明在組合物屮用作PPM磷酸酶抑制劑的應(yīng)用。14、苯乙福明或其類似物在增強(qiáng)或保持AMPK的磷酸化中的應(yīng)用。15、PPM1E或PPM1F在AMPK的去磷酸化中的應(yīng)用。16、美福明或苯乙福明在p-21活化激酶(PAK)的活化中的應(yīng)用。17、美福明或苯乙福明在抑制Ca鈣調(diào)蛋白依賴型激酶II(CaMKII)的去磷酸化中的應(yīng)用。18、由權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的試劑，其用作藥物。19、由權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的試劑在制備用于糖尿病或肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。20、由權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的試劑，其用于糖尿病或肥胖癥的治療中。21、糖尿病或肥胖癥的治療或預(yù)防方法，其包括向受試者施用包含權(quán)利要求18或19中任一項(xiàng)所述的藥物的組合物，其中所述藥物不包括美福明或苯乙福明。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)用于糖尿病或肥胖癥的藥物中的候選試劑進(jìn)行鑒定的方法，所述方法包括(i)提供PPM磷酸酶的候選抑制劑，(ii)提供包含PPM磷酸酶的第一樣品和第二樣品，(iii)使所述候選抑制劑與包含PPM磷酸酶的所述第一樣品接觸，和(iv)測(cè)試所述第一和第二樣品的PPM磷酸酶活性，其中，所述PPM磷酸酶選自由PPM1E、PPM1F、PPM1J、PPM1K、PPM1L和PPM1M組成的組，其中，如果所述第一樣品中的PPM磷酸酶活性低于所述第二樣品，則所述候選抑制劑被鑒定為用于糖尿病(優(yōu)選為II型糖尿病)或肥胖癥藥物中的候選試劑。本發(fā)明涉及美福明和苯乙福明在作為PPM磷酸酶的抑制劑上的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K45/00GK101588843SQ200780050335公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日發(fā)明者帕特麗夏·湯森·韋德·科恩申請(qǐng)人:醫(yī)藥研究委員會(huì)