專利名稱：用于傷口愈合的改進(jìn)方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本領(lǐng)域涉及傷口愈合和組織修復(fù)，并涉及連接蛋白、連接蛋白半通道和間隙連接， 包括具有一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、對(duì)傷口愈合有用的藥劑、和/ 或間隙連接修飾劑的組合物，含有這種組合物的制品和試劑盒以及遞送裝置，和含有這種 組合物的制劑，以及治療傷口和疾病、紊亂或病癥的方法，該傷口和疾病、紊亂或病癥的特 征在于其整體或部分是急性的、延遲的或不完全的傷口愈合或其會(huì)受益于改善的組織修復(fù) 或愈合。
背景技術(shù)：
以下包括可以用于理解本發(fā)明的信息。我們不承認(rèn)本文中所提供的任何信息是先 有技術(shù)，或與所描述或要求的本發(fā)明相關(guān)，或明確或隱含地參考的任何出版物或文獻(xiàn)是先 有技術(shù)。在人或其它哺乳動(dòng)物中，傷口損傷會(huì)引發(fā)細(xì)胞和生化事件的組織的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這 在大多數(shù)情況下都會(huì)導(dǎo)致傷口愈合。理想的愈合傷口是恢復(fù)正常的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、功能以及 細(xì)胞、組織、器官和生物體水平的外觀。傷口愈合過(guò)程，無(wú)論是由于外傷、微生物還是外來(lái)物 質(zhì)所引起，都是經(jīng)由包括許多重疊階段的復(fù)雜過(guò)程進(jìn)行的，這些階段包括炎癥、上皮形成、 血管形成和基質(zhì)沉積。一般而言，這些過(guò)程都會(huì)導(dǎo)致形成成熟的傷口和一定程度上的疤痕 形成。盡管炎癥和修復(fù)主要沿著規(guī)定的過(guò)程發(fā)生，但是該過(guò)程的敏感性取決于各種愈傷分 子的平衡，包括例如調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的網(wǎng)絡(luò)。間隙連接是有利于直接的細(xì)胞_細(xì)胞通信的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。間隙連接通道由兩個(gè)連 接子(半通道)構(gòu)成，每一個(gè)連接子由六個(gè)連接蛋白亞單元構(gòu)成。每一個(gè)六聚體連接子與相 對(duì)膜中的一個(gè)連接子對(duì)接以形成單個(gè)間隙連接。據(jù)報(bào)道，在遍及整個(gè)機(jī)體內(nèi)都能找到間隙 連接通道。例如，諸如角膜上皮的組織具有6至8層細(xì)胞，然而在不同的層中也表達(dá)不同的 間隙連接通道，在基底層中是連接蛋白43，而在基底層到中間翼細(xì)胞層為連接蛋白26。一 般而言，連接蛋白是一個(gè)蛋白家族，通常根據(jù)其分子量命名或基于系統(tǒng)發(fā)生的基礎(chǔ)分成α、 β和Y亞類。已經(jīng)確定了至少20種人類和19種鼠科動(dòng)物的同種型。據(jù)報(bào)道，不同組織和 細(xì)胞類型具有連接蛋白表達(dá)的特征圖譜，且已經(jīng)證實(shí)在損傷或移植之后組織表現(xiàn)出改變連 接蛋白的表達(dá)(Qui, C. et al.，(2003)Current Biology, 13 1967-1703 ；Brander et al.， (2004)，J. Invest Dermatol. 122 1310-20)。反義技術(shù)已經(jīng)提出用于調(diào)整病毒、真菌和代謝病中隱含的基因表達(dá)。參見(jiàn)例如美 國(guó)專利第 5，166，195 號(hào)(HIV 的寡核苷酸抑制劑(oligonucleotide inhibitors of HIV)) 和美國(guó)專利第5，004，810號(hào)(用于與單純皰疹病毒Vmw65 mRNA雜交并抑制復(fù)制的低聚
7物(oligomers for hybridizing to herpes simplex virus Vmw65 mRNAand inhibiting replication)) ο也參見(jiàn)授予Becker和Green的美國(guó)專利第7,098，190號(hào)(連接蛋 白中包含反義核苷酸的配方〃 Formulationscomprising antisense nucleotides to connexin")。也已經(jīng)有間隙連接和半通道的肽抑制劑的報(bào)道。例如參見(jiàn)Berthoud，V. Μ. et al. , Am J. Physiol. Lung Cell MoI. Physiol. 279 :L619-L622(2000) ；Evans, W. H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29 606-612, 以 及 De Vriese Α.S. , et al. Kidney Int. 61 177-185 (2001)。還參見(jiàn) Becker 和 Green 的 PCT/US06/04131 (抗連接蛋白混合物 及其應(yīng)用〃 anti-connexincompounds and uses thereof" ) 已經(jīng)研究了各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子以確定其在傷口愈合中作為治療性介入的 潛力。然而，除血小板源性生長(zhǎng)因子(Regranex 中的活性成分)之外在美國(guó)都還沒(méi)有被 批準(zhǔn)銷售。而且，盡管在理解傷口愈合過(guò)程進(jìn)行的原理方面取得了進(jìn)展，但是對(duì)于適用于傷 口護(hù)理以及改善和/或促進(jìn)傷口愈合的治療性選項(xiàng)還存在顯著不足的需求，包括延遲的或 缺乏免疫力的傷口的愈合，如慢性傷口、與傷口有關(guān)的腫脹、炎癥和疤痕形成、該傷口包括 急性和亞急性傷口。

發(fā)明內(nèi)容
本文中所描述和要求保護(hù)的本發(fā)明具有許多屬性和實(shí)施方式，包括但不限于在發(fā) 明內(nèi)容部分中提出或描述或參照的那些。并不是意在所有都包括在內(nèi)，但是本文中所描述 和要求保護(hù)的本發(fā)明并不限于發(fā)明內(nèi)容部分中確定的特征或?qū)嵤┓绞交蛘呤艿狡湎拗疲?所包含的內(nèi)容僅僅出于舉例說(shuō)明的目的而不是要進(jìn)行限制。本發(fā)明大體上涉及一種或多種抗連接蛋白藥劑(例如，連接蛋白抑制劑，如α-1 連接蛋白脫氧寡核苷酸和α-1抗連接蛋白肽或擬肽)，其與一種或多種治療劑、用于傷口 愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑組合來(lái)進(jìn)行傷口治療的應(yīng)用，這些傷口包括急性傷口、 亞急性傷口、延遲愈合傷口和慢性傷口。本發(fā)明通過(guò)使用一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、用于傷口愈合 的藥劑和/或間隙連接修飾劑而增加了傷口愈合的速率、程度和/或質(zhì)量。在一種優(yōu)選實(shí) 施方式中，一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、用于傷口愈合的藥劑和/或 間隙連接修飾劑的組合使用對(duì)于促進(jìn)傷口愈合具有加性效應(yīng)、協(xié)同效應(yīng)或超加性效應(yīng)。在 另一優(yōu)選實(shí)施方式中，一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、用于傷口愈合的 藥劑和/或間隙連接修飾劑的組合使用，與這些藥劑單獨(dú)給藥時(shí)有效的劑量相比，可以降 低這些藥劑使用的劑量。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多 種治療劑、用于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑的組合使用，與這些藥劑單獨(dú)使用 時(shí)的給藥頻率相比，可以降低給藥頻率。本發(fā)明披露并要求保護(hù)采用抗連接蛋白藥劑與其它治療劑、用于傷口愈合的藥 劑、和/或間隙連接修飾劑組合使用的組合物和方法。本發(fā)明包括含有(a)治療有效量的抗連接蛋白藥劑和(b)用于傷口治療或促進(jìn)傷 口愈合的治療有效量的另一種治療劑的藥物組合物。本發(fā)明包括含有(a)治療有效量的抗 連接蛋白藥劑和(b)治療有效量的間隙連接修飾劑的藥物組合物。優(yōu)選地，該藥物組合物 進(jìn)一步包含藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
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本發(fā)明藥物組合物以組合的、同時(shí)的、分別連續(xù)的或持續(xù)給藥的方式來(lái)提供。在一 種實(shí)施方式中，含有一種或多種抗連接蛋白藥劑的組合物與一種或多種治療劑、用于傷口 愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑同時(shí)給藥或大致同時(shí)給藥。藥物組合物也以組合制劑的形式提供，例如，作為一種或多種抗連接蛋白藥劑與 一種或多種用于傷口愈合的其它藥劑的混合物，這些其它藥劑例如是有效促進(jìn)或改善傷口 愈合的生長(zhǎng)因子，例如血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如， FGF2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 3 ；和/或有效促進(jìn)或改善傷口愈合的細(xì)胞因 子，例如IL-7和IL-10 ；和/或有效促進(jìn)或改善傷口愈合的其它藥劑，例如IGF(如，IGF-1) 和 IGFBP (例如，IGFBP-2)。術(shù)語(yǔ)“組合制劑”包括“套裝試劑盒(kit of parts)”，其意思是如上文所限定的 組合配方(combination parner)成分能夠獨(dú)立給藥或通過(guò)使用與不同于組合配方(a)和 (b)的用量的不同固定組合來(lái)給藥，即同時(shí)給藥、分別給藥或連續(xù)給藥。例如，然后試劑盒部 件就能同時(shí)或按時(shí)序錯(cuò)開(kāi)，即對(duì)于試劑盒部件中任何組件在不同時(shí)間點(diǎn)并以相等的或不同 的時(shí)間間隔錯(cuò)開(kāi)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合制劑給藥會(huì)由于使用這種組合而具有更少的給藥 時(shí)間點(diǎn)和/或給藥之間的時(shí)間間隔增加。一方面，本發(fā)明包括藥物組合物，包括局部遞送形式和制劑，該藥物組合物含有藥 用載體和治療有效量的抗連接蛋白藥劑和一種或多種本文中描述的藥劑。抗連接蛋白藥劑 的實(shí)例包括抗連接蛋白寡聚脫氧核苷酸(“0DN”)，包括反義(包括修飾的和未修飾骨架反 義)、RNAijP siRNA，以及抗連接蛋白肽類和擬肽類。適合的抗連接蛋白藥劑包括例如，針 對(duì)連接蛋白43、26、37、30和31. 1以及32的反義0DN、肽和擬肽。在某些實(shí)施方式中，適合 的組合物包括多種抗連接蛋白藥劑，包括例如連接蛋白43、26、30和31. 1，與一種或多種有 助于傷口愈合和/或組織修復(fù)的其它藥劑的組合。優(yōu)選的抗連接蛋白藥劑是直接針對(duì)抗連 接蛋白43的。與一種或多種抗連接蛋白藥劑組合以用于使傷口愈合的優(yōu)選藥劑包括某些 生長(zhǎng)因子，例如包括血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子α、成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 3，以及胰島素樣生長(zhǎng)因子。與一種 或多種抗連接蛋白藥劑組合以用于使傷口愈合的其它優(yōu)選藥劑包括某些細(xì)胞因子，包括例 如IL-7和IL-10。與一種或多種抗連接蛋白藥劑組合以用于使傷口愈合的其它優(yōu)選藥劑包 括胸腺素β _4、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、β腎上腺素拮抗劑(例如，噻嗎洛爾)、白細(xì)胞 介素-1受體拮抗劑(例如，阿那白滯素)、游離自由基清除劑(例如，N-乙酰半胱氨酸)， 以及含有用于促進(jìn)或改善傷口愈合的蛋白編碼序列的基因療法載體(例如，包括編碼血小 板源性生長(zhǎng)因子-B序列的腺病毒載體)。與一種或多種抗連接蛋白藥劑組合給藥的優(yōu)選治 療劑包括例如，抗炎劑、抗微生物劑(例如，甲氧芐啶)、局部麻醉劑和表層麻醉劑、以及局 部阿片類藥(例如，嗎啡、氫嗎啡酮和芬太尼)。另一方面，本發(fā)明包括向帶有傷口受試者給予以延遲釋放制劑、緩釋制劑、持續(xù)釋 放制劑、控釋制劑和/或以重復(fù)作用制劑形式配制的治療有效量的一種或多種藥用抗連接 蛋白藥劑和一種或多種治療性藥劑、用于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑的方法， 該傷口包括特征為整體上或部分延遲愈合或未完全傷口愈合的傷口。在某些其它方面，本發(fā)明還涉及利用這樣的組合物治療患有與創(chuàng)傷有關(guān)的各種疾
9病、紊亂和病癥或者具有患病的危險(xiǎn)的受試者的方法，其中的創(chuàng)傷包括急性的和亞急性的 傷口、以及延遲愈合的傷口或慢性傷口。另一方面，本發(fā)明包括用于治療具有或疑似患病或易感染特征為整體或部分有傷 或需要修復(fù)組織的任何疾病、紊亂和/或病癥或具有患病危險(xiǎn)的受試者的方法。這樣的組 合物包括例如局部遞送形式和制劑。優(yōu)選的方法包括連續(xù)給予或同時(shí)給予一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種 有助于傷口愈合的藥劑，其中的一者或兩者都按照低于(一種或多種)藥劑單獨(dú)給藥時(shí) (即當(dāng)它們既不是物理組合也不是在治療傷口的過(guò)程中組合給藥時(shí))所使用的劑量提供。 這種藥劑的較小給藥劑量典型地為藥劑單獨(dú)給藥時(shí)劑量的約十二分之一至約十分之一，并 可以為單獨(dú)給藥時(shí)的約八分之一的劑量，約六分之一的劑量，約五分之一的劑量，約四分之 一的劑量，約三分之一的劑量和約一半的劑量。優(yōu)選地，給藥連續(xù)進(jìn)行。優(yōu)選地，藥劑在彼 此間隔至少約半小時(shí)的時(shí)間內(nèi)連續(xù)給藥。藥劑也可以在彼此間隔約1小時(shí)內(nèi)、彼此間隔約 一天到約一周或者以其它認(rèn)為合適的方式來(lái)給藥。優(yōu)選地，首先給予抗連接蛋白藥劑。在 使用一種或多種抗連接蛋白藥劑的情況下，優(yōu)選在給予阻斷或降低連接蛋白表達(dá)或半通道 或間隙連接形成的抗連接蛋白藥劑(例如通過(guò)下調(diào)連接蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)的抗連接蛋白 藥劑)之前給予抗連接蛋白肽或抗連接蛋白擬肽，例如能夠阻斷或降低半通道開(kāi)放的抗連 接蛋白藥劑。優(yōu)選地，該抗連接蛋白藥劑是(一種或多種)抗連接蛋白43藥劑。另一方面，本發(fā)明包括能夠粘附或與受試者皮膚結(jié)合的透皮貼劑、敷料、襯墊、纏 繞帶(wrap)、基質(zhì)和繃帶，所述的物品能夠向受試者遞送治療有效量的一種或多種藥用抗 連接蛋白藥劑和一種或多種其他藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾 劑。另一方面，本發(fā)明包括一種制造的制品，其包括盛裝治療有效量的一種或多種藥 用抗連接蛋白藥劑和一種或多種促進(jìn)傷口愈合的藥用治療劑的容器以及包括用于治療受 試者用途的使用說(shuō)明書。另一方面，本發(fā)明包括一種制造的制品，其包括盛裝治療有效量的一種或多種藥 用抗連接蛋白藥劑和一種或多種促進(jìn)傷口愈合或有助于傷口愈合的藥用治療劑的容器以 及包括用于治療受試者用途的使用說(shuō)明書。另一方面，本發(fā)明包括一種制造的制品，其包括盛裝治療有效量的一種或多種藥 用抗連接蛋白藥劑和一種或多種藥用間隙連接修飾劑的容器以及包括用于治療受試者用 途的使用說(shuō)明書。本發(fā)明包括一種制造的制品，其包括含有一種或多種劑量形式的一種或多種藥用 抗連接蛋白藥劑和一種或多種藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑 的包裝材料，其中該包裝材料具有標(biāo)簽，指明該劑量形式能夠用于患有或疑似患有或有易 感本文所描述的或引用的任何疾病、紊亂和/或病癥，包括整體上或部分地以急性、受損、 緩發(fā)或慢性傷口愈合為特征的疾病、紊亂和/或病癥。這樣的劑量形式包括，例如，局部遞 送形式和制劑。本發(fā)明包括一種制劑，該制劑包含藥用抗連接蛋白藥劑和以治療有效量促進(jìn)受試 者傷口愈合或組織修復(fù)的有助于傷口愈合的藥用藥劑。本發(fā)明包括一種制劑，該制劑包含 藥用抗連接蛋白藥劑和以治療有效量促進(jìn)受試者傷口愈合的藥用藥劑。本發(fā)明包括一種制
10劑，該制劑包含藥用抗連接蛋白藥劑和以治療有效量促進(jìn)受試者傷口愈合的藥用間隙連接 修飾劑。這樣的制劑包括，例如，局部遞送形式和制劑。優(yōu)選的制劑包括一種或多種抗連接 蛋白藥劑和一種或多種有助于傷口愈合的藥劑，其中的一者或二者都以低于該藥劑或該些 藥劑單獨(dú)使用時(shí)所用用量或劑量(即當(dāng)它們既不進(jìn)行物理組合也不在治療傷口療程中組 合給藥時(shí))來(lái)提供。這種以組合方式給予或提供較小劑量的藥劑典型地為藥劑單獨(dú)給藥時(shí) 劑量的約十二分之一到約十分之一的量，并可以為單獨(dú)給藥時(shí)的約八分之一的量，約六分 之一的量，約五分之一的量，約四分之一的量，約三分之一的量和約一半的量。本發(fā)明包括在藥品的制造中使用治療有效量的含有一種或多種藥用抗連接蛋白 藥劑和一種或多種藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑的組合物的 方法。這樣的藥品包括，例如局部遞送的形式和制劑。這樣的藥品包括治療如本文中所披 露的受試者的那些藥品。正如本文中所提到的，這樣的藥品優(yōu)選包括用量降低的一種或多 種藥用抗連接蛋白藥劑和一種或多種藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接 修飾劑。本發(fā)明包括在一種劑型的生產(chǎn)中使用治療有效量的一種或多種藥用抗連接蛋白 藥劑和一種或多種藥用治療劑、對(duì)傷口愈合有用的和/或間隙連接修飾劑的方法。這樣的 劑型包括，例如局部遞送的形式和制劑。這樣的劑型包括治療本文中所公開(kāi)的受試者的那 些劑型。正如本文中所提到的，這樣的劑型優(yōu)選包括用量降低的一種或多種藥用抗連接蛋 白藥劑和一種或多種藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑。另一方面，本發(fā)明提供了包括向受試者給予本發(fā)明的藥物組合物而用于治療傷口 例如包括急性的、亞急性的、緩發(fā)性的和慢性傷口的治療方法。另一方面，本發(fā)明提供了抗連接蛋白藥劑(例如，抗-α-lODN、肽或擬肽)和治療 藥劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑在生產(chǎn)用于促進(jìn)需要治療的患者的傷 口愈合的藥物產(chǎn)品中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)或增強(qiáng)傷口愈合或治療，或者預(yù)防或改善纖維化或 其它纖維化病癥的方法，該方法包括向需要治療的患者給予一種或多種抗連接蛋白藥劑和 一種或多種治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑。在某些其它方面，本發(fā)明提供了 (i)包含抗連接蛋白藥劑和其與治療劑、有助于 傷口愈合的藥劑和/或促進(jìn)(例如，縮短愈合時(shí)間，改善傷愈效果)傷口愈合的間隙連接修 飾劑組合的使用說(shuō)明的包裝；(ii)包含一種或多種治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或 間隙連接修飾劑以及它們與一種或多種促進(jìn)傷口愈合的抗連接蛋白藥劑組合的使用說(shuō)明 的包裝；和(iii)包含一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、有助于傷口愈合 的藥劑和/或間隙連接修飾劑及其在促進(jìn)傷口愈合或減少傷口相關(guān)的纖維化方面的使用 說(shuō)明的包裝。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物產(chǎn)品與傷口敷料或傷愈促進(jìn)基質(zhì)組合提供。提 供傷口敷料或基質(zhì)的適當(dāng)形式包括含有分散于固體基底之上或之中的抗連接蛋白藥劑和 一種或多種治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑的固體基底?？惯B接蛋白藥劑和治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑可以在 同一組合物中給予或者由分別的組合物給予。優(yōu)選地，正如本文中所提到的，這些藥劑以減 少用量的一種或多種藥用抗連接蛋白藥劑和一種或多種藥用治療劑、有助于傷口愈合的藥
11劑和/或間隙連接修飾劑來(lái)給藥?？惯B接蛋白藥劑和治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑可以同 時(shí)、連續(xù)或分別地向患者給藥。如果連續(xù)給藥，則優(yōu)選將抗連接蛋白藥劑和治療劑、有助于 傷口愈合的藥劑和/或間隙連接修飾劑連續(xù)給藥。優(yōu)選地，這些藥劑在彼此間隔至少約半 小時(shí)內(nèi)連續(xù)給藥。這些藥劑也可以在彼此間隔約1小時(shí)內(nèi)，在彼此間隔約1天到1周內(nèi)或 者按照其它認(rèn)為合適的方式給藥。優(yōu)選地，首先給予抗連接蛋白藥劑。在使用一種或多種 抗連接蛋白藥劑的情況下，優(yōu)選在給予阻斷或降低連接蛋白表達(dá)或半通道或間隙連接形成 的抗連接蛋白藥劑(例如通過(guò)下調(diào)連接蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)的抗連接蛋白藥劑)之前給予抗 連接蛋白肽或抗連接蛋白擬肽，例如能夠阻斷或降低半通道開(kāi)放的抗連接蛋白藥劑。優(yōu)選 地，該抗連接蛋白藥劑是(一種或多種)抗連接蛋白43藥劑。以下將提供本發(fā)明的這些和其它方面，但這都不應(yīng)該限制發(fā)明內(nèi)容部分中的信息 或受到發(fā)明內(nèi)容部分中的信息的限制。


圖IA至圖II描述了傷口處的Cx43的表達(dá)。圖IA描述了傷口處的Cx43基因表 達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。圖IA描述了用對(duì)照sODN(n = 4，開(kāi)口柱)和Cx43as0DN(n = 4 ；填充 柱)治療的傷口中在第1天和第7天Cx43對(duì)GAPDH的相對(duì)表達(dá)水平；數(shù)據(jù)表示為平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤差*P < 0. 05。圖IB至圖IF描述了用雙苯酰亞胺(bis-benzimide)核染色(藍(lán)) 對(duì)用Cx43as0DN(圖IB 1天，圖2D 2天，圖IF :7天)或?qū)φ罩委煹膫?圖IC :1天，圖 1E:2天和圖1G:7天)實(shí)施的Cx43染色(綠)。圖IH和圖II描述了在傷口邊緣中成像位 置的圖示。(圖1H)圖像B-E。(圖II)圖像F和G。圖2A至圖2H描述了受傷后的細(xì)胞增殖。圖2A至圖2D描述了通過(guò)對(duì)對(duì)照ODN (圖 2A 第2天，圖2C 第7天)和Cx43as0DN(圖2B 第2天，圖2D 第7天)中的抗BrdU單克 隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色而實(shí)施的傷口處的細(xì)胞增殖分析。箭頭和箭分別指示傷口邊 緣和前緣。圖2E至圖2H描述了 BrdU染色的細(xì)胞；⑴和表皮(圖2E :n = 5)和新生表皮 (圖2F:n = 5)中傷口邊緣每個(gè)區(qū)域的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目；(ii)在皮膚傷口邊緣(圖 2G:n = 5)和形成的肉芽組織(圖2H:n = 5)中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。以平均值士標(biāo)準(zhǔn) 誤差表示計(jì)數(shù)，*P < 0. 05。刻度條表示200 μ m。圖3A至圖3C描述了中性白細(xì)胞募集進(jìn)入傷口位置。圖3A和圖3B描述了中性白 細(xì)胞募集到用對(duì)照sODN(圖3A)處理和Cx43as0DN處理(圖3B)并在第1天采用抗MPO抗 體進(jìn)行分析的皮膚傷口中。圖3C描述了用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱在第1天η = 4 ；在第2天η =5)和Cx43as0DN(填充柱在第一天η = 3 ；在第二天η = 4)治療之后傷口位置MPO陽(yáng) 性細(xì)胞的數(shù)目。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ< 0.05?？潭葪l表示50 μ m。圖4A至圖4C描述了巨噬細(xì)胞募集到傷口位置。圖4A和圖4B描述了巨噬細(xì)胞募 集進(jìn)入用對(duì)照sODN(圖4A)和Cx43as0DN(圖4B)治療的皮膚傷口，采用抗F4/80抗體在 第7天進(jìn)行分析。圖4C描述了用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱在第2天η = 4 ；在第7天η = 7)和 Cx43as0DN(填充柱在第2天η = 34 ；在第7天η = 6)治療之后在第2天和第7天巨噬細(xì) 胞募集到皮膚傷口中。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*Ρ< 0.01?？潭葪l表示50 μ m。圖5々至圖58描述了(^12和1順-(1在傷口位置的表達(dá)。圖5A和圖5B描述了 Ccl2
12和TNF-α在傷口位置基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。將用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱)或CX43as0DN(填 充柱)治療后在第1、2和7天(對(duì)于每一個(gè)n = 5)Ccl2(圖5A)和TNF-α (圖5B)對(duì)GAPDH 的相對(duì)表達(dá)水平的定量化。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P < 0. 05。圖6A至圖6K描述了 TGF-β 1的表達(dá)。圖6Α至圖6J描述了用對(duì)照sODN(圖6A 至圖6E)和Cx43as0DN(圖6F至圖6J)治療的傷口位置的TGF-β 1的免疫組織化學(xué)?？?度條表示200 μ m(圖6A和圖6F)和50 μ m(圖6B至圖6E，以及6G至圖6J)。黑箭頭示出 了表皮的新生邊緣。相對(duì)于對(duì)照sODN(圖6D和圖6E)處理的傷口表皮，Cx43as0DN處理 的傷口(圖61和圖6J)表皮中的TGF-β 1染色強(qiáng)得多。紅箭頭和黑箭頭分別示出了典型 的TGF-β 1伸長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和圓形的推定的白細(xì)胞(presumptive leukocyte)。 圖6K描述了用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱)或CX43as0DN(填充柱)治療的傷口位置的TGF-β 1的 mRNA在第1、2和7天(每一個(gè)η = 5)表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤 差，*Ρ < 0. 05。圖7Α至圖7F描述了肉芽組織的形成和成纖維細(xì)胞的遷移。圖7Α和圖7Β描述了 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞募集進(jìn)入用對(duì)照sODN(圖7A)和CX43as0DN(圖7B)治療的皮膚傷口中， 采用TRITC-鬼筆環(huán)肽(TRITC-Phalloidin)和DAPI核染色在第2天進(jìn)行分析。圖7C描述 了觀察用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱n = 5)或CX43as0DN(填充柱n = 5)治療的傷口時(shí)每個(gè)區(qū)域 內(nèi)每一傷口位置處成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)目。圖7D描述了顯示用Cx43as0DN治療后遷移 顯著地更快的成纖維細(xì)胞遷移的傷愈分析結(jié)果。圖7E和圖7F描述了在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基 中的傷口圖像；其為受傷時(shí)(圖7E)和傷后4小時(shí)(圖7F)的圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P < 0. 02 **P < 0. 01?？潭葪l表示50 μ m。圖8A至圖8B描述了傷口位置中的膠原表達(dá)。圖8A描述了在用對(duì)照sODN(開(kāi)口 柱)和CX43as0DN(填充柱)治療的傷口位置通過(guò)定量測(cè)定受傷后在第7、10和14天和未 受傷皮膚(η = 5)中的羥脯氨酸(HP)含量而評(píng)估的膠原含量。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn) 誤差，P < 0. 05。圖8B描述了用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治療的傷口 位置在第1、2和7天(每一個(gè)n = 5)Colla 1的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。數(shù)據(jù)表示為 平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，*P < 0. 05。圖9A至圖9C描述了肉芽組織濃度。圖9A和圖9B描述了在對(duì)照sODN治療(圖 9A)和asODN治療(圖9B)的傷口中第14天傷口肉芽組織H&E染色。圖9C描述了用對(duì)照 sODN(開(kāi)口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治療之后的第5天(對(duì)照物n = 7，asODN :n = 6)、 第 7 天(對(duì)照物n = 5，asODN :n = 5)、第 10 天(對(duì)照n = 5，asODN :n = 6)和第 14 天 (對(duì)照n = 5, asODN :n = 6)分析的肉芽組織區(qū)域。在用asODN治療之后肉芽組織區(qū)域在 第5天的測(cè)定已經(jīng)顯示出面積稍有減小，但是在第7、10和14天面積減小變得很顯著(*P < 0. 05. < 0. 01)。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差?？潭葪l表示1mm。圖10A至圖10C描述了傷口位置處的細(xì)胞凋亡。圖10A和圖10B描述了在第7天 以對(duì)照s0DN(圖10A)和Cx43as0DN(圖10B)治療的傷口中肉芽組織的TUNEL染色。死亡 的細(xì)胞顯示為亮綠色點(diǎn)、其中一些已用箭頭加亮?？潭葪l表示50μπι。圖10C描述了在第 5、7和10天(每一個(gè)η = 6)觀察用對(duì)照sODN(開(kāi)口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治療的 傷口位置中每個(gè)視野區(qū)域的死亡細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差?？潭葪l表示 50 μ m0
圖IlA至圖IlF描述了傷口位置處成肌纖維細(xì)胞的成熟。圖IlA和圖IlD描述了 第7天的傷口中用雙苯酰亞胺核染色(藍(lán))對(duì)肉芽組織邊緣(圖IlA和圖11B)和在10天 傷口中用雙苯酰亞胺核染色(藍(lán))對(duì)肉芽組織中心(圖IlC和圖11D)進(jìn)行的抗-α平滑肌 肌動(dòng)蛋白(SMA)染色(綠)。圖IlE描述了定量化染色水平，這表明，在第7天(P = 0. 004) Cx43as0DN治療傷口中的SMA染色顯著地多于對(duì)照，表明肌成纖維細(xì)胞的較早成熟和分化。 在第10天當(dāng)大多數(shù)SMA染色和成肌纖維細(xì)胞在Cx43as0DN治療傷口中消失時(shí)，仍然存在這 種較早的成熟，而在對(duì)照傷口中染色仍然十分強(qiáng)烈(P = 0. 000002)。圖IlF描述了在肉芽 組織中成像位置的圖示區(qū)域1(圖IlA和圖11B)和區(qū)域11(圖IlC和圖11D)。數(shù)據(jù)表示 為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差?？潭葪l表示25 μ m。圖12A至圖12H描述了傷口位置的血管形成。圖12A至圖12F描述了傷后第7天 (圖12A和圖12B)、第10天(圖12C和圖12D)第14天(圖12E和圖12F)用雙苯酰亞胺核 染色(藍(lán))對(duì)肉芽組織新生血管的血管假性血友病因子的染色(綠)。在反義治療的傷口 (圖12A、圖12C和圖12E)中，血管在早期時(shí)間點(diǎn)(第7天圖12A和圖12B以及第10天圖 12C和圖12D)的形成更廣泛且明顯好于用對(duì)照ODN治療的情況(圖12B、圖12D和圖12F)， 與對(duì)照的情況相比對(duì)照ODN治療導(dǎo)致染色顯著減少(7天*P = 0. 0019 ；10天= 0. 015)。 到第14天，asODN組中的血管尺寸已經(jīng)顯著增加，并與對(duì)照具有相似大小的尺寸(圖12G)。 圖12H描述了肉芽組織中成像位置的圖示區(qū)域1(圖12A和圖12B)和區(qū)域11(圖12C至 圖12E)。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差?？潭葪l表示25 μ m。圖13A至圖13B描述了與對(duì)照治療相比，asODN治療后傷口愈合的肉眼可見(jiàn)圖像 (圖13A)和在傷口區(qū)域中的相對(duì)變化(圖13B)。圖14描述了人角膜緣(Human Limbal rim)-脫落的豬間質(zhì)基質(zhì)嵌合體。圖15描述了連接到用于檢測(cè)120種不同生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的蛋白水平的抗體 芯片(antibody array)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的實(shí)例。每個(gè)兩陣列膜上載有四個(gè)樣品(每 個(gè)具有重復(fù)且具有陰性和陽(yáng)性對(duì)照的膜有60種生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子)。圖16描述了在培養(yǎng)基中2周后，與異源嵌合體的角膜緣區(qū)域相比異源嵌合體間質(zhì) 中的生長(zhǎng)因子水平分析。這就是對(duì)照角膜(未經(jīng)反義處理)。對(duì)兩種生長(zhǎng)因子特別感興趣 (箭頭)。在異源嵌合體基質(zhì)中IGFBP-2的水平非常高，而在角膜緣中IGF-I的水平更高。 據(jù)報(bào)道，前者對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞遷移(其對(duì)于間質(zhì)角膜細(xì)胞使切口(stoma)從角膜緣再增殖可 能很重要)很重要，而后者對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞增殖(其在可能對(duì)在角膜緣中提供增加切口的細(xì) 胞來(lái)源很重要)很重要。圖17描述了在培養(yǎng)基中2周后與異源嵌合體的角膜緣區(qū)域相比異源嵌合體基質(zhì) 中的生長(zhǎng)因子水平分析(基于CX43as0DN治療的角膜的數(shù)據(jù))。對(duì)兩種生長(zhǎng)因子特別感 興趣(箭頭)。與未處理的對(duì)照物相比，在經(jīng)反義處理的異源嵌合體間質(zhì)中具有高水平的 IGF-7，而與未處理的對(duì)照物尤其是對(duì)照角膜緣相比，在角膜緣和間質(zhì)中都具有更高水平的 IGFBP-2。據(jù)報(bào)道，前者對(duì)于促進(jìn)上皮生長(zhǎng)(其與在反義處理的異源嵌合體中所觀察到的上 皮再生的增加一致)很重要，而后者對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞遷移(其與從反義處理的角膜緣的上皮 再增殖增加一致)很重要。圖18圖示說(shuō)明了一組典型的細(xì)胞因子，其基于在相比于低炎性傷口模型的發(fā)炎 中它們的表達(dá)水平增加而進(jìn)行識(shí)別。這些典型的細(xì)胞因子能夠作為用于調(diào)節(jié)傷口愈合的適
14合靶標(biāo)。圖19圖示說(shuō)明了一組典型的細(xì)胞因子，其基于相比于炎性模型在低炎性傷口模 型中它們的表達(dá)水平增加而進(jìn)行識(shí)別。這些典型的細(xì)胞因子能夠作為用于調(diào)節(jié)傷口愈合的 適合靶標(biāo)。
具體實(shí)施例方式本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“紊亂”是受益于促進(jìn)傷口愈合和/或減少腫脹、發(fā)炎和/或 疤痕形成的藥劑的任何紊亂、疾病或病癥。例如，包括外科手術(shù)或外傷所致的傷口，以及伴 有與神經(jīng)性、局部缺血性、微脈管病理學(xué)、骨區(qū)(尾骨(骶骨)、髖(轉(zhuǎn)子)、臀(坐骨)或腳 踵)上的壓力相關(guān)的畸形有關(guān)的傷口、再灌注損傷和瓣回流病因和病癥引起的傷口。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”是指任何哺乳動(dòng)物，包括人類、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及 動(dòng)物園動(dòng)物、體育運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、羊、豬、牛等。本文中優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是 人，包括成年人、兒童和老年人。本文中所使用的“預(yù)防”是指整體上或部分地預(yù)防，或改善或控制。如本文中所使用的，關(guān)于本發(fā)明的化合物或組合物的“治療有效量”是指足以產(chǎn)生 所需的生物的、藥物的或治療結(jié)果的用量。那些結(jié)果可以是疾病或紊亂或病癥的征候、癥狀 或病因的減輕，或者生物系統(tǒng)的任何其它的期望變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該結(jié)果會(huì)涉及 傷口愈合的促進(jìn)作用以及整體或部分地減少腫脹、發(fā)炎和/或疤痕形成。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”既指治療性處理也指預(yù)防性或防御性措施。需要 治療的對(duì)象包括已經(jīng)帶有傷口或其它相關(guān)障礙的對(duì)象，以及易于具有傷口或相關(guān)紊亂或被 診斷患有該紊亂的對(duì)象或者在其中體內(nèi)預(yù)防該紊亂的對(duì)象。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗連接蛋白藥劑”是影響或調(diào)節(jié)連接蛋白、連接蛋白半 通道(連接子)、或間隙連接的活性、表達(dá)或形成的化合物。抗連接蛋白藥劑包括但不限于 反義化合物(例如，反義多核苷酸)、RNAi和siRNA化合物、抗體及其連接片斷，以及肽和多 肽，其包括“擬肽”和肽類似物。優(yōu)選的抗連接蛋白藥劑是抗連接蛋白43藥劑。示例性的 抗連接蛋白藥劑將在本文中更加詳細(xì)地討論。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”既指治療性處理也指預(yù)防性或防御性措施。需要 治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有紊亂的對(duì)象，以及易于患有給紊亂或被診斷患有該障礙的對(duì)象或 者在其體內(nèi)預(yù)防該紊亂的對(duì)象。術(shù)語(yǔ)“擬肽”和“模擬物”包括可以與它們所模擬的蛋白區(qū)域具有基本相同的結(jié)構(gòu) 和功能特征的天然存在的和人工合成化學(xué)化合物。在連接蛋白的情況下，可以模擬例如與 連接子_連接子分子對(duì)接和細(xì)胞_細(xì)胞通道形成有關(guān)的相對(duì)的連接蛋白的細(xì)胞外環(huán)。“肽類似物”是指具有類似于模板肽的特性的化合物，并且可以是非肽類藥物?！皵M 肽”(也稱為“模擬肽”)包括肽基化合物，也包括非肽基化合物如肽類似物。在結(jié)構(gòu)上類 似于治療用肽的擬肽可以用于生產(chǎn)等價(jià)物或增強(qiáng)治療或預(yù)防的效果。一般而言，擬肽在結(jié) 構(gòu)上與模板多肽(即具有生物學(xué)或藥學(xué)功能或活性的多肽)相同或相似，但也可具有一個(gè) 或多個(gè)肽鍵，該肽鍵可選地由選自例如-CH2NH-、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH-(順式和反 式)、-coch2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-組成組中的鍵所替代。模擬物能夠完全由天然氨基酸，或氨基酸的非天然類似物構(gòu)成，或者是部分天然肽氨基酸與部分氨基酸的非天然類似 物的嵌合分子。該模擬物也可包含任意量的天然氨基酸保守置換，只要這樣的置換也不會(huì) 實(shí)質(zhì)上改變模擬物的活性即可。例如，如果模擬組合物能夠下調(diào)連接蛋白或連接子的生物 行為或活性，例如阻止連接子對(duì)接而形成間隙_連接-介導(dǎo)的細(xì)胞_細(xì)胞通信，或者阻止連 接子打開(kāi)而將細(xì)胞質(zhì)暴露于細(xì)胞外環(huán)境，則該模擬組合物可被用作抗-鏈接蛋白藥劑。擬 肽、模擬肽和連接蛋白修飾肽包括了本文中所提出描述的，以及本領(lǐng)域或許已知的這種擬 肽、模擬肽和連接蛋白修飾肽，無(wú)論是現(xiàn)在已知的還是未來(lái)開(kāi)發(fā)的。本文中以其各種形式所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)子(modulator) ”和連接蛋白活性的“調(diào) 節(jié)(modulation) ”是指整體或部分地抑制連接蛋白或連接蛋白半通道的表達(dá)或行為或活 性，可以起到抗連接蛋白藥劑的作用。一般而言，術(shù)語(yǔ)“蛋白”是指兩個(gè)或多個(gè)單個(gè)氨基酸(無(wú)論是不是天然存在的)經(jīng) 由肽鍵連接的任何聚合物，也就是當(dāng)連接到一個(gè)氨基酸(或氨基酸殘基)α碳的羧酸基團(tuán) 的羧基碳原子共價(jià)連接至連接于相鄰氨基酸α碳的氨基的氨基氮原子時(shí)就會(huì)形成肽鍵。 這些肽鍵連接，以及包含這些連接的原子(即α碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)， 和氨基氮原子(及其取代氫原子))形成了蛋白質(zhì)的“多肽骨架”。另外，本文中所使用的術(shù) 語(yǔ)“蛋白質(zhì)”應(yīng)理解成包括術(shù)語(yǔ)“多肽”和“肽”(在本文中它們有時(shí)可以互換使用)。類似 地，在本文中蛋白片斷、類似物、衍生物和變異體都可以被稱為“蛋白質(zhì)”，而且除非另外指 出都應(yīng)該認(rèn)為是“蛋白”。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的“片斷”是指包含少于該蛋白質(zhì)全部氨基酸殘基的 多肽。蛋白質(zhì)的“域”也是一個(gè)片斷，且包含經(jīng)常要求具備活性或功能的該蛋白質(zhì)的氨基酸 殘基。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“同時(shí)”用于意指本發(fā)明的一種或多種藥劑同時(shí)進(jìn)行給藥，而 術(shù)語(yǔ)“組合”用于意指它們?nèi)绻皇峭瑫r(shí)或物理組合給藥時(shí)，那么就在利用它們都可以而起 到治療作用的時(shí)間內(nèi)“連續(xù)”給藥。因此，“連續(xù)”給藥可以容許一種藥劑在其它藥劑給藥 之后在數(shù)分鐘(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30分鐘)或大約數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月 給藥，條件是一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種治療劑、有助于傷口愈合的藥劑和/ 或間隙連接修飾劑以有效量同時(shí)存在。組分的一次或多次給藥之間的時(shí)間延遲會(huì)根據(jù)組分 的精確性質(zhì)、彼此間的相互作用和其各自的半衰期而有所不同。術(shù)語(yǔ)“傷口”是指任何組織的創(chuàng)傷，包括例如急性的、亞急性的、延遲的或難以愈合 的傷口，以及慢性傷口。傷口的實(shí)例可以包括開(kāi)放傷口和閉合傷口。傷口包括例如燒傷、切 口傷、切除傷、撕裂傷、擦傷、刺傷或貫通傷、外科手術(shù)傷口、挫傷、血腫、擠壓傷和潰瘍。如本文中所描述的，延遲愈合的傷口或難以愈合的傷口可以包括例如至少部分以 以下一種或多種情況為特征的傷口 1)發(fā)炎階段延長(zhǎng)，2)緩慢形成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，以及 3)上皮形成的速率停滯或降低。如本文中所使用的，慢性傷口可以是指例如至少部分以以下一種或多種情況為特 征的傷口 1)傷口發(fā)炎的慢性自身延續(xù)狀態(tài)，2)缺乏性和缺陷性傷口 ECM，3)受傷細(xì)胞響應(yīng) 差(衰老)，尤其是成纖維細(xì)胞，限制了 ECM的產(chǎn)生，以及4)部分由于缺少必要的ECM配合 作用且缺乏遷移的支架(scaffold)而不能發(fā)生上皮再生。慢性傷口包括靜脈曲張性潰瘍、 動(dòng)脈潰瘍、壓迫性潰瘍、血管炎性潰瘍和糖尿病性潰瘍。術(shù)語(yǔ)“敷料”是指用于向傷口局部施用且不包括適用于全身給藥的組合物的敷料。
16例如，可將一種或多種抗連接蛋白藥劑和/或一種或多種有助于傷口愈合的藥劑、治療劑 和/或間隙連接修飾劑分散于傷口接觸材料的固體片材之上或之內(nèi)，該固體片材例如是紡 織織物或無(wú)紡織物材料，或者可以分散于泡沫層(如聚氨酯泡沫)內(nèi)，或分散于水凝膠內(nèi)， 該水凝膠例如是聚氨酯水凝膠、聚丙烯酸酯水凝膠、明膠、羧甲基纖維素、果膠、藻酸鹽和/ 或透明質(zhì)酸水凝膠，例如分散在凝膠劑或軟膏劑中。在某些實(shí)施方式中，抗連接蛋白藥劑和 /或所述一種或多種有助于傷口愈合的藥劑、治療劑和/或間隙連接修飾劑分散于向傷口 中提供持續(xù)釋放活性成分的可生物降解固體片材之上或之內(nèi)，例如凍干膠原片、凍干膠原/ 藻酸鹽混合物片(可以注冊(cè)商標(biāo)FIBRAC0L從Johnson & Johnson Medical Limited獲得) 或凍干膠原/氧化再生纖維素片(可以注冊(cè)商標(biāo)PR0M0GRAN從Johnson & Johnson Medical Limited 獲得)。如本文中所使用的，“基質(zhì)”包括例如基質(zhì)如膠原、無(wú)細(xì)胞基質(zhì)、交聯(lián)的生物學(xué)支架 分子、基于組織的生物工程結(jié)構(gòu)框架、生物制造的生物假體和其它移植結(jié)構(gòu)例如適用于促 進(jìn)傷口愈合的細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖作用的人造血管。其它合適的生物基質(zhì)材料可以包括化學(xué)修 飾的膠原組織以降低抗原性和免疫原性。其它合適的實(shí)例包括用于傷口敷料的膠原薄膜、 無(wú)抗原或減少抗原的無(wú)細(xì)胞基質(zhì)(Wilson etal.，Trans Am Soc Artif Intern 1990 ；36 340-343)或其它設(shè)計(jì)用于降低對(duì)異種移植物質(zhì)產(chǎn)生抗原應(yīng)答的生物基質(zhì)。其它用于促進(jìn)傷 口愈合的基質(zhì)可以包括例如含有不溶膠原和彈性蛋白的經(jīng)過(guò)處理的牛心包蛋白(Courtman et al.，J Biomed Mater Res 1994;28:655-666)以及其他可以用于為宿主細(xì)胞遷移提 供天然微環(huán)境從而加速組織再生的無(wú)細(xì)胞組織(Malone et al. , J Vase Surg 1984 ；1 181-91)。在某些實(shí)施方式中，可以用有助于傷口愈合的藥劑如生長(zhǎng)因子或其他位置特異性 釋放的傷口愈合促進(jìn)劑、治療劑和/或間隙連接修飾劑來(lái)補(bǔ)充基質(zhì)物質(zhì)。傷口和傷口分類除了前文所提供的定義之外，術(shù)語(yǔ)“傷口”也可以包括例如由不同方式引起的皮膚 和皮下組織的損傷(例如由長(zhǎng)期臥床休息產(chǎn)生的褥瘡和由于外傷引起的傷口)且具有各種 不同的特征。傷口可以根據(jù)傷口的深度而分成1到4級(jí)i)I級(jí)限于上皮組織的傷口 ；ii) II級(jí)延伸到真皮的傷口 ；iii) III級(jí)延伸到皮下組織的傷口 ；和iv)IV級(jí)(或全厚度傷 口)暴露出骨頭的傷口(例如，諸如大轉(zhuǎn)子或骶骨的骨壓覺(jué)點(diǎn))。術(shù)語(yǔ)“部分皮層厚度傷 口 (partial thicknesswound) ”是指包括I III級(jí)的傷口 ；部分皮層厚度傷口的實(shí)例包 括燒傷創(chuàng)面、褥瘡、靜脈瘀滯潰瘍和糖尿病性潰瘍。術(shù)語(yǔ)“深度傷口 ”是指既包括III級(jí)傷 口又包括IV級(jí)傷口。本發(fā)明的組合物和方法意圖治療所有傷口類型，包括深度傷口和慢性 傷口。術(shù)語(yǔ)“慢性傷口”是指未愈合的傷口。優(yōu)選地，慢性傷口選自由靜脈曲張性潰瘍、壓 迫性潰瘍、血管炎性潰瘍、糖尿病性潰瘍和褥瘡性潰瘍組成的組。慢性皮膚傷口包括例如壓 迫性潰瘍、糖尿病性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍、動(dòng)脈潰瘍，以及混合性潰瘍。慢 性傷口可以是動(dòng)脈潰瘍，其包括由完全或部分動(dòng)脈阻塞所致的潰瘍。慢性傷口可以是靜脈 淤滯性潰瘍，其包括由于靜脈瓣失靈和有關(guān)血管疾病而導(dǎo)致的潰瘍。慢性傷口可以是外傷 引發(fā)的潰瘍、糖尿病性潰瘍或血管炎性潰瘍。壓迫性潰蕩壓迫性潰瘍可以基于美國(guó)衛(wèi)生保健政策研究所((AHCPR，Agency for Health Care Policy and Research)，美國(guó)衛(wèi)生及公共服務(wù)部(U. S. D^artment of Health and Human Services))指南分成4個(gè)階段階段1 階段I壓迫性潰瘍是一種可見(jiàn)的與壓力相關(guān)的未受損皮膚的變化，其與身體上鄰近或相對(duì)區(qū)域相比的指征可以包括在一種或多種 以下指征的變化皮膚溫度(發(fā)熱或發(fā)冷)、組織連貫性(強(qiáng)健感(firm)或泥軟感(boggy)) 和/或感覺(jué)(疼痛、發(fā)癢)。潰瘍表現(xiàn)為在輕度變色皮膚中持續(xù)發(fā)紅的限定區(qū)域，而在膚色 較深的皮膚中，潰瘍可以表現(xiàn)出持續(xù)發(fā)紅、發(fā)藍(lán)或發(fā)紫。階段1的潰瘍可以包括未受損皮膚 的不可變白的紅斑和皮膚潰瘍的先兆性損傷。在膚色更深的個(gè)體中，皮膚的變色、發(fā)熱、水 腫、硬結(jié)或硬化也可以是階段1潰瘍的指征。階段2 階段2潰瘍的特征為涉及表皮、真皮或 這兩者的部分厚度的皮膚缺失。這種潰瘍是淺表性的而臨床表現(xiàn)為擦傷、水皰或淺的潰瘍 龕(crater)。階段3 階段3的潰瘍的特征為涉及到皮下組織損傷或壞死的全厚度皮膚缺 失，其可以延伸到但不貫穿底層筋膜。這種潰瘍臨床表現(xiàn)為與鄰近組織剝離或不與鄰近組 織剝離的深的潰瘍龕。階段4 階段4潰瘍的特征為大面積破損、組織壞死或?qū)∪?、骨?或支持結(jié)構(gòu)(例如腱、關(guān)節(jié)囊)產(chǎn)生損壞的全厚度皮膚缺失。在某些實(shí)施方式中，提供了治 療慢性傷口的組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為壓迫性潰瘍的以下AHCPR階段階 段1、階段2、階段3和/或階段4中的一個(gè)或多個(gè)。褥瘡件潰瘍?nèi)殳徯詽兪怯捎陂L(zhǎng)期和不變姿勢(shì)地壓迫骨突起部從而導(dǎo)致局部缺 血而引起的。那些不能自己翻身以卸載體重的患者(如癱瘓、昏迷或嚴(yán)重衰弱的人)易于 出現(xiàn)這種傷口。根據(jù)美國(guó)衛(wèi)生及公共服務(wù)部的定義，主要預(yù)防性措施包括確證高危患者；經(jīng) 常性地進(jìn)行評(píng)估；以及預(yù)防措施，如定期翻身、合適的卸壓寢具、防潮墊和充足的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。 治療選擇可以包括例如，卸壓、手術(shù)清創(chuàng)和酶清創(chuàng)、潮濕傷口護(hù)理和控制細(xì)菌負(fù)荷量。在某 些實(shí)施方式中，提供了治療慢性傷口的組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為褥瘡性潰 瘍或由于長(zhǎng)期壓迫骨突出部而導(dǎo)致局部缺血引起的潰瘍。動(dòng)脈潰瘍動(dòng)脈潰瘍的特征為可導(dǎo)致組織壞死和/或潰瘍的完全或部分動(dòng)脈阻 塞。動(dòng)脈潰瘍的征兆可以包括例如肢體末端無(wú)脈；疼痛性潰瘍；通常為界限分明的小斑點(diǎn) 狀潰瘍；冷卻或冷凍皮膚；毛細(xì)血管復(fù)原時(shí)間延遲(短暫地推壓在腳趾末端并釋放，腳趾應(yīng) 該在約3秒或更短的時(shí)間內(nèi)回復(fù)正常的顏色)；皮膚出現(xiàn)萎縮(例如，發(fā)亮、變薄、變干)；以 及手指和腳趾以及足部毛發(fā)脫落。在某些實(shí)施方式中，提供了治療慢性傷口的組合物和方 法，其中該慢性傷口的特征為動(dòng)脈潰瘍或由于完全或部分動(dòng)脈瘀滯所致的潰瘍。靜脈曲張件潰瘍靜脈曲張件潰瘍是最常見(jiàn)的影響下肢的潰瘍類型，其特征為靜 脈瓣功能障礙。正常的靜脈具有能夠阻止血液回流的瓣膜。當(dāng)這些瓣膜功能不健全時(shí)，靜 脈血的回流就會(huì)引起靜脈充血。血紅蛋白從紅血細(xì)胞逸出并泄漏到血管外空間，導(dǎo)致通常 所見(jiàn)的呈褐色的變色。人們已經(jīng)證明，靜脈曲張性潰瘍周圍皮膚的經(jīng)皮氧分壓下降，這暗示 了存在阻塞該區(qū)域正常血管形成的力。淋巴引流和流動(dòng)也對(duì)這些潰瘍起作用。靜脈曲張性 潰瘍可以出現(xiàn)在腳踝內(nèi)側(cè)附近，并且通常伴有下肢水腫和硬結(jié)；其可以是淺表的，并不太疼 痛并且表現(xiàn)為從患處排出滲液。在某些實(shí)施方式中，提供了治療慢性傷口的組合物和方法， 其中慢性傷口的特征為靜脈曲張性潰瘍或由于靜脈瓣功能障礙和相關(guān)的靜脈疾病所致的 潰瘍。靜脈瘀滯性潰瘍靜脈瘀滯性潰瘍的特征為下肢慢性被動(dòng)靜脈充血導(dǎo)致局部缺 氧。這種傷口的發(fā)病機(jī)理一種可能機(jī)制包括氧跨過(guò)厚的血管周纖維蛋白套(perivascular fibrin cuff)擴(kuò)散到組織中受阻。另一種機(jī)理是大分子滲漏到血管周組織中捕獲維持皮膚 完整性所需的生長(zhǎng)因子。另外，由于靜脈充血而使大的白細(xì)胞的流動(dòng)變慢從而易于形成潰
18瘍，靜脈充血會(huì)使毛細(xì)管閉塞、活化、并使靜脈內(nèi)皮組織受損。因此，在某些實(shí)施方式中，提 供了治療慢性傷口的組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為靜脈瘀滯潰瘍或由于下肢慢 性被動(dòng)靜脈充血和/或引起局部缺氧所致的潰瘍。糖尿病件潰蕩糖尿病患者易于發(fā)生由神經(jīng)性和脈管并發(fā)癥產(chǎn)生的足部潰瘍和其 他潰瘍。外周神經(jīng)病能夠?qū)е伦悴亢?或腿部的知覺(jué)變化或完全喪失。之前就患有神經(jīng)病 的糖尿病患者由于分辨力急劇變差而喪失了全部能力。或許幾天或幾周都完全不會(huì)注意到 患有神經(jīng)病的患者腳部的任何切口或外傷。之前就患有老年性神經(jīng)病的患者喪失了感知持 續(xù)壓力損傷的能力，因此，就可能發(fā)生導(dǎo)致例如足底潰瘍的組織局部缺血和壞死。微血管疾 病是糖尿病顯著并發(fā)癥之一，其也會(huì)導(dǎo)致潰瘍。在某些實(shí)施方式中，提供了治療慢性傷口的 組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為糖尿病足部潰瘍和/或由于糖尿病的神經(jīng)性和/ 或血管并發(fā)癥所致的潰瘍。外傷件潰蕩外傷性潰瘍的形成可以是由于身體受傷而引起的。這些創(chuàng)傷包括例 如，動(dòng)脈、靜脈或淋巴系統(tǒng)的損傷；骨骼的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化；組織層-上皮、真皮、皮下 軟組織、肌肉或骨骼的喪失；身體部分或器官的損傷以及身體部分或組織的喪失。在某些實(shí) 施方式中，提供了治療慢性傷口的組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為與身體外部傷 害相關(guān)的潰瘍。燒傷件潰蕩潰瘍也可以是由于燒傷所致，包括1級(jí)燒傷(即，皮膚淺表性的發(fā)紅 區(qū)域)；2級(jí)燒傷(在水皰流體除去后可以自然痊愈的起皰受傷位置)；3級(jí)燒傷(貫穿整個(gè) 皮膚的燒傷，且通常需要手術(shù)干預(yù)才能傷愈)；燙傷(可以是由于熱水、熱油或輻射流體燙 傷所致)；熱致燒傷(由于火焰燒炙所致，通常是深度燒傷)；化學(xué)灼傷(可以由于酸、堿所 致燒傷，通常是深度燒傷)；電致燒傷(住宅低壓所致或工業(yè)高壓所致)；爆炸突燃(通常 是淺表傷)；和接觸性燒傷(通常是深度燒傷，可以是由于消聲器尾管、熱鐵和爐子所致)。 在某些實(shí)施方式中，提供了治療慢性傷口的組合物和方法，其中該慢性傷口的特征為與身 體燒傷有關(guān)的潰瘍?？惯B接蛋白藥劑本文中所描述的本發(fā)明抗連接蛋白藥劑能夠調(diào)節(jié)或影響的分子運(yùn)輸進(jìn)入或運(yùn)輸 出細(xì)胞(例如，阻斷或抑制或下調(diào))。因此，本文中描述的某些抗連接蛋白藥劑調(diào)節(jié)細(xì)胞通 信(例如細(xì)胞對(duì)細(xì)胞)。某些抗連接蛋白藥劑調(diào)節(jié)或影響分子在細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)空間或胞外 空間之間的分子傳遞。這種抗連接蛋白藥劑一般靶向連接蛋白和/或連接蛋白半通道(連 接子)。含有連接蛋白的半通道以及所產(chǎn)生的間隙連接，在半通道開(kāi)放的情況下，獨(dú)立地涉 及與細(xì)胞質(zhì)和胞外空間或組織之間的小分子釋放或交換，而在間隙連接開(kāi)放的情況下，獨(dú) 立地涉及與鄰接細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之間的小分子釋放或交換。因此，本文中所提供的抗連接蛋 白藥劑可以直接地或間接地降低細(xì)胞之間的耦合和通信或者降低或阻斷細(xì)胞與胞外空間 或組織之間的通信(或分子傳遞)，而對(duì)細(xì)胞向胞外空間或組織(或者從細(xì)胞外空間或組織 向細(xì)胞內(nèi))或者鄰接細(xì)胞之間分子傳遞的調(diào)節(jié)也屬于本發(fā)明抗連接蛋白藥劑和實(shí)施方式 的作用范圍內(nèi)。能夠?qū)Ψ肿油ㄟ^(guò)(例如傳遞)間隙連接或連接蛋白半通道產(chǎn)生所需抑制作用的任 何抗連接蛋白藥劑都可以用于本發(fā)明的實(shí)施方式中。特定的實(shí)施方式還提供了調(diào)節(jié)分子通 過(guò)間隙連接或連接蛋白半通道的任何抗連接蛋白藥劑(例如調(diào)節(jié)、阻斷或減少分子從細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)向胞外空間或鄰接細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之間通過(guò)的那些藥劑)。無(wú)論是否存在間隙連接解 偶聯(lián)(阻斷分子運(yùn)輸通過(guò)間隙連接)，這種抗連接蛋白藥劑都可以調(diào)節(jié)分子通過(guò)間隙連接 或連接蛋白半通道。這樣的化合物包括例如，蛋白質(zhì)和多肽、多核苷酸和其它有機(jī)化合物， 它們可以例如整體上或部分地阻斷間隙連接或半通道的功能或表達(dá)，或者整體上或部分地 下調(diào)連接蛋白的產(chǎn)生。Evans, W. H. andBoitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29 :606_612 (2001) 中列出了某些間隙連接抑制劑。某些抗連接蛋白藥劑提供連接蛋白表達(dá)的下調(diào)作用(例如通過(guò)下調(diào)mRNA的轉(zhuǎn)錄 或翻譯)或者降低或抑制連接蛋白、連接蛋白半通道或間隙連接的活性。在下調(diào)作用的情 況下，這會(huì)具有在連接蛋白表達(dá)下調(diào)的位置通過(guò)間隙連接降低直接細(xì)胞-細(xì)胞通信的作 用，或者通過(guò)半通將細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)暴露于胞外空間的作用。抗連接蛋白藥劑的實(shí)例包括降低或抑制連接蛋白mRNA和/或蛋白表達(dá)或功能或 者降低連接蛋白、連接蛋白半通道或間隙連接的活性、表達(dá)或形成的藥劑?？惯B接蛋白藥劑 包括抗連接蛋白多核苷酸，如反義多核苷酸和其它多核苷酸(如具有siRNA或核糖核酸酶 功能的多聚核苷酸)，以及抗體及其連接片斷，以及肽和多肽，包括調(diào)節(jié)半通道或間隙連接 活性或功能的擬肽和肽類似物。抗連接蛋白多核苷酸抗連接蛋白多核苷酸包括連接蛋白反義多核苷酸以及具有使之能夠下調(diào)連接蛋 白表達(dá)功能的多核苷酸。其它合適的抗連接蛋白多核苷酸包括RNAi多核苷酸和siRNA多 核苷酸。反義多核苷酸和其它抗連接蛋白多核苷酸如RNAi、siRNA和核糖核酸酶多核 苷酸，以及具有修飾的和混合骨架的多核苷酸的合成，對(duì)于本領(lǐng)內(nèi)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知 的。參見(jiàn)例如 Stein CA. andKrieg A. M. (eds), Applied Antisense Oligonucleotide Techno 1 ogy，1998 (Wi 1 ey-Li ss)。合成抗體和連接片斷以及肽和多肽，包括擬肽和肽 類似物的方法對(duì)于本領(lǐng)內(nèi)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。參見(jiàn)例如Lihu Yanget al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 1 ；95 (18) 10836-10841 (1998 年 9 月 1 日)；Harlow and Lane(1988)“ Antibodies :A Laboratory Manuel" Cold Spring Harbor Publications, New York ；Harlow and Lane(1999)" Using Antibodies" A Laboratory Manuel, Cold Spring HarborPub1ications, New York。根據(jù)一個(gè)方面，下調(diào)連接蛋白表達(dá)可以一般基于采用反義多核苷酸的(如DNA或 RNA多核苷酸)的反義方法，且更具體而言是基于反義脫氧寡核苷酸(ODN)的使用。這些多 核苷酸(例如0DN)靶向?qū)⒁幌抡{(diào)的連接蛋白。典型地多核苷酸是單鏈的，但也可以是雙 鏈的。反義多核苷酸可以抑制連接蛋白的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。優(yōu)選多核苷酸是從連接蛋白 基因或mRNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的特異性抑制劑，而不會(huì)抑制從其它基因或mRNA的轉(zhuǎn)錄和/ 或翻譯。產(chǎn)物可以連接到連接蛋白基因或mRNA的(i)5'編碼序列，和/或(ii)編碼序列， 和/或(iii)3'編碼序列。反義多核苷酸一般是與連接蛋白mRNA反義的。這樣的多核苷酸或許能夠雜交 到連接蛋白mRNA，并由此可以通過(guò)干擾連接蛋白mRNA代謝的一個(gè)或多個(gè)方面，包括轉(zhuǎn)錄、 mRNA合成調(diào)控、從細(xì)胞核運(yùn)輸mRNA、翻譯或mRNA降解，而抑制連接蛋白的表達(dá)。反義多核
20苷酸典型地雜交到連接蛋白mRNA而形成雙鏈體，能夠產(chǎn)生對(duì)mRNA的翻譯和/或去穩(wěn)定化 (destabilization)的直接抑制。這種雙鏈體可以通過(guò)核酸酶易于降解。反義多核苷酸可以雜交到所有的或部分的連接蛋白mRNA。典型地，反義多核苷酸 雜交到連接蛋白mRNA的核糖體結(jié)合區(qū)域或編碼區(qū)域。多核苷酸與所有連接蛋白mRNA或局 部連接蛋白mRNA是互補(bǔ)的。例如，多核苷酸可以是所有或部分連接蛋白mRNA的精確補(bǔ)體。 然而，絕對(duì)的互補(bǔ)性是不需要的，而對(duì)于形成在生理?xiàng)l件下熔點(diǎn)超過(guò)約20°C、30°C或40°C 的雙鏈體具有足夠互補(bǔ)性的多核苷酸尤其適用于本發(fā)明。因此，多核苷酸一般是與mRNA互補(bǔ)的序列的同源物。多核苷酸可以是在中等到高 嚴(yán)格度條件下(如0. 03M氯化鈉和0. 03M檸檬酸鈉在約50°C到約60°C )雜交到連接蛋白 mRNA的多核苷酸。對(duì)于某些方面，合適的多核苷酸的長(zhǎng)度典型地為約6至40核苷酸。優(yōu)選多核苷酸 的長(zhǎng)度可以為約12至約35個(gè)核苷酸，或可替代地長(zhǎng)度為約12至約20個(gè)核苷酸或更優(yōu)選 長(zhǎng)度為約18至約32個(gè)核苷酸。根據(jù)一個(gè)可替代方面，多核苷酸的長(zhǎng)度可以為至少約40，例 如至少約60或至少約80個(gè)核苷酸以及長(zhǎng)度為高達(dá)約100、約200、約300、約400、約500、約 1000、約2000或約3000或更多的核苷酸。連接蛋白或多核苷酸靶向的蛋白質(zhì)將依賴于將會(huì)發(fā)生下調(diào)作用的位置。這根據(jù)連 接蛋白亞單位組成反映了身體不同位置的間隙連接的非均勻結(jié)構(gòu)(non-uniform makeup)。 連接蛋白一方面是在人體或動(dòng)物體內(nèi)天然存在的連接蛋白，或者是在連接蛋白表達(dá)或活性 將會(huì)降低的組織中天然存在的連接蛋白。連接蛋白基因(包括編碼序列)一般與本文中提 及的一種或多種特異性連接蛋白的編碼序列具有同源性，如與表8中所示的連接蛋白43編 碼序列具有同源性。連接蛋白典型地是一種α或β連接蛋白。優(yōu)選連接蛋白是一種α 連接蛋白且在待治療的組織中表達(dá)。然而，一些連接蛋白比其它的連接蛋白在組織中的分布更為普遍。最普遍的一種 是連接蛋白43。靶向連接蛋白43的多核苷酸特別適合在本發(fā)明中使用。在其它方面，其它 連接蛋白被靶向。抗連接蛋白多核苷酸包括連接蛋白反義多核苷酸以及具有能夠下調(diào)連接蛋白表 達(dá)功能的多核苷酸。其它合適的抗連接蛋白多核苷酸包括RNAi多核苷酸和SiRNA多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選方面，反義多核苷酸僅僅靶向一種連接蛋白的mRNA。最優(yōu)選地，該連接 蛋白是連接蛋白43。在另一方面，該連接蛋白是連接蛋白26、30、31. 1、32、36、37、40或45。 在其它方面，該連接蛋白是連接蛋白30.3、31、40.1或46.6。還應(yīng)該理解，靶向單獨(dú)連接蛋白的多核苷酸可以組合使用(例如可以靶向1、2、3、 4或多種不同的連接蛋白)。例如，靶向連接蛋白43的多核苷酸和連接蛋白家族的一個(gè)或 多個(gè)其它成員(例如連接蛋白26、30、30· 3、31· 1、32、36、37、40、40. 1、45和46. 6)能夠組合使用?？商娲?，反義多核苷酸可以是組合物的部分，該組合物可以含有指向超過(guò)一種 連接蛋白的多核苷酸。優(yōu)選多核苷酸指向的連接蛋白之一是連接蛋白43。脫氧寡核苷酸指 向的其它連接蛋白可以包括，例如，連接蛋白26、30、30· 3、31· 1、32、36、37、40、40. 1、45和 46.6。指向各種連接蛋白的適合的示例性多核苷酸(和0DN)列于表1中。
單個(gè)反義多核苷酸對(duì)特定的連接蛋白可以是特異性的，或可以靶向1、2、3或多種 不同連接蛋白。特異性多核苷酸一般會(huì)靶向于連接蛋白之間不保守的連接蛋白基因或mRNA 中的序列，而非特異性多核苷酸則會(huì)靶向于各種連接蛋白的保守序列。用于本發(fā)明中的多核苷酸可以合適地是未修飾的磷酸二酯寡聚體。這樣的脫氧寡 核苷酸的長(zhǎng)度可以是不同的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30聚體多核苷酸是特別合適的。本發(fā)明的許多方面參照脫氧寡核苷酸進(jìn)行描述。然而，應(yīng)該理解，其它合適的多核 苷酸(如RNA多核苷酸)可以用于這些方面。反義多核苷酸可以進(jìn)行化學(xué)修飾。這可以增強(qiáng)其對(duì)核酸酶的抗性，并且可以增強(qiáng) 其進(jìn)入細(xì)胞的能力。例如，可以使用硫代磷酸寡核苷酸。其它脫氧核苷酸類似物包括甲基磷 酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二硫代磷酸酯、N3' P5'-氨基磷酸酯和寡核糖核 苷酸硫代磷酸酯以及它們的2' -0-烷基類似物和2' -0-甲基核糖核苷甲基磷酸酯?？?替代地，可以使用混合骨架寡核苷酸(“MBO”)。MBO含有硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸的片斷 且適合代替修飾的脫氧寡_或寡核糖核苷酸。MBO含有硫代磷酸酯鍵的片斷和其他修飾寡 核苷酸的其它片段，如非離子性的甲基磷酸酯，其對(duì)核酸酶或2' -0-烷基寡核糖核苷酸具 有非常高的耐性。制備修飾骨架和混合骨架寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域是已知的。本發(fā)明中使用的反義多核苷酸的精確序列取決于靶連接蛋白。在一種實(shí)施方式 中，合適的連接蛋白反義多核苷酸能夠包括如選自以表1中所列以下序列的脫氧寡核苷酸 的多核苷酸表權(quán)利要求
一種治療方法，包括向需要治療的受試者給予一種組合物，所述組合物包含治療有效量的抗連接蛋白43藥劑和有效促進(jìn)或改善傷口愈合的蛋白或肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽選自由有效促進(jìn)或改善傷口愈合 的生長(zhǎng)因子和有效促進(jìn)或改善傷口愈合的細(xì)胞因子組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述生長(zhǎng)因子選自由血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮 生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因 子、或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 3組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是IL-7或IL-10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽是胰島素樣生長(zhǎng)因子連接蛋白或 分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽是胸腺素β4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽在載體中遞送。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述載體包含編碼血小板源性生長(zhǎng)因子-B的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述載體是腺病毒載體。
10.一種治療方法，包括向需要治療的受試者給予一種包含治療有效量的第一傷口愈 合化合物和第二傷口愈合化合物的組合物，其中，所述第一化合物是抗連接蛋白43藥劑而 所述第二化合物選自由β腎上腺素拮抗劑、白細(xì)胞介素-ι受體拮抗劑、和游離自由基清除 劑組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述β腎上腺素拮抗劑是噻嗎洛爾。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑是阿那白滯素。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述游離自由基清除劑是N-乙酰半胱氨酸。
14.一種治療方法，包括向需要治療的受試者給藥一種包含治療有效量的第一傷口愈 合化合物和第二傷口愈合化合物的組合物，其中，所述第一化合物是抗連接蛋白43藥劑而 所述第二化合物選自由抗炎劑和抗微生物劑組成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述抗微生物劑是桿菌肽、新霉素、多粘菌素、 短桿菌肽或甲氧芐啶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述組合物進(jìn)一步包含麻醉劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述麻醉劑是普莫卡因。
18.一種治療方法，包括向需要治療的受試者給予包含治療有效量的第一傷口愈合化 合物和第二傷口愈合化合物的組合物，其中，所述第一化合物是抗連接蛋白43藥劑而所述 第二化合物是阿片類藥。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述阿片類藥是嗎啡、氫嗎啡酮或芬太尼。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述阿片類藥是氫嗎啡酮。
21.一種治療方法，包括向需要治療的受試者給予包含治療有效量的第一傷口愈合化 合物和第二傷口愈合化合物的組合物，其中，所述第一化合物是抗連接蛋白43藥劑而所述 第二化合物是連接蛋白磷酸化劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述連接蛋白磷酸化劑是一種能夠使連接蛋 白43的至少一個(gè)酪氨酸殘基磷酸化的化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述連接蛋白磷酸化劑是一種能夠使連接蛋 白43的至少一個(gè)蘇氨酸殘基磷酸化的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗連接蛋白43藥 劑是多核苷酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述多核苷酸是反義多核苷酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述反義多核苷酸包含選自SEQ.ID.N0:1至 SEQ. ID. NO 12 的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述反義多核苷酸選自GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 1)；GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 2)；和GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT(SEQ ID NO :3)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述反義多核苷酸具有約15至約35個(gè)核苷 酸，并且足以與連接蛋白43mRNA互補(bǔ)而形成在生理?xiàng)l件下熔點(diǎn)超過(guò)20°C的雙鏈體。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述反義多核苷酸具有約15至約35個(gè)核苷 酸，并且與連接蛋白43mRNA的反義序列具有至少約70%的同源性。
30.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述組合物包含約 0. 1至約1000微克的所述抗連接蛋白43藥劑，所述抗連接蛋白43藥劑是反義多核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗連接蛋白43藥 劑是肽或擬肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述組合物包含約0.01至約100毫克的所述 抗連接蛋白43肽或抗連接蛋白43擬肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗連接蛋白43藥 劑是RNAi或siRNA多核苷酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人類。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物選自由家畜、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園 動(dòng)物、體育運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物組成的組。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述動(dòng)物是馬。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述動(dòng)物是狗或貓。
39.根據(jù)權(quán)利要求1、10、14、18或21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試者具有傷口。
40.一種治療方法，包括向需要治療的受試者給予第一傷口愈合組合物和第二傷口愈 合組合物，所述第一傷口愈合組合物包含治療有效量的抗連接蛋白43藥劑，而所述第二種 傷口愈合組合物包含治療有效量的有效促進(jìn)或改善傷口愈合的蛋白或肽。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述第一和第二傷口愈合組合物彼此間隔至 少約半小時(shí)給藥。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述第一和第二傷口愈合組合物彼此間隔至 少約1小時(shí)給藥，在約1天內(nèi)或彼此間隔約1天給藥，或彼此間隔約1周給藥。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，首先給藥予所述第一傷口愈合組合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括給予第三傷口愈合組合物，其中所述第 三傷口愈合組合物包含抗連接蛋白43肽或擬肽。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，首先給予所述第三傷口愈合組合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽選自表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、IL-7、分泌性白細(xì)胞蛋白 酶抑制劑、胰島素樣生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子連接蛋白。
47.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是血小板源性生長(zhǎng)因子。
48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
49.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 3。
50.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是IL-10。
51.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是胸腺素β 4。
52.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或 肽是在載體中遞送的。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述載體包含編碼血小板源性生長(zhǎng)因子-B的 序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述載體是腺病毒載體。
55.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1 15、18 22或23中任一項(xiàng)所述的組合物 的組分。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中，所述抗連接蛋白43藥劑是肽或擬肽。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，其中，所述組合物包含約0.01至約100毫克 的所述抗連接蛋白肽或抗連接蛋白擬肽。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中，所述抗連接蛋白43藥劑是多核苷酸。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的藥物組合物，其中，所述多核苷酸是反義多核苷酸。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中，所述反義多核苷酸包含選自SEQ. ID. NO :1 至 SEQ. ID. NO 12 的序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中，所述反義多核苷酸選自GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 1)；GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 2)；和GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO :3)。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中，所述反義多核苷酸具有約15至約35個(gè) 核苷酸，并且足以與連接蛋白43mRNA互補(bǔ)以形成在生理?xiàng)l件下熔點(diǎn)超過(guò)20°C的雙鏈體。
63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中，所述連接蛋白43多核苷酸具有約15至 約35個(gè)核苷酸，并且與連接蛋白43mRNA的反義序列具有至少約70%的同源性。
64.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中，所述組合物包含約0.1至約1000微克的所述抗連接蛋白藥劑，且所述抗連接蛋白藥劑是反義多核苷酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中，所述抗連接蛋白藥劑是RNAi或siRNA 多核苷酸。
66.一種用于促進(jìn)或改善傷口愈合的藥物組合物，其包含治療有效量的抗連接蛋白43 藥劑和對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或肽。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的 蛋白或肽是PDGF。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的藥物組合物，其中，所述PDGF蛋白或肽是以載體的形式提 供的。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的藥物組合物，其中，所述載體是腺病毒載體。
70.根據(jù)權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的 蛋白或肽是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的 蛋白或肽是胸腺素β 4。
72.根據(jù)權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的 蛋白或肽是TGF-β 3。
73.根據(jù)權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中，所述對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的 蛋白或肽是IL-10。
74.根據(jù)權(quán)利要求66 72或73中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物被 配制成用于局部給藥。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物被配制成凝膠。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的藥物組合物，其中，所述凝膠是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 基凝膠或羧甲基纖維素基凝膠。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的藥物組合物，其中，所述凝膠是普流尼克凝膠。
78.一種治療慢性傷口的方法，包括向需要治療的受試者給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利 要求67 70或71中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述慢性傷口是糖尿病性潰瘍。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述慢性傷口是靜脈曲張性潰瘍。
81.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述慢性傷口是壓迫性潰瘍、血管炎性潰瘍或 動(dòng)脈潰瘍。
82.一種用于減少需要治療的受試者中疤痕形成的方法，包括向所述受試者給予治療 有效量的根據(jù)權(quán)利要求72或73中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
83.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述藥物組合物是局部給藥的。
84.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中，所述藥物組合物是局部給藥的。
85.一種制備用于治療傷口的藥物的方法，包括將一定用量的第一傷口愈合組合物和 第二傷口愈合組合物組合到一起，其中，所述第一傷口愈合組合物含有有效量的抗連接蛋 白藥劑，而所述第二傷口愈合組合物含有有效量的對(duì)于促進(jìn)或改善受試者傷口愈合有效的 蛋白或肽。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述抗連接蛋白藥劑包含反義多核苷酸。
87.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述藥物被配制成用于局部給藥。
88.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述藥物配制成用于緩釋。
89.一種制品，包含容納有根據(jù)權(quán)利要求55、66 72和73中任一項(xiàng)所述的用于促進(jìn)或 改善傷口愈合或組織修復(fù)的藥物組合物的包裝材料以及在受試者體內(nèi)或體表使用的說(shuō)明 書。
90.一種傷口敷料，包含抗連接蛋白藥劑和對(duì)于促進(jìn)或改善傷口愈合有效的蛋白或肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有一種或多種抗連接蛋白藥劑和一種或多種用于促進(jìn)和/或改善傷口愈合和/或組織修復(fù)的其它藥劑的組合的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K31/711GK101965193SQ200780049832
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者布拉德福德·J·杜夫特, 戴維·L·貝克爾, 科林·R·格林 申請(qǐng)人:科達(dá)治療公司