專利名稱：作為輻射防護(hù)物質(zhì)的乳鐵蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0001本發(fā)明涉及到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說涉及乳鐵蛋白作
為輻射防護(hù)物質(zhì)的用途。乳鐵蛋白用來防止或修復(fù)損傷性電離輻 射的作用，并提高動(dòng)物存活。
背景技術(shù)：
0002電離輻射主要通過細(xì)胞毒作用對細(xì)胞和組織產(chǎn)生不利 影響。在人類中，受到的電離輻射主要通過治療技術(shù)(如抗肺瘤 ;故療)或通過職業(yè)和環(huán)境接觸產(chǎn)生。
0003受到的電離輻射的主要來源是在癌癥或其它增生性疾 病治療中施用的治療輻射。受到治療劑量電離輻射的受試者通常 每次治療接受0.1和2戈瑞(Gy),并可每次治療接受高達(dá) 5Gy。取決于治療醫(yī)生規(guī)定的治療過程，受試者可在幾星期到幾 個(gè)月的過程中接受多劑量。
0004其工作涉及接觸(或可能接觸)輻射的人，例如核能 和核武器工業(yè)中的人，可能會(huì)受職業(yè)量的電離輻射。目前在美國 有104個(gè)經(jīng)許可進(jìn)行商業(yè)運(yùn)營的核電廠。國際上， 一共有430個(gè) 核電廠在32個(gè)國家運(yùn)營。這些核電廠中聘用的所有工作人員在其 指定職責(zé)過程中可能會(huì)接觸電離輻射。例如1979年3月28曰三 里島核電廠意外事故的事件，放射性物質(zhì)釋放到反應(yīng)堆安全殼和 周邊環(huán)境中，表明潛在的有害接觸。即使沒有災(zāi)難性事件，核能 工業(yè)的工作人員比一般公眾受到更高水平的輻射。職業(yè)接觸的其他來源可以是來自放射性醫(yī)療產(chǎn)品制造 遺留的機(jī)械零件、塑料制品和溶劑，煙霧警報(bào)器，緊急標(biāo)志和其 他消費(fèi)品。職業(yè)性接觸也可能會(huì)發(fā)生在核動(dòng)力船只上供職的人 員，尤其是在受核武器放射性沉降污染區(qū)域操作的軍事人員和處 理核事故應(yīng)急人員中看守核反應(yīng)堆的的人。雖然記錄了抗低線性能量轉(zhuǎn)移(以KeV/pm表示)， 如伽瑪射線和X射線(從0.2到2.0 KeV4im)電離輻射導(dǎo)致的損 傷的大多數(shù)已知輻射防護(hù)劑的性能，但它們抗高線性能量轉(zhuǎn)移輻 射如質(zhì)子、中子和a粒子(從4.7到〉150 KeV/|am)引起的損傷的 有效性，正如發(fā)生在核裝置爆炸中的一樣，還未被徹底研究。本文所用的術(shù)語"藥物組合物"指分散在藥學(xué)可接受載
體中的乳鐵蛋白組合物。所迷乳鐵蛋白組合物可包括乳鐵蛋白或
N端乳鐵蛋白變體，其中至少N-末端甘氨酸氨基酸殘基被截短或 取代。本文所用的術(shù)語"治療，，指將治療有效量的重組人乳鐵 蛋白組合物施用于受試者，從而受試者疾病好轉(zhuǎn)。所述好轉(zhuǎn)為癥 狀的任何改善或補(bǔ)救。所述好轉(zhuǎn)是可觀測或可測量的改善。因 此，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到治療可能改善所述疾病但可能不會(huì)完 全治愈所述疾病。
II.乳鐵蛋白乳鐵蛋白(乳鐵蛋白組合物)制備中N-末端乳鐵蛋白 變體(缺失和/或取代)的存在和相對比例可通過^f吏用標(biāo)準(zhǔn)方法的 Edman降解過程，測定N-末端氨基酸序列確定。N-末端乳鐵蛋白 變體的相對比例包含至少1%乳鐵蛋白組合物，至少5%乳鐵蛋白 組合物，至少10%乳鐵蛋白組合物，至少25%的乳鐵蛋白組合 物，至少50%乳鐵蛋白組合物或之間的任何范圍。 —經(jīng)配制，溶液以與所述劑量制劑相容的方式，并以 治療上有效導(dǎo)致癥狀改善或補(bǔ)救的這樣的量給藥。所述制劑以各 種劑量形式，如可吸收的溶液、藥物緩釋膠嚢、皮膚藥膏等容易 地給藥。劑量可取決與被治療的受試者的狀況產(chǎn)生一些變化。負(fù) 責(zé)給藥的人可在任何情況下，決定單個(gè)受試者的合適劑量。此 外，對于對人給藥，制劑需滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦(FDA Office of Biologies standards)要求的無菌、普通安全和純度標(biāo) 準(zhǔn)。
IV.治療治療方案也會(huì)變化，常常取決于電離損傷或輻射的類 型，損傷或接觸輻射的位置，損傷或接觸輻射導(dǎo)致的疾病進(jìn)展， 患者的健康狀況和年齡。顯然某些類型的疾病將需要更積極的治 療，而同時(shí)某些病人則不能忍受更費(fèi)力的方案?；谥委熤苿┑囊阎熜Ш投拘?如有的話)，臨床醫(yī)師將是最適合做出這樣的 決定的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，乳鐵蛋白組合物以有效 量施用，以防止、減少、降低或抑制損傷性電離輻射的身體輻射 造成的損傷，并提高患者生存率。施用的乳鐵蛋白的量為0.01至 2.0g/kg,優(yōu)選0.01至0.5g/kg，單劑量或分劑量。治療設(shè)想持續(xù)到 損傷已經(jīng)正?；?，優(yōu)選30天的連續(xù)治療。吸收劑量的損傷性輻射后，免疫和造血系統(tǒng)的損傷， 使得受試者易患機(jī)會(huì)感染和疾病?？偘准?xì)胞計(jì)數(shù)傳統(tǒng)上是免疫系 統(tǒng)損傷的指標(biāo)。受到輻射后所有PBMC (外周血單核細(xì)胞)絕對 數(shù)量下降時(shí)， 一些變化快于其它，導(dǎo)致相對其初始比例各種血細(xì) 胞群的比例改變。因此設(shè)想本發(fā)明的乳鐵蛋白組合物可以增強(qiáng)或 增加PBMC,或減少PBMC的衰減。更具體地，已知所述損傷導(dǎo) 致循環(huán)中免疫細(xì)胞相對組成的改變，如CD4+ T淋巴細(xì)胞增加，B 淋巴細(xì)胞減少，以及自然殺傷細(xì)胞的顯著增加。這種變化導(dǎo)致免 疫調(diào)節(jié)障礙，并抑制抗原攻擊的免疫響應(yīng)性。因此，本發(fā)明的乳
鐵蛋白組合物可以糾正或積極改變輻射損傷應(yīng)答發(fā)生的免疫失 調(diào)。進(jìn)一步地，設(shè)想乳鐵蛋白組合物刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生MIP-3a。乳鐵蛋白已知通過其抗菌性能有助于身體的防御系統(tǒng)。此 外，有證據(jù)表明，重組人乳鐵蛋白(rhLF) 口服時(shí)引起更廣泛的 先天樣免疫反應(yīng)。先天免疫系統(tǒng)是身體抗惡劣環(huán)境的"第 一道防 線"，包括各種效應(yīng)器和細(xì)胞機(jī)制。此先天免疫反應(yīng)最初可能由已 知存在于腸上皮細(xì)胞表面，如模式識別受體、IL-1受體和一般的 "清道夫"受體的受體"檢測系統(tǒng)"調(diào)節(jié)。這些受體識別并響應(yīng)存在 分子的具體結(jié)構(gòu)特征。其結(jié)果是，各種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路可能 啟動(dòng)(例如NFkB、 Wnt等)，導(dǎo)致身體對普遍存在生物學(xué)狀況 (如感染)的細(xì)胞應(yīng)答的全面安排。就生成重要的趨化因子—— 即MIP-3-a而言，RhLF和來自rhLF的組分引發(fā)了體外人肝細(xì)胞 的類似、響應(yīng)。在具體實(shí)施方案中，用乳鐵蛋白治療可與其他旨在減 少損傷性輻射影響的治療，例如與粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF) (Filgrastim/(Neupogen))，或與氨磷汀，或與其他旨在治療輻射損 傷后果的物質(zhì)合用。
A.含巰基的化合物可用于輻射防護(hù)物質(zhì)的巰基的例子包括但不限于半胱 氨酸、半胱胺、胱胺、AET和2-巰基乙胍(MEG)。巰基胺也是降 低溫度和生理pH的有效物質(zhì)。各種化合物的劑量減少因子(dose reduction factor, DRF)范圍從1.4到2.0。此類化合物特點(diǎn)是巰基 化合物(SH)和胺(NH2)以2個(gè)碳原子分隔?？勺鳛檩椛浞雷o(hù)物質(zhì)的藥理學(xué)物質(zhì)可以包括麻醉藥物 和醇，鎮(zhèn)痛劑(例如嗎啡、海洛因、水楊酸鈉)，鎮(zhèn)靜劑，膽堿 能藥物(如乙酰膽堿、醋曱膽堿)，腎上腺素和去曱腎上腺素， 多巴胺，組胺，五羥色胺，谷胱甘肽，維生素C ,維生素E和 激素(如雌激素)。
C. 其它物質(zhì)免疫調(diào)節(jié)劑是另 一類可以提高受輻射動(dòng)物生存的輻射 防護(hù)物。就其輻射防護(hù)作用而言，最廣泛研究的細(xì)胞因子是白 細(xì)胞介素-1 (IL-1)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、粒細(xì)胞集落刺 激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞CSF (GM-CSF)。
0087]另一個(gè)是輻射防護(hù)物的免疫調(diào)節(jié)劑是刺激各種細(xì)胞因 子生成的AS101(三氯(二氧乙烯-O-O')合碲酸銨)，在小鼠中表現(xiàn)出 輻射防護(hù)活性。
30VI.實(shí)施例白細(xì)胞數(shù)量(^^核細(xì)胞的％)
安慰劑處理LF-處理
0 (輻射前)6060
11515
72230
143050
284063
實(shí)施例4
口服乳鐵蛋白對輻射后健康狀況和死亡率的作用 Wakabayashi H, Abe S, Okutomi T et al: Cooperative anti-Candida effects of lactoferrin or its peptides in combination with azole antifungal agents(乳鐵蛋白或其肽與吡咯抗真菌藥聯(lián)用的協(xié)同 抗白色念J朱菌作用).Microbiol Immunol, 1996; 40: 821-20124
Zimecki M ， Mazurier J ， Machnicki M et al: Immunostimulatory activity of lactotransferrin and maturation of CD4-CD8- murine thymocytes(乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的免疫刺激活性與CD4- CD8-鼠胸腺細(xì)胞的成熟作用).Immunol Lett, 1991; 30: 119-20125Zimecki M, Mazurier J， Spik G， Kapp JA: Human lactoferrin induces phenotypic and functional changes in murine splenic B cdls(人乳鐵蛋白誘導(dǎo)鼠脾B細(xì)胞的表型和功能改變). Immunology, 1995;86:122-27 Zimecki M, Spiegel K, Wlaszczyk A et al: Lactoferrinincreases the output of neutrophil precursors and attenuates the spontaneous production of TNF誦alpha and IL-6 by peripheral blood cells(乳鐵蛋白提高中性白細(xì)胞前體的產(chǎn)出并減弱外周血細(xì)胞對 TNF-a和IL-6的自發(fā)產(chǎn)生).Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 1999; 47: 113-18雖然本發(fā)明及其有利之處已詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解， 本文可作出各種改變、替換和變化，而沒有偏離正如附加的權(quán)利 要求所定義的本發(fā)明的精神與范圍。此外，本申請的范圍并不限 于本說明書中的過程、機(jī)械、制造、物質(zhì)組成、方式、方法和步 驟的特定實(shí)施方案。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本發(fā)明的公開容 易理解一樣，能與本文描述的相應(yīng)實(shí)施方案實(shí)質(zhì)上起相同作用或
實(shí)質(zhì)上得到相同結(jié)果的過程、機(jī)械、制造、物質(zhì)組成、方式、方 法或步驟，現(xiàn)存的或以后發(fā)展的，都可根據(jù)本發(fā)明使用。因此， 附加的權(quán)利要求旨在包括其范圍內(nèi)這樣的過程、機(jī)械、制造、物 質(zhì)組成、方式、方法或步驟。
權(quán)利要求
1. 治療受到輻射的受試者的方法，其包含將有效量的乳鐵蛋白組合物施用于受試者的步驟，其中所述乳鐵蛋白組合物降低受到輻射的受試者的發(fā)病率和/或死亡率。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，所述乳鐵蛋白組合物在受到輻 射前施用。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，所述乳鐵蛋白組合物在受到輻 射后施用。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物分散 在藥學(xué)上可接受的載體中。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中施用的所述乳鐵蛋白組合 物的量為約0.01至2.0g/kg每天。
6. 權(quán)利要求1所述的方法，其中施用的所述乳鐵蛋白組合 物的量為約0.01至0.5g/kg每天。
7. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物口服 或靜脈內(nèi)給藥。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物以液 體制劑給藥。
9. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物以固 體制劑給藥。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述固體制劑包含腸溶包衣。
11. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物局部 給藥。
12. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述輻射選自235U、 1311、 1231、 "Tc、 201Th、 133Xe、 125I、 60Co和137Cs、 60Co、 137Cs、 192Ir、 32P、 9QSr、 226Ra及其組合。
13. 治療受到一定劑量電離輻射所造成的后遺癥的方法，其 包含通過口服給予有效量乳鐵蛋白組合物，補(bǔ)充受試者粘膜免疫 系統(tǒng)的步驟。
14. 增強(qiáng)受到吸收劑量電離輻射的受試者胃腸道粘膜免疫應(yīng) 答的方法，其包含口服給予有效量乳鐵蛋白組合物的步驟。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物刺激 細(xì)胞因子或趨化因子的產(chǎn)生。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物導(dǎo)致 細(xì)胞因子或趨化因子的抑制。
17. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞 介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺 激因子(GM-CSF)和Y千擾素(IFN-力。
18. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述趨化因子為巨噬細(xì)胞 炎性蛋白3a (MIP-3cx)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白la (MIP-lot)、巨噬 細(xì)胞炎性蛋白1(3(MIP-1(3)。
19. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞 介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-4 (IL-4)、白細(xì)胞介素-5'(IL-5)、白細(xì) 胞介素-10 (IL-10)，以及腫瘤壞死因子-a (TNF-(x)。
20. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物抑制 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生。
21. 權(quán)利要求17所述的方法，其中白細(xì)胞介素-18或粒細(xì)胞/ 巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生或活性。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自T淋 巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨喧細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和多形核細(xì)胞。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多形核細(xì)胞是嗜中性 白細(xì)月包。
24. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述T淋巴細(xì)胞選自 CD4+、 CD8+和CD3+T細(xì)胞。
25. 降低受到吸收劑量電離輻射的受試者死亡率的方法，其 包含將有效量的乳鐵蛋白組合物口服給予所述受試者，以減輕所 述吸收劑量作用的步驟。
26. 減輕吸收劑量輻射對受試者的損傷作用的方法，其包含 口服給予所述受試者有效量的乳鐵蛋白組合物，以減輕所述吸收 劑量的損傷作用的步驟。
27. 權(quán)利要求26所述的方法，其中減輕所述損傷導(dǎo)致所述受 試者死亡率降低。
28. 權(quán)利要求26所述的方法，其中減輕所述損傷導(dǎo)致腸相關(guān) 系統(tǒng)性細(xì)菌、病毒或真菌感染降低。
29. 權(quán)利要求26所述的方法，其中減輕所述損傷導(dǎo)致所述受 試者死亡率降低。
30. 減輕吸收劑量輻射對受試者的損傷作用的方法，其包含 口服給予所述受試者有效量乳鐵蛋白組合物和輻射防護(hù)物質(zhì)，以 減輕所述吸收劑量的損傷作用的步驟。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述輻射防護(hù)物質(zhì)是粒細(xì) 胞刺激因子(G-CSF)(非格司亭/(Neupogen))或氨磷汀。
32. 治療受到一定劑量電離輻射造成的后遺癥的方法，其包 含通過局部施用有效量的乳鐵蛋白組合物，補(bǔ)充受試者粘膜免疫 系統(tǒng)的步驟。
33. 增強(qiáng)受到吸收劑量電離輻射導(dǎo)致輻射性皮炎的受試者皮 膚組織免疫應(yīng)答的方法，其包含局部施用有效量乳鐵蛋白組合物 的步驟。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物刺激 細(xì)胞因子或趨化因子的產(chǎn)生。
35. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物導(dǎo)致 細(xì)胞因子或趨化因子的抑制。
36. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-18 (il-18)、白細(xì)胞介素-12 (il-12)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落 刺激因子(gm-csf)和y干擾素(ifn-力。
37. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述趨化因子為巨噬細(xì)胞 炎性蛋白3a(MIP-3a)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白la (MIP-la)、巨噬細(xì) 胞炎性蛋白1(3(MIP-ip)。
38. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞 介素-2 (il-2)、白細(xì)胞介素-4 (il-4)、白細(xì)胞介素-5 (il-5)、白細(xì) 胞介素-10 (IL-IO)，以及腫瘤壞死因子-a (TNF-a)。
39. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物抑制 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)產(chǎn)生。
40. 權(quán)利要求36所述的方法，其中白細(xì)胞介素-18或粒細(xì)胞/ 巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生或活性。
41. 權(quán)利要求40所述的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自t淋 巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和多形核細(xì)胞。
42. 權(quán)利要求41所述的方法，其中所述多形核細(xì)胞為嗜中性 白細(xì)月包。
43. 權(quán)利要求41所述的方法，其中所述T淋巴細(xì)胞選自 cd4+、 cd8+和cd3+t細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及到防護(hù)或修復(fù)損傷性電離輻射作用的領(lǐng)域。所述治療方法包括與其它輻射防護(hù)物質(zhì)和/或標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理結(jié)合，單獨(dú)或與其它治療結(jié)合口服乳鐵蛋白組合物。此外，治療方法提供了局部施用乳鐵蛋白，治療局部損傷性輻射造成的病變。
文檔編號A61K38/00GK101505781SQ200780030596
公開日2009年8月12日 申請日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日
發(fā)明者A·瓦拉哈查里, K·佩特拉克, P·布勒青格 申請人:阿根尼克斯有限公司