專利名稱：肉毒毒素的神經(jīng)毒組分的高頻率應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過給予包含肉毒桿菌毒素復合物的神經(jīng)毒組分的組 合物治療疾病和病癥的方法，其中所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合 物的任何其它蛋白質(zhì)并且其中所述組合物以短間隔和/或高劑量給予。
更具體地，本發(fā)明涉及患者中由肌肉或外分泌腺的活動過度的膽 堿能神經(jīng)支配引起或與之相關的疾病或病況的方法，所述方法包括給 予包括有效量肉毒桿菌毒素復合物的神經(jīng)毒組分的組合物，所迷組合
物不含肉毒桿菌毒素復合物的任何其它蛋白質(zhì)組分，其中(a)所迷患者 是人，(b)組合物通過注射給予，和(c)組合物以小于三個月的間隔給 予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其中第二治療給予的量可以 比第一治療中給予的量更低、更高、或與之相等。本發(fā)明還涉及治療 由患者的肌肉的病理學活性引起或與之相關的疾病或者病況的方法， 所述方法包括給予包括有效量肉毒桿菌毒素復合物的神經(jīng)毒組分的組 合物，所迷組合物不含肉毒桿菌毒素復合物的任何其它蛋白質(zhì)組分， 其中(a)所述患者是患有嚴重活動障礙或嚴重痙攣狀態(tài)的人；(b)所述 組合物通過注射給予；和(c)給予的神經(jīng)毒組分的有效量為成人大于 500 U/kg體重，兒童大于15 U/kg體重。最后，本發(fā)明還涉及減少面 部皺紋或皮膚皺損或消除面部不對稱性的方法，所述方法包括對個體 給予包括有效量肉毒桿菌毒素復合物的神經(jīng)毒組分的組合物，所述組 合物不含肉毒桿菌毒素復合物的任何其它蛋白質(zhì)組分，其中(a)所述個 體是人；(b)組合物通過皮下或肌肉注射給予到涉及形成皮膚皺紋或不 對稱性的一個或多個面部肌肉或肌肉群中或給予到其附近；和(c)組合 物以小于三個月的間隔給予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其 中第二治療中給予的量可以比第一治療中給予的量更低、更高、或與
7之相等。
背景技術：
肉毒毒素由細菌梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生。肉毒毒素有七種抗原獨特的
血清型，即，肉毒毒素A、 B、 C、 D、 E、 F和G。在從溶胞的梭狀芽孢 桿菌培養(yǎng)物中釋放時，肉毒毒素通常與其它細菌蛋白質(zhì)結合， 一起形 成毒素復合物。這種復合物的神經(jīng)毒亞單位在本文中被稱為肉毒毒素
復合物的"神經(jīng)毒組分"。術語"肉毒毒素"是指不含任何其它梭狀 芽胞桿菌蛋白質(zhì)的神經(jīng)毒組分，而且在以下情況下是指"肉毒毒素復 合物"在不需要或不期望在神經(jīng)毒組分的兩種狀態(tài)之間進行區(qū)分的 情況中。這種復合物通常包含另外的所謂的"無毒的"蛋白質(zhì)，這在 本文中稱作"絡合蛋白"或"細菌蛋白"。神經(jīng)毒組分和細菌蛋白的 復合物稱為"肉毒桿菌毒素復合物"或"肉毒毒素復合物"。這種復 合物的分子量可以為約300， 000到約900, 000 Da。絡合蛋白是例如各 種血球凝集素。這種毒素復合物的蛋白質(zhì)本身沒有毒性，但是為神經(jīng) 毒組分提供穩(wěn)定性并且引起肉毒桿菌中毒的口服毒性。與毒素復合物 不同，分離的和純化形式(即，不含任何絡合梭狀芽孢桿菌蛋白)的神 經(jīng)毒組分對酸敏感并且不能耐受胃腸道中的侵蝕性環(huán)境。
肉毒毒素復合物的神經(jīng)毒組分最初作為單一多肽鏈形成，在血清 型A的情況中具有約150 kDa的分子量。在其它血清型中，已經(jīng)觀察 到神經(jīng)毒組分為約145到約170 kDa，取決于細菌來源。例如，在血 清型A的情況中，多肽的蛋白水解加工產(chǎn)生雙鏈多肽形式的活化多肽， 包括由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈。在人類中，重鏈介導對突觸前膽堿 能神經(jīng)末梢的結合和毒素內(nèi)在化到細胞中。輕鏈被認為引起毒性作用， 作為鋅內(nèi)肽酶和裂解負責膜融合(SNARE復合物)的特異性蛋白起作用 (參見例如，Montecucco C、 Shiavo G. 、 Rosetto 0: The mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Arch Toxicol.1996; 18(Suppl.): 342-354))。通過破壞細胞內(nèi)的膜融合過程，肉 毒毒素阻止乙酰扭堿被釋放到突觸間隙中。肉毒毒素在神經(jīng)肌肉接頭 的總體作用是中斷神經(jīng)肌肉傳遞，并且在作用上使肌肉去除神經(jīng)支配。 肉毒毒素還在其它外周膽堿能突觸有活性，引起唾液分泌或出汗減少。
肉毒毒素的每種血清型結合于突觸前神經(jīng)末梢上的血清型特異性 受體部位。肉毒毒素對于膽堿能神經(jīng)元的特異性是基于重鏈對這些神 經(jīng)末梢上的受體部位的高親合力(參見Katsekas S. 、 Gremminloh G.、 Pich E. M. ， Nerve terminal proteins; to fuse to learn. Transneuro Science 1994; 17: 368-379)。
盡管其毒性作用，但是肉毒毒素復合物已經(jīng)被用作許多疾病的治 療劑。肉毒毒素血清型A在美國在1989年被批準用于人類，用于治療 斜視、眼瞼痙車、和其它病癥。在商品名稱BOTOX(Allergan Inc)和 商品名稱DYSPORT(IpsenLtd)下有肉毒毒素A蛋白復合物市售。對于 治療應用，將復合物直接注射到要治療的肌肉中。在生理學pH，毒素 從蛋白復合物釋放，并且發(fā)生期望的藥理學作用。肉毒毒素的作用只 是暫時的，這就是要求肉毒毒素重復給藥以保持治療效果的原因。在 許多病例中，已經(jīng)在肉毒毒素蛋白復合物的重復給藥之后觀察到肉毒 毒素的耐藥性?；颊咝纬上鄳降尼槍ι窠?jīng)毒組分并且阻斷其活性 的中和抗體(G(ischel H、 WohlfarthK、 Frevert J、 Dengler R、 Bigalke H. (1997) Exp Neurol. 1997 Sep; 147 (1): 96-102)。結果是，在(使 用例如Botox或Dysport的)那些患者中，用肉毒毒素復合物治療不 再有效。隨后給予肉毒毒素藥物例如Botox或Dysport不起作用。如 果中止肉毒毒素蛋白復合物治療，則抗體滴度可能降低。然而，必須 中止治療的持續(xù)時間可能是過長的(參見例如Dressier D、 Bigalke H(2002) Botulinum toxin antibody titres after cessation of botulin認toxin therapy. Mov Disord 17: 170—173)。最初，認為對肉毒毒素復合物的耐藥性是罕見的。隨后的報道暗
示，在治療頸部張力障礙的患者中，有約5%頻率的抗體誘導的肉毒毒 素治療失敗(參見Kessler KR、 Skutta M、 Benecke R. , Long-term treatment of cervical dystonia with botulinum toxin A: efficacy, safety, and antibody frequency. German Dystonia Study Group. J Neurol. 1999 Apr; 246 (4): 265-74.)。這個觀察結果是基于對單個
地點的患者的回顧性評價。然而，最近已經(jīng)報道了更加頻繁的發(fā)生率， 表明約20 。/。的^L治療受試者受到影響(參見The Muscular Nerve May 2004， p. 630)。通常，認為抗體誘導的治療失敗的風險主要與給予單 劑量的肉毒毒素有關。
認為包含在復合物中的蛋白質(zhì)可以增強免疫應答。肉毒毒素治療 的抗體誘導的完全失效的另一個危險因素在于注射間隔，即，隨后的 注射輪次之間的間隔。因此，給予肉毒毒素的常見的作法是每三個月 只給予一次，以降低抗體生成的危險。其中較早期出現(xiàn)的肉毒毒素給 藥的作用停止的患者可通過口服藥物治療。然而，那些口服藥物的有 效性是有限的。
肉毒毒素蛋白復合物的另一個不利作用在于其在被注射到目標肌 肉中之后的區(qū)域性或系統(tǒng)擴散。單纖維肌電描記法(SF-EMG)已經(jīng)表明 在遠離注射部位的肌肉中增加的顫抖。例如，Alnty等人，1988 (Alny R. K. 、 Aminoff M. J. 、 Gelb D.J. 、 Uiwenstein D.H. ， Myomuscular effects distant from the site of botulinum neurotoxin injection. Neurology 1988; 38: 1780-1783)表明，通過注射到頸部肌肉中治 療的患者在遠離注射部位的肌肉中具有增加的顫抖和纖維密度。這些 異常在約三到六個月之后恢復正常。局部注射之后的肉毒毒素系統(tǒng)擴 散的其它證據(jù)是出現(xiàn)心血管反射和血壓方面的變化。(參見Alny R. K. 、 Aminoff M. J. 、 Gelb D. J. 、 L5wenstein D. H. ， Myomuscular effects distant from the site of botulinum neurotoxin injection.Neurology 1988; 38: 1780-1783)。
在一些患者中，給予高劑量的肉毒毒素蛋白復合物可能影響不希 望治療的肌肉。例如，在用肉毒毒素蛋白復合物治療眼瞼痙攣時，擴 散可以影響眼瞼張開肌肉，引起眼險下垂。
因此，不僅是抗體生成的危險，而且有系統(tǒng)擴散的危險，使得需 要以相對低并且由此可能較差有效的劑量給予肉毒毒素。因此，醫(yī)生 被強烈建議不要以比每三個月 一次更大的頻率給予BOTOX或DYSP0RT。 這特別地適用于需要高劑量肉毒毒素的患者。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到以上所述，本發(fā)明的一個目的是為受到本文中提及的病癥 困擾的患者提供治療，其允許以縮短的間隔和/或使用相對高劑量給予 治療用肉毒毒素制備物。因為治療用肉毒毒素制備物是用于特定的目 標組織(例如特定的肌肉或腺體)， 一個重要的要求在于限制其擴散到 相鄰組織中。最終的但并非不重要的要求在于降低治療用肉毒毒素制 備物的抗原性。本發(fā)明的另一個目的是提供用適合的藥物以靈活的和/ 或頻繁的間隔治療與痙攣或張力障礙肌肉相關的疾病的方法。本發(fā)明 的另一個目的是提供使用藥物以頻繁的間隔進行美容治療，具有降低 的抗體生成危險和/或減少的系統(tǒng)擴散。
因此，本發(fā)明涉及治療患者中由肌肉或外分泌腺的活動過度的膽 堿能神經(jīng)支配引起或與之相關的疾病或病況的方法，所述方法包括給 予包括有效量肉毒桿菌毒素復合物的神經(jīng)毒組分的組合物，所述組合 物不含肉毒桿菌毒素復合物的任何其它蛋白質(zhì)組分，其中(a)所述患者 是人，(b)組合物通過注射給予，和(c)組合物以小于三個月的間隔給 予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其中第二治療給予的量可以 比第一治療中給予的量更低、更高、或與之相等。值得注意的是，本發(fā)明的包括給予肉毒毒素復合物的神經(jīng)毒組分 的方案通常允許治療與肌肉或外分泌腺的活動過度的膽堿能神經(jīng)支配 有關的任何病況，其中神經(jīng)毒組分阻斷乙酰膽堿分泌到突觸間隙中。 因此，本發(fā)明提供的治療對于以下適應癥可能是直接的，所述適應癥
中大多數(shù)詳細描述在Dressier D(200t)) (Botulinum Toxin Therapy. Thieme Verlag， Stuttgart, New York)中 張力障礙
頭部張力障礙 眼瞼痙攣
口-下頜肌張力障礙
頜張開型
頜關閉型 夜間磨牙 Meige綜合癥
舌張力障礙
眼瞼張開運用不能癥 頸部張力障礙
頸項前屈
頸后傾
頸側(cè)屈
斜頸 咽部張力障礙
喉張力障礙
痙攣性發(fā)音障礙/內(nèi)收肌型
痙攣性發(fā)音障礙/外展肌型
痙攣性呼吸困難 肢張力障礙
臂張力障礙任務特異性張力障礙 指痙攣
音樂家型痙攣 高爾夫球手型痙攣 腿張力障礙
大腿內(nèi)收、大腿外展 膝彎曲、膝伸展 踝彎曲、踝伸展
內(nèi)翻足畸形 腳張力障礙
紋狀趾
腳趾彎曲
腳趾伸展 軸向張力障礙
pisa綜合癥
肚皮舞舞蹈演員型張力障礙 節(jié)段性張力障礙 偏身性肌張力障礙
全身性張力障礙 X-連肌張力障礙
皮質(zhì)基底退化型張力障礙 X-連肌張力障礙
遲發(fā)型張力障礙
脊髓小腦共濟失調(diào)型張力障礙
帕金森氏病張力障礙
亨廷頓舞蹈病張力障礙
Hallervorden Spatz病張力障礙
多巴誘導的運動障礙/多巴誘導的張力障礙
遲發(fā)性運動障礙/遲發(fā)型張力障礙突發(fā)性的運動障礙/張力障礙
運動誘發(fā)的
非運動誘發(fā)的
動作誘導的
腭肌陣攣
肌陣攣
肌纖維顫搐
僵化
良性肌肉痙攣
遺傳性下頜發(fā)抖
異常頜肌肉活性
半側(cè)咀嚼肌痙攣
鰓肥大肌病
咀嚼肌增生
脛骨前肌增生
眼球震顫
振動幻詳見
核上注視麻瘠
epilepsia partialis contimia
planning of spasmodic torticollis operation
外展肌聲帶癱瘓
recalcitant mutational dysphonia
上食管括約肌機能障礙
聲帶肉芽瘤
口吃
Gilles de la Tourette綜合癥中耳肌陣攣
保護性喉閉合喉切除術后的發(fā)音不能保護性眼瞼下垂 瞼內(nèi)翻
括約肌0dii機能障礙 假性下食道遲緩不能癥
非下食道食管運動肌病癥 (nonachalsia oesophageal motor disorders) 陰道痙攣 手術后活動不能 震顫
膀胱機能障礙 逼尿肌括約肌協(xié)同失調(diào) 膀胱括約肌痙攣 半面痙攣
神經(jīng)移植術運動障礙
美容用途
克羅病
蹙眉
面部不對稱性
頦肌微凹(mentalis dimples)
僵人綜合征
破傷風
前列腺增生
肥胖癥治療
嬰兒腦性麻痹
斜視
混合型
麻瘠型
視網(wǎng)膜脫離手術后伴生型 白內(nèi)障手術后型無晶狀體型
肌炎性斜視型
肌病性斜視型
分離的垂直離差型
作為斜視手術附屬型
內(nèi)斜視型
外斜視型
弛緩不能
肛裂
外分泌腺活動過強
Frey綜合癥
鱘魚淚綜合癥
多汗癥
腋部
手掌
足底
鼻溢液
相對唾液過多
中風型
帕金森病型
肌萎縮性側(cè)索硬化型
痙攣狀況
在腦炎和脊髓炎中
自身免疫過程
多發(fā)性硬化
橫貫性脊髓炎
Devic綜合癥
病毒感染
細菌傳染
16寄生蟲感染真菌感染
遺傳性痙攣下肢輕癱卒中后綜合癥
半球梗塞形成腦干梗塞形成
脊髓梗塞形成
中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷中
半球損害
腦干損害
脊髓損害
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血中腦內(nèi)出血蛛網(wǎng)膜下出血硬腦膜下出血
##主內(nèi)出j6l
在肺瘤形成中
半球腫瘤
腦干胂瘤
脊髓腫瘤
肉毒毒素可通過例如培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌細菌得到。本發(fā)明優(yōu)選的梭狀芽孢桿菌種類為肉毒桿菌。然而，重要的是，神經(jīng)毒組分可得自任何其它細菌種類。條件是它是衍生自肉毒桿菌的神經(jīng)毒組分的功能同系物。用于本發(fā)明方法的組合物總是包含神經(jīng)毒組分，所述神經(jīng)毒組分不含任何其它肉毒桿菌蛋白質(zhì)。然而，在生產(chǎn)神經(jīng)毒組分時，毒素可能作為包含神經(jīng)毒組分的復合物從細菌分離得到，即，負責在人類中的毒性作用的蛋白質(zhì)和其它細菌蛋白。隨后，可以從毒素復合物
純化得到神經(jīng)毒組分。如本文中使用的，術語"毒素復合物"或"肉毒毒素復合物，，或"肉毒毒素神經(jīng)毒素復合物"可互換使用，并且是
17指包括約150 kDa的神經(jīng)毒組分和另外的無毒的肉毒桿菌蛋白質(zhì)的高 分子量復合物，所述無毒的肉毒桿菌蛋白質(zhì)包括血球凝集素和非血球 凝集素蛋白(Sakaguchi 1983; Sugiyama 1980)。
本發(fā)明考慮了治療特征在于患有與肌肉或外分泌腺的活動過度的 膽堿能神經(jīng)支配有關的疾病的患者。如本文中使用的術語"患者"是 指從來沒有接觸肉毒毒素的患者以及已經(jīng)接觸過肉毒毒素的患者。后 一種情況的患者可能已經(jīng)形成了針對肉毒毒素復合物或其組分的抗 體。這種抗體可能是中和抗體。優(yōu)選地，患者的抗體滴度不超過7mU, 特別地，中和抗體的滴度不超過7mU。術語"抗體滴度不超過…"是 指低于7 mU，例如，1 mU到6mU或0. 01 mU到1 mU。
如本文中使用的術語"活動過度的膽堿能神經(jīng)支配"是指特征在 于有異常高的量的乙酰膽堿釋放到突觸間隙中的突觸。"異常高的" 是指通過例如將釋放與相同類型但不處于活動過度狀態(tài)的突觸的釋放 相比，相對于可得到的參照活性有最多25°/。的提高、最多50%或更大的 提高，其中肌肉張力障礙可能是活動過度狀態(tài)的表現(xiàn)。"最多25%" 是指例如約1%到約25%。進行所需測量的方法是本領域中已知的。
在本發(fā)明上下文中使用的術語"約"是指"大約"或"近似"。 在數(shù)值的情況中，不限于嚴格的數(shù)值定義，該術語可以解釋為評價一 個數(shù)值為所示值或范圍的+/-10%。
在本說明書中使用的術語"神經(jīng)毒組分，，或"神經(jīng)毒素組分"是 指肉毒毒素復合物的亞單位，其具有神經(jīng)毒活性并且在血清型A情況 下具有約150 kDa的分子量。術語"神經(jīng)毒組分，，還包括在肉毒桿菌 的其它血清型中發(fā)現(xiàn)的功能同系物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，神 經(jīng)毒組分不含任何其它肉毒桿菌蛋白，優(yōu)選也不含可能與神經(jīng)毒組分 結合的RNA。神經(jīng)毒組分可能是約150kDa的單鏈前體蛋白或蛋白水解加工過的神經(jīng)毒組分，包括約50kDa的輕鏈(Lc)和約100kDa的重鏈(He)，輕鏈和重鏈可通過一個或多個二硫鍵連接(綜述參見例如Simpson LL， Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93)。本領域技術人員應該理解，只有在蛋白水解激活之后才能得到完整的生物活性，盡管可以想象未加工的前體可以發(fā)揮一些生物學功能或者是部分活性的。"生物活性"是指(a)受體結合，(b)內(nèi)在化，(c)移動跨越核內(nèi)體膜到胞液中，和/或(d)涉及突觸小泡膜融合的蛋白質(zhì)的內(nèi)肽酶水解裂解。評價生物活性的體外測定法包括小鼠LD5。測定法和小鼠偏,寸月鬲觀'J定'法，i口 Pearce LB、 Borodic GE、 First ER、 MacCallumRD (1994) (Measurement of botulinum toxin activity: evaluationof the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) 和Dressier D、 Lange M、 Bigalke H (2005) (The mouse diaphragm assayfor detection of antibodies against botulinum toxin type B. MovDisord 20: 1617-1619)所述的。
生物活性通常表示為小鼠單位(MU)。如本文中使用的，IMU是在腹膜內(nèi)注射之后殺死50%的特定小鼠種群的神經(jīng)毒組分的量，即，小鼠i.p.LD5。(Schantz & Kauter, 1978)。術語"小鼠單位(MU)"和"單位"或"U"可互換使用?；蛘?，生物活性可以表示為致死劑量單位(LDU)/ng蛋白質(zhì)(即，神經(jīng)毒組分)。本文中使用的術語"MU"可與術語"U"或"LDU"互換使用。
術語"有效量"是指在給藥之后產(chǎn)生病征部分或完全消除的神經(jīng)毒組分的量。有效量通常為1到2000MU，但是可以使用最大為5000MU的劑量。在將高劑量的神經(jīng)毒組分給予患者時，將治療分為一個以上的治療時期可能是有利的。術語"一個以上的治療時期"是指例如2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9個治療時期。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的神經(jīng)毒組分從肉毒桿菌的培養(yǎng)物純化得到。培養(yǎng)肉毒桿菌和從中純化毒素復合物的方法已經(jīng)描述在現(xiàn)有技
術中(在 Schantz & Kauter， 1978. Microbiological methods. Standardized assay for Clostridium botulinum neurotoxins. J Assoc Off Anal Chem 1978; 61 (1): 96-99中綜述)?？梢詫嵸|(zhì)上如 DasGupta & Sathyamoorthy的方法所述從肉毒桿菌純化神經(jīng)毒組分 (DasGupta BR、 Sathyamoorthy V. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. Toxicon. 1984; 22 (3):415-24)。為此，將肉毒桿菌A型在例如20 L發(fā)酵器中在 包括2%朊蛋白胨、1 %酵母抽提物、1 °/。葡萄糖和0. 05%巰基乙酸鈉的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在生長72小時之后，通過加入3 N硫酸使毒素沉淀(最 終的pH = 3.5)。將沉淀和離心的生物材料用pH 6. 0的0. 2 M磷酸鈉 緩沖液提取。在通過用硫酸魚精蛋白沉淀除去核酸之后，通過加入硫 酸銨使毒素沉淀。將已經(jīng)溶解并且相對于pH 6. 0的50 inM礴酸鈉透析 的沉淀物在相同的pH結合于DEAE-Sephadex⑧柱，并且用150mMNaCl 洗脫。隨后在已經(jīng)用pH 7.9的50 mM Tris/HCl緩沖液平衡的 QAE-Sephadex⑧柱上進行色鐠純化。毒素通過NaCl梯度洗脫。在最后 的步驟中，將毒素在SP-Sephadex上在pH 7. G色譜純化。在這種情況 中，使用NaCl梯度(O 300mM)將結合的毒素從柱洗脫。通過SDS聚丙 烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化的毒素，并且其通常表現(xiàn)出 95+/-5%的純度。
肉毒毒素神經(jīng)毒素，特別是上述的毒素復合物，以前被分為七個 血清學獨特的類型，A、 B、 C、 D、 E、 F和G。最近幾年中，已經(jīng)鑒定 了 A-血清型(Al和A2)和C-血清型(Cl和C2)的獨特種群。在這里，這 些種群都被稱為"亞型"。
血清型A的神經(jīng)毒組分可以在商品名XE0MIN商購自Merz Pharmaceuticals,為不含肉毒桿菌毒素復合物的任何其它蛋白質(zhì)的組 合物?；蛘?，用于本發(fā)明方法的神經(jīng)毒組分可以通過重組基因表達產(chǎn)生。 為此，可以將編碼神經(jīng)毒組分或其突變物的開放讀框克隆到感興趣的 宿主細胞中適合于基因表達的載體中。重組基因表達和蛋白質(zhì)純化的 方法是本領域技術人員已知的。
重組的編碼神經(jīng)毒組分的核酸分子可以得自已知的核酸序列或可 以通過重組技術或化學合成從兩個或更多個已知序列重組得到。嵌合 的神經(jīng)毒組分的實例是通過例如將神經(jīng)毒組分的第一血清型的輕鏈與 第二血清型的重鏈融合而產(chǎn)生的分子?；瘜W合成的實例是整個神經(jīng)毒 組分的化學合成。
還包括的是包含l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 IO或最多20個氨 基酸突變的遺傳修飾的神經(jīng)毒組分。突變可以是置換、插入或缺失。 優(yōu)選地，突變不損害如上所述的任何生物學活性。然而，還考慮了使 用突變調(diào)節(jié)神經(jīng)毒組分的生物活性。
還包括的是包含化學修飾的氨基酸的肉毒毒素的神經(jīng)毒組分，例 如一個或多個氨基酸被糖基化、乙?；蛞云渌绞竭M行修飾，這樣 可能有利于毒素的攝取或穩(wěn)定性。特別優(yōu)選的是神經(jīng)毒組分的脂化 (lipidation)?？梢越柚缑复俚捏w外反應或使用適宜的化學反應 條件為神經(jīng)毒組分添加修飾性殘基?；蛘?，可以通過在宿主細胞內(nèi)的 酶的表達反向提供修飾性的酶促功能。
使用上面描述的方法允許顯著提高治療頻率而不誘導針對神經(jīng)毒 組分的中和抗體。在這方面，需要指出的是，在本發(fā)明之前，已知的 治療方案嚴格避免以小于三個月的間隔給藥肉毒毒素，因為肉毒毒素 的更頻繁給藥被認為增加在被治療患者中誘導免疫應答的可能性。支以避免這種問題。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，進行第二治療以便改善第一治療的 治療效果。這會允許更有效地給藥適宜的肉毒毒素劑量。例如，在第 一治療時期中，可以給予神經(jīng)毒組分的接近最佳劑量。如果患者的病 征沒有充分響應，則可以在第二或隨后的治療時期中給予更多的神經(jīng) 毒組分。因此，考慮到本發(fā)明方法的降低的危險，可以使用許多治療 時期以便接近有效治療患者所需的最佳劑量。
根據(jù)本發(fā)明，第 一和第二和隨后的治療時期可以在前一個治療時
期的至少一天之后安排。術語"之后的至少一天"是指例如l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10天，或l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或12周。然而，本發(fā)明還考慮了第二治療在第一治療之后的只幾小時， 例如2、 3、 4、 5、 6、 7或8小時之后安排。
在優(yōu)選實施方案中，第二 (隨后的)治療在第一 (前一個)治療的效 力開始下降的時間點進行。使用這種治療方案，患者可以實現(xiàn)穩(wěn)定的 生活質(zhì)量。
對于患者的參數(shù)"穩(wěn)定的生活質(zhì)量"的測定如下通過參考本發(fā)明 治療的一種病況，即，眼瞼痙攣，基于所謂的眼瞼痙攣障礙指數(shù)(BSDI) 進行示例性描述。眼瞼痙享障礙指數(shù)[BSDI]是用于評價由BEB引起的 日常生活的具體活動損傷的自我評定評分標準，Goertelmeyer R、 Brinkmann S、 Comes G、 Delcker A， The Blepharospasm Disability Index (BSDI) for the Assessment of Functional Health in Focal Dystonia, Clin. Ne訓physiol. 2002; 113(1): S77-S78。
所述評分標準是在每次探訪時由患者進行回答。它包括要進行評 價的6個項目，每個項目分為5-分列表(即，每項0-4分)，分別為"沒有損害"、"輕度/中度/重度的損害"和"由于我的疾病不再可能"。
所述6個項目是"開車"、"閱讀"、"看電視"、"購物"、"步 行"和"進行日?；顒樱Ｅc忽略了不適用項目的情況中的評分標準 的其它功能性評分標準不同，BSDI允許對除"進行日常活動"之外的 五個項目回答'不適用，。
通過將所有適用和回答的項目加和并且除以回答的項目數(shù)計算未 缺失項目的BSDI平均分數(shù)。
然而，在本發(fā)明內(nèi)，可對于要治療的許多其它疾病和病況得到這 種參數(shù)，例如用于頸部張力障礙的顱頸張力障礙調(diào)查表(CCDQ 24) (Mueller J、 Wissel J、 Kemraler G、 Bodner T、 Poewe W， Quality of life in patients with craniocervical dystonia: development of the CCDQ-24, Mov. Disord. 2000; 15(Suppl 3): 761;和HRQL， 用于痙攣狀態(tài)的 Swedish Short Form 36 Health Survey Questionnaire(SF-36)(Welmer AK、 von Arbin M、 Widen Holmqvist L 、 Sommerfeld DK , Spasticity and its association with functioning and health—related quality of life 18 months after stroke, Cerebrovasc. Dis. 2006; 21(4): 247-253)。
在患者的每次再注射治療或最后一次治療中，計算實際的BSDI觀 察結果和基線的BSDI數(shù)值之間的差
△ bsdi = BSDI實際一 BSDI基線
在被治療患者的第 一次探訪過程中和第 一次注射藥物之前測定
BSDI基線。分別在每次(再)注射藥物和其后3周測定BSDI實際。
根據(jù)第一治療記錄的A麗值，用下列方式為每位患者指定三個階
23層中的一個
階層l(中等的改善)-1.00 < A, <-0. 65 階層2(明顯的改善):-1.35 < △, <-1. 00 階層3(癥兆和癥狀消除)ABSDI <-1. 35
如果計算的A腿值中沒有一個大于閾值Ac，則將患者分類為應答 者，即，患者表現(xiàn)出穩(wěn)定的生活質(zhì)量水平。閾值Ac的數(shù)值取決于該 患者所屬的階層。閾值的數(shù)值為
階層1: Ac =-0.40 階層2: Ac =-0. 75 階層3: Ac =-1. 10
應答者表現(xiàn)出基線BSDI值降低，因此表示生活狀態(tài)的質(zhì)量有改善。 改善的最小程度由閾值Ac給出。Ac的數(shù)值隨階層數(shù)減小，因為階層 2的患者表現(xiàn)出比階層1的患者更強的對最初注射的響應(產(chǎn)生較低的 BSDI差)，階層3的患者比階層2的患者反應更強。
最后，對觀察到的再注射治療當天的BSDI水平和基線BSDI水平 之間的差進行分析，以研究在再注射時(預期的治療效果變?nèi)醯臅r間) 生活質(zhì)量水平是否隨時間有任何改善。
用于本發(fā)明的藥物的上述指定和要求的給藥方式通常屬于醫(yī)生治 療患者的活動。然而，給藥方式也可以是藥物生產(chǎn)的一部分，在于例 如藥物的包裝包含對醫(yī)生和/或患者明確適用的說明書傳單，和/或包 裝明確地適宜于允許本發(fā)明的給藥方式。
24在本發(fā)明的說明書中使用的術語"每次治療注射的總量"是指總 的劑量并且表示在單次治療過程中應用于患者的神經(jīng)毒素總量。單次 治療可以包括一次或多次的注射。例如，胸鎖乳突肌、頭夾肌和斜方
肌的治療包括l、 2、 3、 4或5次注射，而肩胛提肌或斜角肌的治療可 以只包括1到3次注射。如本文前述指出的，治療使用的量取決于許 多參數(shù)，所述參數(shù)為本領域已知的。這種參數(shù)包括例如神經(jīng)毒組分的 血清型、注射的目標組織、和患者的許多特異性因素。本發(fā)明考慮了 在給予上述的神經(jīng)毒組分總量過程中可以將單次治療分為兩個或更多 個治療時期。這對于要給予大量神經(jīng)毒組分的情況特別適用。
此外，基于本發(fā)明方法的實施方案，現(xiàn)在有可能更有效地治療需 要另外給藥神經(jīng)毒組分的患者。這可能適用于例如在第一或先前的治
情況,
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，患者是需要高劑量神經(jīng)毒組 分的患者。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，(a)患者是重度運動障 礙或重癥痙攣狀態(tài)的患者和(b)給予的神經(jīng)毒組分有效量為成人大于 500U或兒童大于15 U/Kg體重。
基于本發(fā)明的實施方案，現(xiàn)在有可能用更大得多的量的神經(jīng)毒組 分治療患者。在成年患者中，這種量可為例如大于500 U神經(jīng)毒組分。
如本發(fā)明中使用的，大于500 U的量為例如500 U以上并且最大 為550 U，最大為600 U，最大為700 U，最大為800 U，最大為900 U， 最大為1000 U，最大為1100 U，最大為1200 U，最大為1300 U，最 大為1400 U，最大為1500 U，最大為1600 U,最大為1700 U，最大 為1800 U，最大為1900 U或最大為2000 U的量。優(yōu)選地，給予的劑
25量為500到900 U，更優(yōu)選為約850 U。在兒童中，"高的量"是指大 于15 U/kg，并且最大為16U/kg，最大為17 U/kg，最大為18 U/kg， 最大為19 U/kg，最大為20 U/kg的量。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，大于500 U的量為成人用量或15 U/kg體重的量為兒童用量，并且所述量如下給予(a)在第一時期過程 中注射這個量的第一部分和(b)在一個或多個隨后的治療時期過程中 注射剩余的部分，其中隨后的治療時期在第一治療時期之后的至少一 天安排。神經(jīng)毒組分的總有效量可以在同一天或在不同天給予，即， 在不同的治療時期給予。優(yōu)選地，在給予高的神經(jīng)毒組分量時，可以 將要給予的總量分開并且在兩個或更多個治療時期中給予。這樣，可 以將不適合在單次治療時期給予的大的量給予患者，而不會觀察到顯 著的不利影響。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，患者是已經(jīng)用肉毒毒素治療 但是抱怨治療效果降低并且需要在治療之后3個月期滿之前進行治療 的人。
這種治療效果的降低可以通過治療日歷監(jiān)視，其中患者以每天的 基礎記錄其病癥的嚴重程度(這種治療日歷是例如，由Merz Pharmaceuticals經(jīng)銷的)。
在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案中，活動過度的腺體是自主的外 分泌腺，并且將組合物注射到所述腺體中或其附近。
在優(yōu)選實施方案中，自主的外分泌腺是(a)選自汗腺、淚腺、唾液 腺和粘液腺體；或(b)與選自Frey綜合癥、聘魚淚綜合癥、腋部多汗、 手掌多汗、腳底多汗、頭和頸的多汗、身體多汗、鼻溢液、或中風、 帕金森病或肌萎縮性側(cè)索硬化患者的相對唾液分泌過多的疾病或病況有關的活動過度的腺體。然而，需要指出的是，神經(jīng)毒組分治療的目 標組織涵蓋活動過強的任何外分泌腺。因此，考慮了可以將本發(fā)明用于
治療在Sobotta、 Johannes: (Atlas der Anatomie des Menschen, 22. Auflage. Band 1 und 2. Urban & Fischer, 2005)中提及的任何腺 體，所述文獻被并入本文作為參考。
本發(fā)明還涉及治療患者的由肌肉的病理學活動引起或與之相關的 疾病或病況的方法，所述方法包括給予含有效量肉毒桿菌毒素復合物 的神經(jīng)毒組分的組合物，所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合物的任何 其它蛋白質(zhì)組分，其中(a)所述患者是患有重癥運動障礙或嚴重痙攣狀 態(tài)的人；(b)所述組合物通過注射給予；和(c)給予的神經(jīng)毒組分的有 效量為成人超過500 U或兒童超過15 U/kg體重。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述量為用于成人的超過500 U的 總量，或用于兒童的15U/kg體重的量，并且其中所述量如下給予(a) 通過在第一治療時期過程中注射這個量的第一部分和(b)在一個或多 個隨后的治療時期過程中注射剩余的部分，其中隨后的治療時期在第 一治療時期之后的至少一天安排。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，組合物以小于三個月的間隔 給予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其中在第二治療中給予的量 可以低于、高于或等于第一治療中給予的量。
在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案中，所述疾病或病況是包括肌肉 的張力障礙。術語"涉及張力障礙或肌肉張力障礙的疾病或病況"是 指涉及張力障礙性肌肉的病況。優(yōu)選地，所述病況選自全身性張力障 礙、節(jié)段性張力障礙、局限性張力障礙、多灶性張力障礙和偏身性張 力障礙。局限性張力障礙優(yōu)選選自顱側(cè)張力障礙、頸部張力障礙、肢 張力障礙、軀干張力障礙、和痙攣性言語障礙。頸部張力障礙也稱為痙攣性斜頸，特征在于在頸和肩部的肌肉的無意識的、不適當?shù)募∪?br> 活動過強，導致異常的頭移動和姿勢、痙攣或顫動(Fahn S, Assessment of the Primary Dystonias. In: Munsat TL， editor. Quantification of Neurologic Deficit.Boston:Butterworths;1989. p. 241-270. (ID 1760137))。將神經(jīng)毒組分注射到患病的頸和肩部肌肉在 大多數(shù)患者中引起癥狀的顯著緩解。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，張力障礙是(a)選自(l)顱側(cè)張力 障礙，包括險痙攣、頜張開或頜關閉型的口-下頜張力障礙、夜間磨牙、 Meige綜合癥、舌張力障礙、眼瞼張開的運用不能，(2)頸部張力障礙， 包括頸前傾、頸后傾、頸側(cè)傾、斜頸，(3)咽張力障礙，(4)喉張力障 礙，包括內(nèi)收肌型或外展肌型的痙攣性言語障礙、痙攣性呼吸困難， (5)肢張力障礙，包括臂張力障礙，例如任務特異性張力障礙，包括書 寫痙攣、音樂家型痙攣或高爾夫球手型痙攣，腿張力障礙，包括大腿 內(nèi)收、大腿外展、膝屈曲、膝伸展、踝屈曲、踝伸展、或內(nèi)翻足畸形， 腳張力障礙，包括紋狀趾、腳趾屈曲或腳趾伸展，軸張力陣礙，例如 Pisa綜合癥或肚皮舞舞蹈演員型張力障礙、節(jié)段性張力障礙、偏身性 張力障礙或全身性張力障礙，(6) X-連肌張力障礙，(7)皮質(zhì)基底節(jié) 變性的張力障礙，(8)遲發(fā)型張力障礙，(9)脊髓小腦共濟失調(diào)的張力 障礙，(IO)帕金森病的張力障礙，(ll)亨廷頓舞蹈病的張力障礙，(12) Hallervorden Spatz病的張力障礙，(13)多巴誘導的運動障礙/多巴 誘導的張力障礙，(14)遲發(fā)性運動障礙/遲發(fā)性張力障礙，(15)發(fā)作 性運動障礙/張力障礙(誘發(fā)性的、非誘發(fā)型的、動作誘導的)；或(b) 包括選自斜頸、頸側(cè)傾、頸后傾、頸前傾、屈肘、前臂前旋、屈腕、 拇指內(nèi)扣(thumb-in-palm)或握拳的臨床表現(xiàn)。
下表提供臨床表現(xiàn)和可能涉及的肌肉的非限制性列表，根據(jù)本發(fā) 明的揭示，所述肌肉是優(yōu)選的目標肌肉。臨床表現(xiàn) 可能的目標肌肉
斜頸 頭夾肌、胸鎖乳突肌、斜方肌
頸側(cè)傾 胸鎖乳突肌、頭夾肌、斜角肌復合體、肩胛提肌
頸后傾 頭夾肌、頸斜方肌
頸前傾 胸鎖乳突肌、斜角肌復合體、頦下復合體、舌骨上和舌骨下肌肉群
"痙攣性言語障礙"是由喉部的一個或多個肌肉的無意識運動引 起的聲音異常。痙攣性言語障礙患者談話有困難。痙攣性言語障礙引 起聲音中斷或具有繃緊的、受限的、受壓制的或費力的音質(zhì)。如本文 中揭露的，將神經(jīng)毒組分注射到喉部的患病肌肉通常改善聲音。
瞼痙攣是一種進行性疾病，其特征在于眼輪匝肌的自發(fā)的、雙向
的、間歇的或持續(xù)的無意識收縮(Grandas F、 Elston J、 Quinn N、 Marsden CD. Blepharospasm: A review of 264 patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1988; 51(6): 767-772. (ID 1759120); Jankovic J、 Orman J. Blepharospasm: Demographic and clinical survey of 250 patients. Ann Ophthalmol 1984; 16 (4): 371-376. (ID 1761786); Mauriello JA、 Leone T、 Dhillon S、 Pakeman B、 Mostafavi R、 Yepez MC. Treatment choices of 119 patients with hemifacial spasm over 11 years. Clin Neurol Neurosurg 1996; 98(3): 213-216 (ID 1777068))。根據(jù)本發(fā)明的方法，將肉毒毒素作為局部注
癥治療。
在另一個優(yōu)選實施方案中，用肉毒毒素A型預處理表現(xiàn)出效力持 續(xù)時間短的良性原發(fā)性險痙享患者通過以縮短的注射間隔給予所述肉 毒素神經(jīng)毒素，用不含絡合蛋白的肉毒素神經(jīng)毒素治療，即，以小于 三個月的間隔給予。優(yōu)選地，不含絡合蛋白的肉毒素神經(jīng)毒素是高度
29純化的肉毒素神經(jīng)毒素A型。在患者報告處理效果降低時給予新的肉 毒素神經(jīng)毒素注射劑由于所述治療方案，所述患者可以實現(xiàn)如上所述 的穩(wěn)定的生活質(zhì)量，優(yōu)選如以上論述所確定的。
在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，所述肌肉選自同側(cè)夾肌、對側(cè)胸 鎖乳突肌、同側(cè)胸鎖乳突肌、頭夾肌、斜角肌復合體、肩胛提肌、 postvertebralis、同側(cè)斜方肌、肩肝提肌、兩側(cè)的頭夾肌、上側(cè)斜方 肌、deep postvertebralis、兩側(cè)胸鎖乳突肌、斜角肌復合體、頦下 復合體、肱橈肌、肱二頭肌、旋前方肌、旋前圓肌、屈腕肌、尺側(cè)腔 屈肌、拇長屈肌、拇收肌、拇短屈肌/對向肌、指淺屈肌、指深屈肌。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述疾病或病況是包括肌肉的痙攣 狀態(tài)。
在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，痙攣狀態(tài)是涉及(a)中風后痙攣狀 態(tài)、由腦性麻瘠引起的痙攣狀態(tài)；或(b) (1)與(a)包括涉及多發(fā)性硬化、 橫貫性脊髓炎、Devic綜合癥有關的自身免疫處理，(b)病毒感染，(c) 細菌感染，(d)寄生蟲感染或(e)真菌感染有關的腦炎和脊髓炎的痙享 狀態(tài)，(2)遺傳性痙攣下肢輕癱，(3)半球梗死形成、腦干梗死形成或 脊髓梗死形成所致的卒中后綜合癥，(4)涉及例如半球損害、腦干損害、 脊髓損害的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，(5)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血，例如腦內(nèi)出血、 妹網(wǎng)膜下出血、硬腦膜下出血、或脊柱內(nèi)出血，或(6)瘤形成，例如半 球腫瘤、腦干腫瘤、或脊髓腫瘤。其它治療可以是治療膀胱、痙車性 膀胱、失禁、痙攣性括約肌、由腦性麻痹引起的痙車狀態(tài)、或前列腺 肥大。
術語"中風后痙攣狀態(tài)"是指在中風發(fā)病之后發(fā)生的痙車狀態(tài)。 中風是長期殘疾的主要原因，在19%(2)到38%的患者中發(fā)生痙攣狀態(tài) (Watkins CL、 LeathleyMJ、 Gregson JM、 Moore AP、 Smith TL、 Sha函AK. , Prevalence of spasticity post stroke. CI in Rehabi1 2002; 16 (5): 515-522. (ID 1915001))。痙享狀態(tài)定義為特征在于由伸張反 射的超興奮性引起的作為上運動神經(jīng)原綜合癥(4)的一個組成部分的 具有夸大的肌腱痙攣的張力性伸張反射的速度依賴性增加(肌緊張性) 的運動異常。在一些患者中，痙攣狀態(tài)可能是有利的，如在臀部和膝 伸肌痙攣狀態(tài)的情況中，其可以允許負重，患肢如夾板一樣起作用。 然而，在大多數(shù)患者中，痙攣狀態(tài)引起日常生活的活動困難，例如穿 衣和清潔握拳的手掌(6)。根據(jù)本發(fā)明的揭示，與相應肌群的痙攣狀態(tài) 有關的殘疾的常見的臨床表現(xiàn)可以用神經(jīng)毒組分治療。
術語"膀胱"是指膀胱的病癥，經(jīng)常但不一定是由于脊髓損害或 多發(fā)性硬化或創(chuàng)傷引起的，導致尿失禁和排尿受損。優(yōu)選地，神經(jīng)毒 素給藥的目標肌肉是橫紋尿道括約肌，如在別處描述的(Schurch B. The role of botulinum toxin in neurourology. Drugs Today 2004; 40(3): 205-212. (ID 3097145); Schurch B、 De S6ze M、 Denys P、 Chartier-Kastler E、 Haab F、 Everaert K等人Botulinum toxin type a is a safe and effective treatment for neurogenic urinary incontinence: results of a single treatment, randomized, placebo controlled 6-month study.J Urol 2005; 174(1): 196-200. (ID 3528462))。
術語"失禁，，表示尿失禁，是指不能控制尿從膀胱流出。有各種 種類和程度的失禁，其都在本發(fā)明范圍內(nèi)溢流性失禁是指如下的狀 態(tài)，其中在排尿后膀胱保留尿液，使得膀胱大部分時間保持充滿，導
致無意識的尿從膀胱漏出；壓力性尿失禁是指在膀胱壓力增加時的無 意識排尿，如在咳嗽或舉起重物時的張力情況下；完全性失禁是指不 能有意識控制膀胱頸和尿道的括約肌，導致保留能力完全喪失。在治 療失禁時，可以借助膀胱鏡檢查將本文中提及的組合物通過例如注射 至i逼尿肌中，把三角區(qū)湘卜除在夕卜(Schurch B. The role of botulinumtoxin in neurourology. Drugs Today 2004; 40(3): 205-212. (ID 3097145); Schurch B、 De Seze M、 Denys P、 Chartier-Kastler E、 Haab F、 Everaert K等人，Botulinum toxin type a is a safe and effective treatment for neurogenic urinary incontinence: results of a single treatment, randomized, placebo controlled 6-month study. J Urol 2005; 174(1): 196-200. (ID 3528462))。
術語"前列腺肥大，，是指其中前列腺的正常成分大小和數(shù)量增加 的前列腺增大。它們的增大的體積可以壓縮通過前列腺中心的尿道， 阻止尿通過尿道從膀胱流出。這可以導致尿潴留，并且需要頻繁的排 尿。如果前列腺肥大是嚴重的，則可能發(fā)生完全阻塞。在將本文中所 述的組合物注射到前列腺中之后，觀察到癥狀顯著減輕、前列腺的血 清指示物明顯減少、前列腺體積顯著減小、排尿后的殘余尿體積減少、 和尿流速顯著增大。類似的結果已經(jīng)在別處有所描述(Maria G、 BrisindaG、 Civello IM、 Bentivoglio AR、 Sganga G、 AlbaneseA.， Relief by botulinum toxin of voiding dysfunction due to benign prostatic hyperplasia: results of a randomized, placebo-controlled study. Urology 2003; 62(2): 259-265. (ID 2562820))。
"腦性麻瘠"描述了寬的范圍，包括引起局部麻疾的錐體功能異 常；引起張力障礙、僵硬、痙攣狀態(tài)和痙攣的錐體外系功能異常；運 用不能因素和協(xié)調(diào)功能異常。腦性麻痹(KomanLA、 Mooney JF、 Smith BP、 Goodman A、 MulvaneyT. ， Management of spasticity in cerebral palsy with botulinum-A toxin: report of a preliminary, randomized, double-blind trial. J Pediatr Orthop 1994; 14(3): 299-303. (ID 1767458) ; Pidcock FS. The emerging role of therapeutic botulinum toxin in the treatment of cerebral palsy. J Pediatr 2004; 145(2 Suppl): S33-S35. (ID 2994781))可以發(fā)生在腦出血、昏厥、早產(chǎn)和其它圍產(chǎn)期并發(fā)癥之后。它是引起不協(xié)調(diào)運 動、局部麻痹和各種形式肌肉活動過強的終生病況。在根據(jù)本文中披 露的方法治療時，腦性麻痹患者經(jīng)驗活動過度的肌肉的功能性改善。
在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，痙孿性肌肉是平滑肌或橫紋肌。 治療肌肉活動過強病癥時神經(jīng)毒組分的目標組織可以原則上包括如
Sobotta、 Johannes: At las der Anatomie des Menschen. 22. Auflage. Band 1 und 2. Urban & Fischer, 2005中所述的人體的所有橫紋肌 和平滑肌，所述參考文獻中提及的肌肉都被并入本文作為參考。本發(fā) 明的方法可以以任何這些肌肉作為目標。
法，所述方法包括對個體給予包括有效量的肉毒桿菌毒素復合體的神 經(jīng)毒組分的組合物，所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合體的任何其它 蛋白質(zhì)組分，其中(a)所述個體是人；(b)所述組合物通過皮下或肌肉 注射到涉及形成皮膚皺紋或不對稱的一種或多種面部肌肉或肌肉群中 或其附近給予；和(c)組合物以小于三個月的間隔給予，所述間隔包括 第一治療和第二治療，其中在第二治療中給予的量可以低于、高于或 等于第一治療中給予的量。
本發(fā)明的方法允許治療面部肌肉或患者皮膚的皺紋或面部的不對 稱性。典型地，在這種美容性治療中使用較小的神經(jīng)毒組分量。這種 量優(yōu)選為1到5、 5到10、 10到20、或20到50單位。這種總量可以 在同一天給予或者在治療的隨后的一天給予。例如，在第一治療時期 過程中，可以給予劑量的第一部分。這個第一部分優(yōu)選是次最佳的部 分，即，其不能完全去除皺紋或皮膚皺紋。在一個或多個治療時期過 程中，可以給予總劑量的剩余部分。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將組合物注射到蹙眉的皺紋、水平的前額皺紋、雞爪紋、口周褶皺、頦裂(mental ceases)、雙下巴(popply chin)、和/或頸闊肌帶中。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述肌肉選自頭夾肌、胸 鎖乳突肌、斜角肌復合體、肩胛提肌、半棘肌、頭最長肌、頸最長肌、 多裂肌、頭下斜肌、頭上斜肌、頭后大直肌、頭后小直肌、斜方肌/ 水平部分、斜方肌/頸部、舌骨上肌肉、舌骨下肌肉、二腹肌、內(nèi)側(cè)翼 肌、外側(cè)翼肌、咬肌、顳肌、目艮輪匝肌、鼻肌、降眉間肌、皺眉肌、 口角降肌、降下唇肌、額肌、提上唇肌、提上唇鼻翼肌、口輪匝肌、 笑肌、顴小肌、顴大肌、三角肌、肱三頭肌、肱橈肌、肱二頭肌、旋 前方肌、旋前圓肌、屈腕肌、尺側(cè)腔屈肌、拇長屈肌、對向肌、骨間 肌、封1狀肌、拇收肌、拇短屈肌、指淺屈肌、指深屈肌、內(nèi)收肌群、 股四頭肌、腦繩肌腱、小腿三頭肌、脛骨后肌、拇長屈肌、脛骨前肌、 拇長伸肌、趾長伸肌、拇短屈肌、趾短屈肌、推旁肌。
上述提及的神經(jīng)毒組分可以是組合物或藥物組合物的一部分。這 種藥物組合物可以包含另外的藥學活性組分。"藥物組合物，，是其中 包含或含有用作藥物或診斷劑的活性成分的制劑。這種藥物組合物可 適合于診斷用或治療用對人類患者給藥(即，通過肌肉或皮下注射)。 藥物組合物可以為凍干或真空干燥的、重構的、或在溶液中。在重構 時，優(yōu)選通過加入無菌的生理鹽水(O. 9% NaCl)制備重構的溶液。
這種組合物可以包含另外的組分，例如pH緩沖劑、賦形劑、稀釋 劑、防凍劑、和/或穩(wěn)定劑。
"pH緩沖劑"是指能夠?qū)⒔M合物、溶液等的pH值調(diào)節(jié)到某一數(shù)值 或某一 pH范圍的化學物質(zhì)。
"穩(wěn)定"、"使穩(wěn)定"或"穩(wěn)定化"是指活性成分，即，重構的或水溶液的藥物組合物中的神經(jīng)毒組分，相對于所述生物學活性的神
經(jīng)毒組分被并入藥物組合物中之前的毒性，具有大于約20%、 30%、 40%、 50°/。、 60%、 70%、 80°/。、 90%、和最多約100%的毒性。制備物的活性可 以如本文其它地方所述內(nèi)容測定。
"防凍劑"是指一種賦形劑，其使得活性成分，即，重構的或水 溶液的藥物組合物中的神經(jīng)毒組分，相對于在藥物組合物中被冷凍干 燥之前生物學活性神經(jīng)毒組分的毒性，具有大于約20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、和最多約100°/。的毒性。制備物的活性可 以如本文其它地方所述內(nèi)容測定。
這些穩(wěn)定劑的實例是明膠或白蛋白，優(yōu)選是人源的或得自重組來 源。穩(wěn)定劑可以通過化學方法或通過重組基因工程進行修飾。在本發(fā) 明的優(yōu)選實施方案中，考慮了在冷凍干燥過程中使用醇類例如，肌醇、 甘露醇作為防凍賦形劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定劑可以是非蛋白的穩(wěn)定劑， 包括透明質(zhì)酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二或其兩個或多種的混合物。 這種組合物被認為是具有顯著穩(wěn)定性的更安全的組合物。
在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，藥物組合物可以包含神經(jīng)毒組分 和透明質(zhì)酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，這種組合物任選地用適合 的pH緩沖劑進行pH穩(wěn)定化，特別是使用乙酸鈉緩沖劑，和/或使用防 凍劑多元醇穩(wěn)定化。
除了神經(jīng)毒素組分之外，藥物組合物無論是否包括另外的組分例 如白蛋白、透明質(zhì)酸、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇穩(wěn)定劑，所述藥 物組合物在約+8C到約-2()C的溫度存儲時在六個月、 一年、兩年、三
年和/或四年的時間保持其效力實質(zhì)上無變化。另外，所示的藥物組合物在重構時可具有約20%到約100%的效力或回收率。
本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物可以包括神經(jīng)毒組分和一種或多種另 外的組分。優(yōu)選地，在重構或注射時，本文中披露的藥物組合物具有 約4到7. 5的pH，更優(yōu)選約pH 6. 8到pH 7. 6，最優(yōu)選pH 7. 4到7. 6。 通常，本發(fā)明的藥物組合物包括約6pg到30 ng的量的神經(jīng)毒組分。 優(yōu)選地，神經(jīng)毒組分的生物活性在小鼠LD50試驗中決定為50到250 LDs。單位每ng神經(jīng)毒組分。更優(yōu)選地，神經(jīng)毒組分的生物活性為約150 LD5。。
本發(fā)明的藥物組合物可以包含神經(jīng)毒素和透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸使 神經(jīng)毒素穩(wěn)定化。本文中披露的藥物組合物在重構或在注射時可具有 約4到7. 5的pH。本發(fā)明藥物組合物中的透明質(zhì)酸優(yōu)選以0. 1到10mg 的量與本發(fā)明的神經(jīng)毒組分組合，優(yōu)選在200 U/ml肉毒毒素溶液中為 每ml含1 mg的透明質(zhì)酸。更優(yōu)選地，所述溶液還包含1-100 mM,特 別是10 mM的乙酸鈉緩沖液。
在另一個優(yōu)選實施方案中，組合物可以包含多元醇作為防凍劑。 可以使用的多元醇的實例包括例如，肌醇、甘露醇和其它非還原性醇。
特別地，優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物不含蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的那些實施 方案不含有時用作防凍劑的海藻糖或麥芽三糖或相關的糖或多羥基化 合物。
本發(fā)明藥物組合物中的聚乙烯吡咯烷酮優(yōu)選以10到500 mg的量 與本發(fā)明的神經(jīng)毒組分組合，優(yōu)選在200 U/ml肉毒毒素溶液中為每 ml含100 mg的聚乙烯吡咯烷酮。更優(yōu)選地，所述溶液還包含1-100mM， 特別是IO mM的乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明藥物組合物中的聚乙二醇優(yōu)選以10到500 mg的量與本發(fā) 明的神經(jīng)毒組分組合，優(yōu)選在200 U/ml肉毒毒素溶液中為每ml含100 mg的聚乙二醇。更優(yōu)選地，所述溶液還包含1-100 fflM，特別是10mM 的乙酸鈉緩沖液。
因而，本發(fā)明在更優(yōu)選的實施方案中包括配制為藥物組合物的神 經(jīng)毒組分，所述組合物包含透明質(zhì)酸穩(wěn)定劑或聚乙烯吡咯烷酮穩(wěn)定劑 或聚乙二醇穩(wěn)定劑。另外，所述藥物組合物可以包含乙酸鈉緩沖系統(tǒng) 和/或醇類防凍劑。
以下實施例只是作為例證提供，而不是限制性的。
實施例l:用于治療頸部張力障礙的肉毒毒素療法
對患有頸部張力障礙的45歲男性患者進行肉毒毒素療法的評價。 在所有適當?shù)臋z查之后，建立注射方案，并且給予總劑量為300MU的 不含絡合蛋白質(zhì)的肉毒毒素。在2周后的再評價中，癥狀學得到改善， 但是需要包括另外的目標肌肉和增加最初注射的目標肌肉中的肉毒毒 素劑量。二周以后，再一次對患者進行再評價，治療結果是最佳的。
沒有發(fā)生副作用。到目前為止，在7個隨后的注射輪次中，治療 結果得到維持，而沒有任何抗體誘導的療法失敗的跡象。
實施例2 :用于治療瞼痙攣的肉毒毒素療法短的作用持續(xù)時間。
對患有瞼痙攣的61歲女性患者用總劑量為4脂U的本發(fā)明的包含 神經(jīng)毒組分的、不含絡合蛋白質(zhì)的藥物治療，得到極好的結果。在注 射神經(jīng)毒組分4周之后，效果開始減弱。又過兩周之后，治療的效果幾乎完全中斷。在最初注射輪次之后的7周進行再次注射。以最初的 劑量重復用神經(jīng)毒組分的療法，并且得到相同的效果。6個隨后的注 射輪次中繼續(xù)用神經(jīng)毒組分的治療，得到極好的治療結果并且沒有任 何由抗體誘導的治療失敗的跡象。
實施例3:用于治療全身性痙享狀態(tài)的肉毒毒素療法 高劑量應用。
35歲男性患者患有低含氧量腦損傷，伴有全身性痙攣狀態(tài)。將不 含絡合蛋白質(zhì)的總劑量750MU的本發(fā)明的神經(jīng)毒組分分為250MU的三 個部分以l天間隔給予。在給予2周之后，狀況顯著改善。沒有發(fā)現(xiàn) 局部的或區(qū)域性的或系統(tǒng)性的副作用。在7個隨后的注射輪次中，治 療效果穩(wěn)定，并且沒有出現(xiàn)副作用。沒有由抗體誘導的治療失敗的跡 象。
實施例4:肉毒毒素的美容應用難以建立注射方案和短的作用持 續(xù)時間
將存在有肌肉性蹙眉皺紋和水平額側(cè)皺紋的40歲女性客戶用 2 OMU的不含絡合蛋白質(zhì)的肉毒毒素(即，本發(fā)明的神經(jīng)毒組分)治療。 2周以后，癥狀有所改善，但是需要注射另一個20MU的肉毒毒素。2 周以后，患者對結果完全滿意。4周以后，有利的效果開始減弱，使 得需要再注射總劑量40MU的肉毒毒素。到目前為止，客戶經(jīng)歷了每次 總劑量為40MU的4次隨后的注射輪次。沒有由抗體誘導的治療失敗的 跡象。
權利要求
1. 治療患者的由肌肉或外分泌腺的活動過度的膽堿能神經(jīng)支配引起的或與之相關的疾病或病況的方法，所述方法包括給予含有效量的肉毒桿菌毒素復合體的神經(jīng)毒組分的組合物，所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合體的任何其它蛋白質(zhì)組分，其中(a)所述患者是人，(b)所述組合物通過注射給予，和(c)所述組合物以小于三個月的間隔給予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其中在第二治療中給予的量可以低于、高于或等于第一治療中給予的量。
2. 權利要求l的方法，其中進行第二治療是為了改善第一治療的 治療效果。
3. 權利要求1或2的方法，其中(a) 所述患者是患有重癥運動障礙或嚴重痙攣狀態(tài)的患者；和(b) 給予的神經(jīng)毒組分的有效量為成人超過500 U，兒童超過15 U/kg體重。
4. 權利要求3的方法，其中所述量是用于成人的超過500 U的總 量和用于兒童的超過15 U/kg體重，并且其中所述量如下給予(a) 在第一治療時期過程中注射這個量的第一部分；和(b) 在一個或多個隨后的治療時期過程中注射剩余部分，其中隨后 的治療時期在第一治療時期之后的至少一天安排。
5. 權利要求1到4中任一項的方法，其中所述患者是人，其已經(jīng) 用肉毒桿菌毒素進行治療但是抱怨治療效果降低并且在治療之后3個 月期滿之前需要治療。
6. 權利要求l到5中任一項的方法，其中活動過度的腺體是自主 的外分泌腺，并且將組合物注射到所述腺體中或其附近。
7. 權利要求6的方法，其中(a) 所述腺體選自汗腺、淚腺、唾液腺、和粘液腺體；或(b) 所述腺體與選自以下的疾病或病況有關Frey綜合癥、鱷魚淚 綜合癥、腋部多汗、手掌多汗、腳底多汗、頭和頸多汗、身體多汗、 鼻溢液、或患有中風、帕金森病或肌萎縮性側(cè)索硬化的患者的相對唾 液分泌過多。
8. 治療患者的由肌肉的活動過度的膽堿能神經(jīng)支配引起的疾病 或病況的方法，所述方法包括給予含有效量的肉毒桿菌毒素復合體的 神經(jīng)毒組分的組合物，所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合體的任何其 它蛋白質(zhì)組分，其中(a) 所述患者是患有重癥運動障礙或嚴重痙攣狀態(tài)的人；(b) 所述組合物通過注射給予；和(c) 給予的神經(jīng)毒組分的有效量為成人超過500 U，兒童超過15 U/kg體重。
9. 權利要求8的方法，其中所述量是用于成人的超過500 U的總量和用于兒童的超過15 U/kg體重，并且其中所述量如下給予(a) 在第一治療時期過程中注射這個量的第一部分；和(b) 在一個或多個隨后的治療時期過程中注射剩余部分，其中隨后 的治療時期在第一治療時期之后的至少一天安排。
10. 權利要求8或9的方法，其中組合物以小于三個月的間隔給 予，所述間隔包括第一治療和第二治療，其中在第二治療中給予的量可 以低于、高于或等于第一治療中給予的量。
11. 權利要求1到10中任一項的方法，其中所述疾病或病況是涉 及肌肉的張力障礙。
12. 權利要求11的方法，其中，所述張力障礙(a)選自(l)顱側(cè)張力障礙，包括瞼痙攣、頜張開或頜關閉型的口-下頜張力障礙、夜間磨牙、Meige綜合癥、舌張力障礙、眼瞼張開的 運用不能，(2)頸部張力障礙，包括頸前傾、頸后傾、頸側(cè)傾、斜頸， (3)咽張力障礙，(4)喉張力障礙，包括內(nèi)收肌型或外展肌型的痙攣性 言語障礙、痙攣性呼吸困難，(5)肢張力障礙，包括臂張力障礙，例如 任務特異性張力障礙，包括書寫痙莩、音樂家型痙攣或高爾夫球手型痙 攣，腿張力障礙，包括大腿內(nèi)收、大腿外展、膝屈曲、膝伸展、踝屈 曲、踝伸展、或內(nèi)翻足畸形，腳張力障礙，包括紋狀趾、腳趾屈曲或 腳趾伸展，軸張力障礙，例如Pisa綜合癥或肚皮舞舞蹈演員型張力障 礙、節(jié)段性張力障礙、偏身性張力障礙或全身性張力障礙，(6) X-連 肌張力障礙，(7)皮質(zhì)基底節(jié)變性的張力障礙，(8)遲發(fā)型張力障礙， (9)脊髓小腦共濟失調(diào)的張力障礙，(IO)帕金森病的張力障礙，(11) 亨廷頓舞蹈病的張力障礙，(12) Hallervorden Spatz病的張力障礙， (13)多巴誘導的運動障礙/多巴誘導的張力障礙，(14)遲發(fā)性運動障礙 /遲發(fā)性張力障礙，(15)發(fā)作性運動障礙/張力障礙(誘發(fā)性的、非誘發(fā)型的、動作誘導的)；或(b)包括選自斜頸、頸側(cè)傾、頸后傾、頸前傾、屈肘、前臂前旋、 屈腕、拇指內(nèi)扣(thumb-in-palm)或握拳的臨床表現(xiàn)。
13. 權利要求11的方法，其中所述肌肉選自同側(cè)夾肌、對側(cè)胸鎖 乳突肌、同側(cè)胸鎖乳突肌、頭夾肌、斜角肌復合體、肩胛提肌、 postvertebralis、同側(cè)斜方肌、肩肝提肌、兩側(cè)的頭夾肌、上側(cè)斜方 肌、deep postvertebralis、兩側(cè)胸鎖乳突肌、斜角肌復合體、頦下 復合體、肱橈肌、肱二頭肌、旋前方肌、旋前圓肌、屈腕肌、尺側(cè)腔 屈肌、拇長屈肌、拇收肌、拇短屈肌/對向肌、指淺屈肌、指深屈肌。
14. 權利要求1到10中任一項的方法，其中所述疾病或病況是涉 及肌肉的痙攣狀態(tài)。
15. 權利要求14的方法，其中所述痙攣狀態(tài)是涉及(l)與(a)包括 涉及多發(fā)性硬化、橫貫性脊髓炎、Devic綜合癥有關的自身免疫過程， (b)病毒感染，(c)細菌感染，(d)寄生蟲感染或(e)真菌感染有關的腦 炎和脊髓炎的痙攣狀態(tài)，(2)遺傳性痙攣下肢輕癱，(3)半球梗死形成、 腦干梗死形成或脊髓梗死形成所致的卒中后綜合癥，(4)涉及例如半球 損害、腦干損害、脊髓損害的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，(5)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出 血，例如腦內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下出血、石更腦膜下出血、或脊柱內(nèi)出血， 或(6)瘤形成，例如半球腫瘤、腦干腫瘤、或脊髓肺瘤或(7)中風后痙 攣狀態(tài)，或(9)由腦性麻痹引起的痙攣狀態(tài)。
16. 權利要求14的方法，其中所述肌肉是平滑肌或橫紋肌。
17. 減少面部皺紋或皮膚皺紋或去除面部不對稱性的方法，所述 方法包括對個體給予含有效量的肉毒桿菌毒素復合體的神經(jīng)毒組分的 組合物，所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合體的任何其它蛋白質(zhì)組分， 其中(a) 所述個體是人；(b) 所述組合物通過皮下或肌肉注射給予到涉及形成所述皮膚皺 紋或不對稱的一種或多種面部肌肉或肌肉群中或其附近；和(c) 所述組合物以小于三個月的間隔給予，所述間隔包括第一治療 和第二治療，其中在第二治療中給予的量可以低于、高于或等于第一治 療中給予的量。
18. 權利要求17的方法，其中將所述組合物注射到蹙眉的皺紋、 水平的前額皺紋、雞爪紋、鼻口周褶皺、頦裂、雙下巴、和/或頸闊肌 帶中。
19. 權利要求17或18的方法，其中注射的肌肉選自皺眉肌、眼 輪叵肌、降眉間肌、枕額肌的額肌、眼輪匝肌的眶部、鼻肌、上唇口輪匝肌、下唇口角降肌、頦肌和頸闊??；那些是涉及形成上述皺 纟丈的肌肉。
20. 權利要求1到19中任一項的方法，其中所述神經(jīng)毒組分選自 A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型或其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給予包含肉毒桿菌毒素復合體的神經(jīng)毒組分的組合物治療疾病和病癥的方法，其中所述組合物不含肉毒桿菌毒素復合體的任何其它蛋白質(zhì)，并且其中所述組合物以短間隔和/或高劑量給予。
文檔編號A61K38/48GK101460190SQ200780020682
公開日2009年6月17日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權日2006年6月29日
發(fā)明者D·德萊斯勒, M·馬克思, R·貝納克, S·格拉弗 申請人:莫茨藥物股份兩合公司