專利名稱：：防止輻射傷害的方法與組成物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用精氨酸酶與其它精氨酸降解劑予以保護正常細胞免受輻射傷害，特別是減少治療腫瘤的放射治療期間或之后的癥狀。
背景技術(shù)：
：放射治療是使用高能量射線或粒子殺死癌細胞。放射治療的功效是因為放射治療的游離輻射破壞癌細胞的復(fù)制能力。病人可以只接受放射治療，或與其它治療癌癥的方式如化療與/或手術(shù)結(jié)合使用。放射治療破壞圍繞腫瘤的正常組織，進而引致許多不必要的副作用。這些副作用對治療食道癌，頭頸癌，肺癌和直腸癌的放射治療尤為深刻，因為大量伴隨腫瘤附近的組織也一并破壞。在許多情況下，放射治療的副作用都在開始療程后大約兩星期變得顯然易見，如當(dāng)黏膜炎(口腔或腸道黏膜發(fā)炎)，失去味覺，口干與皮膚出現(xiàn)反應(yīng)這些癥狀開始出現(xiàn)時。黏膜炎是其中主要一種令病人覺得放射治療難以忍受的副作用。病人通常因為不能吞咽和接受流體而體重會下降。在一些極端的例子中，病人可能需要插入胃造口喉去維持足夠的營養(yǎng)。吞咽肌肉痿縮和永久性吞咽問題也是后期后遺癥的危機。很多時候盡管癌癥已經(jīng)治愈，但因治療所引致的口干已經(jīng)成為永久殘疾。在放射治療直腸腫瘤中的副作用如腸道炎和直腸炎會引起可以是急性或慢性的腹瀉與出血。以上兩種皆極難治療。發(fā)明概述基于上述背景，本發(fā)明目的是為正常細胞提供在放射治療中的保護，從而減少放射治療對周邊正常組織的有害作用。輻射破壞正常組織的機制是將細胞的原子游離化。所述破壞更明確地是針對用來儲存遺傳物質(zhì)或DNA的細胞核。放射治療的游離輻射誘發(fā)DNA的損壞。若受輻射損壞的細胞需要進行一種功能，它必需要時間在進行特定功能前去修補本身。如所述修補不能完成，受輻射損壞的細胞可能死亡。細胞在DNA合成期(SPhase)開始合成DNA，期間染色體會被復(fù)制。輻射對DNA的破壞通常在SPhase時發(fā)生。受輻射損壞的細胞很容易在Gl間隙期與GO間隙期(G1與GOphase)時修補。在細胞周期中，Gl與GOphase有兩個檢査點。它們捍衛(wèi)基因穩(wěn)定性與確保DNA的穩(wěn)定性和功能上的整體性。如DNA在前一次分裂時受到損壞，這兩個檢査點更可防止細胞進入有絲分裂或有絲分裂期(MPhase),提供細胞機會去修補DNA與停止受損壞細胞的擴散。本發(fā)明的一個方面確認了在正常體內(nèi)，有狀況可以防止正常細胞于特定的時間長度內(nèi)分裂，這將會在這特定時期下保護這些細胞免被輻射損壞。本發(fā)明相應(yīng)的另一方面是一種保護正常細胞免被輻射損壞的方法，該方法最好是在任何可預(yù)見的正常細胞DNA損壞之前，例如放射治療之前，給予病人一段特定時間內(nèi)有效劑量的精氨酸降解劑。舉例說，所述特定時間可以是最少一日。其它例子可以是一至七日，一至五日與最優(yōu)選的一至三日。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用精氨酸酶在放射治療中保護正常細胞，其中在某一個優(yōu)選的實施方案中，放射治療是用于治療人類腫瘤。精氨酸降解劑可以是不同類型的精氨酸酶，如精氨酸酶，精氨酸脫亞氨酶，或任何其它可以給予人體用以耗盡精氨酸的生物或化學(xué)組成物。在另一優(yōu)選的實施方案中，精氨酸降解劑是人類重組精氨酸酶I。在另一優(yōu)選的實施方案中，人類重組精氨酸酶I是經(jīng)過修飾以增加其半衰期至最少一日。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述重組精氨酸酶I是經(jīng)過聚乙二醇化以增加其血清半衰期至最少一日。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述聚乙二醇化精氨酸酶其已增加的血清半衰期最少三日。其中一種制造所述人類重組精氨酸酶I的方法見于WO04/000349Al。本發(fā)明的再一方面涉及使用精氨酸酶制備在放射治療中保護正常細胞的藥物。在所述放射治療一優(yōu)選實施方案中是治療人類腫瘤。5本發(fā)明的又一方面涉及使用精氨酸酶以防止如骯臟彈的輻射污染的DNA損害作用。附圖簡述圖1表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5,000處理三日的Hep3B細胞的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5，000的濃度是O至U0.5IU/ml。圖2表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5，000處理三日的Hep3B細胞的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的濃度是1到50IU/ml。圖3表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5，000處理三日的Hep3B細胞的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5，000的濃度是100IU/ml。圖4表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5，000處理三日的Alexander細胞系(PLC/PRF/5)的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的濃度是0至l」0.5IU/ml。圖1表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5,000處理三日的PLC/PRF/5細胞的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的濃度是1至!J50IU/ml。圖1表示經(jīng)精氨酸酶-SPA-PEG5,000處理三日的PLC/PRF/5細胞的細胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5，000的濃度是100IU/ml。圖7表示經(jīng)聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I與/或5-氟尿嘧啶處理的人類包皮成纖維細胞(HFF-1)的細胞周期分布。發(fā)明說明本文所用術(shù)語"包含"是指包括下述的元素但并不排除其它元素。本文所述的骯臟彈是指一輻射分散裝置或輻射污染，例如一個能夠遺留大量放射性污染的炸彈，原子彈，或上述兩者結(jié)合而起。本文所用術(shù)語"降解"是指消除精氨酸到一可觸發(fā)正常細胞停止細胞周期的程度，所述程度能夠由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員決定。每次給予放射治療之同時，必須考慮平衡破壞癌細胞與不影響正常細胞。在對正常細胞的放射治療中，通常會因游離輻射損害而引起后期的皮膚損傷，致癌風(fēng)險，致白血病風(fēng)險，與基因損害。輻射損害程度與細胞分裂程度相關(guān)。例如，活躍地分裂的骨髓細胞，黏膜細胞和毛囊細胞將會承受更大的損害。組織的總體損害亦與因接受游離輻射而在細胞內(nèi)積聚離子的時間成比例。放射治療的常見副作用是倦怠和萎靡不振。副作用亦可以是視乎在那里施行輻射而引致特定地方不同程度的損害，如皮膚，軟組織，肌肉，神經(jīng)，分泌腺和腸胃道。細胞周期對治療癌癥非常重要，因為輻射對活躍地分裂中的細胞尤其有效，而對正處于休息期(GOphase)的細胞效用最小。本發(fā)明教導(dǎo)如何以耗盡精氨酸來保護輻射暴露中或以后的正常細胞。本發(fā)明的發(fā)明人曾于WO2004/000349Al中明確并詳細披露如何使用精氨酸酶降解精氨酸。發(fā)明人確應(yīng)到精氨酸酶可以降解精氨酸，由此引起細胞內(nèi)積聚不帶電荷的arg-tRNA，從而例如透過關(guān)閉細胞內(nèi)對渥曼青霉素和/或雷帕霉素敏感的信號序列再阻止蛋白合成。在一例子中，給予接受頭頸癌包括鼻咽癌放射治療的病人有效劑量的精氨酸酶，病人鼻咽和口腔的正常細胞因輻射的損害大幅地減少。下述的案例顯示聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I對正常細胞系與腫瘤細胞系的不同效用。所有引用的參考已在此加入。案例1:經(jīng)過一天及三天培養(yǎng)后聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I對正常人類包皮成纖維細胞HFF-1的效能在加入聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I之前，以低細胞密度的5x104cells/wdl于6-wdl培養(yǎng)板播種正常人類包皮成纖維細胞系(HFF-1)并培養(yǎng)一天。所述培養(yǎng)板再加入濃度分別是0.1,0.5,1,5，10，and50U/ml的聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I再培養(yǎng)。混合治療組加入10U/ml聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I與10嗎/ml5-氟尿嘧啶(5-FU)，而對照組則加入10jig/ml5-FU。然后在攝氏37度，5%二氧化碳/95%空氣的培養(yǎng)機中培養(yǎng)細胞一日與三曰。與相關(guān)療法培養(yǎng)后的細胞應(yīng)在黑暗環(huán)境攝氏零下二十度用胰蛋白分解并以70%乙醇固定至少三十分鐘。已固定的細胞用PBS清洗兩次并在攝氏37度以碘化丙啶(PI)染液(10pl2mg/mlPI和50^110mg/mlRNaseA溶于400WPBS)染色之少三十分鐘。用流式細胞光度儀(使用BDFACSDiva流式細胞光度儀與ModFit軟件)分析每個細胞的細胞周期。結(jié)果顯示于表l，表2與圖7。經(jīng)過濃度是1U/ml的聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I一天培養(yǎng)后的HFF-1細胞，當(dāng)與沒有經(jīng)上述精氨酸酶處理過的細胞相對照時可以見到許多HFF-1細胞在精氨酸耗盡后停止在GO/Glphase。當(dāng)DNA受到損害后，正常體細胞會在GO/Glphase開始細胞修復(fù)機制。因此，這些數(shù)據(jù)顯示出如果正常細胞曾經(jīng)受過聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I的治療后，輻射對DNA的損害能夠減少。表1經(jīng)一天培養(yǎng)后聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I對HFF-1正常細胞的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2經(jīng)三天培養(yǎng)后聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I對HFF-1正常細胞的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>案例2:精氨酸酶在肝癌放射治療中對正常細胞的保護效能用作體外測試的細胞系是Hep3B。以濃度分別為0，0.05，0,1，0.5，1，5，10，50,與100IU/ml的精氨酸酶-SPA-PEG-5，000培養(yǎng)Hep3B細胞系三日。圖1顯示精氨酸酶-SPA-PEG-5,000的結(jié)構(gòu)。圖2-4顯示經(jīng)培養(yǎng)后Hep3B的細胞分布。表3顯示測試結(jié)果(表3以流式細胞光度法的數(shù)據(jù)顯示精氨酸剝奪對肝細胞癌(HCC)細胞系Hep3B的細胞周期分布的影響)。數(shù)據(jù)顯示，癌細胞如Hep3B在適當(dāng)?shù)木彼崦笣舛认聦彼釀儕Z有敏感反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3流式細胞光度法結(jié)果擇要。在較高濃度的聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I之下，盡管細胞液內(nèi)的精氨酸濃度低，有更多Hep3B細胞進入G2phase/Mphase。案例3:精氨酸酶在肝癌放射治療中對正常細胞的保護效能(使用癌細胞系A(chǔ)lexander細胞系(PLC/PRF/5))以濃度分別為O，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，與100IU/ml的精氨酸酶-SPA-PEG-5，000培養(yǎng)PLC/PRP/5細胞系三日。物料及方法與案例1雷同。圖5-7顯示培養(yǎng)后PLC/PRF/5細胞的細胞分布。表4顯示測試結(jié)果。如此，結(jié)果顯示在較高濃度的聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I下，更多PLC/PRF/5細胞進入SPhase,但不能進入G2/MPhase。在濃度高于50IU/ml時，部份PLC/PRF/5細胞死于編程性細胞死亡。精氨酸酶-SPA-PEG-5，000(IU/ml)Sub-Gl(%)GO/Gl(%)S(%)G2/M(%)00.1271.7415.5112.750.053.4960.4815,0917.860.14.3360.9222.7416.320.56.3859.7029.2211.0816.0657.9523.2116.2058.4759.6120.3720.071010.3758.4220.9115.785019.5355.4624.1914,1710027.8151.5336.136.15表4流式細胞光度法結(jié)果擇要。在較高濃度的聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I下，更多PLC/PRF/5細胞進入SPhase,但不能進入G2/MPhase。在濃度高于50IU/ml時，部份PLC/PRF/5細胞死于編程性細胞死亡。比較案例1，2和3，與聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I有關(guān)的HCC細胞死亡是取決于細胞系。Hep3B細胞于低濃度聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I下在GO/GlPhase停止細胞周期，而于較高濃度下在G2/MPhase停止細胞周期。然而在PLC/PRF/5細胞中，聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I主要引致細胞在SPhase停止細胞周期，而在高濃度下令細胞進入編程性細胞死亡。Glphase期間細胞制造蛋白準備細胞分裂。SPhase正常維持18至30小時。GOphase是休息期，細胞還未開始分裂，惟有當(dāng)細胞收到復(fù)制信息后才進入GlPhase。曾有顯示指出，大部分腫瘤細胞如Hep3B細胞與PLC/PRF/5細胞擁有有缺憾的"R"檢查點，并且不理會細胞在低濃度或沒有精氨酸的情況下而進入細胞周期。因此腫瘤細胞對輻射損害更受影響。如案例1所示，正常體細胞在GlPhase停止細胞分裂。由此可見，正常體細胞經(jīng)聚乙二醇化重組人類精氨酸酶I處理過后不會在沒有或低濃度的精氨酸環(huán)境下活躍地分裂，從而如因輻射而起的DNA損害能減至最少。再進一步來說，耗盡癌細胞的精氨酸對癌細胞的影響是劑量取向多于僅此耗盡氨基酸而已。這有可能是癌細胞的精氨酸耗盡后繼而引發(fā)癌細胞進入一種有缺憾的細胞周期路徑。如此向接受放射治療前和/或接受放射治療中的病人給予消耗精氨酸的酶或不單只保護病人免受輻射損害，更可能在消滅癌細胞中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。本文到此已完全地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例。盡管此描述所指是部份實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍然清楚地知道能以變更當(dāng)中特定的細節(jié)來實現(xiàn)本發(fā)明。由此，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)只解釋為在本文前述實施例所限定的范圍中。例如，本發(fā)明可以保護例如專為損害DNA與細胞而設(shè)計的骯臟彈的輻射污染。權(quán)利要求1.一種保護正常細胞免受DNA損害的方法，所述方法是給予病人一段特定時間的有效劑量的精氨酸降解劑。2.如權(quán)利要求l所述的方法，所述DNA損害是放射治療引起。3.如權(quán)利要求2所述的方法，所述放射治療是用以治療人類腫瘤。4.如權(quán)利要求l所述的方法，所述DNA損害是因骯臟彈或其它環(huán)境上的電離輻射引起。5.如權(quán)利要求l所述的方法，所述精氨酸降解劑是人類精氨酸酶I，人類精氨酸酶II或精氨酸脫亞氨酶。6.如權(quán)利要求1所述的方法,所述給予所述精氨酸降解劑是在放射治療之前與/或放射治療當(dāng)中。7.—種保護正常細胞在放射治療中免受DNA損害的方法，其包含以下連續(xù)的或同時進行的步驟a)給予一精氨酸降解劑;及b)給予所述放射治療。8.—種治療人類腫瘤的方法，其包含步驟a)給予一段特定時間一有效劑量的精氨酸降解劑；及b)給予放射治療以治療腫瘤。9.任何一種如權(quán)利要求l，7或8的方法，所述精氨酸降解劑是有血清半衰期最少三日的重組人類精氨酸酶I或II。10.使用精氨酸酶制造保護正常細胞免受DNA損害的藥品。11.如權(quán)利要求10的使用，所述DNA損害是放射治療引起。12.如權(quán)利要求11的使用，所述放射治療是用以治療人類腫瘤。13.如權(quán)利要求10的使用，所述DNA損害是因骯臟彈或其它環(huán)境上的電離輻射引起。14.使用精氨酸酶制造與放射治療結(jié)合用以治療腫瘤的藥品。15.如權(quán)利要求10與14的使用，所述精氨酸酶是有血清半衰期最少三曰的重組人類精氨酸酶i或n。全文摘要本發(fā)明描述的方法是使用一精氨酸降解劑如精氨酸酶及相關(guān)衍生物，其能夠降低生理上精氨酸的濃度，作為輻射保護劑去保護正常哺乳類動物細胞免受因電離輻射而起的DNA損害。經(jīng)過本發(fā)明處理后，接受放射治療的癌病人的正常組織能得到保護，本發(fā)明亦保護免受暴露于輻射散發(fā)性裝置或職業(yè)上與環(huán)境上的電離輻射所帶來的有害效果。文檔編號A61K38/43GK101478982SQ200780009558公開日2009年7月8日申請日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日發(fā)明者鄭寧民申請人:康達醫(yī)藥科技有限公司