專利名稱：：寡核苷酸非病毒遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總地涉及核酸遞送和基因表達(dá)領(lǐng)域。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及用于寡核苷酸，尤其是小干擾RNA(siRNA)的新的非病毒遞送系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAi)是一種涉及由雙鏈短干擾RNA(siRNA)特異性下調(diào)靶基因表達(dá)的天然機(jī)制[l]。RNAi越來(lái)越多地成為功能基因組學(xué)以及靶標(biāo)篩選和體外驗(yàn)證中的常用工具[2，3]。更重要地，基于siRNA的藥物的開(kāi)發(fā)有希望發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病如糖尿病、癌癥和病毒感染的療法[4-7]。對(duì)于其他形式的核酸如質(zhì)粒DNA(pDNA)，血清穩(wěn)定性差，不利的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)以及無(wú)效的細(xì)胞攝取仍然是成功的基因沉默應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)[8]。一種方案部分地克服了這些問(wèn)題，該方案利用了耐受核酸酶降解且細(xì)胞攝取改善的化學(xué)修飾的siRNA[9-11]。另一種方案涉及利用基于聚陽(yáng)離子的siRNA制劑。例如，基于陽(yáng)離子脂質(zhì)的制劑在體外和體內(nèi)siRNA的遞送中有效[12-15]。相反，最初認(rèn)為陽(yáng)離子聚合物不適合用作寡核苷酸遞送[16]。然而，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺型胺(PAMAM)樹(shù)狀聚合物和聚-L-賴氨酸(PLL)可用于siRNA遞送[17-19]。在pDNA優(yōu)化條件下進(jìn)行配制和遞送的陽(yáng)離子聚合物作為寡核苷酸遞送系統(tǒng)的效率有相反報(bào)導(dǎo)。而且，一些報(bào)道關(guān)注上述聚陽(yáng)離子的體內(nèi)毒性可能妨礙其未來(lái)臨床應(yīng)用[20-22]。因此，激發(fā)了用于siRNA遞送的無(wú)毒有效載體的研究。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種組合物，其包含以下成分的復(fù)合物(a)數(shù)均聚合度(DPn)為30-300的低分子量殼聚糖，其中低分子量殼聚糖的脫乙?；潭却笥诿?和(b)寡核苷酸。如權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物包含利用化學(xué)或酶方法由高分子量殼聚糖獲得的低分子量殼聚糖。低分子量殼聚糖的脫乙?；潭却笥?5%，最優(yōu)選大于99%。此外，組合物的凈電荷比基本上為正。所述低分子量殼聚糖用尋靶配基和穩(wěn)定劑進(jìn)行衍生化。寡核苷酸包含引入宿主細(xì)胞時(shí)表達(dá)其功能的沉默序列。寡核苷酸選自RNA分子、反義分子、核酶和微小RNA。本發(fā)明組合物的pH為3.5-8.0，更優(yōu)選7.1-7.6。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明組合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使低分子量殼聚糖與水性溶劑相接觸；(b)將步驟(a)的水性溶液與寡核苷酸在水性溶劑中混合；和(c)保持組合物的pH為3.5-8.0，更優(yōu)選為7.1-7.6。本發(fā)明還涉及制備組合物的方法，該方法包括在步驟(b)之后，降低步驟(b)所得產(chǎn)物溶液的體積以實(shí)現(xiàn)所需的組合物濃度。本發(fā)明還涉及將核酸給予哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括利用所述的組合物并將該組合物引入哺乳動(dòng)物內(nèi)。將組合物引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的方法可通過(guò)肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直腸或陰道途徑給予粘膜組織來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者，組合物可通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、顱內(nèi)、椎管內(nèi)、皮下或心內(nèi)的胃腸外途徑給予粘膜下組織，或給予內(nèi)臟器官、血管或外科手術(shù)期間暴露的其他體表或體腔而引入哺乳動(dòng)物。本發(fā)明方法包括將所述組合物給予哺乳動(dòng)物，其中所述寡核苷酸能夠在至少一種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其功能。本發(fā)明還涉及制備成預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物的藥物的所述組合物制備的使用方法。這些應(yīng)用包括但不限于用于預(yù)防性或治療性治療惡性腫瘤、自身免疫病、遺傳病癥、病原感染和其他病理學(xué)疾病的基因療法、反義療法、或基因疫苗接種。而且，本發(fā)明還涉及利用所述組合物作為體內(nèi)和體外診斷方法中使用的診斷試劑。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明和序列表圖1顯示了siRNA制劑的物理穩(wěn)定性(A)和RNA酶A的保護(hù)作用(B)。用線型DPn85殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物在兩種pH值和所有測(cè)試的電荷比的條件下顯示最高的物理穩(wěn)定性。所有選擇的聚陽(yáng)離子能夠保護(hù)siRNA免于RNA酶A的降解。對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，將100ngsiRNA加載到各個(gè)孔中。對(duì)于殼聚糖DP。18制劑，復(fù)合物以30:1(+/-)和60:1(+/-)的電荷比進(jìn)行配制。對(duì)于PEI制劑則采用電荷比15:1(+/-)，而siRNA與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑2000的復(fù)合物則以重量比2:1(+/-)配制。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性凝膠。圖2顯示了在正常HEK293細(xì)胞(A)以及穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的HEK293細(xì)胞(293-Luc)(B,C)中siRNA的體外遞送。與對(duì)照未處理細(xì)胞相比，用特異性siRNA-Luc與pLuc(A)或pGFP(C)共轉(zhuǎn)染時(shí)實(shí)現(xiàn)了顯著的螢光素酶沉默。僅將siRNA-Luc遞送至293-Luc細(xì)胞時(shí)螢光素酶抑制效率降低(B)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分析螢光素酶基因表達(dá)。利用已為pDNA遞送作了優(yōu)化的殼聚糖(支化DPn34)[27]，與siRNA以電荷比10:1配制形成復(fù)合物。對(duì)于PEI復(fù)合物采用電荷比5:l(+Z-)，而siRNA與LF2000的復(fù)合物則以重量比2:1(+/-)配制?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值±S.D.;n=4。圖3顯示了在293-Luc細(xì)胞中與寡核苷酸形成復(fù)合物的線型(A)和支化(B)殼聚糖的結(jié)構(gòu)變化對(duì)螢光素酶沉默活性的影響。雖然對(duì)于鏈長(zhǎng)大于34個(gè)單體單元(數(shù)均聚合度高于34個(gè)單體單元)的線型殼聚糖形成的復(fù)合物來(lái)說(shuō)鏈長(zhǎng)和電荷比似乎不是關(guān)鍵，但支化殼聚糖復(fù)合物介導(dǎo)有效的螢光素酶沉默要求對(duì)于較長(zhǎng)的殼聚糖鏈長(zhǎng)有較高的電荷密度和較高的電荷比。采用siRNA濃度150納摩爾(100納克/孔)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分析螢光素酶基因表達(dá)。以電荷比30:1(+A)配制殼聚糖復(fù)合物?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值士S.D.;『4。圖4顯示了線型低分子量殼聚糖的siRNA濃度依賴性和相對(duì)效率。對(duì)于較低的siRNA濃度(15-30納克/L，相當(dāng)于22-44納摩爾/孔siRNA濃度)，線型DPn85低分子量殼聚糖顯示最高效能，即將螢光素酶表達(dá)相對(duì)于對(duì)照未處理293-Luc細(xì)胞敲減72-95%。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分析螢光素酶基因表達(dá)。以電荷比30:1(+/-)配制殼聚糖復(fù)合物?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值±S.D.;n=4。圖5顯示了血清對(duì)螢光素酶沉默活性的影響。在測(cè)試的各種聚陽(yáng)離子制劑中，在轉(zhuǎn)染介質(zhì)中存在10%血清時(shí)，在293-Luc細(xì)胞中，所有線型殼聚糖和支化DPn85保留其螢光素酶沉默活性。采用siRNA濃度150納摩爾。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分析螢光素酶基因表達(dá)。對(duì)于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復(fù)合物。siRNA與LF2000的復(fù)合物以重量比2:1(+/-)配制?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值±S.D.;n=4。圖6顯示了siRNA制劑的細(xì)胞毒性。用各種siRNA制劑轉(zhuǎn)染293-Luc細(xì)胞后立即或24小時(shí)后通過(guò)MTT方法測(cè)定胞內(nèi)脫氫酶活性(細(xì)胞毒性的衡量)。與PEI和LF2000相反，用線型DPn85配制的siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)脫氫酶活性均保留。雖然LF2000復(fù)合物在轉(zhuǎn)染后立即顯示顯著的毒性，但轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞活力恢復(fù)。采用siRNA濃度150納摩爾。對(duì)于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復(fù)合物。siRNA與LF2000的復(fù)合物以重量比2:1(+/-)配制?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值±S.D.;n=4-5。圖7顯示了在體外293-Luc(A、B、C)中和穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的SKOV-3細(xì)胞(D)中螢光素酶沉默的時(shí)程。在293-Luc和SKOV-3-Luc細(xì)胞中，DPn85的線型殼聚糖在起效較早和持續(xù)的螢光素酶沉默(持續(xù)5天)方面顯示最佳的螢光素酶沉默動(dòng)力學(xué)，提示完整siRNA胞內(nèi)穩(wěn)定釋放。采用siRNA濃度44納摩爾(30納克/孔)。對(duì)于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復(fù)合物。siRNA與LF2000的復(fù)合物以重量比2:1(+A)配制?；虮磉_(dá)結(jié)果表示為平均值±S.D.;n=4。序列表簡(jiǎn)述SEQIDNO.1:siGL3(正義，5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdTSEQIDN0.2:反義，5'誦UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-Sl)是耙向螢光素酶基因(siRNA-Luc)的未修飾的siRNA雙鏈體，從瑞典蘭德的醫(yī)學(xué)探針公司(MedProbe，Lund,Sweden)定購(gòu)[28]。SEQIDN0.3:錯(cuò)配siRNA;siCONTROL非耙向siRNA#l(siCONl;正義，5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3';SEQIDNO.4:反義，5，-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3')從科羅拉多州拉斐特的DR有限公司(DharmaconResearch,Inc.，Lafayette,CO)定購(gòu)。發(fā)明詳述殼聚糖是一類由(l-4)連接的2-氨基-2-脫氧-(3-D-葡萄糖(GIcN)和N-乙?；愃莆?-乙酰氨基-2-脫氧-P-D-葡萄糖(GIcNAc)構(gòu)成的線型二元多糖，是生物相容的陽(yáng)離子聚合物，其已顯示適用于質(zhì)粒pDNA基因遞送[23-27]。在體外和體內(nèi)快速有效的基因遞送可利用分子量分布充分確定的線型和支化殼聚糖寡聚體來(lái)實(shí)現(xiàn)[25，27]。基于殼聚糖寡聚體的復(fù)合物具有改善的物理性質(zhì)，包括粘度降低和聚合傾向較低。這些復(fù)合物還具有改善的效率，包括改善的細(xì)胞攝取、起效早和高水平體內(nèi)基因表達(dá)。在本發(fā)明中，實(shí)現(xiàn)了在新型siRNA遞送系統(tǒng)中潛在的低分子量(7-17kDa)基本完全脫乙?；?大于99%脫乙?；?的殼聚糖。利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(LF2000)和PEI(線型和支化)作為對(duì)照，研究用低分子量殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物的物理穩(wěn)定性和抗RNA酶降解性。在大多數(shù)關(guān)于siRNA遞送的報(bào)道中，采用共轉(zhuǎn)染方法將非生理學(xué)相關(guān)靶標(biāo)或無(wú)關(guān)pDNA摻入siRNA制劑中。因此，我們首先在穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的細(xì)胞系中體外檢查這種摻入對(duì)通過(guò)各種聚陽(yáng)離子的siRNA遞送效率的影響。然后，我們研究了siRNA制劑和低分子量殼聚糖復(fù)合物的配方和結(jié)構(gòu)。更具體說(shuō)，研究了低分子量殼聚糖(鏈長(zhǎng)和支化程度)結(jié)構(gòu)變化的作用、配方參數(shù)(電荷比，siRNA濃度)、血清影響，并將這些因素與體外基因沉默活性的效率相關(guān)聯(lián)。比較了各種siRNA制劑的細(xì)胞毒性，例如螢光素酶基因沉默的體外動(dòng)力學(xué)。這些研究表明，低分子量殼聚糖有可能用作小干擾RNA(siRNA)的新型遞送系統(tǒng)。采用聚乙烯亞胺(PEI)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(LF2000)作為對(duì)照，使各種鏈長(zhǎng)的殼聚糖與siRNA形成復(fù)合物并檢査其物理穩(wěn)定性和針對(duì)酶降解的保護(hù)作用。在穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的293細(xì)胞中體外研究siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性和螢光素酶基因沉默活性。也研究了殼聚糖結(jié)構(gòu)變化以及配方參數(shù)對(duì)siRNA復(fù)合物螢光素酶沉默活性的影響。低分子量殼聚糖能與siRNA復(fù)合形成物理穩(wěn)定的納米粒(34-86nm)，提供針對(duì)RNA酶降解的保護(hù)作用。殼聚糖鏈較長(zhǎng)和/或低分子量殼聚糖與siRNA之間的電荷比較高導(dǎo)致正電荷數(shù)較高的重要性表現(xiàn)在體外介導(dǎo)螢光素酶沉默活性最高。與PEI和LF2000不同，用低分子量殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物在含10%血清的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中保留其螢光素酶沉默活性。與PEI和LF2000相比，低分子量殼聚糖的細(xì)胞毒性也最小。數(shù)均聚合度(DP。)為85個(gè)單體單元(DP。85)的低分子量殼聚糖要求低至44nM的siRNA濃度以實(shí)現(xiàn)在293-Luc細(xì)胞中維持5天的螢光素酶基因表達(dá)95%沉默。同時(shí)考慮這些因素，我們的發(fā)現(xiàn)表明，低分子量殼聚糖是用于siRNA的有效替代遞送系統(tǒng)。我們過(guò)去曾報(bào)道，鏈長(zhǎng)非常短的基本完全脫乙酰化的低分子量殼聚糖(18-34個(gè)單體單元)在體外和體內(nèi)最宜用于pDNA遞送。在目前的研究中，我們報(bào)道了基本完全脫乙?；臍ぞ厶枪丫垠w作為siRNA體外遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系。為此，選擇各種鏈長(zhǎng)的線型和三糖-取代(支化)的殼聚糖寡聚體。我們發(fā)現(xiàn)，與pDNA遞送相反，34個(gè)單體單元以上的線型殼聚糖寡核苷酸與siRNA形成物理穩(wěn)定的復(fù)合物，并在表達(dá)螢光素酶的HEK293(293-Luc)細(xì)胞中體外介導(dǎo)最高螢光素酶沉默活性。顯然，siRNA和pDNA之間的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系顯著不同。這種差異可能是因?yàn)榕cpDNA相比，siRNA分子較短，柔韌性較低且負(fù)電荷密度較低。因此，siRNA復(fù)合形成物理穩(wěn)定且有效的納米粒需要與聚陽(yáng)離子較強(qiáng)的離子間相互作用[18，33]。我們的研究中用基本完全脫乙?；牡头肿恿繗ぞ厶桥渲频膕iRNA復(fù)合物的粒度(小于100nm)意外地遠(yuǎn)比過(guò)去報(bào)道的脂質(zhì)、PLL和高分子量殼聚糖(85%脫乙?；?的粒度小[33,34]。這可能是因?yàn)榛就耆撘阴；瘹ぞ厶侵麈溕陷^高的電荷密度。此外，低分子量殼聚糖的溶解度提高和粘度降低可能是因?yàn)閟iRNA復(fù)合物的粒度小[35]。與過(guò)去的報(bào)道相一致，siRNA-Luc與無(wú)關(guān)pDNA(pGFP)以單一基因包(package)形式共轉(zhuǎn)染在體外293-Luc細(xì)胞中導(dǎo)致顯著的螢光素酶沉默活性[17]。然而，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)siRNA制劑不含pDNA時(shí)，基因沉默活性顯著受損。因此，我們認(rèn)為，pDNA，這種高負(fù)電荷密度大分子的存在顯著促進(jìn)siRNA通過(guò)改良的協(xié)同作用與各種聚陽(yáng)離子形成復(fù)合物的效率。我們還發(fā)現(xiàn)，較長(zhǎng)的殼聚糖鏈的高電荷密度和/或較高的電荷比不僅將產(chǎn)生物理穩(wěn)定的復(fù)合物，而且還能在體外獲得最有效的基因沉默。我們的發(fā)現(xiàn)與過(guò)去報(bào)道的PAMAM樹(shù)狀聚合物的結(jié)果相一致，siRNA/樹(shù)狀聚合物復(fù)合物要得到較好的復(fù)合作用和基因沉默活性，就要求較高的代數(shù)(generationnumber)、較高的電荷比和較高的siRNA濃度(100nM)[18]?；贚F2000的制劑也推薦類似的高濃度siRNA。在本發(fā)明中，最有效的低分子量殼聚糖(線型DPn85)要求siRNA濃度低至44nM，以在293-Luc細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大于95%的螢光素酶基因表達(dá)沉默。而且，在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，用長(zhǎng)鏈線型低分子量殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物在含10%血清的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中保留其螢光素酶沉默活性。沉默活性被保留最可能的原因是，與PEI和LF2000相反，這些復(fù)合物在這種相對(duì)較高的血清濃度中抗聚集，反映了增強(qiáng)的膠體穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)較短且支化的殼聚糖寡聚體具有較低的基因沉默活性，可能的原因是，電荷密度降低以及殼聚糖主鏈與siRNA之間電荷相互作用的空間位阻導(dǎo)致siRNA復(fù)合受損。與報(bào)道的用高分子量殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性最小相一致，我們發(fā)現(xiàn)在該研究中，即使制劑中釆用高siRNA濃度(150nM)，用DP85低分子量殼聚糖轉(zhuǎn)染后293-Luc細(xì)胞保留其胞內(nèi)脫氫酶活性[33]。低分子量殼聚糖的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于過(guò)去公開(kāi)的PAMAM樹(shù)狀聚合物所得結(jié)果，PAMAM樹(shù)狀聚合物中利用50-100nM的siRNA濃度可導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低(60-50%)。最后，與過(guò)去報(bào)道的PEI[17]相比，用線型低分子量殼聚糖配制的siRNA復(fù)合物起效較早且保留螢光素酶沉默活性。估計(jì)DPn85殼聚糖寡核苷酸動(dòng)力學(xué)的改善是小的納米級(jí)siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取改善以及完整siRNA胞內(nèi)持續(xù)釋放的結(jié)果。2.材料和方法2丄材料含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和螢火蟲(chóng)螢光素酶(pLuc)或綠色熒光蛋白(pGFP)的GMP-級(jí)質(zhì)粒(gWizTM)購(gòu)自美國(guó)北達(dá)科他州法戈的愛(ài)德聞公司(Aldevron,Fargo,ND,USA)。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(LF2000)購(gòu)自英杰公司(Invitrogen)。線型PEI;ExGen500(分子量22kDa)購(gòu)自德國(guó)弗萊蒙塔公司(Ferementas)。支化PEI(分子量25kDa)購(gòu)自瑞典斯德哥爾摩的瑞典阿爾得里奇公司(AldrichSweden,Stockholm,Sweden)。2.2.siRNA雙鏈體SEQIDNO.1:siGL3(正義，5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT10SEQIDN0.2:反義，5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3')是耙向螢光素酶基因(siRNA-Luc)的未修飾的siRNA雙鏈體，由瑞典蘭德的醫(yī)學(xué)探針公司(MedProbe，Lund,Sweden)定制[28]。SEQIDN0.3:錯(cuò)配siRNA;siCONTROL非耙向siRNA弁l(siCONl;正義，5'隱UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3';SEQIDNO.4:反義，5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3')由科羅拉多州拉斐特的DR有限公司(DharmaconResearch,Inc.,Lafayette,CO)定制。2.3.低分子量殼聚糖制備了各種鏈長(zhǎng)的完全N-脫乙?；?脫乙?；潭取?9.8%;FA<0.001)的線型和7%三糖取代的低分子量殼聚糖(支化殼聚糖)并根據(jù)所述進(jìn)行表征[25,29]。全部采用數(shù)均聚合度(DPn)為34、50和85個(gè)單體單元的低分子量殼聚糖。用多角度激光散射的大小排阻色譜(SEC-MALLS)分析鏈長(zhǎng)分布。2.4.細(xì)胞人胚腎細(xì)胞系HEK293(293細(xì)胞)得自美國(guó)馬里蘭州羅克維爾(Rockville,MD,USA)的ATCC。表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶的穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的HEK293(293-Luc細(xì)胞)由芬蘭庫(kù)奧皮奧大學(xué)藥學(xué)院的帕弗豪卡斯基博士(Dr.PaavoHonkakoski,DepartmentofPharmaceutics,UniversityofKuopio:Finland)贈(zèng)送[30]。穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3-Luc)是由德國(guó)馬爾堡菲利普大學(xué)藥理與毒理學(xué)院的阿奇埃尼博士(Dr.AchimAigner，DepartmentofPharmacologyandToxicology,Philipps-UniversityMarburg,Germany)贈(zèng)送[17]。所有細(xì)胞根據(jù)供應(yīng)商的建議進(jìn)行培養(yǎng)。2.5.siRNA復(fù)合物的配制將殼聚糖溶解在pH6.2的MilliQ無(wú)菌水中并進(jìn)行除菌過(guò)濾而制備殼聚糖儲(chǔ)備液(0.2毫克/毫升)。在渦旋混合機(jī)(HddolphREAX2000，4級(jí)，瑞典斯帕歌凱伯實(shí)驗(yàn)室(KeboLab，Spanga,Sweden))上劇烈攪拌的同時(shí)，依次將殼聚糖和siRNA儲(chǔ)備液或siRNA/pDNA(在共轉(zhuǎn)染的情況下)加入MilliQ無(wú)菌水中，配制殼聚糖復(fù)合物，如[25]所述。每微克pDNA或siRNA采用以下各種含量的殼聚糖來(lái)制備電荷比1:1(+/-)的殼聚糖復(fù)合物0.58微克線型殼聚糖，0.69微克被7%A-A-M取代的殼聚糖(支化殼聚糖)[25，27]。在渦旋混合機(jī)上劇烈攪拌的同時(shí)，將PEI溶液加入siRNA儲(chǔ)備液或siRNA/pDNA(在共轉(zhuǎn)染的情況下)中，制備PEI的siRNA復(fù)合物，如[31]所述。將該制劑在室溫下靜置約IO分鐘后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為形成LF2000復(fù)合物，在渦旋混合機(jī)上劇烈攪拌的同時(shí)將siRNA儲(chǔ)備液或siRNA/pDNA(在共轉(zhuǎn)染的情況下)加入殼聚糖溶液中。用轉(zhuǎn)染介質(zhì)OptiMEMI稀釋siRNA和LF2000溶液。將LF2000復(fù)合物在室溫下靜置約30分鐘后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)基礎(chǔ)試驗(yàn)，全部選擇和使用電荷比15:1(+A)的PEI復(fù)合物和重量比2:1(+/-)的LF2000復(fù)合物(數(shù)據(jù)未顯示)。2.6.凝膠阻滯試驗(yàn)利用瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)研究siRNA復(fù)合物的物理穩(wěn)定性。采用40mMTAE緩沖液中配制的4Q/Q瓊脂糖(MetaPhor⑧瓊脂糖，美國(guó)馬薩諸塞州羅克蘭的CBS羅克蘭有限公司(CambrexBioScienceRockland,Inc.,Rockland,ME,USA),如[25]所述。用1.5URNA酶A(英國(guó)安碧公司(Ambion,UK))孵育30-90分鐘后研究形成復(fù)合物的siRNA抵御酶降解的保護(hù)作用，如[18]所述。孵育后，用肝素(5毫克/毫升)使復(fù)合物解離，用瓊脂糖阻滯試驗(yàn)檢査siRNA的完整性。從儲(chǔ)備液獲得的siRNA作為對(duì)照。2.7.殼聚糖多聚復(fù)合體(polyplex)的大小測(cè)定復(fù)合物的大小采用納米篩選儀ZS(英國(guó)馬勒文的馬勒文設(shè)備公司(MalvernInstruments,Malvern,UK)，通過(guò)光子相關(guān)光譜學(xué)進(jìn)行測(cè)定，如[25]所述。用MilliQ水制備siRNA濃度為5微克/毫升的復(fù)合物。所有測(cè)量在25"C下進(jìn)行。2.8.體外傳染試驗(yàn)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)前24小時(shí)，將HEK293(293,293-Luc)細(xì)胞和SKOV-3-Luc細(xì)胞接種到96-孔組織培養(yǎng)板(英國(guó)劍橋的科斯塔公司(Costar，Cambridge,UK))中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天達(dá)到80-90。/。細(xì)胞匯合。在pH7.4無(wú)血清培養(yǎng)基(OptiMEMI血清減少的培養(yǎng)基，瑞典戴比的吉布可/BRL生命科學(xué)AB(Gibco/BRLLifeTechnologiesAB，Taby,Sweden))中或在10。/。血清(FBS)存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入甘露醇實(shí)現(xiàn)等滲(300mOsm/kg)。用預(yù)熱的OptiMEM洗滌細(xì)胞，并在各孔中加入50微升siRNA復(fù)合物制劑。在共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，每孔中加入0.33微克pDNA(pLuc或pGFP)。所有體外實(shí)驗(yàn)中包括錯(cuò)配(對(duì)照)siRNA。5小時(shí)孵育后，去除制劑，加入0.2毫升新鮮培養(yǎng)液。對(duì)于超過(guò)兩天的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)第二天更換培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染后24-120小時(shí)的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，用預(yù)熱的PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞，并用螢光素酶裂解緩沖液(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(Promega，Madison，WI))裂解細(xì)胞。然后用發(fā)光計(jì)(澳大利亞維也納的米迪塔公司(MediatorsPhL,Vienna,Austria))測(cè)定螢光素酶基因表達(dá)。由螢火蟲(chóng)螢光素酶(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，StLouis,MO))制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定螢光素酶的表達(dá)量。2.9.胞內(nèi)脫氫酶活性(MTT方法)通過(guò)MTT方法評(píng)價(jià)各種siRNA制劑在293-Luc細(xì)胞中對(duì)胞內(nèi)脫氫酶活性的影響(細(xì)胞毒性的衡量)，如[32]所述。簡(jiǎn)言之，如上所述轉(zhuǎn)染293-Luc細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，加入用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配制的MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑餘》(德國(guó)迪森豪夫的西格瑪公司(Sigma,Deisenhofen,Germany))溶液。4小時(shí)后，加入100微升酸-異丙醇(配制的0.04M鹽酸)溶解甲膘結(jié)晶。釆用讀板儀(澳大利亞格勞迪的TA有限公司(TECANSafire2，TecanAustriaGmbH，Grodig，Austria))測(cè)定570nm的吸光度，在690nm進(jìn)行背景校正。設(shè)備將以相同方式處理的培養(yǎng)基的吸光度設(shè)定為0。處理細(xì)胞的胞內(nèi)脫氫酶活性與對(duì)照(未處理)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，并由以下方程進(jìn)行計(jì)算%相對(duì)胞內(nèi)脫氫酶活性=[八(試驗(yàn))*100/A(對(duì)照)]，其中A(試驗(yàn))和A(對(duì)照)分別是處理細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的吸光度值。在另一設(shè)定條件下，轉(zhuǎn)染后使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)。然后，用MTT試劑處理細(xì)胞以檢測(cè)各種制劑的延遲毒性。132.10.數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)利用一式四份樣品進(jìn)行至少兩次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。用ANOVA分析平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。p<0.05時(shí)認(rèn)為組間均值間差異顯著。物理穩(wěn)定性和酶保護(hù)作用我們首次在凝膠阻滯試驗(yàn)中研究了各種鏈長(zhǎng)的線型和支化殼聚糖寡聚體與siRNA形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。只有用較高電荷比的較長(zhǎng)的線型寡核苷酸配制的復(fù)合物才能在pH8.0保留siRNA，該pH是電泳緩沖液常用的pH(圖1A)。數(shù)均聚合度(DPJ為85個(gè)單體單元(DP。85)的線型低分子量殼聚糖在所有檢測(cè)的電荷比下提供的物理穩(wěn)定性最高。相反，當(dāng)凝膠緩沖液的pH降至7.4時(shí)，所有檢測(cè)的低分子量殼聚糖能夠與siRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在升高的pH值下支化或較短的殼聚糖寡聚體的siRNA制劑的物理穩(wěn)定性降低提示，為形成與過(guò)去優(yōu)化的用低分子量殼聚糖配制的pDNA復(fù)合物相比物理穩(wěn)定的復(fù)合物，要求較高的聚陽(yáng)離子電荷密度和較強(qiáng)的siRNA相互作用[25,27]。由于酶降解可能是基因沉默活性的限制性因素，我們也研究了選定低分子量殼聚糖保護(hù)siRNA免于RNA酶A酶降解的能力(孵育時(shí)間采用30-90分鐘)。根據(jù)基因遞送的要求，與裸siRNA相比，所有檢測(cè)的低分子量殼聚糖以及陽(yáng)性對(duì)照(PEI和LF2000)提供對(duì)抗酶降解的保護(hù)作用，而裸siRNA被RNA酶A完全降解(圖1B)。需要與肝素進(jìn)行較長(zhǎng)的孵育時(shí)間(2小時(shí))以破壞用線型DPn85和LF2000配制的復(fù)合物，反映出與其他檢測(cè)的聚陽(yáng)離子相比物理穩(wěn)定性提高(數(shù)據(jù)未示出)。粒度由于siRNA制劑的粒度可大大影響其組織分布和細(xì)胞攝取，因此我們研究了用低分子量殼聚糖配制的siRNA的粒度。表1顯示，低分子量殼聚糖與siRNA自組裝形成納米化粒子(34-86nm)。所得粒子的粒度取決于組14分的+/-電荷比。雖然在最低電荷比10:1(+/-)的情況下得到小粒度(34-46nm)，使用較高電荷比導(dǎo)致相對(duì)較大的粒度(61-86nm)。粒度通過(guò)光子相關(guān)光譜學(xué)進(jìn)行測(cè)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>比較共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)靶標(biāo)的沉默由于在大多數(shù)體外試驗(yàn)中，siRNA分子與其pDNA靶標(biāo)同時(shí)遞送(共轉(zhuǎn)染)，我們利用錯(cuò)配(非沉默)siRNA作為對(duì)照，首次檢測(cè)了低分子量殼聚糖遞送編碼螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告序列的pDNA(pLuc)與靶向相同報(bào)告序列的siRNA(siRNA-Luc)的基因包的效率。在pDNA劑量、我們實(shí)驗(yàn)室中為pDNA遞送而優(yōu)化的最有效低分子量殼聚糖和電荷比的優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件下[27],在293細(xì)胞(不表達(dá)螢光素酶報(bào)告序列)中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)支化D巳34殼聚糖寡聚體或LF2000遞送的siRNA-Luc導(dǎo)致與對(duì)照制劑(僅pLuc)相比，螢光素酶表達(dá)顯著敲減(圖2A)。對(duì)于兩種遞送系統(tǒng)，均未觀察到錯(cuò)配siRNA顯著抑制螢光素酶表達(dá)。然而，當(dāng)在相同條件下siRNA-Luc改為僅由選定聚陽(yáng)離子遞送至穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的293-Luc細(xì)胞(與基因沉默應(yīng)用較相關(guān)的情況)時(shí)，所得螢光素酶沉默活性非常低，要實(shí)現(xiàn)螢光素酶表達(dá)的顯著性沉默要求較高的siRNA濃度(圖2B)。為研究共轉(zhuǎn)染技術(shù)是否會(huì)影響293-Luc細(xì)胞中的基因沉默活性，將無(wú)關(guān)質(zhì)粒(pGFP)摻入上述檢測(cè)的相同siRNA-Luc制劑中。與293細(xì)胞所得結(jié)果類似，支化殼聚糖寡聚體、PEI和LF2000以最低siRNA濃度(1-30納克/孔，相當(dāng)于1.5-40納摩爾/L)介導(dǎo)顯著的螢光素酶表達(dá)敲減(40-85%)(圖2C)。在siRNA制劑中摻入pDNA(共轉(zhuǎn)染)對(duì)基因沉默活性有正面作用。這些結(jié)果提示，用于siRNA遞送的制劑要求與pDNA不同，為在體外通過(guò)聚陽(yáng)離子成功遞送siRNA需要表征重要的參數(shù)。低分子量殼聚糖的結(jié)構(gòu)變化和配方參數(shù)對(duì)基因沉默活性的影響a)鏈長(zhǎng)、主鏈支化程度和電荷比為了檢查殼聚糖結(jié)構(gòu)和配方參數(shù)對(duì)低分子量殼聚糖遞送siRNA的影響，我們首先測(cè)試了鏈長(zhǎng)、支化程度和電荷比對(duì)siRNA復(fù)合物在293-Luc細(xì)胞中體外介導(dǎo)螢光素酶表達(dá)沉默的影響。對(duì)于線型殼聚糖，鏈長(zhǎng)大于34個(gè)單體單元的殼聚糖介導(dǎo)不依賴電荷比的顯著螢光素酶沉默(圖3A)。用支化殼聚糖寡聚體配制的復(fù)合物介導(dǎo)螢光素酶沉默同時(shí)取決于電荷比和鏈長(zhǎng)(圖3B)。對(duì)于較長(zhǎng)的支化殼聚糖寡聚體，較高的電荷比可彌補(bǔ)殼聚糖主鏈支化(取代)的負(fù)面作用。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，低分子量殼聚糖的高電荷密度不僅能夠產(chǎn)生物理穩(wěn)定的復(fù)合物，而且能夠提供在體外有效的siRNA制劑。b)線型低分子量殼聚糖的siRNA濃度和相對(duì)效率下一步，在293-Luc細(xì)胞中研究siRNA濃度對(duì)用各種線型低分子量殼聚糖(以恒定的電荷比)配制的復(fù)合物的螢光素酶沉默活性的影響。對(duì)于最低siRNA濃度(15-50納克/L，相當(dāng)于22-73納摩爾/L)，線型DPn85復(fù)合物將螢光素酶表達(dá)相對(duì)于對(duì)照未處理細(xì)胞敲減72-95%而顯示最高效能(圖4)。當(dāng)siRNA濃度從70增加至300納克/L(103-440納摩爾/孔)時(shí)，除DPn18之外，所測(cè)試的線型殼聚糖復(fù)合物顯示相當(dāng)?shù)奈灩馑孛赋聊€。用線型、較長(zhǎng)鏈低分子量殼聚糖配制的復(fù)合物的效能較高支持siRNA制劑的物理穩(wěn)定性在實(shí)現(xiàn)最高基因沉默活性中有作用。血清存在下的體外轉(zhuǎn)染我們還研究了轉(zhuǎn)染介質(zhì)中的血清對(duì)各種siRNA制劑效率的影響。在10%血清的存在下，用DP值為34-85個(gè)單體單元的線型殼聚糖及支化DPn85殼聚糖寡聚體配制的siRNA復(fù)合物在293-Luc細(xì)胞中保留其基因沉默活性(圖5)。)。相反，用PEI和LF2000配制的siRNA復(fù)合物的基因沉默活性受損。效率受損一種可能的原因是轉(zhuǎn)染期間粒子聚集。體外細(xì)胞毒性為確保較高的螢光素酶沉默效率不是細(xì)胞毒性升高的結(jié)果，我們采用MTT方法研究了用相對(duì)較高濃度的siRNA(150納摩爾)配制的各種聚陽(yáng)離子復(fù)合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)脫氫酶活性的影響。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，未觀察到用線型DPn85配制的siRNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)脫氫酶活性(細(xì)胞毒性的衡量)有影響(圖6)。相反，用PEI和LF2000觀察到顯著的毒性影響，其中線型PEI毒性最高。雖然用LF2000復(fù)合物處理的細(xì)胞在24小時(shí)后恢復(fù)其胞內(nèi)脫氫酶活性，但用PEI處理的細(xì)胞顯示24小時(shí)后脫氫酶活性的進(jìn)一步降低。這些結(jié)果表明，即使使用較高濃度的siRNA，線型DPn85低分子量殼聚糖的急性細(xì)胞毒性亦低于PEI和LF2000。siRNA體外動(dòng)力學(xué)最后，研究了將siRNA-Luc遞送至293-Luc細(xì)胞后螢光素酶沉默的時(shí)程。測(cè)試了DP值為34-85個(gè)單體單元的低分子量殼聚糖、PEI和LF2000。不包括DP18殼聚糖，因?yàn)樗蝗玳L(zhǎng)鏈殼聚糖有效(圖4)。用線型DPn85配制的siRNA復(fù)合物介導(dǎo)螢光素酶沉默起效早，1天后檢測(cè)到顯著作用(70%)，2天后達(dá)到最大(92%)(圖7A)?；虺聊钚猿掷m(xù)5天，提示完整siRNA胞內(nèi)穩(wěn)定釋放。支化殼聚糖寡聚體的螢光素酶沉默動(dòng)力學(xué)效率不如線型寡聚體(圖7B)。LF2000和PEI的基因沉默作用比低分子量殼聚糖介導(dǎo)的作用低(圖7C)。在另一種細(xì)胞系SK0V-3-Luc細(xì)胞中，螢光素酶沉默動(dòng)力學(xué)給出類似于293-Luc細(xì)胞的結(jié)果(圖7D)。參考文獻(xiàn)MeisterQTuschlT，雙鏈RNA的基因沉默機(jī)制(Mechanismsofgenesilencingbydouble-strandedRNA),Nature.431(7006)(2004)343-9。SachseC,KrauszE,KronkeA,HannusM,WalshA,GrabnerA,OvcharenkoD,DorrisD，TrudelC，So皿ichsenB等，利用合成的短干擾RNA17進(jìn)行靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的高通量RNA干擾方案生物途徑的功能基因組學(xué)石開(kāi)究(High-throughputRNAinterferencestrategiesfortargetdiscoveryandvalidationbyusingsyntheticshortinterferingRNAs:functionalgenomicsinvestigationsofbiologicalpathways),MethodsEnzymol.392((2005)242-77。DallasA，VlassovAV,RNAi:—種新的反義技術(shù)及其治療潛力(RNAi:anovelantisensetechnologyanditstherapeuticpotential),MedSciMonit.12(4)(2006)RA67-74。CejkaD，LosertD,WacheckV,短干擾RNA(siRNA):工具還是治療？(ShortinterferingRNA(siRNA):toolortherapeutic),ClinSci(Lond).110(1)(2006)47-58。BurkhardtBR,LyleR,QianK,ArnoldAS,ChengH，AtkinsonMA，ZhangYC，將siRNA有效遞送至細(xì)胞因子刺激的胰島素瘤細(xì)胞使Fas表達(dá)沉默并抑制Fas介導(dǎo)的凋亡(EfficientdeliveryofsiRNAintocytokine-stimulatedinsulinomacellssilencesFasexpressionandinhibitsFas-mediatedapoptosis),FEBSLett.580(2)(2006)553-60。DeviGR，癌癥療法中基于siRNA的方法(siRNA-basedapproachesincancertherapy),CancerGeneTher,(2006)。NishitsujiH,KoharaM,KannagiM,MasudaT,通過(guò)耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒整合必需序列的短或長(zhǎng)發(fā)夾RNA有效抑制1型人免疫缺陷病毒(EffectiveSuppressionofHumanImmunodeficiencyVirusType1throughaCombinationofShort-orLong-HairpinRNAsTargetingEssentialSequencesforRetroviralIntegration),JVirol.80(15)(2006)7658-66。SioudM，小干擾RNA遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(OnthedeliveryofsmallinterferingRNAsintomammaliancells),ExpertOpinDrugDeliv.2(4)(2005)639-51。ElmenJ,ThonbergH,LjungbergK,FriedenM,WestergaardM,XuY，WahrenB,LiangZ,OramH,KochT等，閉鎖核酸(LNA)介導(dǎo)siRNA穩(wěn)定性禾口功會(huì)g的改善(Lockednucleicacid(LNA)mediatedimprovementsinsiRNAstabilityandfunctionality),NucleicAcidsRes.33(1)(2005)439-47。ChenX,DudgeonN,ShenL,WangJH，用于藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的基因沉默寡核苷酸的化學(xué)修飾(Chemicalmodificationofgenesilencingoligonucleotidesfordrugdiscoveryanddevelopment),DrugDiscovToday.10(8)(2005)587-93。LorenzC，HadwigerP，JohnM，VornlocherHP,UnverzagtC,siRNA的類固醇和脂質(zhì)偶聯(lián)物以提高肝細(xì)胞的細(xì)胞攝取和基因沉默(SteroidandlipidconjugatesofsiRNAstoenhancecellularuptakeandgenesilencinginlivercells),BioorgMedChemLett.14(19)(2004)4975-7。DalbyB,CatesS,HarrisA,OhkiEC,TilkinsML,PricePJ,CiccaroneVC,脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000試劑的高級(jí)轉(zhuǎn)染主要神經(jīng)元，siRNA和高通量應(yīng)用(AdvancedtransfectionwithLipofectamine2000reagent:primaryneurons,siRNA,andhigh-throughputapplications),Methods.33(2)(2004)95-103。HassaniZ，LemkineGF，ErbacherP，PalmierK，AlfamaQGiovannangeliC，BehrJP,DemeneixBA,皮摩爾水平脂質(zhì)介導(dǎo)的siRNA遞送下調(diào)外源性基因小鼠腦中的表達(dá)(Lipid-mediatedsiRNAdeliverydown-regulatesexogenousgeneexpressioninthemousebrainatpicomolarlevels),JGeneMed.7(2)(2005)198-207。SantelA,AlekuM,KeilO，EndruschatJ,EscheV，F(xiàn)ischQDamesS，LofflerK，F(xiàn)echtnerM,ArnoldW等，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中用于RNA干擾的新型siRNA-脂質(zhì)復(fù)合體技術(shù)(AnovelsiRNA-lip叩lextechnologyforRNAinterferenceinthemousevascularendothelium),GeneTher.(2006)。PirolloKF，ZonQRaitA,ZhouQ，YuW,HogrefeR,ChangEH，用于短干擾RNA遞送的腫瘤靶向納米免疫脂質(zhì)體復(fù)合物(Tumor-targetingnanoimmunoliposomecomplexforshortinterferin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子、反義分子、核酶和微小RNA。9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH范圍為3.5-8.0。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH范圍為7.1-7.6。11.一種制備如權(quán)利要求1所述組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使低分子量殼聚糖與水性溶劑相接觸；(b)在水性溶劑中混合步驟(a)的水性溶液與寡核苷酸；和(c)維持組合物的pH為3.5-8.0。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法還包括降低步驟(b)產(chǎn)生的產(chǎn)物溶液的體積以得到所需的組合物濃度。13.將核酸給予哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求1所述的組合物引入哺乳動(dòng)物。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，通過(guò)肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直腸或陰道途徑給予粘膜組織而將所述組合物引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、顱內(nèi)、椎管內(nèi)、皮下或心內(nèi)的胃腸外途徑給予粘膜下組織，或給予內(nèi)臟器官、血管或外科手術(shù)期間暴露的其他體表或體腔而將所述組合物引入哺乳動(dòng)物。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述組合物是能夠在至少一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)其功能的寡核苷酸。17.—種使用如權(quán)利要求1所述組合物的方法，所述方法包括制造用于預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物的藥物，所述藥物包含如權(quán)利要求1所述的組合物。18.—種使用如權(quán)利要求1所述組合物作為診斷試劑的方法，所述方法包括在體內(nèi)或體外診斷方法中使用。19.如權(quán)利要求17所述的組合物在制造用于預(yù)防性或治療性治療惡性腫瘤、自身免疫病、遺傳病癥、病原感染和其他病理疾病的基因治療、反義治療或遺傳疫苗接種中使用的藥物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括通過(guò)以下給藥途徑給予將所述組合物弓I入哺乳動(dòng)物體內(nèi)a)通過(guò)肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、直腸或陰道途徑給予粘膜組織，b)通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、顱內(nèi)、椎管內(nèi)、皮下或心內(nèi)給予的胃腸外途徑給予粘膜下組織，c)給予內(nèi)臟、血管或外科手術(shù)期間暴露的其他體表或體腔。全文摘要低分子量殼聚糖寡聚體能夠?qū)iRNA自組織成納米化的顆粒，提供針對(duì)酶降解的保護(hù)作用并介導(dǎo)在體外長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的基因沉默。用低分子量殼聚糖配制siRNA復(fù)合物過(guò)程中對(duì)結(jié)構(gòu)變量的控制提供了有效的siRNA體內(nèi)外替代遞送系統(tǒng)。文檔編號(hào)A61K48/00GK101588821SQ200780034344公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2007年9月14日優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日發(fā)明者K·M·瓦姆,M·M·伊薩,P·A·S·阿爾圖松,S·P·斯特蘭德申請(qǐng)人:Fmc生物聚合物聯(lián)合股份有限公司