專利名稱：包含合成佐劑的疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物和疫苗組合物領域。更具體地，本文描述的實施 方案涉及藥物和疫苗組合物，以及相關的預防和治療方法，其中所述 組合物包括p比喃葡萄糖脂佐劑(glucopyranosyl lipid adjuvant, GLA)。
相關領域描述
高級生物體的免疫系統(tǒng)被表征為區(qū)分外源物質(或"非己，，物質)和 親近的或"自身"組分，這使得外源物質引發(fā)免疫反應而"自身"組分被
其中在體液反應中由稱為漿細胞的分化的B淋巴細胞產(chǎn)生抗原特異性 抗體，在細胞介導的反應中不同類型的T淋巴細胞作用通過多種機制 清除抗原。例如，能識別特異性抗原的CD4+輔助T細胞可以通過釋 放諸如細胞因子的可溶性的介質募集免疫系統(tǒng)的其它細胞來作出反應 以參與免疫反應。同樣，也 能"i只另'J 4爭異'1"生#凡原的CD8+纟田月包毒T纟田月包 可以通過結合到攜帶抗原的細胞或顆粒并破壞或損傷所述細胞或顆粒 來作出反應。通常為誘導宿主理想的免疫反應，提供根據(jù)多種不同制 劑的某些疫苗，這在免疫學領域是已知的。
病毒、細菌或某些真核病原體的熱滅活的或者活的減毒的傳染性病原 體進行免疫；用能夠指導遺傳物質表達的無毒力轉染原進行免疫，其 中所述遺傳物質編碼免疫反應所針對的一種或多種抗原；以及用包含來自特定病原體的分離的免疫原(諸如蛋白)的亞單位疫苗進行免疫，
以產(chǎn)生針對所述病原體的免疫。(參見，例如，Liu, 1998iVafMreMeAcMe 4(5 suppl.):515.)對于某些抗原，可有一種或多種類型的理想免疫，這 些方法中沒有一種對所述免疫特別有效，包括疫苗的開發(fā)，所述疫苗 在免疫學上保護宿主抗人免疫缺陷病毒或其它傳染性病原體、癌癥、 自體免疫疾病或其它臨床病癥中是有效的。
長期認為腸細菌脂多糖(LPS)是免疫系統(tǒng)的有效刺激物，盡管它在 佐劑中的使用已經(jīng)由于其毒性效應被縮減。LPS的無毒衍生物，單磷 酰月旨質 A (MPL)已被 Ribi 等(1986， Immunology and lmmunopharmacology of Bacterial Endotoxins (纟田菌內(nèi)毒素的免疫學禾口 免疫藥物學)，Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)描述，所述單磷酰脂質 A是通過從葡糖胺的還原端移除核心糖基團和磷酸產(chǎn)生的。
MPL的另一種去毒形式是從二糖骨架的3-位去除?；満蟮玫剑?其被稱為3-0-脫?；鶈瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)。它可以通過GB 2122204B中教導的方法來純化和制備，GB 2122204B參考文獻也/>開 了雙磷酰脂質A和其3-0-脫?；凅w的制備。例如，已經(jīng)以具有直徑 小于0.2/mi的小粒度的乳劑的形式制備了 3D-MPL，且其制備方法在 WO 94/21292中被公開。包含單磷脂酰脂質A和表面活性劑的水制劑 已在WO9843670A2中被描述。
可以從細菌來源中純化和加工欲被配制在佐劑組合物中的細菌脂 多糖來源的佐劑，或可選擇地，它們可以是合成的。例如，在Ribi等， 1986(上述)中描述了純化的單磷酰脂質A,在GB 2220211和U.S. Pat, No. 4,912,094中描述了衍生自沙門氏菌屬(&/附0"^/"平)的3-0-脫酰 基單磷酰脂質A或3-0-脫?；p磷酰脂質A。 3D-MPL和(S(l-6)二糖 葡糖胺以及其它純化的和合成的脂多糖已被描述(WO 98/01139; U.S. Pat. No. 6,005,099和EP 0 729 473 Bl , Hilgers et al.， 1986 /杠 j〃erg_y /mwtmo/" 79(4):392陽6; Hilgers et at" 1987， /mmimo《ogy, 60(1); 141-6;和EP 0 549 074 Bl)。 3D-MPL和來自智利急莢樹(gw/〃q/a Sa; o加n'a Mo/^a)樹皮的皂香佐劑的組合物在EP 0 761 231 B中被描 述。WO 95/17210公開了佐劑乳化系統(tǒng)，其基于與免疫刺激物QS21
10配制的鯊烯、O!-生育酚和聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(TWEENTM-80),
任選地包括3D-MPL。盡管這種組合物易得到，但使用來自天然產(chǎn)物 的佐劑伴隨著高生產(chǎn)成本、批次之間的不一致、大規(guī)模生產(chǎn)的困難， 以及雜質在任何給定的制劑的組合構成中存在的不確定性。
很明顯，對改良的疫苗存在需要，特別是對有益地包含高純度、 化學定義的佐劑組分的疫苗存在需要，所述疫苗顯示了不同批次之間 的 一 致性，可以被以工業(yè)規(guī)模有效制備而不引入不必要的或結構不確 定的污染物。本發(fā)明提供了用于這種疫苗的組合物和方法，并提供了 其它相關的優(yōu)勢。
發(fā)明簡述
本發(fā)明在其幾個實施方案中涉及組合物和方法，所述組合物和方 法有利地使用了合成吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)作為佐劑和疫苗組分。 依照本文描述的本發(fā)明的一個實施方案，提供了包含抗原和吡喃葡萄 糖脂佐劑CGLA)的疫苗組合物。
在另一個實施方案中，提供了包含(a)抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑 (GLA)和鐘樣受體(toll-like receptor, TLR)激動劑的疫苗組合物，其中在 某些另外的實施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利 什曼蟲(丄e/Wmam'a)同源體以及至少 一種丙肝抗原。在另一個實施方案 中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和選自皂苷和皂苷類 似物的至少一種輔佐劑的疫苗組合物。在另一個實施方案中，提供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和載體的疫苗組合物，所述載體 包含油和ISCOMATRIXTM的至少一種。在另一個實施方案中，提供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及下述的一種或多種的疫苗組 合物(i)至少一種輔佐劑，(ii)至少一種TLR激動劑，(iii)至少一種咪 唑并喹啉(imidazoquinoline)免疫反應調(diào)節(jié)劑，以及(iv)至少 一種雙莖環(huán) 免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)。在某些另外的實施方案中，(i)所述輔佐劑當存在 時選自明礬、植物石威和去垢劑，其中所述植物石威選自番茄素，且所述 去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85 (Span 85)和硬脂酰酪氨酸(Stearyl tyrosine); (ii)所述TLR激動劑當存在時選自脂多糖、肽聚糖、 聚1:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LelF) 的利什曼蟲同源體以及至少 一種丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并喹啉免 疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(resiquimod) (R848)、咪喹莫特 (imiquimod)禾口噶德莫特(gardiquimod)。在另一個實施方案中，4是供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)、以及輔佐劑和藥學上可接受載 體中至少一種的疫苗組合物，其中所述輔佐劑選自細胞因子、去垢 劑和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，且所述藥學上可接受的載體包 含選自如下的載體磷酸釣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體、 新體(novasome)、非離子表面活性劑嚢泡(noisome)和微粒。在特別的 實施方案中，其中使用了脂質體或類似的載體，GLA位于脂質體的層 狀結構，或被包裹。在另一個特別的實施方案中，其中使用了微粒， 所述微粒是基于或包含聚合物脂肪脂質(fat lipids)的 一種。
在某些另外的實施方案中，細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-a和IFN々，嵌段聚合物或生物可降解聚合物選自普流羅 尼克L121 (PluronicL121)、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C, 去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
在另一個實施方案中，提供了包含至一種重組表達構建體和吡喃 葡萄糖脂佐劑(GLA)的疫苗組合物，所述構建體包含可操作連接于編 碼抗原的核酸序列的啟動子。在一個實施方案中，所述重組表達構建 體存在于病毒載體，該構建體在某些另外實施方案中存在于選自腺病 毒、1|>相關病毒、皰滲病毒、十曼病毒、痘病毒和逆轉錄酶病毒的病毒 中。
依照上述所有實施方案中的某些，GLA沒有3'-脫-0-?；Ｒ勒?上述所有實施方案中的某些，GLA包含(i)雙葡糖胺骨架，其具有通過 非還原末端葡糖胺的1位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位氨基己醣 之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii)連接于非 還原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷?；鶊F；以及(iii)至多6個的 脂酰鏈，其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于還原末端葡糖胺的3羥基， 其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還原末端葡糖胺的2-氨基，并包
12含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈，以及其中 一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-羥基并包含通過酯
鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。
依照包括TLR激動劑的上述所有實施方案中的某些，TLR激動劑 能夠通過與選自TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9中的至少一種TLR相互作用來遞送生物信號。在某些 另外的實施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚1:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利 什曼蟲同源體以及至少一種丙肝抗原。在特別的實施方案中，其中使 用了 TLR-7和/或TLR-8激動劑，TLR-7和/或TLR-8激動劑祐:i秀陷于 嚢泡中。
依照上述所有實施方案中的某些，GLA具有下式
其中R1、 R3、 115和R6是Cn-C2o烴基；且R2和R4是C12-C20烴基。 依照上述所有實施方案中的某些，疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi)引 發(fā)免疫反應。在某些另外的實施方案中，免疫反應是對抗原特異的。 依照上述所有實施方案中的某些，所述抗原能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)免疫 反應，所述免疫反應選自體液反應和細胞介導的反應。依照上述所有 實施方案中的某些，疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)至少一種免疫反 應，所述反應選自Th1-型T淋巴細胞反應、Th2-型T淋巴細胞反應、 細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應、抗體反應、細胞因子反應、淋巴因子 反應、趨化因子反應以及炎癥反應。依照上述所有實施方案中的某些， 疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)至少一種免疫反應，所述反應選自(a)一種或多種細胞因子的產(chǎn)生，其中所述細胞因子選自干擾素-7
(IFN-力、肺瘤壞死因子-a (TNF-a); (b)—種或多種白介素的產(chǎn)生，其 中所述白介素選自IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL陽IO、 IL-12、 IL-13、 IL隱16、 IL-18和IL陽23; (c)一種或多種趨化因子的產(chǎn)生，其中 所述趨化因子選自MIP-la、 MIP-1/3、 RANTES、 CCL4和CCL5;以 及(d)選自記憶性T細胞反應、記憶性B細胞反應、效應T細胞反應、 細胞毒T細胞反應以及效應B細胞反應的淋巴細胞反應。
依照上述所有實施方案中的某些，抗原來自選自細菌、病毒和真 菌的至少一種傳染性病原體。
在某些另外的實施方案中，細菌是放線細菌(Actinobacterium)，且 仍在某些另外的實施方案中，所述放線細菌是分支桿菌 (mycobacterium)。在某些其它相關的實施方案中，所述分支桿菌選自 肺結核分支桿菌(M. ^Z^n^/os/s)和麻風分支桿菌(M. /印rae)。在某些其 它的實施方案中，所述細菌選自沙門氏菌OSfl/mowe〃a)、、淋J求菌 (A^^en'fl)、螺力走體(5orre/!'a)、 衣原體(C/i/flmy^a)和博德特氏菌
在某些其它相關的實施方案中，病毒選自單純皰滲病毒、人類免 疫缺陷病毒(HIV)、 貓免疫缺陷病毒(FIV)、 巨細月包病毒 (cytomegalovirus)、 7jc痘-帶狀皰滲病毒(Varicella Zoster Virus)、肝炎病 毒、愛潑斯坦-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus, EBV)、呼吸道合胞病毒、 人乳頭瘤病毒(HPV)和巨細胞病毒。依照上述所有實施方案中的某些， 抗原來自人類免疫缺陷病毒，其在某些另外的實施方案中選自HIV-1 和HIV-2。
在某些其它相關的實施方案中，真菌選自曲霉菌(As/ ergz7/w)、芽 生菌(5/aWomyc&s1)、王求孑包菌(Cocc/^'o^/es)牙口月申孑包子菌(尸we"moc;AS"s)。 在某些其它相關的實施方案中，所述真菌是酵母，其在某些另外相關 的實施方案是假絲酵母(OwAWfl)，其中仍在某些另外的實施方案中， 假絲酵母選自白色念珠菌(C.a化z'cfl"力、光滑念珠菌(Cg/Wrato)、克柔 念珠菌(C.A:n^e")、 葡萄牙念珠菌(C. /ww7am'ae)、 熱帶念珠菌 (6*.加/>/(:<2//力、近平滑念珠菌(C./ ara戸7c^z-力。依照上述所有實施方案中的某些，抗原來自寄生蟲，所述寄生蟲 在某些另外的實施方案中是原生動物，其在某些另外的實施方案中是
瘧原蟲(尸/^moAwm)，其仍在某些另外的實施方案中選自惡性癥原蟲(尸. /a/cZ/ fln/m)、間日癥原蟲(尸Wva;c)、三日癥原蟲ma/fln力e)和卵圓癡 原蟲(尸力va/e)。在某些其它實施方案中，寄生蟲選自棘阿米巴 (Jca"http://zamoe6a0、溶組織內(nèi)阿米巴(五"tomoe6a /^to/_y"ca)、管圓線蟲 (y^g/c^&owgj/iw)、 曼氏血吸蟲(Sc/n'Wosoma mawsom'/) 、 i矣及血吸蟲 (5"c力z、toso附fl Aaemato6/w附)、日本血吸蟲(Sc/n'Wosoma ya/ om'cw附)、湄 公河血吸蟲(ScA^toso附a weA:owg0、 隱孑包子蟲(C>7/>toy/7onWww)、 鉤口 線蟲(v4wcy/oWoma)、溶組織內(nèi)阿米巴(五wtomoe6a /n'Wo(y"cfl)、結腸內(nèi)阿 米巴(五wtowoe6a co")、迪斯帕內(nèi)阿米巴(五wtomoeZ7a fifopflr)、 p合特曼 內(nèi)阿米巴(五"to附oe6a Aa/^wawm')、 波氏內(nèi)阿米巴(五wtomoe6fl; o/ech)、 班氏吳策線蟲(WwcAeren'a 6a"CTq/H)、賈第蟲(G^W&)、利什曼蟲 (Z^、/ wam'a)、蟲需形 <主腸蟯蟲(五WeroZ^W51 ve/7m'cw/an、)、人蟲回蟲(^scan's /wm6n'co/cfes)、 毛首鞭形線蟲(7Wc/mWs fn'c/mn'a)、 美洲板口線蟲 (jVecator amen'ca"m力、十二才旨腸鉤蟲(y4wc_y/asto/wa 6 wocfewa/e)、 馬來絲 蟲(5n/g7'(2 ma/a少z〕、》走盤尾絲蟲(O cZzocen:a vo/viz/w)、 麥i也那龍纟戔蟲 (Z)racawct//1^ mec /wew57's)、》走毛線蟲(7WcA/we〃a 5^>"/^)、 糞類圓線蟲 (;SYrowgy/oW&s Wercora/^)、 中華后睪吸蟲57'we似/"、 并殖 吸蟲'屬(尸aragowz'mws sp)、 肝片形p及蟲(Fascz'o/fl /^/ a"cfl)、 姜片吸蟲 (尸flsa'o/a magwa)、 大片吸蟲(Fasdo/a g7'gawZ/ca)、 牛肉i"條蟲 sagi"a/a)和豬肉纟條蟲(Zlaem'a so/Zmw)。
依照上述所有實施方案中的某些，抗原來自至少一種癌細胞。在 某些另外的實施方案中，所述癌細胞源自原發(fā)性實體腫瘤，且在某些 其它另外的實施方案中，所述癌細胞源自為轉移性或繼發(fā)性實體腫瘤 的癌，以及在某些其它的實施方案中，所述癌細胞源自為循環(huán)腫瘤或 腹水腫瘤的癌。在某些相關的實施方案中，所述癌細胞源自選自下述 的癌宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、 脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮細胞肉 瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、
15尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、 磷狀上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、 乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌(bronchogenic carcinoma )、 腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌和 腎母細胞瘤(Wilms，tumor)。在某些其它相關的實施方案中，癌細胞源 自選自下述的癌睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、 神經(jīng)膠質瘤、星細胞瘤、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、顱咽管瘤、 室管膜瘤(ependymoma)、卡〉果體瘤、血管母細胞瘤(hemangioblastoma)、 聽神經(jīng)瘤、少突膠質細胞瘤(oliodendroglioma)、腦膜瘤、黑素瘤、成 神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、瓦 爾登其斤凈爭4侖巨王求蛋白血癥(Waldenstrom's macroglobulinemia)禾口重鏈 病。
依照上述所有實施方案中的某些，抗原來自與自身免疫疾病相關 的至少一個抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫 學上交叉反應。在某些另外的實施方案中，與自身免疫疾病相關的抗 原決定部位、生物分子、細月包或組織選自snRNP (當所述自身免疫疾 病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡時)，曱狀腺球蛋白、促曱狀腺素受體和曱狀腺上 皮細胞中的至少一種(當所述自身免疫疾病是曱狀腺機能亢進(Graves， disease)時)，血小板(當所述自身免疫疾病是血小板減少性紫癜時)，天 皰滲4元原、橋庫立芯#唐蛋白-3 (desmoglein-3)、橋粒斑蛋白(desmoplakin)、 包斑蛋白(envoplakin)和大皰性類天皰瘡抗原1中的至少一種(當所述 自身免疫疾病是天皰瘡時)，髓磷脂堿性蛋白(當所述自身免疫疾病是 多發(fā)性硬化時)，胰島j3細胞(當所述自身免疫疾病是1型糖尿病時)以 及乙酰膽堿受體(當所述自身免疫疾病是重癥肌無力(myasthenia gravis) 時)。
在另 一個實施方案中，提供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物， 其包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。 在另一個實施方案中，提供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物，其 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及藥學上可接受的載體或賦形 劑。在另一個實施方案中，提供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)、鐘樣受體(TLR)激動劑以及藥 學上可接受的載體或賦形劑。在另外的實施方案中，TLR激動劑選自 脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長 和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體以及至少 一種丙肝抗原。在另 一個實施方案中，提供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物，其包含 抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)、選自皂苷和皂苷類似物的至少一種 輔佐劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。在另一個實施方案中，提 供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖脂 佐劑(GLA)以及藥學上可接受的載體，所述載體包含油和 ISCOMATRIXTM中的至少一種。在另一個實施方案中，提供了誘導或 增強免疫反應的藥物組合物，其包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖脂佐劑 (GLA)， (c)下述中的一種或多種(i)至少一種輔佐劑、(ii)至少一種TLR 激動劑、(iii)至少 一種咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和(iv)至少 一種雙莖 環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)，以及(d)藥學上可接受的載體或賦形劑。在某 些另外的實施方案中，(i)輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和去垢劑， 其中所述植物堿是番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司 盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激動劑當存在時選自脂多糖、肽聚糖、 聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF) 的利什曼蟲同源體和至少 一種丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并p奎啉免疫 反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另 一 個實施方案中，提供了誘導或增強免疫反應的藥物組合物， 其包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及至少一種輔佐劑和藥學上 可接受的載體，其中所述輔佐劑選自細胞因子、嵌段共聚物或生物 可降解的聚合物以及去垢劑，并且所述藥學上可接受的載體包含選自 磷酸鉤、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體以及微粒的載體。在 某些另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流 羅尼克⑧L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去垢 劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
在另一個實施方案中，提供了藥物組合物，其包含至少一種重組表達構建體、吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及藥學上可接受的載體或賦 形劑，所述構建體包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子。 在某些另外的實施方案中，所述重組表達構建體存在于病毒載體，該 構建體在某些另外實施方案中存在于選自腺病毒、腺相關病毒、皰滲 病毒、慢病毒、痘病毒和逆轉錄酶病毒的病毒中。
依照上述藥物組合物的某些另外的實施方案，抗原和GLA彼此接 觸；而依照上述藥物組合物的某些其它另外的實施方案，抗原和GLA 彼此并不接觸。在某些另外的實施方案中，其中所述抗原和GLA彼此 不接觸，它們存在與分離的容器內(nèi)。在其它實施方案中，提供了誘導 或增強免疫反應的藥物組合物，其包含含有抗原和第 一 藥學上可接受 的載體或賦形劑的第 一結合物；以及含有吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和 第二藥學上可接受的載體或賦形劑的第二結合物，其中所述抗原和
GLA彼此并不接觸。在另外的實施方案中，所述抗原和GLA存在于 分離的容器內(nèi)。在某些相關的實施方案中，所述第一藥學上可接受的 載體或賦形劑不同于所述第二藥學上可接受的載體或賦形劑。在其它 相關的實施方案中，所述第一藥學上可接受的載體或賦形劑與所述第 二藥學上可接受的載體或賦形劑并無不同。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體傳染性疾病的方法， 所述個體具有或疑似有患傳染性疾病的危險，所述方法包括給予所述 個體包含(a)抗原和(b)吡喃糖脂佐劑(GL.A)的疫苗組合物，其中所述抗 原來自至少一種與所述傳染性疾病相關的傳染性病原體，或與其在免 疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述傳染性疾病。在另一個實施 方案中，提供了治療或預防個體傳染性疾病的方法，所述個體具有或 疑似有患傳染性疾病的危險，所述方法包括給予個體包含(a)抗原、(b) 吡喃糖脂佐劑(GLA)和(c)鐘樣受體(TLR)激動劑的疫苗組合物，其中所 述抗原來自至少一種與所述傳染性疾病相關的傳染性病原體，或與其 在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述傳染性疾病。在另外的 實施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼原 蟲同源體以及至少一種丙肝抗原。在另一個實施方案中，提供了治療
18和預防個體傳染性疾病的方法，所述個體具有或疑似有患傳染性疾病 的危險，所述方法包括給予所述個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡糖脂佐劑 (GLA)和(c)選自皂苷和皂苷類似物的至少一種輔佐劑的疫苗組合物， 其中所述抗原來自與傳染性疾病相關的至少一種傳染性病原體，或者 與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述傳染性疾病。在另 一個實施方案中，提供了治療或預防個體傳染性疾病的方法，所述個 體具有或疑似有患傳染性疾病的危險，所述方法包括給予個體包含(a) 抗原、(b)吡喃葡糖脂佐劑(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中的 至少一種的載體的疫苗組合物，其中所述抗原來自與傳染性疾病相關 的至少一種傳染性病原體，或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治 療或預防所述傳染性疾病。在另一個實施方案中，提供了治療或預防 個體中傳染性疾病的方法，所述個體具有或疑似有患傳染性疾病的危 險，所述方法包括給予個體疫苗組合物，所述組合物包含(a)抗原，(b) 吡喃葡糖脂佐劑(GLA),以及(c)下述中的一種或多種(i)至少一種輔 佐劑、(ii)至少一種TLR激動劑、(iii)至少一種咪唑并喹啉免疫反應調(diào) 節(jié)劑和(iv)至少 一種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)，其中所述抗原來自與 傳染性疾病相關的至少一種傳染性病原體，或者與其在免疫學上交叉 反應，并由此治療或預防所述傳染性疾病。在某些另外的實施方案中， (i)所述輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和去垢劑，其中所述植物磁< 是番茄素，且所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂 酰酪氨酸；(ii)所述TLR激動劑當存在時選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利 什曼蟲同源體和至少 一種丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并查啉免疫反應 調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體傳染性疾病的方法， 所述個體具有或疑似有患傳染性疾病的危險，所述方法包括給予所述 個體包含(a)抗原、(b)吡喃糖脂佐劑(GLA)和(c)輔佐劑和藥學上可接受 的載體中的至少一種的疫苗組合物，其中所述輔佐劑選自細胞因子、 嵌段共聚物或生物可降解聚合物和去垢劑，且所述藥學上可接受的載 體包括選自磷酸鈣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體和微粒的載體，其中所述抗原來自與所述傳染性疾病相關的至少 一種傳染性病 原體或與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述傳染性疾病。
在某些另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 NF-a和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流 羅尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，并且所述去垢 劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體傳染性疾病的方法， 所述個體具有或疑似有患所述轉染性疾病的危險，所述方法包括給予 所述個體包含(a)至少一種重組表達栽體和(b)p比喃葡萄糖脂佐劑(GLA) 的疫苗組合物，所述構建體包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的 啟動子，其中所述抗原來自與所述傳染性疾病相關的至少一種傳染性 病原體，或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述傳染 性疾病。在另外的實施方案中，所述重組表達構建體存在于病毒載體， 其在某些另外的實施方案中存在于選自腺病毒、腺相關病毒、皰滲病 毒、慢病毒、痘病毒和逆轉錄酶病毒的病毒。依照與上述方法相關的 某些實施方案，所述抗原來自選自細菌、病毒和真菌的至少一種傳染 性病原體。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體自身免疫疾病的方 法，所述個體具有或疑似有患自身免疫疾病的危險，所述方法包括給 予所述個體包含(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的疫苗組合物， 其中所述抗原來自與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生 物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或 預防所述自身免疫疾病。在另一個實施方案中，提供了治療或預防個 體自身免疫疾病的方法，所述個體具有或疑似有患自身免疫疾病的危 險，所述方法包括給予所述個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑 (GLA)和(c)鐘樣受體(TLR)激動劑的疫苗組合物，其中所述抗原來自與 自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織， 或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防自身免疫疾病。在 某些另外的實施方案中，所述TL R激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I: C 、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體以及至少一種丙肝抗原。在另一個實施方案中，提供了 治療和預防個體自身免疫疾病的方法，所述個體具有或疑似有患自身
免疫疾病的危險，所述方法包括給予所述個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡 萄糖脂佐劑(GLA)和(c)至少 一 種選自皂苷和皂苷類似物的輔佐劑的疫 苗組合物，其中所述抗原來自與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決 定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并 由此治療或預防自身免疫疾病。在另一個實施方案中，提供了治療或 預防個體中自身免疫疾病的方法，所述個體具有或疑似有患自身免疫 疾病的危險，所述方法包括給予個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐 齊寸(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中的至少一種的載體的疫苗 組合物，其中所述抗原來自與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定 部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并由 此治療或預防自身免疫疾病。在另一個實施方案中，提供了治療或預 防個體免疫性疾病的方法，所述個體具有或疑似有患自身免疫疾病的 危險，所述方法包括給予個體疫苗組合物，所述組合物包含(a)抗原， (b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)， (c)下述中的一種或多種(i)至少一種輔 佐劑、(ii)至少一種TLR激動劑、(iii)至少一種咪唑并查啉免疫反應調(diào) 節(jié)劑、(iv)至少一種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)，其中所述抗原來自與 自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織， 或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防自身免疫疾病。在 某些另外的實施方案中，(i)所述輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和 去垢劑，其中所述植物堿是番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇 酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激動劑當存在時選自脂 多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和 起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體和至少一種丙肝抗原；以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹 莫特和嘎德莫特。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體自身免疫疾病的方 法，所述個體具有或疑似有患自身免疫疾病的危險，所述方法包括給 予個體疫苗組合物，所述組合物包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)輔佐劑和藥學上可接受的載體中的至少一種，其中所 述輔佐劑選自細胞因子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物，以及去 垢劑，并且所述藥學上可接受的載體包括選自磷酸4丐、水包油型乳劑、 油包水型乳劑、脂質體以及微粒的載體，其中所述抗原來自與自身免 疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者 與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述自身免疫疾病。在 另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNFa和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流羅尼克 L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去祐劑選自急 苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
在另一個實施方案中，提供了治療或預防個體自身免疫疾病的方 法，所述個體具有或疑似有患自身免疫疾病的危險，所述方法包括給 予個體包含(a)至少一種重組表達構建體和(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA) 的疫苗組合物，所述構建體包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的 啟動子，其中所述抗原來自與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定 部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并由 此治療或預防自身免疫疾病。在另外的實施方案中，所述重組表達構 建體存在于病毒載體，該構建體在某些另外實施方案中存在于選自腺 病毒、A泉^目關病毒、皰滲病毒、'f曼病毒、痘病毒和逆4爭錄酶病毒的病 毒中。、術 、^, 、 、 ,,, 、— ？、 、術
自身免疫疾病選自l型糖尿病、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、重癥肌無力、克羅恩氏病(Crohn's disease)、曱狀腺機能尤 進、血小板減少性紫癜和天皰滲。在上述與治療或預防自身免疫疾病 相關的的某些其它實施方案中，與自身免疫疾病相關的抗原決定部位、 生物分子、細胞或組織選自snRNP (當所述自身免疫疾病是系統(tǒng)性紅 斑狼瘡時)，曱狀腺球蛋白、促甲狀腺素受體和曱狀腺上皮細胞中的至 少一種(當所述自身免疫疾病是曱狀腺機能亢進時)，血小板(當所述自 身免疫疾病是血小板減少性紫癜時)，天皰滲抗原、橋粒芯糖蛋白-3、 橋粒斑蛋白、包斑蛋白和大皰性類天皰癡抗原1中的至少一種(當所述自身免疫疾病是天皰滲時)，髓磷脂堿性蛋白(當所述自身免疫疾病是 多發(fā)性硬化時)，胰島/3纟W胞(當所述自身免疫疾病是1型糖尿病時)以
及乙酰膽^5威受體(當所述自身免疫疾病是重癥M^無力時)。
依照其它實施方案，提供了治療或預防個體癌癥的方法，所述個
體具有或疑似有患癌癥的危險，所述方法包括給予個體包含(a)抗原和 (b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的疫苗組合物，其中所述抗原來自與癌癥 相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在 免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述癌癥。依照其它的實施方 案，提供了治療或預防個體癌癥的方法，所述個體具有或疑似有患癌 癥的危險，所述方法包括給予所述個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂 佐劑(GLA)和(c)鐘樣受體(TLR)激動劑的疫苗組合物，其中所述抗原來 自與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或 者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述癌癥。在某些另 外的實施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲 同源體以及至少一種丙肝抗原。依照其它的實施方案，提供了治療和 預防個體癌癥的方法，所述個體具有或疑似有患癌癥的危險，所述方 法包括給予個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和(c)選自皂 苷和皂苷類似物的至少一種輔佐劑的疫苗組合物，其中所述抗原來自 與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者 與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述癌癥。
依照其他的實施方案，提供了治療或預防個體癌癥的方法，所述 個體具有或疑似有患癌癥的危險，所述方法包括給予所述個體包含(a) 抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中 的至少一種的載體的疫苗組合物，其中所述抗原來自與癌癥相關的至 少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上 交叉反應，并由此治療或預防所述癌癥。依照其它的實施方案，提供 了治療或預防個體癌癥的方法，所述個體具有或疑似有患癌癥的危險， 所述方法包括給予所述個體疫苗組合物，所述組合物包含(a)抗原，(b) 吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)，以及(c)下述中的一種或多種(i)至少一種
23輔佐劑、(ii)至少一種TLR激動劑、(iii)至少一種咪唑并p查啉免疫反應 調(diào)節(jié)劑和(iv)至少 一種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)，其中所述抗原來自 與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者 與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述癌癥。在某些另外 的實施方案中，(i)所述輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和去垢劑， 其中所述植物堿是番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司 盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激動劑當存在時選自脂多糖、肽 聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子 4a (LeIF)的利什曼蟲同源體和至少 一種丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并 喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德 莫特。依照其它的實施方案，提供了治療或預防個體癌癥的方法，所 述個體具有或疑似有患癌癥的危險，所述方法包括給予個體疫苗組合
物，所述組合物包含(a)抗原、(b戶比喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)輔佐 劑和藥學上可接受的載體中的至少一種，其中所述輔佐劑選自細胞因 子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物以及去垢劑，并且所述藥學上 可接受的載體包括選自磷酸鈣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質 體以及微粒的載體，其中所述抗原來自與癌癥相關的至少 一種抗原決 定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并 由此治療或預防所述癌癥。在另外的實施方案中，所述細胞因子選自 GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNFa和IFN々，所述嵌段共聚物或生 物可降解聚合物選自普流羅尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG 和聚I:C，且所述去垢劑選自皂芬、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰 酪氨酸。依照其它的實施方案，提供了治療或預防個體癌癥的方法， 所述個體具有或疑似有患癌癥的危險，所述方法包括給予個體包含(a) 至少一種重組表達構建體和(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的疫苗組合 物，所述構建體包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子，其 中所述抗原來自與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細 胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并由此治療或預防所述癌 癥。在另外的實施方案中，所述重組表達構建體存在于病毒載體中， 該構建體在某些另外實施方案中存在于選自腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒、慢病毒、痘病毒和逆轉錄酶病毒的病毒中。
在上述治療或預防癌癥的方法的某些另外的實施方案中，抗原來 自至少一種癌細胞，所述癌細胞在某些另外的實施方案中源自原發(fā)性 實體肺瘤，且其在某些其它另外的實施方案中，源自為轉移性或繼發(fā) 性實體肺瘤的癌，以及在某些其它另外的實施方案中，源自為循環(huán)腫 瘤或腹水肺瘤的癌。在某些實施方案中，所述癌細胞源自選自下述的 癌宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂 肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮細胞肉瘤、 淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、 尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、磷狀上皮細 胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺 癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、 絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌和腎母細胞瘤。在某些其它的實施
方案中，癌細胞源自選自下述的癌睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、
膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質瘤、星細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、 室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質細胞瘤、 腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥和重鏈病。
依照上述治療或預防傳染性疾病或自身免疫疾病或癌癥的方法的
任一種的某些另外實施方案，給藥步驟進行一次；而在這些方法的某 些其它另外實施方案中，給藥步驟至少進行兩次；且在某些其它另外 的實施方案中，給藥步驟至少進行三次；在某些其它另外的實施方案 中，給藥步驟進行四次或更多次。依照上述治療或預防傳染性疾病或
自身免疫疾病或癌癥的方法中的任一種的某些另外的實施方案，在給 藥步驟前，個體用引發(fā)劑預處理，所述引發(fā)劑選自細菌提取物、活病 毒疫苗、包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子的至少 一種 重組表達構建體和包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子的 病毒載體。在另外的實施方案中，所述細菌提取物來自卡介菌(Bacillus Calmet-Guerin, BCG)。
在另一個實施方案中，提供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特
25異性免疫反應的方法，其包括給予個體包含(a)抗原和(b)他喃葡萄糖脂 佐劑(GLA)的疫苗組合物。在另一個實施方案中，提供了引發(fā)或增強 個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應的方法，其包括給予個體包含(a) 抗原、(b)卩比喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和(c)鐘樣受體(TLR)激動劑的疫苗組 合物。在某些另外的實施方案中，TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、 聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF) 的利什曼蟲同源體以及至少一種丙肝抗原。在另一個實施方案中，提 供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應的方法，其包括 給予個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和(c)選自皂苷和皂 苷類似物的至少一種輔佐劑的疫苗組合物。在另一個實施方案中，提 供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應的方法，其包括 給予個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)包含油和 ISCOMATRIXtm中的至少 一種的載體的疫苗組合物。在另 一個實施方 案中，提供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應的方法， 其包括給予個體疫苗組合物，所述組合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖 脂佐劑(GLA)以及(c)下述中的一種或多種(i)至少一種輔佐劑、(ii)至 少一種TLR激動劑、(iii)至少一種。米唑并查啉免疫反應調(diào)節(jié)劑、(iv) 至少一種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)。在某些另外的實施方案中，所述 輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和去垢劑，其中所述植物堿選自番 茄素，且所述去垢劑選自皂香、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪 氨酸；(ii)所述TLR激動劑當存在時選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲 同源體和至少 一種丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑 當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另一個實施方案中，提供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特 異性免疫反應的方法，其包括給予個體包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂 佐劑(GLA)以及(c)輔佐劑和藥學上可接受的載體中的至少 一種的疫苗 組合物，其中所述輔佐劑選自細胞因子、嵌段共聚物或生物可降解 聚合物以及去垢劑，并且所述藥學上可接受的載體包括選自磷酸鈣、 水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體以及微粒的載體。在某些另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-ce 和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流羅尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去垢劑選自急苦、聚 山梨醇酯80、司盤85和硬脂酖酪氨酸。
在另一個實施方案中，提供了引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特 異性的免疫反應的方法，其包括給予個體包含(a)至少一種重組表達構 建體和(b戶比喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的疫苗組合物，所述構建體包含可 操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子。在某些另外的實施方案中， 所述重組表達構建體存在于病毒載體中，該構建體在某些另外實施方 案中存在于選自腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒、慢病毒、痘病毒和 逆轉錄酶病毒的病毒中。
在上述引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性反應的方法的某些 實施方案中，GLA沒有被3'-脫-0-酰化。在上述引發(fā)或增強個體體內(nèi) 期望的抗原特異性反應的方法的某些其它的實施方案中，GLA包含 (i)雙葡糖胺骨架，其具有通過非還原末端葡糖胺的l位氨基己醣和還 原末端葡糖胺的6位氨基己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的 還原末端葡糖胺；(ii)連接于非還原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷?；鶊F；以及(iii)至多6個的脂酰鏈，其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接 于還原末端葡糖胺的3羥基，其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還 原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；?鏈連接的十四酰鏈，以及其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端 葡糖胺的3-羥基并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷酰基鏈連接 的十四酰鏈。在某些相關的另外實施方案中，TLR激動劑當存在時能 夠通過與選自TLR-2、 TLR匿3、 TLR誦4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR畫7、 TLR-8 和TLR-9的至少一種TLR相互作用來遞送生物信號。在某些另外的實 施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、 鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體以 及至少一種丙肝抗原。
在上述引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性反應的方法的某些 另外的實施方案中，GLA具有下式
27其中
R1、 R3、尺5和R6是Cu-C2。烴基；且
R2和R4是C,2-C2。烴基。
在上述引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性反應的方法的某些 另外的實施方案中，疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)免疫反應。在某 些另外的實施方案中，免疫反應對所述抗原是特異的。在上述引發(fā)或 增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性反應的方法的某些另外的實施方案 中，所述抗原能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)免疫反應，所述免疫反應選自體液 反應或細胞介導的反應。在上述引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異 性反應的方法的某些另外的實施方案中，疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi) 引發(fā)至少一種免疫反應，所述反應選自Th1-型T淋巴細胞反應、TH2-型T淋巴細胞反應、細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應、抗體反應、細胞 因子反應、淋巴因子反應、趨化因子反應以及炎癥反應。在上述引發(fā) 或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性反應的方法的某些另外的實施方案 中，疫苗組合物能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)至少一種免疫反應，所述反應選 自(a)—種或多種細胞因子的產(chǎn)生，其中所述細胞因子選自千擾素-7 (IFN-力、肺瘤壞死因子-a(TNF-a); (b)—種或多種白介素的產(chǎn)生，其中 所述白介素選自IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL-IO、 IL-12、 IL陽13、 IL-16、 IL-18和IL-23; (c)—種或多種趨化因子的產(chǎn)生，其中 所述趨化因子選自MIP-la、 MIP-1 /3、 RANTES、 CCL4和CCL5;以
28及(d)選自記憶性T細胞反應、記憶性B細胞反應、效應T細胞反應、 細胞毒T細胞反應以及效應B細胞反應的淋巴細胞反應。
依照某些其它的實施方案，提供了制備疫苗組合物的方法，其包 括將(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)混合。依照某些其它的實施 方案，提供了制備疫苗組合物的方法，其包括將(a)抗原、(b)吡喃葡萄 糖脂佐劑(GLA)以及(c)鐘樣受體(TLR)激動劑混合。在某些其它的實施 方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、 鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a(LelF)的利什曼蟲同源體以 及至少一種丙肝抗原。依照某些其它的實施方案，提供了制備疫苗組 合物的方法，其包括將(a)抗原、(b)他喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)選 自皂苷和皂苷類似物的至少一種輔佐劑混合。依照某些其它的實施方 案，提供了制備疫苗組合物的方法，其包括將(a)抗原、(b戶比喃葡萄糖 脂佐劑(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIX 中的至少 一種的載體混 合。依照某些其它的實施方案，提供了制備疫苗組合物的方法，其包 括將(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)下述中的一種或多種 混合(i)至少一種輔佐劑、(ii)至少一種TLR激動劑、(iii)至少一種咪 唑并全啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和(iv)至少 一種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)。 在某些另外的實施方案中，(i)輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和去 垢劑，其中所述植物堿選自番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇 酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激動劑當存在時選自脂多糖、 肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因 子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體和至少一種丙肝抗原；以及(iii)咪唑并 喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德 莫特。依照某些其它的實施方案，提供了制備疫苗組合物的方法，其 包括將(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及(c)輔佐劑和藥學上可 接受的載體中的至少一種混合，其中所述輔佐劑選自細胞因子、嵌 段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢劑，并且所述藥學上可接受的 載體包含選自磷酸鈣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體以及微 粒的載體。在某些另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-ce和IFN-7，所述嵌,史共聚物或生物可降解聚合物選自普流羅尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C， 且所述去垢劑選自皂芬、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
依照某些其它的實施方案，提供了制備疫苗組合物的方法，其包 括將(a)至少一種重組表達構建體和(b)p比喃葡萄糖脂佐劑混合，所述構 建體包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子。在某些另外的 實施方案中，所述重組表達構建體存在于病毒載體中，該構建體在某 些另外實施方案中存在于選自腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒、慢病 毒、痘病毒和逆轉錄酶病毒的病毒中。在某些實施方案中，GLA沒有 3'-脫-0-?；?。在某些實施方案中，GLA包含(i)雙葡糖胺骨架，其 具有通過非還原末端葡糖胺的1位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位 氨基己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii) 連接于非還原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷?；鶊F；以及(iii)至 多6個的脂酰鏈，其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于還原末端葡糖胺的 3羥基，其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還原末端葡糖胺的2-氨 基，并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈， 以及其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-羥基并包 含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。在某些實 施方案中，TLR激動劑能夠通過與選自TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9的至少一種TLR相互作用來遞送生 物信號。在某些另外的實施方案中，所述TLR激動劑選自脂多糖、肽 聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子 4a (LeIF)的利什曼蟲同源體以及至少 一種丙肝抗原。
依照上述制備疫苗組合物的方法的某些實施方案，GLA具有下
式
30其巾
R1、 R3、 R5和R6是Cn-C2o烴基；且
R2和R4是C『C2。烴基。
在某些另外的實施方案中，混合步驟包括乳化，且在某些其它另 外的實施方案中，混合步驟包括形成顆粒，所述顆粒在某些另外的實 施方案中包括微粒。在某些其它另外的實施方案中，混合步驟包括形 成沉淀物，所述沉淀物包含全部或部分抗原以及全部或部分GLA。
在某些其它的實施方案中，提供了免疫佐劑藥物組合物，其包含 吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。在某些 其它的實施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及鐘樣受 體(TLR)激動劑的免疫佐劑組合物。在某些另外的實施方案鐘，TLR 激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核 核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體以及至少一種丙肝 抗原。在某些其它的實施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA) 以及選自急苷和急普類似物的至少 一種輔佐劑的免疫佐劑組合物。在 某些其它的實施方案中，提供了免疫佐劑藥物組合物，其包含吡喃葡 萄糖脂佐劑(GLA)以及包含油和免疫刺激復合物基質TM (ISCOMATRIXtm)中的至少一種的藥學上可接受的載體。在某些其它 的實施方案中，提供了免疫佐劑組合物，其包含(a)吡喃葡萄糖脂佐劑 (GLA)，以及(b)下述中的一種或多種(i)至少一種輔佐劑、(ii)至少一 種TLR激動劑、(iii)至少一種咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和(iv)至少一 種雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)。
在某些另外的實施方案中，(i)輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿 和去垢劑，其中所述植物堿是番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨 醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激動劑當存在時選自脂多 糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起 始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體和至少一種丙肝抗原；以及(iii)咪 唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和 嘎德莫特。在某些其它的實施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA) 以及輔佐劑和藥學上可接受的載體的至少 一種的免疫佐劑組合物，其
中所述輔佐劑選自細胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及
去垢劑，并且所述藥學上可接受的載體包含選自磷酸鈣、水包油型乳 劑、油包水型乳劑、脂質體以及微粒的載體。在某些另外的實施方案
中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-a和IFN-y， 所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流羅尼克L121 、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，且所述去垢劑選自皂苦、聚 山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。
在某些其它實施方案中，提供了改變宿主免疫反應的方法，其包 括給予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和藥學上可接受的載體或 賦形劑的免疫佐劑藥物組合物，并由此改變宿主的免疫反應。在某些 其它的實施方案中，提供了改變宿主免疫反應的方法，其包括給予 宿主包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和(b)鐘樣受體(TLR)激動劑的免疫 佐劑組合物，并由此改變宿主的免疫反應。在某些另外的實施方案中， TLR激動劑選自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、 真核核糖體延長和起始因子4a (LeIF)的利什曼蟲同源體和至少一種丙 肝抗原。在其它另外的實施方案中，提供了改變宿主免疫反應的方法， 其包括給予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及選自皂苷和皂苷 類似物的至少 一 種輔佐劑的免疫佐劑組合物，并由此改變宿主的免疫 反應。在某些其它的實施方案中，提供了改變宿主免疫反應的方法， 其包括給予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐劑GLA)以及藥學上可接受的 載體的免疫佐劑組合物，并由此改變宿主的免疫反應，所述載體包含 油和ISCOMATRIXTM中的至少一種。在某些其它的實施方案中，提供 了改變宿主免疫反應的方法，其包括給予宿主免疫佐劑組合物，并 由此改變宿主的免疫反應，所述組合物包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA) 和下述的一種或多種(i)至少一種輔佐劑、(ii)至少一種TLR激動劑、 (iii)至少 一種咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和(iv)至少 一種雙莖環(huán)免疫調(diào) 節(jié)劑(dSLIM)。
在某些其它的實施方案中，輔佐劑當存在時選自明礬、植物堿和
32去垢劑，其中所述植物堿是番茄素，所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸；TLR激動劑當存在時選自脂多糖、 肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因 子4a(LelF)的利什曼蟲同源體和至少一種丙肝抗原；以及咪唑并查啉 免疫反應調(diào)節(jié)劑當存在時選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。 在某些其它的實施方案中，提供了改變宿主體內(nèi)免疫反應的方法， 其包括給予宿主免疫佐劑組合物，并由此改變宿主的免疫反應，所述 組合物包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)以及輔佐劑和藥學上可接受的載 體的至少一種，其中所述輔佐劑選自細胞因子、嵌段共聚物或生物 可降解聚合物以及去垢劑，并且所述藥學上可接受的載體包含選自磷 酸鈣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體以及微粒的載體。在某 些另外的實施方案中，所述細胞因子選自GM-CSF、 IL誦2、 IL隱7、 IL-12、 TNF-ce和IFN-7,所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物選自普流羅尼 克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，且所述去垢劑選自 皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸。步驟進行一次、兩次、三次、四次或更多次。在上述改變宿主免疫反 應的某些其它另外的實施方案中，改變宿主免疫反應包括誘導或增強 免疫反應。在上述改變宿主免疫反應的某些其它另外的實施方案中， 改變宿主的免疫反應包括下調(diào)免疫反應。在上述改變宿主反應的某些 另外的實施方案中，所述方法還包括同時或以任一順序連續(xù)地給予抗 原，所述抗原來自與誘導的或增強的免疫反應所針對的傳染性疾病相 關的至少一種傳染性病原體，或者與其在免疫學上交叉反應。在某些 另外的此類實施方案中，給予抗原的步驟進行一次、兩次、三次、四方案中，所述方法包括同時給予或以任一順序連續(xù)給予抗原，所述抗決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應。 在某些另外的此類實施方案中，給予抗原的步驟進行一次、兩次、三的實施方案中，所述方法包括同時給予或以任 一 順序連續(xù)給予抗原， 該抗原來自與誘導的或增強的免疫反應所針對的癌癥相關的至少 一種 抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反 應。在某些另外的此類實施方案中，給予抗原的步驟進行一次、兩次、 三次、四次或更多次。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含在第一容器內(nèi)的上述免疫佐劑組合物，以及在第二容器內(nèi)的抗原，其中所述免疫佐劑 組合物不與所述抗原接觸。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含在第一容器內(nèi)的上述的免疫佐劑組合物，以及在第二容器內(nèi)的 包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子的至少 一種重組表達 構建體，其中所述免疫佐劑組合物不與所述重組表達構建體接觸。在 剛描述的試劑盒的某些另外的實施方案中，所述抗原來自選自細菌、 病毒、酵母和原生動物中的至少一種傳染性病原體。在剛描述的試劑盒的某些其它另外的實施方案中，抗原來自至少一種癌細胞。在剛描 述的試劑盒的某些其它另外的實施方案中，抗原來自與自身免疫疾病 相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在 免疫學上交叉反應。參照下面的詳細描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面會被容易 地理解。此外，本文提及的、更為詳細地描述本發(fā)明的某些方面的各 種參考文獻都以其整體通過引用的方式并入本文。附圖筒述

圖1顯示了 HPLC數(shù)據(jù)，表明了 MPL-AF和GLA-AF中的污染物 質的數(shù)目和含量。使用安捷倫1100 (Agilent 1100)系統(tǒng)和ESA電霧式 檢測器(Corona CAD detector)采集這些層析譜。該方法在Waters Atlantis C18柱上采用曱醇到氯仿梯度來執(zhí)行。注射液分別包括2.5 的GLA和MPL,以及作為助溶劑的0.27 /xg的合成磷酸膽堿(POPC)。圖2顯示了表明細胞因子和趨化因子水平的ELISA數(shù)據(jù)，所述細 胞因子和趨化因子是由Mono Mac 6細胞系的人巨噬細胞(圖a-e)以及 PBMC來源的樹突狀細胞(DC)(圖f-h)應答GLA刺激時表達的。細胞以每孑L 1x105個細胞用GSK Biologicals MPL⑧的水制齊寸(MPL-AF)、 GLA的水制劑(GLA-AF)或單獨的AF々某介物培養(yǎng)24小時。通過夾心 ELISA測量上清中的MIP陽lb, IP-10, IL-6, IL-23和IL-lb的水平。圖3顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用與GLA-AF或GLA-SE配制 的兩種不同劑量的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，圖A; 以及在第28天，圖B)，與單獨使用Fluzone相比，在小鼠體內(nèi)誘導的 抗Fluzone抗體產(chǎn)生的水平。圖A和B顯示了第 一次(A)或第二次(B) 注射后一周，小鼠的ELISA抗體滴度，所述小鼠在3周時間內(nèi)被用在 含有GLA-AF、 GLA-SE或沒有佐劑的制劑中的20 ml (1.8 /ig)或2 ml (0.18 mg) Fluzone (Flu)疫苗免疫了兩次。圖C顯示了第二次免疫后的 小鼠血清中的中和抗體(HAI)的滴度。圖4顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用單獨的或與GLA-SE配制的 SMT抗原進行第三次免疫后一周，在小鼠體內(nèi)誘導的抗-SMT抗體產(chǎn) 生的水平。在三周時間內(nèi)用配制在含有GLA(GLA-SE，每次免疫每只 動物20 pg)的穩(wěn)定乳劑中的SMT抗原(每次免疫每只動物10 ptg)免疫 或者用單獨的SMT蛋白注射C57BL/6小鼠三次。每次免疫后一周通 過放血采集血清，通過ELISA檢測SMT特異性的IgGl和lgG2c抗體 的血清水平。顯示了倒數(shù)終點滴度的平均值和標準誤。圖5顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用與不同量的GLA (40, 20, 5 或1 ^g)配制的利什(Leish)-110f抗原進行首次免疫后1周，與鹽水對 照相比，在小鼠體內(nèi)誘導的抗利什-110f抗體產(chǎn)生的水平。在兩周時間 內(nèi)，用利什-110f抗原(每次免疫每只動物10 j^g)免疫或用鹽水注射 Balb/c小鼠三次，所述抗原配制于含有40, 20, 5或1 mg的GLA的穩(wěn) 定乳劑(GLA-SE)中。每次免疫后一周通過放血采集血清，通過ELISA 檢測利什-110f特異性IgGl和lgG2a抗體的血清水平。顯示了首次免 疫后7天采集的血清的倒數(shù)終點滴度的平均值和標準誤。圖6顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用與不同量的GLA配制的利 什-110f抗原進行第三次免疫后l周，與鹽水對照相比，在小鼠體內(nèi)誘 導的抗利什-110flFN-7細胞因子產(chǎn)生的水平。來自Balb/c小鼠的脾細 胞在單獨的培養(yǎng)基中，或在含有10 mg/ml的利什-110f或3 mg/ml的伴刀豆球蛋白A(ConA)的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)3天，所述小鼠在兩周時 間內(nèi)被用配制于含有40、 5或1 /ig的MPL的穩(wěn)定乳劑(MPL-SE)或含 有40、 5或1 Atg的GLA的穩(wěn)定乳劑(GLA- SE;)內(nèi)的利什-110f抗原(IO /xg)免疫三次，或用鹽水溶液注射。通過ELISA檢測了上清中的IFN-g 水平。顯示了平均值和標準誤。圖7顯示了 ICS數(shù)據(jù)，表明了進行第三次免疫后一周在小鼠體內(nèi) 誘導的產(chǎn)生ID83特異性的IFN-7、 IL-2和TNF細胞因子的CD4+和 CD8+T細胞的頻數(shù)(frequencies)，所述免疫是使用單獨的ID83或由含 有 GLA (GLA畫SE) 、 GLA+CpG (GLA/CpG-SE)或 GLA+GDQ (GLA/GDQ-SE)的制劑作為佐劑的ID83進行的。來自C57BL/6小鼠的 脾細胞在含有10mg/mlID83的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)12小時，所述小鼠 在三周的時間內(nèi)被用與GLA-SE 、 GLA/CpG-SE 、 GLA/嘎德莫特 (GDQ)-SE配制的肺結核分支桿菌ID83融合蛋白(8 pg)免疫三次或者 用鹽水注射。通過細胞內(nèi)染色檢測以及通過在BDLSRIIFACS上進行 流式細胞計數(shù)測量CD3+CD4+或CD3+CD8+設門T細胞內(nèi)的IL-2、 TNF和IFN-g的細胞水平。圖8，圖A顯示了ICS數(shù)據(jù)，表明了使用ML0276抗原進行第三 次免疫后一周，與鹽水和空白對照相比，在小鼠體內(nèi)誘導的產(chǎn)生 ML0276特異性IFN-7細胞因子的CD4+T細胞的頻數(shù)，所述ML0276 抗原用含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制劑、或含有GLA的穩(wěn)定油乳 劑(GLA-SE)、或混合在一起的上述三者配制。來自C57BL/6小鼠的 脾細胞在含有10 mg/ml的ML0276的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)12小時，所 述小鼠在三周時間內(nèi)被用與CpG、咪喹莫特(IMQ)、 GLA-SE、上述三 者的組合配制的麻風分支桿菌ML0276抗原(10 pg)免疫三次或用鹽水 注射。圖A顯示了通過細胞內(nèi)染色沖企測以及通過在BD LSRII FACS 上進4亍流式細胞計數(shù)測量的CD3+CD4+ T細胞內(nèi)的IFN-g的細胞水 平。圖B顯示了作為保護相關的引流淋巴結的細胞性。發(fā)明詳述本發(fā)明在其幾個實施方案中提供了疫苗組合物、佐劑組合物以及
包括使用合成的吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的相關方法。GLA提供了合
成免疫佐劑，其優(yōu)于現(xiàn)有技術的佐劑，且特別優(yōu)于天然產(chǎn)物佐劑，能
夠以基本上均一的形態(tài)制備。而且，與天然產(chǎn)物來源的佐劑不同，GLA
其從限定的起始物質以化學方式合成來獲得化學定義的產(chǎn)物，具有質 和量的批次之間的一致性，因此GLA提供了包括改良的產(chǎn)品質量控制 的先前未有的益處。令人驚喜地，盡管3-?；鶈瘟姿嶂|A與某些毒 性有關，但是已發(fā)現(xiàn)當它的2氨基位含有單?；湑r，該分子保留可 接受的安全譜(safety profile)。此外，這類化合物的合成是簡化的，因 為3位特異的脫乙酰作用具有技術挑戰(zhàn)。因此，本發(fā)明還提供了安全 和易于合成方面的優(yōu)勢。
如本文所描述的，含有GLA的組合物和它們應用的方法在一些實 施方案中包括GLA本身與藥學上可接受的載體或賦形劑用于免疫佐 劑活性(包括"輔佐")的用途，其中給予個體GLA可以完全獨立于給予 個體一種或多種抗原，和/或在時間上和/或空間上與其分離，所述抗原 是個體免疫反應(例如，抗原特異性反應)的引發(fā)或增強所針對的。其 它的實施方案包括GLA在疫苗組合物中的應用，所述組合物也包括一 種或多種由所述疫苗引發(fā)或增強的免疫反應所針對的抗原。如本文所 述的，在某些相關的實施方案中，這些疫苗組合物也包括一種或多種 鐘樣受體(TLR)激動劑和/或一種或多種輔佐劑、咪唑并喹啉免疫反應 調(diào)節(jié)劑與雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)中的一種或多種。在其它相關的實 施方案中，本文提供的疫苗組合物可以包含GLA和一種或多種重組表 達構建體，每一個構建體都包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的 啟動子，所述抗原是個體免疫反應的引發(fā)或增強所針對的。
GLA
如上文所提及的，作為以化學方法合成的佐劑，GLA可以以基本 上均一的形態(tài)制備，其指就GLA分子而言，至少80%、優(yōu)選至少85%、 更優(yōu)選至少卯％、更優(yōu)選至少95%以及仍更優(yōu)選至少96%、 97%、 98% 或99%純化的GLA制劑，該GLA分子包含(i)雙葡糖胺骨架，其具有通過非還原末端葡糖胺的1位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位氨基 己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii)連接
于非還原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷?；鶊F；以及(iii)至多6個 的脂酰鏈，其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于還原末端葡糖胺的3羥基， 其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還原末端葡糖胺的2-氨基，并包 含通過酯鍵與多于12個,灰原子的烷?；溸B接的十四酰鏈，以及其中 一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-羥基并包含通過酯 鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。給定的GLA制劑 的純度測定可以由熟悉適當?shù)姆治龌瘜W方法學的技術人員容易地完 成，諸如通過氣相層析法、液相層析法、質譜法和/或核磁共振分析。 本文所^使用的GLA可以具有下述通用結構式
其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2o烴基；且仗2和R"是<:12-(320烴基。
GLA可以例如從Avanti Polar Lipids, Inc. (Avanti極性脂質公司) (Alabaster, AL (阿拉巴馬)；產(chǎn)品號699800，其中R1、 R3、 115和116是 十一烴基，且112和114是十二烴基)商購。
"烴基"指直鏈或支鏈的、無環(huán)或環(huán)狀的、不飽和的或飽和的脂肪 烴，其含有1至20個碳原子，在某些優(yōu)選的實施方案中，含有11至 20個碳原子。代表性的飽和直鏈烴基包括曱基、乙基、正-丙基、正-丁基、正-戊基、正-己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、 十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而飽和的 支鏈烴基包括異丙基、仲丁基、異丁基、叔-丁基、異戊基等。代表性 的飽和環(huán)狀烴基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等；而不飽和 的環(huán)狀烴基包括環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基等。環(huán)狀烴基在本文也被稱為"同素環(huán)(homocyclcs)"或"同素環(huán)(homocyclic rings)"。不飽和的烴基在相鄰 的碳原子之間包含至少一個雙鍵或三鍵(分別被稱為"烯基"或"炔基")。 代表性的直鏈和支鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基、 異丁烯基、l-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-l-丁烯基、2-曱基-2-丁烯基、 2,3-二曱基-2-丁烯基等；代表性的直鏈和支鏈炔基包括乙炔基、丙炔 基、l-丁炔基、2-丁炔基、l-戊炔基、2-戊炔基、3-曱基-l-丁炔基等。 因此，在本文涉及的某些實施方案中，GLA可以具有上述任一種 結構，且在某些實施方案中，特別涉及GLA可以具有在下述專利申請 的一個或多個中公開的脂質佐劑的任一結構，而在某些其它的實施方 案中，特別涉及GLA可以不具有在下述專利申請的 一個或多個中公開 的脂質佐劑的任一結構U.S. Pat. No. 6，544，518、 EP 1531158、 WO 2001/036433、 WO 97/11708、 WO 95/14026、 U.S. 4,987,237、 JP 63010728、 JP 07055906、 WO 2000/013029、 U.S. 5,530,113 、 U.S. 5,612,476、 U.S. 5,756,718、 U.S. 5,843,918、 WO 96/09310、 U.S. Pub. 2004/161776、 U.S. Pub. No. 2003/170249、 U.S. Pub. No. 2002/176867、 WO 2002/032450 、 WO 2002/028424 、 WO 2002/016560 、 WO 2000/042994、 WO 2000/025815、 WO 2000 018929、 JP 10131046、 WO 93/12778、 EP 324455、 DE 3833319、 U.S. 4,844,894、 U.S. 4,629,722。 依照某些實施方案，GLA沒有3'-脫-0-?；?。 抗原
用于本文描述的疫苗組合物和應用GLA的方法的某些實施方案 中的抗原可以是個體內(nèi)免疫反應的引發(fā)或增強所針對的任一靶抗原決 定部位、分子(包括生物分子)、分子復合物(包括含有生物分子的分子 復合物)、亞細胞集群、細胞或組織。通常，術語抗原指所關注的多肽 抗原。然而，如本文所-使用的，抗原也可以指編碼所關注的多肽抗原 的重組構建體(例如，表達構建體)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述 抗原可以是或可以來自與感染、癌癥、自身免疫疾病、過敏癥、哮喘 癥或任何其它的狀態(tài)(其中，抗原特異性免疫反應的激活是理想的或有 益的)相關的傳染性病原體和/或抗原決定部位、生物分子、細胞或組 織，或者與其在免疫學上交叉反應。優(yōu)選地，在某些實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑含有能夠引發(fā)針 對人類或其它哺乳動物病原體的免疫反應的抗原或抗原成分，所述抗
原或抗原成分可以包括來自病毒的成分，諸如來自HIV-1(如tat， nef， gpl20或gpl60)、人類皰滲病毒(如gD或其衍生物或如來自HSV1或 HSV2的ICP27的即刻早期蛋白)、巨細胞病毒((特別是人類)(如gB或 其衍生物)、輪狀病毒(Rotavirus)(包括活力減弱病毒)、愛潑斯坦-巴爾 氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘帶狀皰滲病毒(諸如gpl, II和IE63) 或者來自諸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、曱 型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及戊型肝炎病毒的肝炎病毒，或者來自 其它的病毒病原體，諸如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白 或其衍生物)、副流感病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例 如HPV6, 11， 16， 18等)、蟲媒病毒(例如黃熱病毒(Yellow Fever Virus)、 登革熱病毒(Dengue Virus)、蟲皁傳月鹵炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒或流感病毒(全活或滅活病毒、4姿種在雞胚或 MDCK細胞內(nèi)的裂解流感病毒，或完整流感病毒體(如由Gluck, Vaccine, 1992， 10, 915-920所描述的)或者是其純化的或重組的蛋白， 諸如HA， NP, NA或M蛋白或者其組合)。
在某些其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑含有能夠引發(fā) 針對人類或其它哺乳動物病原體的免疫反應的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括來自一種或多種細菌病原體的成分，所述病 原體例如奈瑟菌屬某些種(A^^en'fl印p)，包括淋病奈瑟菌(TV. gowo〃/zea)和腦膜炎奈瑟菌(A^ we"/"g"WM)(例如莢膜多糖和其偶聯(lián) 物、轉鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PiIC、黏附素)；化膿鏈 球菌OS.;^oge"^)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸質)， 無乳鏈球菌(S. a^z/ac"ae),變異鏈球菌0. 杜克雷嗜血桿菌(//.
莫拉菌屬某些種(Moraxe//a s; p)，包括粘膜炎莫拉菌(Af cato/r/mfe), 也稱為粘膜炎布蘭漢3求菌(^^3"/^附6//(3 caton7mfe)(例如 高和低分子量的黏附素及透明質酸酶)；博德特菌屬某些種C8o^/ete〃a 印/0 ，包括百曰咳博德特菌(5. ; eWM^(例如百曰咳桿菌粘附素、百 日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛)，副百日咳博德特菌;^ra; eWM^/s)和支氣管敗血癥博德特菌(及 ZvYmc/n'"〃caJ; 分枝桿菌屬某些種(M少coZ)"cten'臓印p )， 包括月申結 核分枝桿菌(例如ESAT6,抗原85A、 -B或-C)、牛型分枝桿菌(M. 6ov&)、麻風分枝桿菌(M./印rae)、鳥分枝桿菌(M. av/"m)、副結核分枝 桿菌(M. /^n^wZ^rciz/ow^)、恥祐分枝桿菌(A/. swegwa"'力；軍團病桿菌 屬某些種(丄eg/owe〃a 包括嗜肺軍團菌(丄.pwewmop/n'/a);埃希氏
菌屬某些種C&c/^n'c/n'a ^; )，包括腸毒素性大腸埃希菌(e"tera/o;dc五. co/Z)(例如定居因子、不耐熱毒素或其衍生物、耐熱毒素或其衍生物)、 腸出血性大腸埃希菌0^ra/^morrag/c co//)、腸致病性大腸埃希菌 O"^ra; fl^oge"z'c五.co//)(例如志賀(Shiga)毒素樣毒素或其衍生物)；弧 菌屬某些種(7z力ho印/ ),包括霍亂弧菌(7. c力o/era)(例如霍亂毒素或其 衍生物)；志賀菌屬某些種(W/ge〃a^; ),包括索氏志賀菌(& ^""&)、 痢疾志賀菌(S.辦^w^^e)、弗氏志賀菌0S.y ex"en7);耶爾森菌屬某些 種(7^sz'm'a ^; )，包括小腸結腸炎耶爾森菌(J. 6"& <:0//"^)(例如Yop 蛋白)、鼠疫耶爾森菌(j. ; m似)、假結核耶爾森菌(j. 戸ei^/o勵emz/os7》；彎曲桿菌屬某些種(CV m;^/o6fl"er卿),包括空
腸彎曲桿菌(c. ^m')(例如毒素、翁附素和透明質酸酶)和結腸彎曲桿
菌(C. co/Z);沙門菌屬某些種(Sa/mo"e//a ^; ),包括傷寒沙門菌(S. 0^/n〕、副傷寒沙門菌GS.; ara(y; A/)、豬霍亂沙門菌(S. c/ o/era^！^),腸 炎沙門菌OS. e",en'/z'cfe);利斯特菌屬某些種(丄Men'a s; ; .),包括單核細 月包增生利斯特菌(丄.mowoc3^ogewe"; 螺桿菌屬某些種(Z/e"co6a"er 印; )，包括幽門螺桿菌(/Z.;^/on')(例如尿素酶、過氧化氫酶、空泡素)； 假單胞菌屬某些種(i^ewdomo"w w力，包括銅綠假單胞菌(尸. aer"g/wosa); 葡萄球菌屬某些種(5Va/ /^/ococc^ 577p.), 包括金黃色葡 萄球菌(S. aw"w)、表皮葡萄球菌OS. e^Ww脂Vfe);腸球菌屬某些種 (^V^eracoccM s; / .), 包4舌糞腸王求菌(S./aecafc)、屎腸3求菌(五./aecz.Mm); 梭菌屬某些種(C/as^Wwm w; .)，包括破傷風梭菌(C. Wam')(例如破傷 風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C. Zw&"m/m)(例如肉毒菌毒素及其衍 生物)、艱難梭菌(C. ^^"7e)(例如梭菌毒素類A或B及其衍生物)；芽 孢桿菌屬某些種C8a"7/ws印; .)，包括炭疽桿菌(B. anthmcis)(例如肉毒菌毒素及其衍生物)；棒桿菌屬某些種(a o^eZja"en'wm ^/ .)，包括白 喉棒桿菌(C. A》/^/2en'ae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬某些 種(5o廳e/Za 包括伯氏疏螺旋體(5. Zwrgafor/en')(例如OspA, OspC,
DbpA, DbpB)、伽氏疏螺力走體(5. ganVn》(例如OspA, OspC, DbpA， DbpB)、阿弗西尼疏螺旋體(5. a/ze/")(例如OspA， OspC， DbpA, DbpB)、 安德森疏螺旋體(及v4w&ao"z7)(例如OspA, OspC, DbpA， DbpB)、赫姆 斯疏螺旋體(5./^wwz7);埃里希體屬某些種(五/zWcAz'a^p.),包括馬埃 里希體(E. equi)和人類粒細胞埃里希體病(the Human Granulocytic Ehrlichiosis)的々某介；立克次體屬某些種(Wd^加'a s/ / )，包括立氏立克 次體(i . n'c^to");衣原體屬某些種(CA/am;^'a ^; .)包括沙眼衣原體 (C. fracAowfl似)(例如MOMP,肝素結合蛋白)，肺炎衣原體(C. / "ewmom'ae)(例如MOMP，肝素結合蛋白)、鸚鵠熱衣原體(C. psittaci); 鉤端螺旋體屬某些種(Z印to印zVa ),包括問號鉤端螺旋體(L. interrogans);密螺萬炎體屬某些種(77^; owema ^p.)， 包括蒼白球密螺旋: 體(r. /7a〃zV/^2)(例如罕見的外膜蛋白)，齒垢密螺旋體(T. denticola)、 豬瘌疾密螺旋體(T. hyodysenteriae);或其他細菌病原體。
在某些其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑含有能夠引發(fā) 針對人類或其它哺乳動物病原體的免疫反應的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括來自 一種或多種寄生蟲的成分(參見，例如， John, DT. and Petri, W.A., AfarA:e〃 awe Afed/ca/尸anxs"o/ogy-9"
五丄(Markell和Voge的醫(yī)學寄生蟲學-第9版)，2006， WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D,D.， GeorgzVParas"o/ogy/or f^m.wan'fl/w-S"
(Georgis的獸醫(yī)寄生蟲學-第8版)，2002， WB Saunders, Philadelphia),所述寄生蟲例如癡原蟲屬某些種(P/asmoAwm ), 包 括惡性癡原蟲(尸./a/cz》wMm);弓形蟲屬某些種(7b;co/7^wma)，包 括人剛地弓形蟲(r.go"A7)(例如SAG2， SAG3, Tg34);內(nèi)阿米巴屬某 些種(五"towoe6a ^ / .),包括溶組織內(nèi)阿米巴(五./^to/j^'ca);巴貝蟲屬 某些種(SaZ ew'a s/w.),包括田鼠巴貝蟲(及mZcro");錐蟲屬某些種 (7Vy; 朋asom(2 577/7.), 包括克氏錐蟲(r. co/z/); 賈第蟲屬某些種(GVan^/fl ^; .)，包括藍氏賈第蟲(G. lamblia);利什曼蟲某些種，包括碩大利什
42曼蟲(丄.m"7》。；月申嚢蟲屬某些種(尸wei/moc，化印/7.),包4舌卡氏肺嚢蟲 CP. can'""); 毛滴蟲屬某些種(rn'c/zowoww )， 包4舌鞘毛滴蟲(r. vag/"afe);或者來自能夠感染哺乳動物的蠕蟲，諸如(i)線蟲感染(包 4舌，^f旦不卩艮于蠕形住腸蟯蟲(五w&TOWtw verm/cw/an、)、人蟲回蟲(^ycan、 /w附6hc(9zW^s)、 毛首l便形纟戔蟲(Jh.cAi/n、 Zn.c/mn.(3)、 美洲4反口纟戔蟲 (jVeca/owMe〃'ca肌51)、 十二指腸鉤蟲(v4wcj^/o加麵di/oc ewa/e)、 班氏吳 策纟戔蟲(『wcAeren'a Z fl"cro/h〕、 馬來絲蟲(5n/g/a附a/a力)、^走盤尾絲蟲 (OwcAocerca vo/vm/m"、 麥i也刃卩龍纟戔蟲(ZVflcawcw/t^ mecfz,wews&)、》走毛 線蟲(JWc/^"e〃a s/ /ra"力禾口糞類圓線蟲(5Vrawgy/o/6 &s Wercora//"); (ii) 吸蟲感染(包4舌，但不限于曼森血吸蟲(Sc/n'Woswnfl wa朋om')、埃及血 吸蟲(5^/n'Woyoma /wemaZo6z'wm)、 曰本血吸蟲(5"c/z&^woma、 湄公河裂體吸蟲(Sc/n.Wosoma 、 中華后睪吸蟲Aorc/^
w'we mi)、 并殖吸蟲屬(Pamgom'mw51 s/ )、 肝片形吸蟲(Fawc/o/a Ae/ a〃ca)、 姜片吸蟲(Fascz.o/a mag"a)、 大片吸蟲(Fasc/o/a g7'gwz"ca)); 以及(iii)絳蟲感染(包括但不限于牛肉絳蟲和豬肉絳蟲)。因此某些實施 方案可以涉及包括來自血吸蟲屬某些種(Sc/n'Wowwm s/^.)或來自酵母 的抗原的疫苗組合物，血吸蟲屬某些種如曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲和/ 或日本血吸蟲，酵母諸如假絲酵母屬(Ow^/a^; .),包括白假絲酵母 (C. a/6/ca"";隱球菌屬(Co^tococa^ ^; .)，包括新型隱球酵母(C.
對于結核分枝桿菌，其它優(yōu)選的特異性抗原例如ThRal2、 Tb H9、 TbRa35、 Tb38-1、 Erd 14、 DPV、 MTI、 MSL、 mTTC2和hTCCl (WO 99/51748)。針對結核分枝桿菌的蛋白還包括融合蛋白及其變體，其中 結核分枝桿菌的至少兩種、優(yōu)選三種多肽融合成較大的蛋白。優(yōu)選的 融合物包括Ral2-TbH9畫Ra35、 Erdl4-DPV-MTI、 DPV畫MTI-MSL、 Erdl4DPV-MTI-MSL-mTCC2、 Erdl4-DPV-MTI畫MSL、 DPV-MTI-MSL陽 mTCC2、 TbH9隱DPV-MTI (WO 99151748)。
對于衣原體最優(yōu)選的抗原包含例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)、 ORF3 (EP 366 412)以及推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制劑的 其它衣原體抗原可以選自在WO 99128475中描述的組。優(yōu)選的細菌疫苗包含來自包括肺炎鏈球菌的鏈球菌屬某些種的抗原(例如莢膜多糖
及其偶聯(lián)物、PsaA、 PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結合蛋白)和蛋白抗 原肺炎鏈球菌溶血素(5"c/^m 5kp/i"爿cto， 1989, 67， 1007; Rubins et al.， M/craZ /fl/尸wAoge"ew、卩微蘭務放4^理」，25， 337-342),以及其突 變的去毒衍生物(WO 90/06951; WO 99/03884)。其它優(yōu)選的細菌疫苗 包含來自嗜血菌屬(//^附叩/ 7^ ^ p.)的抗原，包括流感嗜血桿菌B型
!'w/Zwewzae (y/ e (例如PRP及其偶聯(lián)物)，不可分型流感嗜血桿菌， 例如OMP26、高分子量黏附素、P5、 P6、蛋白質D和脂蛋白D，以 及絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽(U.S. Pat. No. 5,843，464)或多重拷貝變 體或其融合蛋白。
乙型肝炎表面抗原衍生物在本領域是公知的，其包括在歐洲專利 申請EP-A414 374、 EP-A-0304 578和EP 198474中描述的那些PreSl、 Pars2S表面抗原等。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的疫苗制劑包含HIV-1 抗原、gpl20，特別是在CHO細胞中表達時。在另外的實施方案中， 本發(fā)明的疫苗制劑包含本文上面限定的gD2t。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，含有要求保護的佐劑的疫苗包含的 抗原來自被認為是生殖器疣病因的人類乳頭瘤病毒(HPV) (HPV 6或 HPV ll及其它)，以及是宮頸癌病因的HPV病毒(HPV16、 HPV18及 其它)。生殖器疣預防或治療性疫苗的特別優(yōu)選形式包含Ll顆粒和殼 粒，以及包含選自HPV6和HPV11蛋白E6、 E7、 L1和L2的一個或 多個抗原的融合蛋白。融合蛋白某些優(yōu)選的形式包括WO 96/26277中 公開的L2E7，以及GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285)中公開的蛋白 D(l/3)-E7。優(yōu)選的HPV宮頸感染或癌癥的預防性或治療性疫苗組合 物可以包含HPV 16或18的抗原。例如，Ll或L2抗原單體，或者作 為病毒樣顆粒(VLP)共同呈現(xiàn)的Ll或L2抗原，或者在VLP或殼粒結 構內(nèi)單獨呈現(xiàn)的單獨的Ll蛋白。這些抗原、病毒樣顆粒和殼粒本身 是已知的。參見例如WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792和 W093/02184。
其它早期蛋白可以單獨地被包括或者作為諸如E7、 E2或優(yōu)選例 如F5的融合蛋白；特別優(yōu)選的實施方案包括包含L1E7融合蛋白的VLP (WO 96/11272)。特別優(yōu)選的HPV16抗原包含與蛋白D載體融合 的早期蛋白E6或E7以形成來自HPV16的蛋白D-E6或E7融合物， 或其組合；或者包含E6或E7與L2的組合(WO 96/11272)?？蛇x擇地， HPV16或18的早期蛋白E6和E7可以呈現(xiàn)為單分子，優(yōu)選蛋白 D-E6/E7融合物。這類疫苗可任選地包含來自HPV18的E6和E7蛋白 的任一者或兩者，優(yōu)選以蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。本發(fā)明的疫苗另外還包含來自其它HPV菌抹 的抗原，優(yōu)選來自HPV 31或33菌抹。
本發(fā)明的疫苗還包含來自導致瘧疾的寄生蟲的抗原。例如，來自 惡性癡原蟲的優(yōu)選抗原包括RTS，S和TRAP。 RTS是雜交蛋白，包含 惡性癡原蟲的環(huán)子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C-末端部分，后者通 過乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四個氨基酸連接于乙型肝炎病毒 表面(S)抗原。其完整結構在國際專利申請?zhí)朠CT/EP92/02591中公開， 該國際申請公布號為WO 93/10152，要求英國專利第9124390.7號申 請的優(yōu)先權。當在酵母中表達時，RTS作為脂蛋白顆粒產(chǎn)生，且當它 與來自HBV的S抗原共表達時，它產(chǎn)生了稱為RTS，S的混合顆粒。
在以WO 90/01496公布的國際專利申請?zhí)朠CT/GB89/00895中描 述了TRAP抗原。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是瘧疾疫苗，其中抗原制劑 包含RTS,S和TRAP抗原的組合?？赡苁嵌嗉壈Y疾疫苗的組分的候選 物的其它疾原蟲抗原是惡性癡原蟲MSP1, AMA1 ， MSP3, EBA, GLURP， RAP1, RAP2，鉗合蛋白(Sequestrin), PffiMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27125， Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230，以及在疾原蟲屬某些種中的它們的類似物。
因此，本文公開的某些實施方案涉及來自諸如細菌、病毒或真菌 的至少一種傳染型病原體的抗原，所述病原體包括放線細菌，諸如結 核分支桿菌和麻風分支桿菌或另外的分支桿菌；細菌諸如沙門菌屬、 奈瑟球菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬或博德特菌屬的成員；病毒諸如 單純皰滲病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、巨 細胞病毒、水痘帶狀皰滲、肝炎病毒、愛潑斯坦-巴爾氏病毒(EBV)、 呼吸道合胞病毒、人乳頭狀瘤病毒(HPV)以及巨細胞病毒；HIV諸如
45HIV-1或HIV-2;真菌諸如曲霉菌、芽生菌、球孢菌和肺孢子菌，或 者酵母，包括假絲酵母屬，諸如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠 菌、葡萄牙念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌；寄生蟲諸如原生動 物，例如癥原蟲屬，包括惡性癥原蟲、間日癥原蟲、三日疸原蟲和卵 圓癥原蟲；或者另外的寄生蟲，諸如棘阿米巴、溶組織內(nèi)阿米巴、管 圓線蟲、曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、埃及 吸血蟲、鉤蟲線蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、結腸內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米 巴、哈特曼內(nèi)阿米巴、波氏內(nèi)阿米巴、班氏吳策線蟲、賈第蟲以及利 什曼蟲的一種或多種。
例如，在含GLA的疫苗實施方案中含有來自疏螺旋體屬的抗原， 所述抗原可以包括核酸、病原體來源的抗原或抗原制劑、重組產(chǎn)生蛋 白或肽，以及嵌合融合蛋白。 一種這樣的抗原是OspA。 OspA借助其 在宿主細胞內(nèi)的生物合成可以是載脂形式的完全成熟的蛋白 (Lipo-OspA)，或者可選擇地可以是非載脂的衍生物。這種非載脂衍生 物包括非載脂NSl-OspA融合蛋白，其具有流感病毒的非結構蛋白 (NS1)的N-末端的前81個氨基酸，以及完整的OspA蛋白，且另一種 MDP-OspA是攜帶3個附加的N-末端氨基酸的OspA的非載脂形式。
鑒別具有或疑似有患本文所述傳染性病原體感染的危險的個體的 組合物和方法在本領域是已知的。
例如，細菌結核分支桿菌導致肺結核(TB)。該細菌通常侵襲肺臟， 但也可以侵襲腎臟、脊柱和腦。如果不能恰當治療的話，TB疾病可以 是致死性的。當被傳染的人打噴嚏或咳嗽時，這種疾病可以在人與人 之間播散。在2003年，美國報道的TB病例超過了 14,000例。
盡管結核通常可以采用長期的抗生素治療來控制，但這種治療不 足以預防該疾病的播散并引起了關于抗生素抗性菌抹的潛在選擇的擔 憂。被傳染的個體在一段時間內(nèi)可以是無癥狀的，但有傳染性。此外， 盡管依從治療方案是關鍵的，但患者行為難以監(jiān)測。 一些患者不能完 成治療過程，這導致了無效治療和耐藥性的發(fā)生(例如美國專利 7,087,713)。
目前，活細菌疫苗是誘導針對肺結核的保護性免疫的最有效的方
46法。用于這 一 目的的最常見的分支桿菌(Mycobacterium)是卡介菌 (Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)，牛型分支桿菌的無毒力抹。然而， BCG的安全性和功效是爭議的來源，且有些國家，如美國并不給全民 接種。通常使用皮膚測試來完成診斷，其包括結核菌素PPD (蛋白純 化的衍生物)的皮內(nèi)暴露?？乖禺愋訲細胞反應導致了注射后48、 72小時在注射部位的可測量的硬結，這提示已暴露于分支桿菌抗原。 但是敏感性和特異性一直是該測試的難題，并且接種了 BCG的個體不 能與受感染的患者區(qū)分開(例如，美國專利7,087,713)。
盡管巨噬細胞一直作為肺結核桿菌免疫的主要效應器，但T細胞 是所述免疫的優(yōu)勢誘導細胞。T細胞在保護肺結核桿菌感染中的重要 作用在AIDS患者中被示例由于與人類免疫缺陷病毒(HIV)感染有關 的CD4 T細胞的耗竭，AIDS患者體內(nèi)通常會出現(xiàn)肺結核分支桿菌。 已表明，分支桿菌反應性CD4 T細胞是干擾素-7(IFN-力強大的產(chǎn)生細 胞，其也已被進一步表明觸發(fā)小鼠體內(nèi)巨噬細胞的抗分支桿菌效應。 盡管IFN-7在人體內(nèi)的作用是不清楚的，但已有研究表明1,25-二羥基 -維生素D3單獨地或與IFN-7或腫瘤壞死因子-ca關用激活人巨噬細胞 以抑制肺結核分支桿菌感染。此外，已知IFN-7激活人巨噬細胞以產(chǎn) 生1,25-二羥基-維生素D3。類似地，已表明，IL-12在激發(fā)對肺結核 分支桿菌感染的抗性中發(fā)揮作用。對肺結核分支桿菌感染的免疫學的 綜述,參見Chan and Kaufmann, in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (肺結核發(fā)病機理、保護和控制)，Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994)。
包括多肽和編碼這種多肽的DNA分子的應用，所述多肽含有一種或 多種分支桿菌蛋白的至少一種免疫原部分。含有這種多肽或DNA序 列以及適當?shù)臋z測試劑的診斷試劑盒可以用于;^測患者和生物樣本中 的分支桿菌感染。也提供了針對這種多肽的抗生素。此外，這種化合 物可以配制于疫苗和/或藥物組合物中，用于抗分支桿菌感染的免疫。 (美國第6,949,246和6,555,653號專利)。
47二十世紀60年代，在世界上很多地方都消滅了癥疾，但這種疾病 仍持續(xù)存在，并出現(xiàn)了耐藥的新致病抹。瘧疾在90多個國家是主要的
公共衛(wèi)生問題。10例癡疾中有9例出現(xiàn)在撒哈拉以南非洲(sub-Saharan Africa)。超過1/3的世界人口正面臨危險，且每年有350至500百萬 的人感染癥疾。今年有45百萬懷孕婦女面臨感染癥疾的危險。在那些 已經(jīng)被感染的個體中，每年有超過1百萬被感染個體死于可預防的疾 病。那些死亡者中主要是非洲的兒童。
癡疾通常是在人4皮受感染的雌癡蚊(Anopheles mosquito)口丁咬時4專 播。蚊子必須通過汲取已經(jīng)感染了癡疾的人的血被感染后才能傳播癥 疾。癥疾由寄生蟲導致，且該病的臨床癥狀包括發(fā)熱和流感樣不適， 諸如寒戰(zhàn)、頭痛、月幾肉疼痛和疲^f巻。這些癥狀可以伴有惡心、嘔吐和 腹瀉。癡疾也可以導致由紅細胞的損失引起的貧血和黃疽。 一種類型 的瘧疾，惡性癡疾，如果不能及時治療的話，可能導致腎衰、驚厥、 意識模糊、昏迷和死亡。
個體中癥疾的體外診斷方法是已知的，其包括將從個體采集的組 織或生物學流體與分子或多肽組合物接觸(在允許體外免疫反應在所 述組合物和存在于組織或生物流體中的抗體之間發(fā)生的條件下)，以及 形成的抗原抗體復合物的體外檢測(參見，例如，美國專利7,087,231)， 其中所述分子或多肽組合物包括一個或多個多肽序列，其攜帶由惡性 疰原蟲的傳染活性導致的蛋白的 一 個或多個T抗原決定部位的全部或 部分。
已經(jīng)描述了重組惡性癡原蟲(3D7) AMA-1胞外區(qū)的表達和純化。 先前的方法已經(jīng)產(chǎn)生了高純化的蛋白，其保留了天然分子的折疊和二 碌b鍵。重組的AMA-1可以用作i貪斷試劑以及用于抗體制備，和作為 蛋白單獨用于或作為疫苗的一部分用于預防瘧疾。(美國專利 7,029,685)
本領域已經(jīng)描述了編碼種屬特異性的間日疾原蟲癡疾肽抗原的多 核苷酸，所述抗原是分泌入感染后的易感哺乳動物宿主血漿內(nèi)的蛋白 或蛋白片段，這樣產(chǎn)生針對這些抗原的單克隆或多克隆抗體。所述肽 抗原、單克隆抗體和/或多克隆抗體用于診斷疰疾的測定中被利用，以及用于確定是否間日癡原蟲是導致感染的種屬。(美國專利6,706,872) 也已經(jīng)報道了種屬特異性的間日瘧原蟲瘧疾肽抗原，其是分泌入感染 后的敏感哺乳動物宿主血漿內(nèi)的蛋白或蛋白片段，這樣產(chǎn)生針對這些 抗原的單克隆或多克隆抗體。所述肽抗原、單克隆抗體和/或多克隆抗 體在用于診斷癡疾的測定中被利用，以及被用于確定是否間日癡原蟲 是導致感染的種屬(參見，例如，美國專利6,231 ，861)。
通過產(chǎn)生高純度蛋白的方法也已經(jīng)表達了重組的惡性癡原蟲(3D7) AMA-1胞外區(qū)，其保留了天然分子的折疊和二辟J建。所述重組的 AMA-1用作i貪斷試劑，以及用作疫苗用于抗體產(chǎn)生(美國專利 7,060,276)。同樣已知的是重組惡性疾原蟲(3D7) MSP-142的表達和純
化，其保留了天然分子的折疊和二硫鍵。重組的MSP-l42用作診斷試
劑以及用作疫苗用于抗體產(chǎn)生。(美國專利6,855,322)。
因此根據(jù)這些和相關的公開內(nèi)容，已知檢測人類癡疾感染的診斷 方法，以鑒定具有或疑似有患疾疾傳染性病原體感染的危險的個體。 具體地，例如，將血液樣本與含有3-乙?；奏は汆溥识似账?(APAD)、底物(例如，乳酸鹽或乳酸)以及緩沖液合并。該試劑祐:i殳計 為檢測由癡疾寄生蟲產(chǎn)生的獨特的糖分解酶的存在。已知該酶是寄生 蟲乳酸脫氫酶(PLDH)。使用上述試劑，很容易區(qū)別PLDH與宿主的 LDH。所述試劑與寄生蟲感染的血液樣本合并導致了 APAD的還原。 但是APAD不^皮宿主LDH還原。然后可以通過多種技術，包括光譜、 熒光測定、電泳或比色分析來^r測還原的APAD。以上述方式4企測還 原的APAD提供了疾疾感染的陽性指示(例如美國專利5,124,141)。在 另 一種診斷瘧疾的方法學中，包含特征性氨基酸序列的多肽源自惡性 癡原蟲抗原GLURP，并可在4企測樣本中被針對所述多肽或與其反應的 特異性抗體所識別。(美國專利5,231,168)
利什曼病是世界范圍內(nèi)的寄生蟲病，在印度次大陸、非洲和拉丁 美洲頻繁流行，是世界衛(wèi)生組織開發(fā)疫苗的優(yōu)先考慮對象。不同疾病 的復合，利什曼寄生蟲導致了內(nèi)臟器官的致命感染以及嚴重的皮膚病。 利什曼病最具破壞性的形式中的 一種是鼻和嘴的毀容感染。利什曼病 例的數(shù)量越來越多，目前在許多地區(qū)以難于控制。作為HIV感染的結
49果，利什曼病在一些發(fā)達地區(qū)也處于上升狀態(tài)，特別是在南歐?？衫?用的藥物是有毒性的、昂貴的，并需要長期的每日注射。
利什曼蟲是定居于免疫系統(tǒng)的巨噬細胞或白血細胞的原生動物寄 生蟲。這種寄生蟲通過小的吸血昆蟲(沙蠅)的叮咬傳播，所述昆蟲由 于定居于地球上的廣大地區(qū)，難以控制。
內(nèi)臟利什曼病是該病三種表現(xiàn)形式中最危險的。據(jù)估計每年發(fā)生
約500,000例內(nèi)臟形式(黑熱病(kala-azar)或"致死疾病")的新病例。超 過200百萬的人目前處于感染內(nèi)臟利什曼病的危險中。超過90%的內(nèi) 臟利什曼病例發(fā)生在印度、孟加拉國、蘇丹、巴西和尼泊爾。大多數(shù) 死亡發(fā)生在兒童?；加衅つw形式的那些人通常是永久的毀容。
利什曼蟲感染難以i貪斷，并且通常涉及組織活4企樣本的組織病理 學分析。然而已經(jīng)開發(fā)了幾種血清學和免疫學診斷測定。(美國專利 7,008,774; Senaldi et al" (1996) /畫畫/. M&AoA 193:9 5; Zijlstm, et al., (1997) 7Va"義i . Soc. Tro; . Tl^A i/yg. 91 :671 673; Badaro， et al" (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761 ; Choudhary, S., et al.， (1992)丄Com附. ZXs. 24:32 36; Badaro， R., et al.， (1986)爿附.7Vo/ . 35:72 78;
Choudhary, A., et al" (1990) 7>顯.及.Soc. 7Vo; . MW.外g. 84:363 366; 和Reed， S. G.， et al., (1990)爿m.丄7Vo; . MW. /fyg. 43:632 639)。前鞭毛 體釋放代謝產(chǎn)物進入培養(yǎng)基以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。這些代謝產(chǎn)物是宿主 免疫原性的。參見Schnur， L. F.， et al., (1972) Isrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al" (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On， J.， et al" (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269;和Bray, R. S., et al" (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609; U.S. Pat. No. 6,846,648，美國專利 5,912,166;美國專利5,719,263;美國專利5，411 ,865)。
世界范圍內(nèi)大約有40百萬人感染導致AIDS的病毒HIV。每年約 3百萬人死于該病，他們中的95%是在發(fā)展中國家。每年有接近5百 萬的人感染HIV。目前在撒哈拉以南非洲，該病的負擔最重，但它正 在向諸如印度、中國和俄羅斯的其它國家快速傳播。這種流行病在少 數(shù)民族人口中蔓延最快。在美國，從1981年起，已經(jīng)報道了超過
50950,000例的AIDS。 AIDS襲擊處于多產(chǎn)的年紀的人。由于生物學和 社會原因，婦女患HIV/AIDS的危險增加。
AIDS由人類免疫缺陷病毒(HIV)導致，所述病毒殺死和破壞人體 免疫系統(tǒng)的細胞，并且進行性破壞人體對抗感染和某些癌癥的能力。 HIV最普遍的傳播是通過與受感染的伴侶進行無保護的性交。對這一 問題最有力的解決方案是預防病毒的播散。實現(xiàn)這一目的的一條途徑 是制備安全、有效和負擔得起的HIV疫苗。在世界范圍內(nèi)，處于HIV 感染高危險中的5個患者中不到1個采取了有效的預防。
診斷HIV感染的方法是已知的，包括通過患者樣本的病毒培養(yǎng)、 確定的核酸序列的PCR，以及檢測患者血清中抗-HIV抗體的存在的抗 體測試(參見例如，美國專利第6,979,535， 6,544,728， 6,316,183， 6,261 ,762,4,743,540號)。
根據(jù)本文公開的某些其它實施方案，疫苗組合物和相關的制劑以 及應用方法可以包括來自癌細胞的抗原，其可以用于癌癥的免疫治療 學治療。例如，佐劑制劑可以利用腫瘤排斥抗原，諸如前列腺癌、乳 腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑色素瘤癌的排斥抗原。 示例性的癌癥或癌細力包來源的抗原包括MAGE 1、 3和MAGE4或其 它MAGE抗原如在WO99/40188中公開的那些、PRAME、 BAGE、 Lage (也被稱為NY Eos 1) SAGE和HAGE (WO 99/53061)或GAGE (Robbins and Kawakami， 1996 Cwrm^ Pp/m'cms /mwwwo/ogy 8, pps 628-636; Van den Eynde et al" /w^7z加'owa/ Towma/ o/ C7/m'ca/ cfe i e層rc/ (1997&1998); Correale et al. (1997)， Jo訓a/ o/他"麵/ /"W/M/e 89, p. 293。癌抗原的這些非限定性實例表達于諸如黑 色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌的多種胂瘤類型中。參見，例如美國專 利第6,544,518號。
依照某些本文公開的實施方案，適于與GLA —起使用的其它肺瘤 特異性抗原包括但不限于腫瘤特異性或腫瘤相關性神經(jīng)節(jié)苷脂類，如 GMb和GM3或其與載體蛋白的偶聯(lián)物；或者在GLA疫苗組合物中使 用的用于引發(fā)或增強抗癌癥免疫反應的抗原可以是自身肽激素，諸如 用于許多癌癥的治療的全長促性腺激素釋放激素(GnRH, WO95/20600)， 一種10個氨基酸長的短肽。在另一個實施方案中，使用 了前列腺抗原，諸如前列腺特異性抗原(PSA)、 PAP、 PSCA(例如， 淑, 95(4) 1735-1740 1998)、 PSMA或在優(yōu)選的實施方 案中的稱為前列腺酶(Prostase)的抗原。(例如，Nelson, et al.，尸rac.胸/. Jc"(i. t/&4(1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al.A^". Sd. 1999. 96， 3114-3119; WO 98/12302; U.S. Pat. No. 5,955,306; WO 98/20117; U.S. Pat. Nos. 5,840,871和5,786,148; WO/004149。從 W098/137418和WO/004149中可知其它的前列腺特異性抗原。另一 種是STEAP (iW^S96 14523 14528 7-12 1999)。
用于本發(fā)明的背景下的其它腫瘤相關抗原包括Plu-1 ( /所o/. C7zem 274 (22) 15633 -15645, 1999)、 HASH-1 、 HasH-2、 Cripto (Salomon et al飾m， 199, 21 :61-70， U.S. Pat. No. 5,654， 140)和Criptin (U.S. Pat. No. 5,981,215)。此外與癌癥治療疫苗特別相關的抗原也包括酪氨 酸酶和存活蛋白。
本文7>開的涉及包含癌抗原的含有GLA的疫苗組合物的實施方 案可以用于對抗由腫瘤相關抗原表達表征的任何癌癥，諸如 HER-2/neu表達或其它癌癥特異性或癌癥相關抗原。
診斷具有或疑似有患癌癥危險的個體中的癌癥可以通過眾多本 領域公認的方法學中的任一種來完成，這可以依賴于包括臨床表現(xiàn)、 癌癥的進展程度、癌癥類型或其它因素而變化。癌癥診斷學的實例包 括患者樣本(例如，血液、皮膚活檢、其它組織活檢、手術樣本等)的 組織病理學檢測、組織細胞化學4企測、免疫組織細胞化學^r測和免疫 組織病理學檢測，對限定的遺傳(例如，核酸)標志物的PCR檢測，對 循環(huán)中的癌相關抗原或攜帶所述抗原的細胞的血清學檢測，或對限定 的特異性抗體的血清學檢測，或者本領域技術人員熟悉的其它方法學。 參見，例如，美國專利第6,734,172; 6,770,445; 6,893,820; 6,979,730; 7,060,802; 7,030,232; 6,933,123; 6,682,901; 6,587,792; 6,512,102; 7,078,180; 7,070,931號；JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 211(7):18。
本發(fā)明的某些實施方案的疫苗組合物和方法可以用于預防或治療自身免疫疾病，其包括疾病、狀態(tài)或病癥，其中宿主或個體的免疫 系統(tǒng)不利地介導針對"自身"組織、細胞、生物分子(例如，肽、多肽、
蛋白、糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂質、脂質、糖脂、諸如RNA和DNA 的核酸、低聚糖、多聚糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖等等，以及個體細胞 和組織的其它分子組分)或抗原決定部位(例如，特異性的免疫限定識 別結構，諸如被抗體可變區(qū)互補決定區(qū)(CDR)或被T細胞受體CDR識 別的那些)的免疫反應。
其在任一種情形下都針對正常的自組織。哺乳動物的自身免疫疾病通 常分類為兩種不同類型中的一種細胞介導的疾病(即T-細胞)或抗體 介導的病癥。細胞介導的自身免疫疾病的非限定性實例包括多發(fā)性硬 化、風濕性關節(jié)炎、橋本曱狀腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自 身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(uvoretinitis)。抗體介導的自身免疫病癥包括 但不限于重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(或SLE)、曱狀腺機能亢進、 自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性哮喘、 冷球蛋白血癥、血栓性血小板減少性紫癜、原發(fā)性膽管纖維硬化和惡 性貧血。與系統(tǒng)性紅斑狼瘡有關的抗原是小核核糖核酸蛋白(snRNP); 與曱狀腺機能亢進有關的抗原是促曱狀腺激素受體、曱狀腺球蛋白和 曱狀腺上皮細胞的其它組分(Akamizu et al" 1996; Kellerman et al" 1995; Raju etal., 1997和Texier et al.， 1992);與天皰瘡有關的抗原是類 鈣粘蛋白(cadherin-like)天皰瘡抗原，諸如橋粒芯糖蛋白3和其它黏附 分子(Memar et al" 1996: Stanley, 1995; Plott et al" 1994; and Hashimoto, 1993);以及與血栓性血小板減少性紫癜有關的抗原是血小板抗原。(參 見，例^口，美國專利6,929,796; Gorski et al. (Eds.), (自身
免疫),2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P. E. (Eds.) CWrew/ Cowce, z'w y^o/m附wm'^朋d CArow/c /^/7amma"ow (自身免疫和慢性炎癥的現(xiàn)代觀點)(Cwrr. r印.M/craZ^o/, /mww加/Y微^:參夢和名疾夢的應A觀^」)2001, Springer, NY.)
53自身免疫參與80多種不同的疾病，包括1型糖尿病、多發(fā)性硬化、 狼瘡、風濕性關節(jié)炎、硬皮病和曱狀腺疾病。對于大多數(shù)自身免疫疾
病缺乏有關發(fā)病率的有力的量化評估。20世紀90年代末完成的最新 研究表明自身免疫疾病是美國第三位最常見的主要疾??；且最常見的 自身免疫疾病影響了超過8.5百萬美國人。該疾病流行的目前估值是 美國人口的5%到8%。大多數(shù)自身免疫疾病傾向于侵襲女性?？赡塬@ 得自身免疫疾病的女性是男性的2.7倍多。女性更易感自身免疫疾?。?男性看起來比女性具有更高水平的天然殺傷細胞活性。(Jacobsen et al， C7/wz'ca//附mwwo/ogy 7mmwwo/ a/Ao/ogy， 84:223-243， 1997.)
當免疫系統(tǒng)將自身組織錯認為異物而啟動不恰當?shù)墓魰r，就發(fā) 生了自身免疫疾病。機體可受到自身免疫疾病不同方式的侵襲，包括， 例如腸道(克羅恩氏疾病)和腦(多發(fā)性硬化)。已知自身抗體攻擊自身細 胞或自身組織以損傷它們的功能，并由此導致自身免疫疾病，并且已
知在自身免疫疾病真正發(fā)生(例如，臨床體4i和癥狀出現(xiàn))之前就可以 在患者的血清中檢測出自身抗體。因此自身抗體的檢測可以早期發(fā)現(xiàn) 或識別自身免疫疾病的存在或發(fā)展為自身免疫疾病的風險。基于這些 發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了針對自身抗原的多種自身抗體，并且在臨床檢驗中
已經(jīng)測量了針對自身抗原的自身抗體(例如，美國專利6,919,210, 6,596,501 ， 7，012，134， 6,919,078),而其它的自身免疫診斷學可能涉及 相關代謝產(chǎn)物的檢測(例如,美國專利第4,659,659號)或免疫學活性(例 如，美國專利第 4,614,722和5,147,785, 4,420,558, 5,298,396, 5,162,990， 4,420,461， 4,595,654， 5，846，758， 6,660,487號)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物特別適用于治療老人和/或免 疫低下患者，包括腎透析個體、化療和/或放療個體、接受移植者等。 這些個體通常顯示對疫苗的減弱的免疫反應，因此使用本發(fā)明的組合
物能夠增強這些個體達到的免疫反應。
在其它實施方案中，用于本發(fā)明的組合物中的一種抗原或多種抗 原包括與呼吸系統(tǒng)疾病有關的抗原，諸如由細菌感染(例如，肺炎球菌 感染)導致或加劇的那些疾病，用于預防和治療諸如慢性阻塞性肺疾病 (COPD)的狀態(tài)。COPD的生理學定義是在患'隄性支氣管炎和/或肺氣腫
54部分可逆的呼吸道阻塞(Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121)。 COPD的惡化經(jīng)常是由細菌(例 如，肺炎球菌)感染引起的(Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336- 63)。 TLR
如本文描述的，本發(fā)明的某些實施方案涉及疫苗組合物和免疫佐 劑組合物，包括藥物組合物，所述組合物包括一種或多種鐘樣受體激 動劑(TLR激動劑)。鐘樣受體(TLR)包括天然免疫系統(tǒng)的細胞表面跨膜 受體，其賦予宿主細胞早期識別多種保守的微生物分子結構的能力， 所述分子結構可以存在于眾多傳染性病原體內(nèi)或表面。(例如，Armant et al" 2002 G飾,腸/. 3(8):reviews(綜述)3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 272:50; Medzhitov et al" 1997 CW. C|p/w. /畫畫/. 9:4;
Luster 2002 CWr. O/ /". /mwwwo/. 14:129; Lien et al. 2003 iVa/. /mmimo/. 4:1162; Medzhitov， 2001淑及ev. /畫歸/. 1:135; Takeda et al" 2003 j i ev/附麵wo/. 21:335; Takeda et al. 2005 /"Z. 7mmw加/. 17:1 ; Kaisho et al" 2004臉rah /"/e". 6:1388; Datta et al" 2003 /. /畫畫/. 170:4102)。
誘導TLR-介導的信號轉導以促進通過天然免疫系統(tǒng)的免疫反應 的啟動可以通過TLR激動劑來實現(xiàn)，所述TLR激動劑與細胞表面的 TLR結合。例如，脂多糖(LPS)可以是通過TLR2或TLR4的TLR激 動劑(Tsan et al., 2004 /.丄ei/A;. 76:514; Tsan et al.， 2004爿m. /.
尸力W/0/. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 WocA: 24:206);聚(月幾苷-胞香)(聚I:C)可以是通過TLR3的TLR激動劑(Salem et al., 2006 24:5119); CpG序歹'j(含有未曱基化的胞嘧啶-鳥噤呤或"CpG" 二核苷酸基序的寡聚脫氧核苦酸，例如，CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al. M^Ws FzW ~ C/z'w 尸力ar麵co/ 27:193; Vollmer et al.t>w rAmz/ 少 5:673; Vollmer et al., 2004 Jw&'附/cn96. v4gew" CAe附o/力e廣48:2314; Deng et al., 2004 / /附mwwo/. 173:5148)可以是通過TLR9的TLR激動 劑(Andaloussi et a.， 2006 G7/fl 54:526; Chen et al" 2006 J. /mmw o/. 177:2373);肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6的激動劑(Soboll et al., 2006
55腸/. 7 e戶t/. 75:131 ; Nakao et al., 2005 J. /顯歸/. 174:1566); 3M003 (4-氨基-2-(乙氧甲基)-ce,o:-二曱基-6,7,8,9-四氬-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-乙醇水合物，分子量318Da，來自3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN,其 也是相關化合物3M001和3M002的來源；Gorden et al., 2005 /www"o/. 174:1259)可以是TLR7激動劑(Johansen 2005 五xp. j〃erg. 35:1591 )和/或TLR8激動劑(Johansen 2005);鞭毛蛋白可以是 TLR5激動劑(Feuillet et al.， 2006淑腦103:12487); 且丙肝抗原可以作為通過TLR7和/或TLR9的TLR激動劑(Lee et al., 2006尸亂胸.加J. "&4 103:1828; Horsmans et al,， 2005 42:724)。其它的TLR抗原是已知的(例如，Schirmbeck et al., 2003 /wmw"o/. 171:5198),且依照本文描述的某些實施方可以4吏用其它的 TLR抗原。
例如，借助于背景知識(參見,例如,美國專利第6,544,518號申請)， 已知含有未曱基化的CpG 二核苷酸("CpG")的免疫激活型寡核苷酸可 以作為通過全身和粘膜兩種途徑給藥時的佐劑(WO 96/02555, EP 468520, Davis et al.，丄/畫歸/， 1998. 160(2):870-876; McCluskie and Davis，丄/mmimo/" 1998， 161(9):4463-6)。 CpG是存在于DNA中的胞嘧 啶一鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。cg基序在免疫激活中的重要作用由
Krieg,Mm^e 374,p546 1995闡明。詳細的分析已經(jīng)表明CG基序必須 是在某一序列背景下，且這些序列在細菌DNA中是常見的，但在脊 推動物DNA中罕見。所述免疫激活序列通常是嘌呤、嘌呤、C、 G、 嘧啶、嘧啶；其中所述二核苦酸CG基序不是甲基化的，^f旦已知其它 未甲基化CpG序列具有免疫激活性，且可以用于本發(fā)明的某些實施方 案中。當CpG配制于疫苗中時，它可以在游離的溶液中與游離的抗原 (WO 96/02555; McCluskie and Davis,見上述)一起給藥，或與抗原共i介 偶聯(lián)(PCT公布號WO 98/16247),或者與諸如氬氧化鋁的載體配制(例 ^口, Davis et al.見上述，Brazolot畫Millan et al., iVocA^Z/JcatiSc/., C/S^， 1998, 95(26), 15553-8)。
用于本發(fā)明的佐劑或疫苗的優(yōu)選寡核苷酸優(yōu)選包含由至少三個、 更優(yōu)選至少6個或多個核苷酸分開的兩個或多個二核苷酸CpG基序。本發(fā)明的寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，寡核苷 酸中的核苷酸間是二硫代磷酸酯或更優(yōu)選硫代磷酸鍵，盡管磷酸二酯 和其它的核苷酸間鍵都在包括帶有混合核苦酸間鍵合的寡核苷酸的本
發(fā)明的范圍內(nèi)。在U.S. Pat. Nos. 5,666,153, 5,278,302和WO95/26204
中描述了產(chǎn)生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
優(yōu)選的寡核苷酸的實例具有在下述公開文獻中公開的序列；對于 某些本文公開的實施方案，所述序列優(yōu)選含有硫代磷酸修飾的核苷酸 間鍵合
CPG 7909: Cooper et al" "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults. (CPG 7909佐劑在抗逆轉錄病毒治療的HIV感染的成年人中改善乙型 肝炎病毒疫苗的血清保護).'^4/2)& 2005 Sep 23;19(M):M73-9.
CpG 10101: Bayes et al., "Gateways to clinical trials (臨床試驗途 徑)."M&Ws FzW. .C"w.泡函co/. 2005 Apr;27(3): 193-219.
Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9 (TLR9的免疫激活性CpG 寡聚脫氧核普酸配體的藥物開發(fā)進展)."Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5): 673-682
可選擇的CpG寡核香酸可以包括上文引用的公開文獻中描述的優(yōu) 選序列變體，其不同在于具有無意義(inconsequential)的核苷酸序列置 換、插入、刪除和/或添加。本發(fā)明的某些實施方案中使用的CpG寡 核苷可以通過本領域已知的任何方法合成(例如EP 468520)?？梢岳?自動合成儀方便地合成這些寡核苷酸。所述寡核苷酸通常是脫氧核苷 酸。在優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯， 或更優(yōu)選地是硫代磷酸鍵，盡管磷酸二酯也在本發(fā)明涉及的實施方案 范圍內(nèi)。也涉及包含不同核魯酸間鍵合的寡核香酸，例如，混合的硫 代磷酸磷酸二酯。也可以使用穩(wěn)定寡核芬酸的其它核苦酸間鍵。
輔佐劑
本文提供的某些實施方案包括疫苗組合物和免疫佐劑組合物，包 括藥物組合物，所述組合物除了 GLA,含有至少一種輔佐劑，該輔佐劑指這種組合物中具有不同于GLA的佐劑活性的組分。具有所述佐劑 活性的輔佐劑包括一種成份，其在給予諸如人類(例如人類患者)、非 人類的靈長類、哺乳動物或具有公認的免疫系統(tǒng)的另一種高等真核生
物體的個體時能夠改變(即，以統(tǒng)計學上顯著的方式增加或降低；以及 在某些優(yōu)選的實施方案中，增強或增加)免疫反應的能力和壽命。(參 見,如J i口 ， Powell and Newman, "Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach (疫苗設計-亞單位和佐劑方法)"，1995， Plenum Press, New York)。在本文/>開的某些實施方案中，GLA和期望的抗原，以 及任選地一種或多種輔佐劑可以因此改變，例如引發(fā)或增強針對期望 的抗原的免疫反應，所述抗原可以與GLA同時給藥，或者可以在時間 和/或空間上(例如，在不同的解剖學部位)分開給藥。但某些發(fā)明實施 方案并不限制于此，還涉及在不包括指定抗原的組合物中的GLA的給 藥，但所述組合物還可以包括一種或多種TLR激動劑、輔佐劑、咪唑 并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑以及雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)。
因此如上所述，輔佐劑包括除了 GLA之外具有佐劑作用的成分， 諸如皂苷和皂苷類似物，包括QS21和QS21類似物(參見,例如，U.S. Pat. No. 5,057,540; EP 0 362 279 Bl; WO 95/17210)、明礬、諸如番茄素的 植物堿、諸如(但不限于)皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨 酸的去垢劑、 一種或多種細胞因子(例如，GM-CSF， IL-2， IL-7, IL-12, TNF-a， IFN-力、咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑以及雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑 (dSLIM,例如，Weeratna et al., 2005 Faca7ze 23:5263)。
在例如美國專利6,544,518， Lacaille-Dubois， M and Wagner H. (1996 2:363-386)，美國專利第5,057,540號，Kensil, O"
i ev 77^ C釘^ ， 1996， 12 (1-2): 1-55和EP 0 362 279 Bl中 講述了包括皂苷的去垢劑。包含Quil A部分(皂芬)的稱為免疫激活復 合物(ISCOMS)的孩i粒結構是溶血的，且已經(jīng)用于疫苗的制備中 (Morein, B., EP 0 109 942 Bl)。據(jù)報道，這些結構具有佐劑活性(EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711)。這些溶血急苦QS21和QS17 (Quil A的 HPLC純化部分)已經(jīng)作為有效的系統(tǒng)佐劑;故描述，且在U.S. Pat. No.5,057,540和EP 0 362 279 Bl中公開了它們的制備方法。這些參考
58文獻中也描述了 QS7 (Quil-A的非溶血部分)作為系統(tǒng)疫苗的有效佐劑的用途。在Kensil et al. (1991. J. Immunology 146:431-437)中還描述了QS21的用途。QS21和聚山梨醇酯或環(huán)式糊精的組合也是已知的(WO99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含諸如QS21和QS7的QuilA部分的微粒佐劑系統(tǒng)。已經(jīng)用于系統(tǒng)接種疫苗研究的其它皂苷包括來自諸如絲石竹屬(Gypsophila)和肥皂草屬(Saponaria)的其它植物品種的那些(Bomford et al.， Kacc/"e, 10(9):572-577, 1992)。
七葉樹皂角素(E s cin)是與用于本文公開的實施方案的佐劑組合物中的皂苷有關的另一種去垢劑。七葉樹皂角素在默克索引(第12版第3737條目)中被描述為皂苷的混合物，存在于馬栗樹(horse chestnuttree),歐洲七葉杉于(Jescw/Ms/n》; ocflWawwm」的沖予中。描述了它通過層析和純化(Fiedler， Arzneimittel- Forsch. 4, 213 (1953)),以及通過離子交換樹脂(Erbring et al., U.S. Pat. No. 3，238,190)的分離。七葉樹皂角素部分
M， et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8): 1454-1464))。毛地黃皂苷是另一種去垢劑，也在默克索引(第12版，第3204條目)中被描述為皂苷，其來自毛地黃CD/g/tofc/ i^pi^efl)的籽，并依照Gisvoldet al.， 爿m.J5^0c， 1934， 23, 664禾口 Rubenstroth-Bauer，尸Ajas7'o/.CA亂，1955, 301, 621描述的方法被純化。
用于本文公開的某些實施方案中的其它輔佐劑包括嵌段共聚物或生物可降解聚合物，其涉及本領域相關技術人員熟悉的 一類聚合化合物?？梢园ㄔ贕LA疫苗組合物內(nèi)或GLA免疫佐劑內(nèi)的嵌段共聚物或生物可降解聚合物的實例包括普流羅尼克⑧L121 (BASF Corp.，Mount Olive, NJ;參見，例如，Yeh et al" 1996 PZ 畫.版13:1693;美國專利第5,565,209號)、CRL1005 (例如，Triozzi et al., 1997 C"" C證.
3:2355)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、以及聚I:C。(參見,例如，Powell andNewman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗設計—亞單^立和佐劑方法)"，1995, Plenum Press, New York)
59某些實施方案涉及包括油的GLA疫苗和GLA免疫佐劑，所述油在某些此類實施方案中可以促進輔佐劑活性，在其它的此類實施方案中可以附加地或選擇地提供藥學上可接受的載體或賦形劑。已知許多
疫佐劑組合物中。舉例來說，此類油的實例包括但不限于角鯊烯、角鯊烷、礦物油、橄欖油、膽固醇和二縮甘露醇單油酸酯。
已知的，并可以作為輔佐劑包括在本發(fā)明公開的某些實施方案中。某些優(yōu)選的咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑包括(作為非限定性實例)雷西莫特(R848)、咪p奎莫特和嘎德莫特(Hemmi et al., 2002 A^. 7mmt/"o/.3:196; Gibson et al" 2002 Ce//. /mw腳/. 218:74; Gorden et al., 2005/mww"o/. 174:1259);這些和其它的咪唑并會啉免疫反應調(diào)節(jié)劑在適當?shù)臈l件下，也可以具有本文描述的TLR激動劑活性。其它的免疫反應調(diào)節(jié)劑是基于核酸的雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)?？梢栽赟chmidt et al.,2006 垂rgy 61:56; Weihrauch et al. 2005 C// C羅w11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals， J. Knablein (Editor).John Wiley & Sons, December 6, 2005.(183至約200頁討論了 dSLIM)中，以及從Mologen AG (Berlin, FRG: [2006年8月18曰在http:〃www,mologen.com/English/ 04.20-dSLIM.shtml的在線4全索]中發(fā)現(xiàn)被涉及用于本發(fā)明公開的某些實施方案中的dSLIM的具體實例。
如上文所述，與本文所述的GLA —起使用的一種輔佐劑可以是鋁輔佐劑，其通常被稱為"明礬"。明礬輔佐劑基于下述羥基氧化鋁、^疇酸羥鋁，或各種專利鹽(proprietary salts)。使用明石凡輔佐劑的疫苗可以包括用于破傷風菌抹、HPV、曱型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒的疫苗以及本文描述的其它抗原。鋁輔佐劑是有優(yōu)勢的，因為它們具有良好的安全記錄、能放大抗體反應、穩(wěn)定抗原并且用于大規(guī)模生產(chǎn)相對簡單。(Edelman 2002 Mo/. 21:129-148; Edelman， R. 1980
Rev. /"/ec/.版2:370-383,)
可以與GLA結合用于有效的免疫刺激的其它輔佐劑包括皂普和皂苷類似物，包括QS21以及在本文被稱為QS21類似物的產(chǎn)生相似作用的結構相關化合物。QS21已經(jīng)被公認為是優(yōu)選的輔佐劑。QS21可以包含來自智利皂笑樹(Qi"llaja Saponana Molma)的樹皮、經(jīng)11PLC純化的非毒性部分。在U.S. Pat, No. 5，057，540中公開了 QS21的制備。(還可參見美國專利第6,936,255, 7,029,678和6,932,972號)
在某些實施方案中，GLA也可以與被稱為ISCOMS的"免疫激活復合物"(例如美國專利第6,869,607, 6,846,489， 6,027,732， 4,981,684號)結合，包括皂普來源的ISCOMATRIX ,其可以從例如Iscotec(Stockholm, Sweden)和CSL Ltd. (Parkville， Victoria, Australia)商購。
重組表達構建體
依照本文公開的某些實施方案，GLA疫苗組合物可以含有至少一種重組表達構建體，其包含可操作連接于編碼抗原的核酸序列的啟動子。在某些另外的實施方案中，所述重組表達構建體存在于諸如腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒、慢病毒、痘病毒或逆轉錄酶病毒載體的病毒載體中。制備和使用這些表達構建體和載體的組合物和方法是本4貞i或已4口的，侈ij々口依照、Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols inMolecular Biology (新編分子生物學實驗指南)，2006 John Wiley &Sons, NY，用于本文提供的多肽抗原的表達。通?？梢栽诶缑绹鴮＠?,844,192; 7,037,712; 7,052,904; 7，001，770; 6,106,824; 5,693,531;6,613,892; 6，875，610; 7,067,310; 6,218,186; 6,783,981; 7，052，904;6,783,981; 6,734,172; 6,713,068; 5,795,577和6,770,445號以及別處找到用于某些本發(fā)明公開的實施方案中的重組表達構建體的非限定性實例，以及適用于本文提供的多肽抗原表達的教導。
免疫反應
本發(fā)明因此提供了在能夠啟動免疫反應的宿主內(nèi)改變(即，例如，相對于本領域的技術人員熟悉的適當對照，以統(tǒng)計學上顯著的方式增強或降低)免疫反應的組合物。正如本領域的普通技術人員已知的，免疫反應可以是宿主免疫狀態(tài)的任何積極的改變，其可以包括參與宿主免疫狀態(tài)的維持和/或調(diào)節(jié)的一種或多種組織、器官、細胞或分子的結構或功能的任何改變。通常，可以通過多種公知的參數(shù)的任一種^^測免疫反應，這些參數(shù)包括但不限于體內(nèi)或體外的下述^r測可溶性免疫球蛋白或抗體的檢測；諸如細胞因子、淋巴因子、趨化因子、激素、生長因子等可溶性介質以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核普和/
或脂質介質的檢測；由免疫系統(tǒng)中細胞改變的功能或結構特性確定的
細胞激活狀態(tài)的變化，例如細胞增殖、改變的運動性、諸如特異性基
因表達或溶細胞行為的專門活性誘導；通過免疫系統(tǒng)的細胞的細胞分化，包括改變的表面抗原表達譜或凋亡的啟動(程序性細胞死亡)；或者任何其它可以;險測免疫反應存在的標準。
免疫反應通常被認為是，例如，通過宿主免疫系統(tǒng)的細胞和組織在分子和細胞水平上區(qū)分自身結構和異已結構，但本發(fā)明不應局限于此。例如，免疫反應還可以包括由自身分子、細胞或組織的免疫識別導致的免疫系統(tǒng)狀態(tài)變化，這可以伴隨諸如免疫系統(tǒng)組分的典型調(diào)節(jié)的許多正常狀態(tài)，或者可以存在于諸如在自身免疫和退行性疾病中觀測到的不適當?shù)淖陨砻庖叻磻牟±頎顟B(tài)。作為另一個實例，除了誘導特定免疫系統(tǒng)活性的上調(diào)(諸如抗體和/或細胞因子產(chǎn)生，或者細胞介導的免疫激活)外，免疫反應還可以包括可檢測的免疫的抑制、消弱或任何其它的下調(diào)，這可以是由選擇的抗原、抗原給藥途徑、特異耐受誘導或其它因素導致的。
可以通過本領域的普通技術人員易于熟悉的許多公知的免疫學測定的任一種來建立由本發(fā)明的疫苗誘導的免疫反應的檢測。這些測定包括，但不必限于體內(nèi)或體外的下述檢測可溶性抗體的檢測；諸如細胞因子、淋巴因子、趨化因子、激素、生長因子等可溶性介質以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苦和/或脂質介質的檢測；由免疫系統(tǒng)中細胞改變的功能或結構特性來確定的細胞激活狀態(tài)的變化，例如細胞增殖、改變的運動性、諸如特異性基因表達或溶細胞行為的專門活性誘導；通過免疫系統(tǒng)的細胞的細胞分化，包括改變的表面抗原表達譜或凋亡的啟動(程序性細胞死亡)。進行這些和類似測定的操作步4聚是7>#口的，并且可以在<列^口 Lefkovits (/wmwwo/ogy Me/Aofi^ Afawwa/:T7zg C頻/ rg/ze聽've <S<9MrcedooA o/rec/zm々w&s (0^瘦夢才法手H面的戎j諒參,勸，1998;也可參見C群eW尸ratoco/".w/畫麗o/柳W建夢豸-繪 /^」；還可參見，例如，Weir, i7aw必ooA: o/ ￡r/ en>ne"M/
62/mmwwo/ogy (^^發(fā)^瘦夢手^f」，1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Se/ecto/ M^Ao^s Ce〃w/ar 7mmwwo/ogy 〈勿應 f瘦夢才法;#逸」，1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green andReed， 1998 Sde"ce 281 :1309和其中引用的參考文件)中找到。
抗原反應性T細胞增殖的檢測可以通過多種已知的技術實現(xiàn)。例 如，T細胞增殖可以通過測量DNA合成的速率來^r測，且抗原特異性 可以通過控制暴露于候選的抗原反應性T細胞的刺激物(諸如，例如， 特異性期望的抗原-脈沖抗原呈遞細胞或對照抗原-脈沖抗原呈遞細月包) 來測定。被刺激增殖的T細胞顯示了增加的DNA合成速率。測量DNA 合成速率的經(jīng)典方式是，例如，通過用含氚的胸腺嘧咬脈沖標記T細 胞培養(yǎng)物，所述含氚的胸腺嘧啶是摻入新合成的DNA的核苷前體。 摻入的含氣胸腺。密啶的量可以用液體閃爍譜儀來測定。檢測T細胞增 殖的其它方式包括測量白介素-2 (IL-2)產(chǎn)生的增加、Ca"流出或染料攝 取，諸如3-(4，5-二甲基p塞唑-2-基)-2,5-聯(lián)苯-四唑?？蛇x擇地，可以測 量淋巴因子(諸如干擾素-力的合成，或者可以定量應答特定抗原的T 細胞的相對數(shù)目。
例如，可以通過采用諸如放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、平衡透析或包括Western印跡的固相免疫印跡的體外方法學， 測定來自用本發(fā)明的疫苗處理的宿主的樣本(例如，包含免疫球蛋白的 樣本，諸如血清、血漿或血液)來檢測抗原特異性抗體的產(chǎn)生。在優(yōu)選 的實施方案中，ELISA測定還可以包括用靶抗原特異性的固相單克隆 抗體進行靶抗原的抗原捕獲固定，例如，以增加該測定的^:感性。例 如，使用商業(yè)途徑容易得到的方法、裝置和試劑(例如Sigma, St. Louis, MO;還參見R&D Systems 2006 Catalog, R&D Systems, Minneapolis, MN),通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)也可以容易地檢測可溶性介質 (例如，細胞因子、趨化因子、淋巴因子、前列腺等)的詳細結果。
許多其它的免疫學參數(shù)可以使用本領域公知的常規(guī)測定來監(jiān)測。 這些可以包括，例如，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC) 測定、繼發(fā)性體外抗體反應、利用已確立的標志物抗原系統(tǒng)進行各種 外周血細胞或淋巴樣單核細胞亞群的流式免疫細胞熒光測定分析、免
63疫組織化學或其它相關的測定。例如，可以在Rose etal. (Eds.), Ma聽a/
5成人1997 American Society of Microbiology, Washington, DC中找到 這些和其它測定。
因此，本發(fā)明涉及本文提供的疫苗和佐劑組合物能夠引發(fā)或增強 宿主的至少一種免疫反應，所述免疫反應選自Th1-型T淋巴細胞反應、 Th2-型T淋巴細胞反應、細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應、抗體反應、 細胞因子反應、淋巴因子反應、趨化因子反應以及炎癥反應。在某些 實施方案中，免疫反應可以包含下述中的至少一種 一種或多種細胞 因子的產(chǎn)生，其中所述細胞因子選自千擾素-7(IFN-7)、腫瘤壞死因子 -a (TNF-a); —種或多種白介素的產(chǎn)生，其中所述白介素選自IL-l、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL陽IO、 IL-12、 IL-13、 IL-16、 IL-18 和IL-23; —種或多種趨化因子的產(chǎn)生，其中所述趨化因子選自 MIP-lce、 MIP-1 0、 RANTES、 CCL4和CCL5;以及選自記憶性T細 胞反應、記憶性B細胞反應、效應T細胞反應、纟田月包毒T細胞反應以 及效應B細胞反應的淋巴細胞反應。參見，例如WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6,692,752; U.S. 7,084,256; U.S. 6,977,073; U.S. 6,749,856; U.S. 6,733,763; U.S. 6，797，276; U.S. 6,752,995; U.S. 6,057,427; U.S. 6,472,515; U.S. 6,309,847; U.S. 6,969,704; U.S. 6,120,769; U.S. 5,993,800; U.S. 5,595,888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951 ; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53;Beutler et al., 1986 Nature 320:584; U.S. 6，991 ,791 ; U.S. 6，654，462; U.S. 6,375,944。 藥物組合物
藥物組合物通常包含GLA (可/人Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL購買；產(chǎn)品號699800),且還可以包含本文提供的與藥學上可接受 的載體、賦形劑或稀釋劑結合的一種或多種組分，其選自抗原、TLR 激動劑、輔佐劑(任選地包括細胞因子、咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和 /或dSLIM)和/或重組表達構建體。
因此，在某些方面，本發(fā)明涉及GLA"單治療"，其中如本文所述 的，GLA被配制于基本上沒有其它抗原的組合物中，并被給予個體以
64激活免疫反應，例如非特異性免疫反應，由此治療或預防疾病或其它 狀態(tài)，諸如生物體導致的感染。在一個實施方案中，例如，本發(fā)明的 組合物和方法采用了單磷酰二糖用于激活個體的免疫反應。在另一特 定實施方案中，所述組合物和方法使用脂質A的2-單酰形式來激活個
體的免疫反應。在另一特定實施方案中，GLA采用了噴霧形式，任選 地以試劑盒的形式提供。
GLA可以優(yōu)選配制于穩(wěn)定的乳劑中。在一個特定的實施方案中， 例如，提供了在基本上沒有其它抗原的穩(wěn)定乳劑中包含脂質A衍生物 的組合物。在另一個特定的實施方案中，提供了適用于哺乳動物的包 含3-酰基單磷酸脂質A的衍生物的組合物，其中2位氨基具有單酰鏈， 且該組合物基本上沒有其它抗原。
在某些其它實施方案中，藥物組合物是包含GLA和抗原的疫苗組 合物，另外還可以包含本文提供的與藥學上可接受的載體、賦形劑或 稀釋劑結合的一種或多種組分，其選自TLR激動劑、輔佐劑(包括例 如細胞因子、咪唑并壹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑和/或dSLIM)等和/或重組表 達構建體。
示例性的載體在使用的劑量和濃度對受者無毒。對于基于GLA加 核酸的疫苗，或者對于包含GLA和抗原的疫苗，每千克體重給予約 0.01]Ltg至約100 mg，通常是通過皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑或 通過其它途徑給予。
優(yōu)選的劑量是約1 /Ag/kg至約1 mg/kg，特別優(yōu)選的是約5 /xg/kg 至約200jLig/kg。對本領域的技術人員顯而易見的是，給藥的數(shù)量和頻 率依賴于宿主的反應。用于治療用途的"藥學上可接受的載體"是藥學 領域7>知的，且在例如Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥 物科學)，Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)中被描述。例 如，可以使用生理學pH的無菌鹽水和磷酸緩沖鹽。防腐劑、穩(wěn)定劑、 染料以及甚至調(diào)味劑都可以提供在藥物組合物中。例如，苯曱酸鈉、 山梨酸和對羥基苯曱酸酯可以作為防腐劑加入。同上在1449。此外， 可以使用抗氧化劑和懸浮劑。同上。"藥學上可接受的鹽"指本發(fā)明的化合物的鹽，其來自所述化合物和 有機酸或無機酸(酸加成鹽)或者有機或無機堿(堿加成鹽)的合并物。本 發(fā)明的組合物可以以游離堿或鹽的形式使用，兩種形式都被認為是在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
藥物組合物可以是允許該組合物給予患者的任何形式。例如，所 述組合物可以是固體、液體或氣體(氣溶膠)的形式。給藥的典型途徑 包括，但不限于，口部的、表面的、腸胃外的(例如舌下的或經(jīng)頰的)、 舌下的、直腸的、陰道的以及鼻內(nèi)的(例如作為噴霧劑)。本文使用的
術語腸胃外的包括電離子導入(例如U.S. 7,033,598; 7,018,345; 6，970，739)、超聲波導入(例如，U.S. 4,780,212; 4,767,402; 4,948,587; 5,618,275; 5,656,016; 5,722,397; 6,322,532; 6,018,678)、熱的(例如U.S. 5,885,211; 6,685,699)、被動透皮(例如U.S. 3，598,122; 3,598,123; 4,286,592; 4，314,557; 4,379,454; 4,568,343; 5,464,387; UK Pat. Spec. No. 2232892; U.S. 6,871 ,477; 6,974,588; 6,676,961)、微針(例如U.S. 6,908,453; 5,457,041 ; 5,591 ,139; 6，033,928)給藥，且還包括皮下注射、 靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、海綿竇內(nèi)(intmcavernous)、鞘內(nèi)(intrathecal)、 外耳道內(nèi)(intrameatal)、尿道內(nèi)注射或輸注方法。在特定的實施方案中， 本文描述的組合物(包括疫苗和藥物組合物)通過選自電離子導入、微 氣穴(microcavitation)、超聲波導入或微針的技術皮內(nèi)給藥。
如此配制藥物組合物以使在將該組合物給予患者時，包含其中的 活性成分是生物可利用的。給予患者的組合物釆用 一個或多個劑量單 位的形式，其中，例如，藥片可以是單一劑量單位，以氣溶膠形式的 本發(fā)明的 一種或多種化合物的容器可以有多個劑量單位。
對于口服給藥，可以存在賦形劑和/或粘結劑。實例是蔗糖、高嶺 土、淀粉糊精、藻酸鈉、羧曱基纖維素和乙基纖維素。著色劑和/或調(diào) 味劑可以存在?？梢允褂猛繉印?br> 組合物可以是液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳劑或懸浮劑。 作為兩個實例，所述液體可以口服給藥或通過注射遞送。當意名叉口服 給藥時，優(yōu)選的組合物包含甜味劑、防腐劑、染色/著色劑以及增味劑 的一種或多種。在意欲通過注射給藥的組合物中，可以包括表面活性
66劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑的 一種或多種。
本文使用的液體藥物組合物藥物組合物，無論是以溶液、懸浮液 的形式或其它相似的形式，都可以包括下述載體或賦形劑的一種或多 種諸如注射水、鹽水溶液、優(yōu)選生理鹽水、林格液、等滲氯化鈉的 無菌稀釋液，諸如角豊烯、角鯊烷、礦物油、二縮甘露醇單油酸酯、 膽固醇和/或合成的單和二甘油酯的可以作為溶劑或懸浮介質的不揮
發(fā)性油，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它溶劑；諸如苯甲醇或尼泊 金甲酯的抗菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉的抗氧化劑；諸如乙二 胺四乙酸的螯合劑；諸如乙酸鹽、種檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液以及諸 如氯化鈉或葡萄糖的張力調(diào)節(jié)劑。腸胃外制劑可以裝入安瓿、 一次性 注射器或由玻璃或塑料制成的多次劑量瓶內(nèi)。可注射的藥物組合物優(yōu) 選是無菌的。
在特別的實施方案中，本發(fā)明的藥物或疫苗組合物包含小于0.2 um的穩(wěn)定水懸浮液，且進一步包含選自磷脂、脂肪酸、表面活性劑、 去垢劑、皂苷、含氟脂(fluorodatedlipids)等的至少一種組分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物以可以霧化的方式配制。 在疫苗或藥物組合物中包括諸如遞送載體的其它組分也可以是理 想的，所述遞送載體包括但不限于鋁鹽、油包水型乳劑、生物可降解 油載體、水包油型乳劑、生物可降解微膠嚢以及脂質體。在上文也描
括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-異谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、 GM-CSF、 7干擾素和IL-12。
盡管本發(fā)明的藥物組合物可以使用本領域的技術人員已知的任何 合適的載體，但載體的類型依賴給藥方式和是否需要持續(xù)釋放而變化。 對于腸胃外給藥，諸如皮下注射，載體優(yōu)選包含水、鹽水、乙醇、脂 肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可以使用上述載體的任一種或固體 載體，諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、 葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以使用生物可降解的微球體(例如聚乳交 酯(polylactic galactide))作為本發(fā)明的藥物組合物的載體。例如在美國專利第4，897，268和5,075,109號中公開了合適的生物可降解的微球體。 在這點上，大于約25微米的微球體是優(yōu)選的。
藥物組合物(包括GLA疫苗和GLA免疫佐劑)也可以含有諸如緩 沖液的稀釋液，諸如抗壞血酸的抗氧化劑、低分子量(少于約10個殘 基)的多肽、蛋白質、氨基酸、包括葡萄糖、蔗糖或糊精的碳水化合物， 諸如EDTA的螯合劑，谷胱甘肽和其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽 水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是示例性的適當?shù)南♂屢骸?yōu) 選地，使用適當?shù)馁x形劑溶液(例如，蔗糖)作為稀釋液可以將產(chǎn)品配 制成冷凍干產(chǎn)物。
如上文所述，在某些實施方案中，本發(fā)明包括能夠遞送編碼期望 的抗原的核酸分子的組合物。這種組合物包括重組病毒載體(例如，逆 轉錄病毒(參見WO 90/07936, WO 91/02805， WO 93/25234, WO 93/25698和WO 94/03622)、 &泉病毒(參見Berkner,所o&c/ m々i^s 6:616-627, 1988; Li et al.， //謂.G匿77 e廣4:403-409， 1993; Vincent et al.，淑.5:130-134， 1993; and Kolls et al" P亂胸/. Jcad. W.
97:215-219, 1994),痘病毒(參見美國專利第4,769,330號；美國專 利第5,017，487號；和WO 89/01973))、絡合到聚陽離子分子的重組表 達構建體核酸分子(參見WO 93/03709),以及與脂質體結合的核酸(參 見Wang et al.，尸亂胸/. Jed Sc/.固84:7851 , 1987)。在某些實施 方案中，DNA可以連接到殺死的或滅活的腺病毒(參見Curiel et al.， //wm. Gewe rAer 3:147-154， 1992; Cotton et al., iVoc.爿cad. Sd.
89:6094， l"2)。其它合適的組合物包括DNA-配體(參見Wu et al., C力em. 264:16985-16987, 1989)和脂質-DNA組合物(參見 Feigner et al.，尸rac. Mz". JcaA <Scz'. 84:7413-7417, 1989)。
除了直接的體內(nèi)操作，也可以采用間接體內(nèi)(ex vivo)操作，其中將 細胞從宿主取出，修飾并置入相同的宿主動物或另外的宿主動物。顯 然，本領域技術人員可以利用上述組合物的任一種將編碼抗原的核酸 分子導入間4妻體內(nèi)環(huán)境中的組織細胞。用于病毒的、物理的和化學的 才聶取方法的操作是本領域公知的。因此，本發(fā)明用于增強或引發(fā)宿主、患者或細胞培養(yǎng)物的免疫反 應。如本文使用的，術語"患者，，指任何溫血動物，優(yōu)選人類?；颊呖?以罹患傳染性疾病、諸如乳腺癌的癌癥或自身免疫疾病，或者可以是 正常的(即，沒有可檢測的疾病和/或感染)。"細胞培養(yǎng)物"是含有免疫 活性細胞或免疫系統(tǒng)的分離的細胞(包括，但不限于，T細胞、巨p盆細 胞、單核細胞、B細胞和樹突狀細胞)的任何制備物。所述細胞可以通 過本領域普通技術人員公知的多種技術來分離(例如聚蔗糖-泛影葡胺
(Ficoll-hypaque)密度離心)。細胞可以(但不必須)從罹患癌癥的患者中 分離出，且可以重新導入治療后的患者。
在某些實施方案中，意欲腸胃外或口服給藥的液體組合物應該含 有一定量的GLA疫苗組合物以達得合適的劑量。通常，該量是組合物 中抗原重量的至少0.01%。當意名爻口服給藥時，該量可以在組合物重 量的0.1%至約70%變動。優(yōu)選的口服組合物含有約4%至約50%的抗 原。優(yōu)選的組合物和制劑如下制備使腸胃外劑量單位含有0.01%至 1%重量比的活性成分。
藥物組合物可以用于表面給藥，在這種情況下，載體可以適宜地 包括溶液、乳劑、藥膏或凝膠基質。所述基質，例如，可以包括下述 中的一種或多種礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、諸如水 和乙醇的稀釋液，以及乳化劑和穩(wěn)定劑。增稠劑可以存在于用于表面 給藥的藥物組合物中。如果計劃透皮給藥，組合物可以包括透皮貼片 或電離子導入裝置。表面制劑可以含有來自約0.1%至約10% w/v (每 單位體積的重量)的抗原(例如GLA-抗原疫苗組合物)或GLA (例如免 疫佐劑組合物；GLA可以從Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL處 得到；例如產(chǎn)品號699800)的濃縮物。
意欲直腸給藥的組合物，可以采用例如栓劑的形式，其在直腸內(nèi) 溶化并釋放出藥物。用于直腸給藥的組合物可以含有作為合適的無刺 激賦形劑的油脂性基質。這種基質包括，但不限于，羊毛脂、可可油 和聚乙二醇。在本發(fā)明的方法中，疫苗組合物/佐劑可以通過使用插入 物、珠子、延時釋放制劑、貼片或快速釋放制劑來給藥。
69某些實施方案也涉及包含本文描述的GLA疫苗組合物和/或GLA 免疫佐劑組合物的試劑盒，其可以以一種或多種容器提供。在一個實 施方案中，GLA疫苗組合物和/或GLA免疫佐劑組合物的所有組分共 同存在于單個容器內(nèi)，但本發(fā)明的實施方案并不限制于此，還可以涉 及兩個或多個容器，其中，例如，GLA免疫佐劑組合物與抗原組分分 離，互不接觸。通過非限定的理論，認為在一些情況下，GLA免疫佐 劑組合物的單獨給藥是有益的，而在另一些情況下，這種給藥與抗原 的給藥在時間上和/或空間(例如在不同的解剖部位)上分開是有益的， 仍在另 一些情況下，個體的給藥是有益地給予本文所述的GLA疫苗組 合物，其包含抗原和GLA，以及任選地，最好還是本文所述的其它組 分。
所述試劑盒實施方案的容器可以是任何合適的容器，器皿、小瓶、 安瓿、管子、杯子、盒子、瓶子、長頸瓶、罐、盤、單孔或多孔器械 的孔、槽、桶等等，或者其它裝置，本文公開的組合物可以在其中放 置、儲存和/或轉運，并易于移走其中的內(nèi)容物。通常，這種容器可以 由與目的用途相兼容的材料制造，從中可以容易地實現(xiàn)包含的內(nèi)容物 的回收。這種容器的優(yōu)選實例包括玻璃和/或塑料密封的或可重新密封 的管子和安瓿，包括具有橡膠隔膜的那些或其他密封的裝置，其使用 針和注射器與內(nèi)容物的回抽兼容。例如，這樣的容器可以由玻璃或化 學兼容的塑料或樹脂制成，該玻璃或化學兼容的塑料或樹脂可以由一 種材料制成，也可以是涂覆由這種材料，該材料允許容器中的物質的 有效回收和/或保護這種物質免受例如諸如紫外線或溫度極限的降解 條件的影響，或防止包括微生物污染物的不必要的污染物進入。容器 優(yōu)選地為無菌的或可滅菌的，并且由可與任何載體、賦形劑、溶劑、 媒介物等兼容的材料制成，這樣可被用于懸浮或溶解本文所描述的疫 苗組合物和/或免疫佐劑組合物和/或抗原和/或重組表達構建體等等。
乳劑系統(tǒng)還可以用于配置本發(fā)明的組合物。例如，許多單相或多 相乳劑系統(tǒng)已經(jīng)被描述。已經(jīng)證明，水包油乳劑佐劑本身作為一種輔 助成分是有用的(EP 0 399 843B)。此外，水包油乳劑和其他活性劑的 合并物作為疫苗佐劑也已經(jīng)^皮描述(WO 95/17210; WO 98/56414; WO99/12565; WO 99/11241)。已描述了其他油乳劑佐劑，諸如油包水乳劑 (U.S. Pat. No. 5,422,109; EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳劑(U.S. Pat. No. 5.424,067; EP 0 480 981 B)。用于本發(fā)明的油乳劑佐劑可以是天然 的或合成的，可以是礦物的的或有機的。礦物油和有機油的實例很容 易為本領域的技術人員所理解。
在一個特別的實施方案中，本發(fā)明的組合物包含水包油乳劑，其 中GLA摻入油相中。在另一個實施方案中，本發(fā)明組合物物包含水包 油乳劑，其中GLA摻入油相中，并存在另外的組分，諸如本文所描述 的輔佐劑、TLR激動劑等。
為了使任何水包油組合物適合對人類的給藥，乳劑系統(tǒng)的油相優(yōu) 選包含一種可代謝油。術語可代謝油的含義為本領域所熟知。可代謝 可以被定義為"能夠通過新陳代謝被轉化，，(Dorland's illustrated Medical Dictionary (道蘭氏圖解醫(yī)學詞典)，W. B. Saunders Company, 25th edition (1974))。所述油可以是任何植物油、魚油、動物油或合成 油，其對受體無害且能夠通過新陳代謝被轉化。堅果(例如花生油)、 種子和谷物是植物油最通常的來源。合成油也是本發(fā)明中的 一部分， 可以包括商用油，例如NEOBEEe及其他。
例如角鯊烯(2,6,10， 15,19,23-六曱基-2,6,10,14,18，22-二十四碳六 烯)，是一種不飽和油，在鯊魚肝油中大量存在，在橄欖油、麥芽油、 米糠油和發(fā)酵粉中含量較少，它是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。考慮 到角鯊烯是膽固醇生物合成中的中間物(默克索引，第10版，第8619 條目)，因此它是可代謝的油。特別優(yōu)選的油乳劑是水包油乳劑，尤其 是水包角鯊烯乳劑。另外，本發(fā)明中最優(yōu)選的油乳劑佐劑包含一種抗 氧化劑，其優(yōu)選地為a生育酚油(維生素E, EP 0 382 271 Bl)。 WO 95/17210和WO 99/11241公開了任選地與免疫刺激劑QS21和/或 3D-MPL(上文已經(jīng)討論過)配制的基于角鯊烯、ce生育酚、吐溫⑧80 (TWEEN⑧80)的乳劑佐劑。WO 99/12565公開了通過在油相中加入固 醇，對這些角鯊烯乳劑的改進。另夕卜，甘油三酯，諸如三辛精((327115()06) 可以被加入油相中，以便穩(wěn)定乳劑(WO 98/56414)。
71存在于穩(wěn)定的水包油乳劑中的油滴的大小優(yōu)選直徑小于1微米，
可以在基本上30-600nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選直徑基本上約30-500 nm，且 最優(yōu)選直徑基本上為150-500 nm，特別是直徑約為150 nm，所述直徑 是用光子相關光譜法測量的。在這一點上，數(shù)目為80%的油滴應在優(yōu) 選的范圍內(nèi)，數(shù)目更優(yōu)選超過90%和最優(yōu)選地超過95%的油滴位于限 定的大小范圍內(nèi)。存在于本發(fā)明中的油乳劑中的組分的量常規(guī)是2% 至10%的諸如角罝烯的油；2%至10%的a生育酚(如果存在時)；以及 0.3%至3%的表面活化劑，諸如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。優(yōu)選 地，油a生育酚的比例等于或少于1，這樣能提供更穩(wěn)定的乳劑。司 盤85也可以以約1%的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明中的疫苗另 外含有穩(wěn)定劑是有益處的。
法包括將油相與如PBS/吐溫80⑧溶液的表面活性劑混合，隨后用均質 器均質化。例如，包括將混合物通過注射器針頭一次、兩次或更多次 的方法適合均質化少量的液體。同樣地，在微射流均質器(microfluidiser) (M110S微流體儀，最大50個通道，在6帕的最大輸入壓(約為850帕 的輸出壓)下作用2分鐘時間)中的乳化過程適合制備較小或較大體積 的乳劑。可以通過包括測量產(chǎn)生的乳劑的常規(guī)試驗來進行這種調(diào)整， 直至制備出所需直徑的油滴。
下面提供的實施例用于說明而非限制。
實施例
實施例1
GLA水制劑
本實施例描述了含有GLA的佐劑水制劑的制備。該GLA水制劑 (GLA-AF)含有注射水(WFI)、 GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; 產(chǎn)品號 699800)和 1-棕櫚酰-2-油酰-膽堿磷酸 (l隱palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphochline, POPC)。 通過卄尋乙醇 和POPC溶液添加到預稱重量的GLA中制備所述制劑。將潤濕的GLA 超聲10分鐘以盡可能地分散GLA。然后將GLA在氮氣中干燥。干燥
72的GLA和POPC用WFI重新水化以達到恰當?shù)捏w積。將該溶液在60°C 下超聲15-30分鐘，直至所有的GLA和POPC都溶解。對于長期的保 存，GLA-AF制劑必須凍干。凍干過程包括將甘油添加到溶液中，直 到達到總體積的2%。然后將溶液置于l-10mL量的小瓶中。隨后使小 瓶經(jīng)歷凍干過程，該過程包括冰凍溶液及隨后將其置于真空中通過升 華抽走凍結的水份。
實施例2
GLA HPLC分析
本實施例描述了含GLA的佐劑水制劑的HPLC分析。將該制劑生 產(chǎn)出后(參見，上述實施例1),要進行某些放行和穩(wěn)定性檢驗以確保產(chǎn) 品質量和重現(xiàn)性。所有的制劑都要使用高效液相層析(HPLC)、動態(tài)光 散射(DLS)和視覺檢測來進行放行和長期穩(wěn)定性檢驗。使用Agilent 1100系統(tǒng)和ESA電霧式?jīng)_全測器采集HPLC層析譜。該方法在Waters Atlantis C18柱上采用曱醇到氯仿梯度來執(zhí)行。注射液分別包括2.5 gg 的GLA(Avanti Polar Lipids, Inc,， Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800, GLA-AF)或MPL (GSK Biologicals， Rixensart， Belgium, MPL畫AF),和 作為助溶劑的0.27 的合成磷酸膽堿(POPC)。
圖1顯示了表明MPL-AF和GLA-AF中的污染物質的數(shù)目和含量 的HPLC數(shù)據(jù)。
HPLC譜顯示了 GLA-AF比MPL-AF更純。也就是說，GLA誦AF 中的污染物峰少于MPL-AF佐劑制劑中的污染物峰。較純的起始產(chǎn)物 對研究者來說益處巨大，因為獲得的生物反應來自用于GLA制劑中的 單一的主要組分。
實施例3
GLA油制劑
本實施例描述了 1毫升含有GLA的佐劑油制劑的制備。將 GLA(100微克；Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800) 與溶于25毫摩爾磷酸銨緩沖液(pHN5.1)中的甘油(22.7mg)、磷脂酰膽
73堿或卯磷脂(7.64 mg)、普流羅尼克⑧F-68 (BASF Corp.， Mount Olive, NJ)或類似的嵌段共聚物(0.364 mg)在角鯊烯(34.3mg)中乳化，使用0.5 mgD,L-a-生育酚作為抗氧化劑。在高壓下處理該混合物，直至形成不 分散的且具有小于180 nm的平均粒度的乳劑。然后將乳劑無菌過濾至 玻璃單位劑量瓶中并加蓋以儲存較長時間。該制劑在2-8°C下儲存時， 可以使用至少三年。
實施例4
GLA對鼠巨噬細胞和樹突狀細胞的刺激
本實施例描述了表明GLA的佐劑作用的體外模型。采用標準的組 織培養(yǎng)方法學和試劑。按照供應商的建議，維持鼠J774和RAW267.4 巨喧細月包系的細月包(American Type Culture Collection, Manassas, VA)， 并將其在多孔器皿中以粘附的細胞單層培養(yǎng)。遵循Xiong " a/.(J. Biol. Chem 2004, 279， ppl0776-83)的實驗方案，樹突狀細胞源自骨髓祖細 胞。通過在細胞培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM)中稀釋水性佐劑 制劑獲得合成GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800)的多種佐劑濃度，并在收集無細胞培養(yǎng)物上清前，將細胞在含 有5% C02的濕潤空氣中于37°C維持24小時。使用特異性的夾心 ELISA測定試劑盒(細胞因子試劑盒來自eBiosciences, San Diego， CA, 趨化因子試劑盒來自R&D Systems, Minneapolis, MN)，，換照生產(chǎn)商的 說明書，測定上清液中諸如IL-12、 IL-6和TNF的可溶性鼠細胞因子， 以及諸如RANTES的趨化因子。
GLA-AF在小鼠巨噬細胞系和原代鼠樹突狀細胞(DC)中誘導劑量 依賴性免疫反應，這由諸如IL-12p40、 IL-6和TNF的細胞因子以及如 RANTES的趨化因子分泌所表征。
實施例5
GLA對人巨噬細胞和樹突狀細胞的刺激
本實施例描述了表明GLA的佐劑作用的體外模型。使用了標準的 組織培養(yǎng)方法學和試劑。
74按照供應商的建議，維持人Mono Mac 6巨噬細胞系(美國典型培 養(yǎng)物保藏中心，Manassas, VA)的細胞，并將其在多孔板中以粘附的細 胞單層培養(yǎng)。遵循標準的實驗方案，樹突狀細胞源自外周血單核細胞 (PBMC)。通過將水性佐劑制劑稀釋于細胞培養(yǎng)基(對于MonoMac 6, 是含有10%的胎牛血清的DMEM;對于DC,是含有10%人血清的 DMEM)中，得到合成GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn) 品號699800)或天然產(chǎn)物MPL (GSK Biologicals， Rixensart, Belgium) 的多種佐劑濃度，并在收集無細胞培養(yǎng)物上清之前，將細胞在含有5% C02的濕潤空氣中于37°C維持24小時。 -使用特異性的夾心ELISA測 定試劑盒(細胞因子試劑盒來自eBiosciences， San Diego, CA，以及趨化 因子試劑盒來自R&D Systems, Minneapolis, MN)，按照生產(chǎn)商的說明 書，測定上清液中諸如IL-1(S、 IL-23和IL-6的可溶性人細胞因子，以 及諸如IP-10 、 RANTES和MIP-1/3的趨化因子。
圖2顯示了表明細胞因子和趨化因子的水平的ELISA數(shù)據(jù)，所述 細胞因子和趨化因子是由Mono Mac 6細胞系的巨噬細胞(圖a-e)以及 單核細胞來源的樹突狀細胞(圖f-h)應答GLA刺激時表達的。
GLA-AF在人巨噬細胞系Mono Mac 6(圖2，圖a-e)以及原代DC (圖2，圖f-h)中誘導了劑量依賴性免疫反應，這由諸如IL-1/3、 IL-6、 IL-23的細胞因子和諸如RANTES 、 IP-10 、 MIP-1 )8的趨化因子的分泌 所表征。對于測試的所有細胞因子和趨化因子，濃度在5-500的 GLA-AF的活性^f氐于MPL-AF。
實施例6
GLA對人血細胞的刺激
本實施例描述了表明GLA的佐劑作用的體外模型。使用了標準的 組織培養(yǎng)方法學和試劑。
用合成 GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800)或天然產(chǎn)物MPL (GSK Biologicals, Rixensart, Belgium)的多
種佐劑濃度培養(yǎng)人全血細胞，所述佐劑濃度是通過將水性佐劑制劑溶 于細胞培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM)中得到的。在收集無細胞
75培養(yǎng)物上清之前，將血細胞在含有5% C02的濕潤空氣中于37°C維持 16小時n使用特異性的夾心F,T,TSA測定試劑盒(eBiosciences， San Diego CA)，按照生產(chǎn)商的說明書，測定上清液中可溶性人細胞因子IL-W。 GLA-AF在人全血細胞中誘導了劑量依賴性的免疫反應，這由 IL-1/5細胞因子的分泌所表征。在該測定中，92 nM的GLA在功效方 面等價于57,000 nM的MPL-AF。
實施例7
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GL A在流感疫苗中的佐劑作用的體內(nèi)模型。 采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免 疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在三周時間內(nèi)，用人類劑量的1/25 (20 /il)和1/250 (2 /xl)的Fluzone 疫苗(Sanofi-Aventis， Swiftwater， PA)免疫小鼠(每組3只Balb/c動物) 兩次，所述疫苗單獨使用，或配制于(i)依照上述實施例1使用的操作 步驟的含有GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800;每次免疫每只動物給予20 pg)的水性乳劑("GLA-AF")中，或 者配制于(ii)依照上述實施例3使用的操作步驟的含有GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每只動物 給予20 jLtg)的穩(wěn)定乳劑("GLA-SE")中。每次免疫后一周，通過給動物 放血采集血清，并依照發(fā)表的方法(同上)通過ELISA檢測特異針對 Fluzone的總IgG抗體血清水平。依照發(fā)表的方法，通過血凝抑制實驗 (HAI)也檢測了病毒中和抗體的血清水平。
圖3顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用兩種不同劑量的與GLA-AF 或GLA-SE配制的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，圖A; 以及在第28天，圖B),與單獨使用Fluzone相比，在小鼠體內(nèi)誘導的 抗Fluzone抗體產(chǎn)生的水平。顯示了每組/時間點中的倒數(shù)終點滴度的 平均值和標準誤。圖3的圖C顯示了 HAI數(shù)據(jù)，表明了使用兩種不同 劑量的與GLA-AF或GLA-SE配制的Fluzone疫苗進行第二次免疫后
76一周，與單獨使用Fluzone相比，在小鼠體內(nèi)誘導的病毒中和抗體產(chǎn)
生的水平。顯示了每組/時間點中的倒數(shù)終點滴度的平均值和標準誤。
應答Fluzone疫苗的總IgG和中和抗體滴度通過在水制劑或穩(wěn)定 油制劑中添加GLA而增強。與2 pi劑量Fluzone疫苗一起使用的GLA 的佐劑作用更為顯著，誘導的抗原特異性體液反應與單獨使用20 pi Fluzone疫苗相似(GLA-AF)或更強(GLA-SE)。這些結果提示通過用含 有GLA的制劑輔佐，降低Fluzone疫苗的劑量，且仍誘導高水平的IgG 和中和抗體滴度是可能的。這在諸如禽流感的世界性傳染病的情形下 特別重要。
實施例8
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性利什曼蟲抗原疫苗中的 佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周時間內(nèi)，用單獨使用的SMT抗原(每次免疫每只動物給予 10 Mg)或用配制于依照上述實施例3使用的操作步驟的含GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每只動物 給予20/xg)的穩(wěn)定乳劑(GLA-SE)中的SMT抗原免疫小鼠(每組三只 C57BL/6動物)三次。第三次免疫后一周，通過給動物放血采集血清， 且依照發(fā)表的方法，通過ELISA4企測特異性針對SMT抗原的IgGl和 lgG2c抗體的血清水平。
圖4顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了單獨使用SMT抗原或使用與 GLA-SE配制的SMT抗原第三次免疫后一周，在小鼠體內(nèi)誘導的抗 -SMT抗體產(chǎn)生的水平。顯示了每組的倒數(shù)終點滴度的平均值和標準 誤。
IgGl或lgG2c抗體同種型分別主要與TH2或TH1反應有關。已 經(jīng)表明，TH1反應對于抗利什曼蟲感染的保護是必需的。單獨接種 SMT主要誘導SMT特異性的IgGl抗體。接種SMT+GLA-SE誘導較高的抗體滴度，并將顯型逆轉到主要是lgG2c抗原特異性的抗體反應， 其與抗該疾病的保護有關。
實施例9
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性利什曼蟲抗原疫苗中的 佐劑作用的體內(nèi)才莫型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周時間內(nèi)，用配制于依照上述實施例3中使用的操作步驟的 含不同量的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc.， Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800;每次免疫每只動物給予40, 20, 5或1 jiig)的穩(wěn)定乳劑(GLA-SE) 中的利什-110f抗原(每次免疫每只動物給予10 Aig)免疫小鼠(每組三只 Balb/c動物)三次。第一次免疫后一周，通過給動物放血采集血清，且 依照發(fā)表的方法(同上)，通過ELISA檢測特異性針對利什-110f的IgGl 和lgG2a抗體的血清水平。
圖5顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用與不同量的GLA (40， 20, 5 或l jitg)配制的利什-110f抗原第一次免疫后一周，與鹽水對照相比， 在小鼠體內(nèi)誘導的抗利什-11 Of抗體產(chǎn)生的水平。顯示了每組的倒數(shù)終 ,#、滴度的平均值和標準誤。
利什-11 Of特異性的IgG 1和lgG2a抗體滴度是GLA劑量依賴性的。 在測試的所有GLA的濃度都觀測了 TH1相關的IgG2a抗體的優(yōu)勢。
實施例10
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性利什曼蟲抗原疫苗中的 佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
78在3周時間內(nèi)，用鹽水或配制于依照上述實施例3中使用的4乘作
步驟的含有GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800;每次免疫每只動物給予20 pg)的穩(wěn)定乳劑(GLA-SE)中的利什 -lllf抗原(每次免疫每只動物給予10/^g)免疫小鼠(每組三只Balb/c動 物)三次。最后一次免疫后2周，處死小鼠，收集脾臟，依照發(fā)表的方 法，通過ELISA分析T細胞依賴性的IFN-7和IL-4細胞因子對體外 抗原刺激的應答。
IL-4或IFN-7細胞因子分別主要與TH2或TH1反應有關。我們和 其它人已經(jīng)表明TH1反應對于抗利什曼蟲感染是必需的。所有的動物 對伴刀豆球蛋白A (—種有效的有絲分裂原)反應良好。接種利什 -lllf+GLA-SE i^導了利什-lllf抗原特異性的細胞反應，而在鹽水對 照組沒有這種反應。當與伴刀豆球蛋白A比較時，接種利什 -lllf+GLA-SE誘導了遠超過IL-4的IFN-7，其是與抗該疾病的保護有 關的TH1:TH2比率或顯型。
實施例11
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性利什曼蟲抗原疫苗中的 佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周時間內(nèi)，用鹽水或配制于穩(wěn)定乳劑中的利什-110f抗原(每 次免疫每只動物^會予10 gg)免疫小鼠(每組三只Balb/c動物)三次，所 述乳劑含有不同量的(i)依照上述實施例3中使用的操作步驟的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每只 動物給予40, 5或1 /ig) (GLA-SE),或者(ii)由生產(chǎn)商供應的乳劑 ("MPL隱SE", GSK Biologicals， Rixensart, Belgium)中的MPL⑧(每次免疫 每只動物給予40, 5或l/xg)。最后一次注射后一周，處死小鼠并收集 脾臟，依照發(fā)表的方法(同上)，通過ELISA分析T細胞依賴性的細胞因子對體外抗原刺激的應答。IFN-7細胞因子反應與抗利什曼蟲 感染的TH1保護顯型有關。
圖6顯示了 ELISA數(shù)據(jù)，表明了使用與不同量的GLA配制的利 什-110f抗原進行第三次免疫后l周，與鹽水對照相比，在小鼠體內(nèi)誘
導的抗利什-110f的IFN-7細胞因子產(chǎn)生的水平。顯示了每組中的平均 值和標準誤。
所有的動物都對伴刀豆球蛋白A (—種細胞活化劑和有絲分裂原) 反應良好。接種利什-110f+GLA-SE以劑量依賴性方式誘導了利什-110f 抗原特異性的細胞因子反應，而在鹽水對照組沒有觀測到這種反應。 在所有測試的濃度下，GLA-SE比MPL-SE更有效，誘導了更高水平 的IFN-7，所述IFN-7是由抗原特異性T細胞分泌的。
總之，將穩(wěn)定油制劑中的GLA添加到利什曼蟲疫苗抗原候選物利 什-110f中主要誘導了與保護性TH1顯型有關的抗原特異性的細胞型 (T細胞)免疫反應。此外，GLA-SE在誘導保護相關的細胞因子如IFN， 方面比MPL-SE更有效。
實施例12
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性利什曼蟲抗原疫苗中的 佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周時間內(nèi)，用鹽水或配制于穩(wěn)定乳劑中的利什-110f抗原(每 次免疫每只動物給予10 Mg)免疫小鼠(每組三只Balb/c動物)三次，所 述乳劑含有不同量的(i)依照上述實施例3中使用的操作步驟的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每只 動物給予20 或5 /ig) (GLA-SE),或者(ii)由生產(chǎn)商供應的乳劑 ("MPL-SE", GSK Biologicals, Rixensart， Belgium)中的MPL⑧(每次免疫 每只動物給予20或5 Mg)。最后一次注射后一周，處死小鼠并收集脾 臟，依照發(fā)表的方法(同上)，通過細胞內(nèi)細胞染色(ICS)和流式細胞術
80分析T細胞依賴性的IFN-7、 IL-2和TNF細胞因子對體外抗原刺激的 應答。這三種細胞因子與抗利什曼蟲感染的TH1保護顯型有關。
當在單細胞水平分析時，與利什-110f+MPL-SE組相比，在利什 -llOf+GLA-SE組中，表達所有三種細胞因子IFN-7、 IL-2和TNF或 IFN-7和IL-2組合的CD4+ T細胞的頻數(shù)更高，且在20和5 /xg劑量都 觀測到了這一結果。據(jù)報道(Seder e a/.)，表達所有三種細胞因子 IFN-7、 IL-2和TNF的CD4+ T細胞的高頻數(shù)與抗利什曼蟲感染的保 護相關。
總之，將穩(wěn)定油制劑中的GLA添加到利什曼蟲疫苗抗原候選物利 什-110f中主要誘導了與保護性TH1顯型有關的抗原特異性的細胞型 (T細胞)免疫反應。此外，GLA-SE在誘導保護相關的細胞因子如IFN-7、 IL-2和TNF方面比MPL-SE更有效。
實施例13
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性肺結核分支桿菌抗原疫 苗中的佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南),Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周時間內(nèi)，用單獨的或配制于依照上述實施例3中使用的操 作步驟的含GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號 699800;每次免疫每只動物給予20 jLig)的穩(wěn)定乳劑(GLA-SE)中的ID83 抗原(每次免疫每只動物給予8 jug)免疫小鼠(每組三只C57BL/6動物) 三次。第三次免疫后一周，通過給動物放血采集血清，且依照發(fā)表的 方法(同上)，通過ELISA4會測特異性針對ID83的IgGl和lgG2c抗體 的血清水平。IgGl或lgG2c抗體同種型分別主要與TH2或TH1反應 有關。已經(jīng)表明，TH1反應對于抗肺結核分支桿菌感染的保護是必需 的。
單獨接種ID83主要誘導抗原特異性的IgGl抗體。相比之下，接 種ID83+ GLA-SE誘導更高的抗體滴度，并將顯型逆轉到主要是lgG2c
81抗原特異性的抗體反應，其與抗該疾病的保護有關。
實施例14
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性肺結核分支桿菌抗原疫 苗中的佐劑作用的體內(nèi)it型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周時間內(nèi)，用單獨的或配制于含有GLA(GLA-SE)、 GLA + CpG (CpG1826， Coley Pharmaceuticals, 25 /ig) (GLA/CpG-SE)或GLA+嘎德莫 特(GDQ) (Invivogen, 20 ^g) (GLA/GDQ-SE)的穩(wěn)定乳劑中的ID83抗原 (每次免疫每只動物給予8 Mg)免疫小鼠(每組三只C57BL/6動物)三次。 最后一次注射后3周，處死小鼠并收集脾臟，依照發(fā)表的方法，通過 ICS和流式細胞術分析CD4+和CD8+ T細胞依賴性的IFN々、IL-2和 TNF細胞因子對體外ID83抗原刺激的應答。IFN-7、 IL-2和TNF細胞 因子的表達與抗肺結核分支桿菌感染的保護性TH1反應有關。
圖7顯示了 ICS數(shù)據(jù)，表明了進行第三次免疫后一周在小鼠體內(nèi) 誘導的產(chǎn)生ID83特異性的IFN-7、 IL-2和TNF細胞因子的CD4+和 CD8+T細胞的頻數(shù)，所述免疫是使用單獨的ID83或由含有GLA
制劑輔佐的ID83進4亍的。
產(chǎn)生ID83特異性細胞因子的CD4+或CD8+ T細胞的頻數(shù)在鹽水 或單獨的ID83疫苗組處于背景水平。產(chǎn)生ID83抗原特異性細胞因子 的T細胞，CD4+和CD8+兩者都由ID83+GLA-SE的接種所誘導，且 它們的頻tt通過添加如GDQ(TLR7/8)或CpG (TLR9)的另 一種TLR配 體被進一步增加。表達IFN-7 + TNF或IFN-7 + IL-2的T細胞是優(yōu)勢 群。
總之，用GLA-SE輔佐針對肺結核分支桿菌的抗原大大增強了抗 原特異性的細胞反應(T細胞)，如通過表達IFN-7、 IL-2和/或TNF細 胞因子的T細胞的頻數(shù)所測量的。將GLA-SE與另 一種TLR配體合并進一步增加了產(chǎn)生抗原特異性細胞因子的細胞的頻數(shù)，所述細胞是與 抗該疾病的保護有關的顯型。
實施例15
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性麻風分支桿菌抗原疫苗 中的佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周時間內(nèi)，用由水制劑輔佐的ML0276抗原(每次免疫每只動 物給予10 /ig)免疫小鼠(每組三只C57BL/6動物)三次，所述制劑含有 CpG(CpG1826, Coley Pharmaceutical,每次免疫每只動物給予25gg)、或 咪喹莫特(IMQ) (3M Pharma,每次免疫每只動物給予25/xg)或GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每 只動物給予25/xg，根據(jù)上述實施例3中使用的實驗操作，GLA-SE)、 所述三者的混合物，或是作為陰性對照的鹽水。第二次免疫后3周， 通過給動物放血釆集血清，且依照發(fā)表的方法(同上)，通過ELISA檢 測特異性針對ML0276的IgG抗體的血清水平。
來自鹽水對照組的動物沒有顯示出ML0276特異性的IgG，且來 自ML0276+CpG和ML0276+IMQ組的動物顯示了極低水平的抗原特 異性抗體。相比之下，ML0276+GLA-SE誘導了顯著水平的ML0276 特異性的IgG，其在三種佐劑一起使用時可被進一步增強。
總之，這些數(shù)據(jù)支持GLA-SE和/或GLA-SE與另外的TLR配體 的組合當與抗原ML0276 —起使用時對于誘導抗原特異性抗體的輔佐 作用。
實施例16
含有GLA疫苗的體內(nèi)應用
本實施例描述了表明GLA在含有特異性麻風分支桿菌抗原疫苗 中的佐劑作用的體內(nèi)模型。采用了標準的免疫方法學和試劑(Current
83Protocols in Immunology (免疫學實驗指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周時間內(nèi)，用由水制劑輔佐的ML0276抗原(每次免疫每只動 物給予10 Atg)免疫小鼠(每組三只C57BL/6動物)三次，所述制劑含有 CpG (CpGi826, Coley Pharmaceutical,每次免疫每只動物纟會予25/ig)、或 咪喹莫特(IMQ) (3M Pharma,每次免疫每只動物給予25/xg)或GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;產(chǎn)品號699800;每次免疫每 只動物給予25Atg，根據(jù)上述實施例3中使用的實驗操作，GLA-SE)、 所述三者的混合物，或是作為陰性對照的鹽水。最后一次注射后3周， 處死小鼠并收集脾臟，依照發(fā)表的方法，通過ICS和流式細胞術分析 CD4+ T細胞依賴性的IFN-7細胞因子對體外ML0276抗原刺激的應 答。IFN-7細胞因子的表達與抗麻風分支桿菌感染的保護性TH1反應 有關。
圖8的圖A顯示了 ICS數(shù)據(jù)，表明了相比于鹽水和空白對照，使 用ML0276抗原進行第三次免疫后一周，在小鼠體內(nèi)誘導的產(chǎn)生 ML0276特異性IFN-7細胞因子的CD4+ T細胞的頻數(shù)，所述抗原是用 含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制劑或含有GLA (GLA-SE)的穩(wěn)定油 乳劑，或混合在一起的所述三者配制的。顯示了每組的平均值。圖8 的圖B顯示的數(shù)據(jù)表明了與鹽水和空白對照相比，在用ML0276抗原 免疫的小鼠體內(nèi)，引流麻風分支桿菌感染部位的淋巴結的細胞性，所 述ML0276抗原用含有CpG、或咪喹莫特(IMQ)的水制劑或含有GLA (GLA-SE)的穩(wěn)定油乳劑或上述三者的混合物配制。顯示了每組的平均 值和標準誤。
來自生理鹽水對照組的動物沒有顯示出ML0276特異性的IFN-7 反應，背景頻數(shù)是陽性細胞的0.04%。來自CpG和IMQ組的動物顯 示了產(chǎn)生抗原特異性細胞因子的細胞的頻數(shù)輕度增加，分別是0.17% 和0.11%。相比之下，當使用GLA-SE作為佐劑時，觀測到了 ML0276 特異性的IFN-， CD4+T細胞顯著增加的數(shù)目(0.66%),當三種佐劑混 合在一起時，頻數(shù)進一步增加(2.14%)。
隨后使小鼠的子集感染麻風分支桿菌，發(fā)現(xiàn)小鼠受到ML0276+GLA-SE的保護，這通過與注射了鹽水的對照相比，引流感 染部位的淋巴結內(nèi)的細胞數(shù)目降低被測量。接種ML0276+CpG和 ML0276+IMQ與鹽水相比，僅誘導了細胞數(shù)目的中度降低。
總之，這些數(shù)據(jù)支持GLA-SE和/或GLA-SE與另外的TLR配體 的組合當與抗原ML0276 —起使用時對于誘導抗原特異性細胞反應的 輔佐作用。
本說明書中引用的和/或列于申請記錄表中的上述所有的美國專 利、美國專利申請公布、美國專利申請、國外專利、國外專利申請和 非專利的公開出版物都以其整體通過引用的方式并入本文。
通過上述，可以理解，盡管本文以示例的目的描述了本發(fā)明的具 體實施方案，但在不背離本發(fā)明的精神和范疇內(nèi)可以做出各種變化。 因此，除受所附的權利要求書限制外，本發(fā)明不受其它限制。
權利要求
1.疫苗組合物，其包含(a)抗原；和(b)吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)。
2. 如^5L力要求1所述的疫苗組合物，其還包含選自下述的至少一種另外組分(a) 鐘樣受體(TLR)激動劑；(b) 皂苷或皂苷模擬物；(c) 包含油和ISCOMATRIXTM中的至少 一種的載體；(d) 咪唑并會啉免疫反應調(diào)節(jié)劑；(e) 雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM);(f) 輔佐劑；以及(g) 藥學上可接受的載體。
3. 如權利要求2所述的疫苗組合物，其中(i) 所述輔佐劑，當存在時，選自明夙、植物堿和去垢劑，其中所述植物堿選自番茄素，且所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸；(ii) 所述TLR激動劑，當存在時，選自脂多糖、肽多糖、聚I:C、 CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a(LelF)的利什曼蟲同源體以及至少一種丙型肝炎抗原；(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑，當存在時，選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述輔佐劑，當存在時，選自細胞因子、去垢劑和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述藥學上可接受的載體，當存在時，包含選自磷S^丐、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體和微粒的載體。
4. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述GLA沒有被3'-脫-0-?；?br> 5. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述GLA是3-酰基單磷酸脂質A的衍生物，其中2-氨基位置包含單?；?。
6. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述GLA包含(i) 雙葡糖胺骨架，其具有通過非還原末端葡糖胺的l位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位氨基己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii) 連接于非還原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基團；以及(iii) 至多6個脂酰鏈；其中 一個脂酰鏈通過酯^:連接于還原末端葡糖胺的3-羥基，其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還原末端葡糖胺的2-氨基并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈，以及其中 一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-鞋基并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。
7. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述GLA具有下式其中R2和R'R'、 RR"和I^是CH-C2o烴基；且是Cl2-C20經(jīng)基。
8. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述抗原包含至少一種多肽抗原或至少一種重組表達構建體，所述重組表達構建體包含可才喿作連接于編碼至少 一 種多肽抗原的核酸序列的啟動子。
9. 如權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述抗原來自(i)與傳染性疾病相關的至少一種傳染性病原體，(ii)與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或(iii)與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應。
10. 引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應的方法，所述方法包括給予個體包含(a)抗原和(b)他喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的組合物，其中所述抗原來自(i)與傳染性疾病相關的至少一種傳染性病原體，(ii) 與癌癥相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或(iii) 與自身免疫疾病相關的至少一種抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應，并由此引發(fā)或增強個體體內(nèi)期望的抗原特異性免疫反應。
11. 如權利要求IO所述的方法，其中所述組合物還包含選自下述的至少一種另外組分(a) 鐘樣受體(TLR)激動劑；(b) 皂苷或皂苷模擬物；(c) 包含油和ISCOMATRIXtm中的至少 一種的載體；(d) 咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑；(e) 雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM);(f) 輔佐劑；以及(g) 藥學上可接受的載體。
12. 如權利要求11所述的方法，其中(i)所述輔佐劑，當存在時，選自明諷、植物堿和去垢劑，其中所述植物堿選自番茄素，且所述去垢劑選自皂苷、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸，(ii) 所述TLR激動劑，當存在時，選自脂多糖、肽多糖、聚I:C、 CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a(LelF)的利什曼蟲同源體以及至少一種丙肝抗原，以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑，當存在時，選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述輔佐劑，當存在時，選自細胞因子、去垢劑和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述藥學上可接受的載體，當存在時，包含選自磷酸釣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體和微粒的載體。
13. 如權利要求10所述的方法，其中所述GLA沒有被3'-脫-O-?；?br> 14. 如權利要求10所述的方法，其中所述GLA是3-酰基單磷酸脂質A的衍生物，其中2-氨基位置包含一個酰基鏈。
15. 如權利要求IO所述的方法，其中所述GLA包含(i) 雙葡糖胺骨架，其具有通過非還原末端葡糖胺的l位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位氨基己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii) 連接于非還原端葡糖胺的4位氨基己醣的0-磷?；鶊F；以及(iii) 至多6個的脂酰鏈；其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于還原末端葡糖胺的3羥基，其中一個脂酰鏈通過酰胺鍵連接于非還原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷酰基鏈連接的十四酰鏈，以及其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-羥基并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。
16.如權利要求IO所述的方法，其中所述GLA具有下式其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2o烴基;且R2和R4是d2-C2。烴基。
17.如權利要求10所述的方法，其中所述抗原包含至少一種多肽抗原或至少 一種重組表達構建體，所述重組表達構建體包含可操作連接于編碼多肽抗原的核酸序列的啟動子。
18.如權利要求IO所述的方法，其中所述抗原來自(i)與傳染性疾病相關的至少 一種傳染性病原體，(ii)與癌癥相關的至少 一個抗原決定部位、生物分子、細胞或組織或(iii)與自身免疫疾病相關的至少一個抗原決定部位、生物分子、細胞或組織，或者與其在免疫學上交叉反應。
19.誘導或增強免疫反應的藥物組合物，其包含:(a) 吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA);以及(b) 藥學上可接受的載體或賦形劑。
20.如權利要求19所述的藥物組合物，其中所述組合物還包含選自下述的至少一種另外組分(a) 鐘樣受體(TLR)激動劑；(b) 皂苷；(c) 包含油和ISCOMATRIXtm中的至少 一種的載體；(d) 咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑；(e) 雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM);(f) 輔佐劑；以及(g) 藥學上可接受的載體。
21. 如權利要求20所述的藥物組合物，其中(i) 所述輔佐劑，當存在時，選自明礬、植物堿和去垢劑，其中所述植物堿選自番茄素，且所述去垢劑選自急香、聚山梨醇酯80、司盤85和硬脂酰酪氨酸，(ii) 所述TLR激動劑，當存在時，選自脂多糖、肽多糖、聚I:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖體延長和起始因子4a(LelF)的利什曼蟲同源體以及至少一種丙肝抗原，以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反應調(diào)節(jié)劑，當存在時，選自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述輔佐劑，當存在時，選自細胞因子、去垢劑和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述藥學上可接受的載體，當存在時，包含選自磷酸釣、水包油型乳劑、油包水型乳劑、脂質體和微粒的載體。
22. 如權利要求19所述的藥物組合物，其中所述GLA包含(i) 雙葡糖胺骨架，其具有通過非還原末端葡糖胺的l位氨基己醣和還原末端葡糖胺的6位氨基己醣之間的醚鍵連接于非還原末端葡糖胺的還原末端葡糖胺；(ii) 連接于非還原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷?；鶊F；以及(iii) 至多6個的脂酰鏈；其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于還原末端葡糖胺的3羥基，其中一個脂酰鏈通過酰胺^t連接于非還原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷酰基鏈連接的十四酰鏈，以及其中一個脂酰鏈通過酯鍵連接于非還原末端葡糖胺的3-羥基并包含通過酯鍵與多于12個碳原子的烷?；溸B接的十四酰鏈。
23.如權利要求19所述的藥物組合物，其中所述GLA具有下式:<formula>formula see original document page 8</formula>其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2。烴基；且R2和R4是d2-Qo烴基。<formula>formula see original document page 8</formula>其中R1、 R3、 R5和R6是Cn-C2o烴基；且R2和R4是d2-C20烴基。
24.刺激個體非特異性免疫反應的方法，其包括權利要求19的藥物 組合物的給藥。
25.試劑盒，其包含(a) 包含吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)和藥學上可接受的載體或賦形劑 的組合物；以及(b) 第二容器內(nèi)的抗原，其中所述免疫組合物不與所述抗原接觸。
全文摘要
本發(fā)明基于以基本上均一形態(tài)提供的合成吡喃葡萄糖脂佐劑(GLA)的有益免疫學佐劑特性的發(fā)現(xiàn)，公開了用于誘導或增強免疫反應的包括疫苗和藥物組合物在內(nèi)的組合物和方法?；瘜W定義的合成GLA提供了包含天然產(chǎn)物佐劑、不同批次之間一致的疫苗組分，沒有污染物或活性的波動。也提供了疫苗和藥物組合物，其包括GLA以及抗原、鐘樣受體(TLR)激動劑、輔佐劑和諸如藥物載體的載體中的一種或多種。
文檔編號A61K39/39GK101516396SQ200780035774
公開日2009年8月26日 申請日期2007年9月26日 優(yōu)先權日2006年9月26日
發(fā)明者史蒂文·G·里德, 達瑞克·卡特 申請人:傳染性疾病研究院