專(zhuān)利名稱：尋常魚(yú)鱗病、特異反應(yīng)性和其他病癥的預(yù)防/治療的制作方法
尋常魚(yú)鱗病、特異反應(yīng)性和其他病癥的預(yù)防/治療發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及尋常魚(yú)鱗病(IV)、特異反應(yīng)性和潛在地其他與聚絲蛋白基 因序列中功能失去突變相關(guān)的病癥的預(yù)防/治療。該預(yù)防/治療基于試劑的 使用，所述試劑能使宿主的翻譯系統(tǒng)連讀聚絲蛋白基因的突變等位基因中 存在的無(wú)義突變。發(fā)明背景尋常魚(yú)鱗病(IV; OMIM# 146700)是人類(lèi)最普遍的角質(zhì)化遺傳病癥和最 常見(jiàn)的單基因病癥之一。最廣泛提及的發(fā)生率數(shù)字是1/250，該數(shù)字基于 對(duì)6051名健康的英國(guó)學(xué)童的調(diào)查'。IV與特異反應(yīng)性體質(zhì)的關(guān)系得到了 充分確定；37-50。/?；加蠭V的人具有特異反應(yīng)性體質(zhì)，具體地特異反應(yīng)性 皮炎(濕疹)''15，且相反之，大約8%特異反應(yīng)性皮炎患者具有典型的IV 特征L 16。IV的表型特征包括掌超線性，毛發(fā)角化病和最明顯見(jiàn)于下腹部、手臂 和腿部的細(xì)小鱗屑2。聚絲蛋白(絲聚集蛋白)在角質(zhì)層形成中十分重要 "。濾泡內(nèi)表皮顆粒層中的透明角蛋白顆粒主要由400 kDa蛋白聚絲蛋白 原(profilaggrin)組成。在獨(dú)特的短N(yùn)末端結(jié)構(gòu)域之后，大部分聚絲蛋白原 分子由324個(gè)氨基酸聚絲蛋白序列的10-12個(gè)重復(fù)序列組成6。隨著顆粒 細(xì)胞的末端分化，聚絲蛋白原通過(guò)蛋白水解裂解為 37kDa聚絲蛋白肽和 含有S100樣轉(zhuǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N末端結(jié)構(gòu)域。聚絲蛋白迅速聚集為角蛋白 細(xì)胞骨架，從而顆粒細(xì)胞瓦解為扁平的無(wú)核鱗片。該濃縮的細(xì)胞骨架在角 質(zhì)化細(xì)胞包膜(CCE)形成過(guò)程中通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶而交聯(lián)。CCE是皮膚最 外面的屏障層，其不僅防止水分流失，而且還阻止過(guò)敏原和傳染性病原體 的進(jìn)入7。因此，聚絲蛋白是促進(jìn)表皮分化和維持屏障功能的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。免疫印跡研究顯示聚絲蛋白在IV患者的皮膚和/或角質(zhì)形成細(xì)胞中缺 乏或明顯減少8—，另外，在一些患有IV的個(gè)體中證明了減少的聚絲蛋白 mRNA11。隱性小鼠突變體，絮片狀尾部具有人類(lèi)IV的組織學(xué)和超 結(jié)構(gòu)標(biāo)記12，并且獲得了與鼠科聚絲蛋白基因座(F丄C^的強(qiáng)烈遺傳連鎖17' 18。盡管生化分析顯示了力，純合體中的缺陷性聚絲蛋白原操作，但是迄 今尚未鑒定在F丄G基因中的任何基因組突變。本發(fā)明人揭示了編碼聚絲蛋白的基因中的某些功能失去突變，而且隨 繼的聚絲蛋白減少/損失與IV和其他病癥如特異反應(yīng)性皮炎(濕疹)、哮喘、 銀屑病和/或變態(tài)反應(yīng)的發(fā)展相關(guān)。該工作是多篇處于印刷中的論文(Smith F. J. D.等，2006; Palmer C. N, A.等，2006)和共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)GB0525492.5的主題。除通過(guò)基因治療應(yīng)用的潛在治療外，如果利用為克 服至少一些鑒定的聚絲蛋白突變而設(shè)計(jì)的小分子藥物能治療IV，則將是理想的。因此，本發(fā)明的目的包括提供用于預(yù)防和/或治療IV和其他相關(guān)病癥 的手段。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于本發(fā)明人關(guān)于某些試劑容許連讀聚絲蛋白基因中功 能失去突變的能力的工作。本發(fā)明的第一個(gè)方面提供能夠連讀聚絲蛋白基因中功能失去突變的 試劑用于制備用于治療IV和/或相關(guān)疾病藥物的用途。在另一方面，提供了治療IV和/或其他相關(guān)疾病的方法，該方法包括 向受試者施用能夠連讀聚絲蛋白基因中功能失去突變的試劑。應(yīng)該意識(shí)到本發(fā)明能夠治療IV和/或治療易發(fā)展IV的動(dòng)物受試者，尤 其是人類(lèi)受試者。另外，由于嚴(yán)重或輕微形式的IV和其他疾病的聯(lián)系， 該治療可以用于可能易患有或患有特異反應(yīng)性皮炎(濕疹)、哮喘、銀屑 病或變態(tài)反應(yīng)，如接觸型變態(tài)反應(yīng)和食物變態(tài)反應(yīng)(例如，花生變態(tài)反應(yīng)) 的受試者。關(guān)于皮膚病癥，低水平的聚絲蛋白表達(dá)能夠?qū)е螺p微和/或亞臨 床疾病的發(fā)展。這樣，本發(fā)明還可以涉及預(yù)防和/或治療所述輕微和/或亞 臨床形式疾病。的確，許多皮膚病癥是未確診的，且這樣的治療被更多地 認(rèn)為是美容治療。因此，本發(fā)明還延伸到任何這樣的美容治療中。
能夠被克服的功能失去突變通常是無(wú)義突變。這樣的突變典型地是單堿基修飾，所述單堿基修飾導(dǎo)致過(guò)早終止密碼子的產(chǎn)生(即，TGA， TAG 或TAA)。盡管本發(fā)明人已經(jīng)在聚絲蛋白基因中鑒定了大量導(dǎo)致功能失去 的突變，但是一種突變特別導(dǎo)致符合讀框地生成過(guò)早終止密碼子。該突變 是在F丄G基因的位置1501處的1個(gè)堿基取代。該突變是1501OT (從起 始ATG開(kāi)始編號(hào))，其導(dǎo)致胞苷被胸苷取代，且相應(yīng)的在位置501處精氨 酸變?yōu)榻K止密碼子(R501X)的氨基酸改變。由于該突變發(fā)生在第一個(gè)聚 絲蛋白重復(fù)序列中并且導(dǎo)致終止密碼子的產(chǎn)生，所以不產(chǎn)生聚絲蛋白肽的 功能拷貝。盡管，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了聚絲蛋白基因中的其他突變，但是 該突變是迄今為止在歐洲高加索人群中最為常見(jiàn)的，且本發(fā)明優(yōu)選的方面 是克服該突變。受試者可以是任何需要預(yù)防性或治療性處理的受試者，且適宜地，可 以是新生兒或甚至胎兒。然而，受試者可以處于生命的任何階段，且因此 包括新生兒、兒童和成年人。存在大量已知的能夠誘導(dǎo)連讀無(wú)義突變的試劑。 一類(lèi)試劑是某些氨基 糖苷類(lèi)抗生素，包括慶大霉素、巴龍霉素、新霉素和妥布霉素(BidouL.等, 基因治療(Gene Therapy) 11: 619-627, 2004; Howard MT.,等神經(jīng)學(xué)年 刊(AnnNe醫(yī)l) ,55:422-426,2004)。另一類(lèi)包括負(fù)霉素的試劑記述在US2005/0014835中，將其引入作為 參考。最終的突變tRNA能夠作為無(wú)義突變阻抑制子生成。這些從突變的 tRNA基因中生成，所述突變的tRNA基因?qū)е律蛇@樣的tRNA，所述 tRNA具有改變的反密碼子因而它們具有連讀由無(wú)義突變產(chǎn)生的密碼子的 能力。這記述在例如Panchal RG等，人類(lèi)基因治療(Human Gene Therapy), 10:2209-2219 (1999)中。除上述經(jīng)鑒定的試劑外，可能存在其他合適的突變阻抑制子，且本發(fā) 明還提供了鑒定阻抑制子的方法。因此，在另一個(gè)方面，提供了測(cè)試試劑連讀無(wú)義突變能力的方法，該方面包括下列步驟a) 提供突變聚絲蛋白基因/報(bào)道基因構(gòu)建體；b) 使測(cè)試試劑和所述構(gòu)建體相接觸；和C)檢查該測(cè)試試劑是否能夠影響突變聚絲蛋白基因的連讀和報(bào)道基 因的表達(dá)。任何合適的己鑒定的試劑能夠用于治療iv和/或本文所提及的其他相 關(guān)疾病，或?qū)嶋H上任何由無(wú)義突變引起的疾病/遺傳病癥。應(yīng)該意識(shí)到所述構(gòu)建體應(yīng)該受到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制元件如啟動(dòng)子和終 止子序列的控制。而且，該構(gòu)建體中存在包含內(nèi)部無(wú)義序列的聚絲蛋白核 酸序列。無(wú)需使用完整的聚絲蛋白核酸序列，僅需要一部分。適宜地，聚絲蛋白核酸序列可以是10-1000bp的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地15-200bp的長(zhǎng)度。典型的突變聚絲蛋白基因/報(bào)道基因構(gòu)建體包括符合讀框地與3'報(bào)道 基因序列相連接的5，突變聚絲蛋白核酸序列。照這樣，為了實(shí)現(xiàn)任何的報(bào) 道基因序列表達(dá)，必須連讀位于5'聚絲蛋白序列中的無(wú)義/終止密碼子。優(yōu)選的構(gòu)建體還包括另外的聚絲蛋白序列5'的陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因。如 應(yīng)該意識(shí)到地，全部序列符合讀框地彼此連接。對(duì)于這樣的構(gòu)建體，提供 了5'陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因，因此使用者可以確保該構(gòu)建體適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能。 如果沒(méi)有發(fā)生聚絲蛋白基因連讀，則只有該陽(yáng)性報(bào)道基因提供可檢測(cè)到的 信號(hào)。然而，如果發(fā)生聚絲蛋白序列的連讀，該陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因和聚絲 蛋白序列的3'報(bào)道基因兩者均提供可檢測(cè)到的信號(hào)。備選地，該陽(yáng)性報(bào)道 基因可以在單獨(dú)啟動(dòng)子的控制下存在于構(gòu)建體中，或該陽(yáng)性報(bào)道基因可以 由單獨(dú)的共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒所編碼。對(duì)于報(bào)道基因或陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因的使用而言合適的報(bào)道基因是技 術(shù)人員所熟知的，且包括例如螢光素酶基因，P半乳糖苷酶基因，熒光基 因諸如綠色熒光蛋白等，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，|3-葡糖醛酸糖苷酶等。此外， 從不同生物體物種能夠獲得特定基因的不同形式。特別優(yōu)選的構(gòu)建體包括作為陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因的海腎螢光素酶基因， 突變聚絲蛋白核酸序列和作為報(bào)道基因的螢火蟲(chóng)螢光素酶基因，其受到利 用例如HSV-TK啟動(dòng)子和SV40-多聚A終止子信號(hào)的適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)錄控制，如 示意性顯示于圖l中。然而，可以設(shè)想許多其他適合的構(gòu)建體，且報(bào)道基 因可以是當(dāng)其表達(dá)時(shí)，僅容許細(xì)胞在特定生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存活的報(bào)道基因。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)可以進(jìn)行任何具體的報(bào)道基因表達(dá)
第一輪篩選后，合適地，可以通過(guò)測(cè)試從患有與無(wú)義突變相關(guān)疾病的 患者獲得的細(xì)胞或細(xì)胞系上的試劑，而測(cè)試任何可能有用的試劑，從而確 定/確證該試劑能夠?qū)е逻B讀突變。
應(yīng)該意識(shí)到該方法可以在本領(lǐng)域中已知的基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的系 統(tǒng)中進(jìn)行。
現(xiàn)在進(jìn)一步通過(guò)實(shí)施例并參考附圖描述本發(fā)明，它們顯示


圖1顯示用于檢驗(yàn)聚絲蛋白無(wú)義突變連讀試劑的構(gòu)建體。A:通過(guò)2bp
的缺失從pRL-TK中的/ -/wc突變的TAA終止密碼子，和與F丄G和Z-i:wc 符合讀框地插入的J^al位點(diǎn)；B:克隆到pSP-luc+NF的iVcoI位點(diǎn)中的 凡G寡核苷酸盒；C:從突變的ATG密碼子用于減少"滲漏的"(leaky) 表達(dá)。
圖2顯示用于克隆進(jìn)入pSP-luc+的FLG寡核苷酸盒；
圖3顯示TR3構(gòu)建體來(lái)自染色體6p22.1的人Arg (CGA) tRNA基
因；
圖4顯示TR4B構(gòu)建體來(lái)自染色體15q26.1的人tRNA-Arg(TCG)基
因；
圖5顯示預(yù)測(cè)的TR3和TR4B阻抑制子tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其顯示了 突變的反密碼子環(huán)。用粗體顯示反密碼子環(huán)，且標(biāo)記了容許該環(huán)與TGA 密碼子配對(duì)的G〉A(chǔ)突變。所示堿基是由DNA所預(yù)測(cè)的，而不說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后 修飾；
圖6顯示聚絲蛋白R(shí)501X突變的連續(xù)(a)用pRLF-FLG-WT或pRLF-FLG-501X報(bào)道基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞系293的連讀。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)， 按照制造商的方案溶解細(xì)胞并利用Promega雙螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定螢 光素酶。
未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不提供海腎或螢火蟲(chóng)信號(hào)。含有野生型聚絲蛋白序列的 陽(yáng)性對(duì)照構(gòu)建體pRLF-FLG-WT提供陽(yáng)性海腎和螢火蟲(chóng)信號(hào)。相反地， pRL-FLG-501X構(gòu)建體提供同等的海腎信號(hào)但在缺乏任何連讀試劑的情況 下，不提供可檢測(cè)到的螢火蟲(chóng)信號(hào)。這證明pRLF-FLG-501X構(gòu)建體不是 "滲漏的"，且因此適合于檢驗(yàn)或連讀試劑。
(b)用含有人聚絲蛋白基因片段的pRLF-FLG-501X共報(bào)道基因瞬時(shí)
轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，所述人聚絲蛋白基因片段攜帶符合讀框地克隆在海腎和
螢火蟲(chóng)螢光素酶之間的R501X突變。
以針對(duì)海腎螢光素酶活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲(chóng)螢光素酶活性測(cè)量 連讀活性。進(jìn)行了四次重復(fù)閱讀并進(jìn)行平均。阻抑制子tRNAs TR3和 TR4BsupTGA容許聚絲蛋白R(shí)501X無(wú)義突變的連讀。慶大霉素以劑量依 賴的形式，容許聚絲蛋白R(shí)501X突變的連讀。
圖7顯示慶大霉素在來(lái)自尋常魚(yú)鱗病個(gè)體(FLG R501X純合體)的角 質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)聚絲蛋白的重新表達(dá)。
原代角質(zhì)形成細(xì)胞在無(wú)血清KGM中生長(zhǎng)，并通過(guò)從低(0.09mM)向高 鈣培養(yǎng)基(1.89mM)中的轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)其分層(分化)。利用甲醇/丙酮固定培養(yǎng) 物，并通過(guò)間接免疫熒光利用了針對(duì)人聚絲蛋白重復(fù)序列的Novocastm單 克隆抗體15C10對(duì)培養(yǎng)物迸行染色。利用1 mg/ml DAPI (4,6-聯(lián)脒-2-苯基 吲哚)復(fù)染細(xì)胞核；(a)正常對(duì)照角質(zhì)形成細(xì)胞在分化后表達(dá)聚絲蛋白，(b) R501X純合體角質(zhì)形成細(xì)胞在分化后不表達(dá)聚絲蛋白，(c)R501X純合體 角質(zhì)形成細(xì)胞在600 ^g/ml慶大霉素的存在下(用藥物培養(yǎng)96小時(shí))，在 分化后表達(dá)聚絲蛋白；和
圖8顯示慶大霉素處理后來(lái)自R501X患者的聚絲蛋白表達(dá)。在器官培 養(yǎng)中，用600 ^g/ml慶大霉素培養(yǎng)來(lái)自患有明顯尋常魚(yú)鱗病的R501X純合 體患者的皮膚活組織切片物質(zhì)96小時(shí)，恢復(fù)聚絲蛋白表達(dá)(箭頭)。培養(yǎng) 后，活組織切片用福爾馬林固定，石蠟包埋，并利用Novocastm抗人聚絲 蛋白重復(fù)單克隆抗體15C10,以免疫過(guò)氧化物酶檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行免疫組化處
理；A:未處理的活組織切片；B慶大霉素處理
方法和結(jié)果
實(shí)施例l:用于檢驗(yàn)連讀試劑的共報(bào)道基因構(gòu)建體
將對(duì)應(yīng)于人聚絲蛋白基因堿基數(shù)1480- 1523的寡核苷酸盒，(F丄G; 從ATG起始密碼子開(kāi)始編號(hào)編碼序列；Genbank登記號(hào)NM—002016.1 )， 克隆到唯一的Wco I限制性位點(diǎn)中，該位點(diǎn)在質(zhì)粒載體pSP-luc+NF (Promega)中跨越螢火蟲(chóng)螢光素酶基因(/:z^c)的ATG密碼子。圖2中顯示 的寡核苷酸盒具有增加的突出端，其對(duì)應(yīng)于iVco I的黏性末端。這些盒對(duì)
應(yīng)于含有密碼子501的人F丄G基因區(qū)域，即普通的R501X突變位點(diǎn)。形 成了野生型和R501X突變形式。通過(guò)DNA測(cè)序，鑒定并核實(shí)了具有處于 正確方向的插入物的克隆。插入F丄G盒后，通過(guò)利用下列引物的位點(diǎn)定 向誘變將ATG密碼子，即/-丄1^基因最初的起始密碼子，突變?yōu)锳GG精 氨酸密碼子，所述引物是FLmutl 5'AGG CAT TCA GCC AGG GTC ACC GAC GCC 3'禾卩FLmut2 5' GGC GTC GGT GAC CCT GGC TGA ATG CCT 3' (Stratagene快變系統(tǒng)(Stratagene QuikChange system))。這是為了防止 最初起始密碼子的可能使用，其可能甚至在含有TGA或其他終止密碼子 的F丄G盒的存在下，導(dǎo)致螢火蟲(chóng)螢光素酶的"滲漏"表達(dá)。通過(guò)DNA測(cè) 序證實(shí)克隆。將這些克隆命名為pSP-R501和pSP-X501，其分別對(duì)應(yīng)于野 生型和突變形式。
通過(guò)缺失2bp (TA)突變質(zhì)粒載體pRL-TK(Promega)中的海腎螢光素 酶基因(iMw)的TAA終止密碼子。這是利用下列引物的位點(diǎn)定向誘變 完成的，所述引物是pRL.M15'TCAAAAATGAACAAATTCTAGAGC GGC C 3'禾卩pRL.M2 5' GGC CGC TCT AGA ATT TGT TCA TTT TTG A 3' (Stratagene快變系統(tǒng)(Stratagene QuikChange system))。對(duì)突變的克隆(命 名為pRL-Ml)進(jìn)行了完全測(cè)序。
為了制備完整的共報(bào)道基因構(gòu)建體，從pSP-R501和pSP-X501中切下 含有完整FLG-/-￡wc融合基因的Mze I - ^Z)a I片段。將這些克隆到pRL-Ml
的唯一Z&al位點(diǎn)中，這是可能的，其原因在于iW7el和^)fll具有相容的
黏性末端。通過(guò)DNA測(cè)序，選擇具有正確方向的野生型和R501X突變克 隆。將野生型和R501X突變共報(bào)道基因構(gòu)建體分別命名為pRLF-FLG-WT 和pRLF-FLG-501X (圖1)。
實(shí)施例2:產(chǎn)生人阻抑制子tRNA基因以用于TGA無(wú)義突變
人類(lèi)基因組包括大量CGA-精氨酸t(yī)-RNA基因。這些是非常緊密的基 因，且含有RNA聚合酶III的基因內(nèi)啟動(dòng)子(LewinB.,在基因VII(Genes VII),牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press) ,2000,第624-626頁(yè))。 在目前人類(lèi)基因組的集合(HG17; http:〃genome.ucsc.edu)中鑒定出這些基 因中的兩種，為方便將其命名為T(mén)R3和TR4B，并由正常人對(duì)照DNA對(duì) 它們進(jìn)行擴(kuò)增。TR3位于染色體6p22.1上，且TR4B位于染色體15q26.1 上。具體地，利用引物TR3.F 5' CGA TGC AGA CAA TAT GCA GA 3'和 TR3.R 5' CTA AGC CTA CAA AAC CGA AA 3'，將TR3基因作為668bp的 片段進(jìn)行擴(kuò)增，其對(duì)應(yīng)于人類(lèi)基因組HG17集合中堿基編號(hào) chr6:26,407,555-26，408,284。利用引物TR4B.F 5' GAC TTC TGG GTG GGC TCT CC 3'和TR4B.R 5' CCC TCC CTC TCC ACT TTC CT 3'，將TR4B基 因作為465bp的片段進(jìn)行擴(kuò)增。該片段對(duì)應(yīng)于人類(lèi)基因組HG17集合中堿 基編號(hào)chrl5:87,679，164- 87,679,628。利用高保真PCR系統(tǒng)(羅氏(Roche)) 和下列條件((94°C 2分鐘)xl; (94°C 30秒，X°C 30秒，72°C 60秒) x35; (72°C 5分鐘)xl)進(jìn)行了PCR。對(duì)于TR3，退火溫度X:55"C;對(duì) 于TR4B， X=58°C。將這些片段克隆到pCR2.1載體(InVitrogen)中，并 對(duì)一些克隆進(jìn)行測(cè)序從而獲得不含PCR的克隆人為產(chǎn)物的每種構(gòu)建體的 克隆。圖3和4中顯示了標(biāo)有注釋的完整構(gòu)建體序列。圖5中顯示了對(duì)由 此生成的tRNA分子所預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)這些tRNA基因的反密碼子環(huán) 進(jìn)行了突變，從而使這些識(shí)別TGA終止密碼子而非CGA精氨酸密碼子， 即從5'TCG3'到5'TCA3'突變基因中的反密碼子環(huán)。在TR3基因中，這 對(duì)應(yīng)于突變G351A，'從引物TR3.F的第一個(gè)堿基開(kāi)始任意編號(hào)(見(jiàn)上)。 在TR4B中，該突變對(duì)應(yīng)于G180A，從引物TR4B.F的第一個(gè)堿基開(kāi)始編 號(hào)(見(jiàn)上)。
實(shí)施例3: F丄G連讀的雙螢光素酶測(cè)定
通過(guò)利用Fugene-6系統(tǒng)(羅氏(Roche))，在96孔板中將共報(bào)道基因 構(gòu)建體pRLF-FLG-WT和pRLF-FLG-501X瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的 人腎上皮細(xì)胞系)中，而對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，對(duì)細(xì)胞使用 雙螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)，所述系統(tǒng)檢測(cè)特異性螢光素酶信號(hào)，其對(duì) 應(yīng)于海腎和螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)道基因。對(duì)野生型共報(bào)道基因， pRLF-FLG-WT，獲得了海腎和螢火蟲(chóng)螢光素酶的強(qiáng)信號(hào)，如圖6a所示。 相反地，對(duì)pRLF-FLG-501X構(gòu)建體，僅獲得了海腎信號(hào)，顯示出存在于 該構(gòu)建體中F丄G盒內(nèi)的R501X過(guò)早終止密碼子突變導(dǎo)致螢火蟲(chóng)螢光素酶 表達(dá)的完全喪失(圖6a)。
實(shí)施例4: FLG無(wú)義突變的連讀測(cè)定
利用具有濃度范圍0-2000嗎/ml慶大霉素的pRLF-FLG-501X，如上所 述在96孔板中進(jìn)行了 293細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。利用pRLF-FLG-WT平行地 進(jìn)行了陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)染。如上所述，利用雙螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)測(cè)量 聚絲蛋白無(wú)義突變連讀活性。圖6b顯示慶大霉素以劑量依賴的方式，容 許R501X過(guò)早終止密碼子突變的連讀，該試驗(yàn)中最大連讀發(fā)生在濃度為 2000嗎/ml時(shí)。作為使用氨基糖苷進(jìn)行R501X突變的連讀的備選，測(cè)試了 人阻抑制子轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)種類(lèi)TR3supTGA和TR4BsupTGA (見(jiàn)實(shí) 施例2)。利用Fugene-6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(羅氏(Roche))，將這些共轉(zhuǎn)染到如 上所述具有pRLF-FLG-501X報(bào)道基因質(zhì)粒的293細(xì)胞中。這顯示出所測(cè) 試的兩種阻抑制子tRNA種類(lèi)均提供強(qiáng)連讀信號(hào)(圖6b)。
實(shí)施例5:角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物中聚絲蛋白表達(dá)的再活化
建立了來(lái)自患有嚴(yán)重IV個(gè)體的原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物，已經(jīng)顯示 出所述個(gè)體是對(duì)聚絲蛋白R(shí)501X突變的純合體，正如Smith FJD等，自然 遺傳學(xué)(Nature Genetics ) 2006，印刷中所述。正常原代角質(zhì)形成細(xì)胞不 表達(dá)聚絲蛋白到可測(cè)量的水平，其原因在于后者是晚分化特異性蛋白。然 而，通過(guò)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到高鈣培養(yǎng)基中，可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞表達(dá)聚絲蛋白， 這導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的層化和分化，從而引起聚絲蛋白的表達(dá)(Smith FJD 等,2006，印刷中)。正常對(duì)照角質(zhì)形成細(xì)胞的分化引起聚絲蛋白原在充分 層化的細(xì)胞集落中表達(dá)(圖7)。利用間接免疫熒光，使用了針對(duì)人聚絲蛋 白重復(fù)肽中表位的單克隆抗體15C10 (Novocastra)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。相 反，來(lái)自R501X純合體患者的充分層化的培養(yǎng)物未能表達(dá)聚絲蛋白原(圖 7，也見(jiàn)SmithFJD等，2006中，印刷中)。然而，當(dāng)用600嗎/ml慶大霉素 處理來(lái)自R501X純合體患者的分化的培養(yǎng)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)充分層化的細(xì)胞集 落在96小時(shí)，以與正常對(duì)照相當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)聚絲蛋白原(圖7)。而且， 聚絲蛋白原以細(xì)胞質(zhì)顆粒的形式存在，與對(duì)照角質(zhì)形成細(xì)胞中觀察到的那 些相當(dāng)。因此，慶大霉素能夠在培養(yǎng)的細(xì)胞中促進(jìn)R501X聚絲蛋白突變 的連讀。 實(shí)施例6:器官培養(yǎng)中表皮聚絲蛋白表達(dá)的再活化在添加或減去600pg/ml慶大霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)物中培養(yǎng)3mm立方體的皮膚活組織切片材料4天，該材料來(lái)自患 有明顯IV的聚絲蛋白R(shí)501X/R501X純合體患者。培養(yǎng)后，固定并包埋該 活組織切片材料以進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化。當(dāng)用針對(duì)人聚絲蛋白重復(fù)肽中 表位的單克隆抗體15C10 (Novacastra)染色時(shí)，未處理的活組織切片完全是 陰性的(圖8)，這與對(duì)聚絲蛋白無(wú)效突變純合性相一致(Smith FJD等,自 然遺傳學(xué)(Nature Genetics)論文，2006，印刷中)。相反，用慶大霉素培養(yǎng) 過(guò)的活組織切片材料顯示出顆粒細(xì)胞層的強(qiáng)烈染色(圖8)。由于純合或混 合雜合聚絲蛋白無(wú)效突變，所以缺乏可通過(guò)組織學(xué)鑒定的透明角質(zhì)顆粒是 嚴(yán)重IV的標(biāo)記(SmithFJD等，自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)論文，2006， 印刷中)。顯著地，用慶大霉素處理于此觀察到的聚絲蛋白染色的恢復(fù)引起 透明角質(zhì)顆粒的重新出現(xiàn)(圖8)。此外，在顆粒層中較高的一些細(xì)胞中， 其中聚絲蛋白染色特別強(qiáng)烈，觀察到其細(xì)胞形態(tài)變得更加扁平(圖8)。因 此，恢復(fù)的蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)正確的表皮終止分化，這與聚絲蛋白蛋 白功能的完全恢復(fù)相一致。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1. 一種試劑用于制備用于治療IV和/或相關(guān)疾病的藥物的用途，所述試劑能夠賦予在聚絲蛋白基因中連讀功能失去突變的能力。
2. —種預(yù)防或治療IV和/或其他相關(guān)疾病的方法，其包括向受試者施 用試劑的步驟，所述試劑能夠賦予在聚絲蛋白基因中連讀功能失去突變的 能力。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其中認(rèn)為所述方法是美容治療。
4. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述功能失去突變 是無(wú)義突變。
5. 按照權(quán)利要求4的用途或方法，其中所述突變是1501OT(從起始 ATG開(kāi)始編碼)，其導(dǎo)致胞苷被胸苷所取代和相應(yīng)的在位置501處精氨酸 變?yōu)榻K止密碼子(R501X)的氨基酸改變。
6. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)方法的用途，其中所述受試者是新生 兒、兒童或成年人。
7. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述試劑是氨基糖 苷類(lèi)抗生素。
8. 按照權(quán)利要求7的用途或方法，其中所述氨基糖苷是慶大霉素、巴 龍霉素、新霉素或妥布霉素。
9. 按照權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述試劑是負(fù)霉素 或突變tRNA。
10. —種測(cè)試試劑連讀無(wú)義突變能力的方法，其包括下列步驟a) 提供突變聚絲蛋白基因/報(bào)道基因構(gòu)建體；b) 使測(cè)試試劑和所述構(gòu)建體相接觸；和c) 檢査所述測(cè)試試劑是否能夠影響突變聚絲蛋白基因的連讀和報(bào)道基因的表達(dá)。
11. 按照權(quán)利要求10的方法，其中所述聚絲蛋白核酸序列長(zhǎng)度為 10-1000 bp。
12. 按照權(quán)利要求10或11的方法，其中突變聚絲蛋白基因/報(bào)道基因 構(gòu)建體包含與3，報(bào)道基因序列符合讀框地連接的5'突變聚絲蛋白核酸序 列。
13. 按照權(quán)利要求12的方法，其中所述構(gòu)建體還包括另外的聚絲蛋白 序列5'陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)道基因。
14. 按照權(quán)利要求13的方法，其中所述報(bào)道基因是螢光素酶基因，(3-半乳糖苷酶基因，熒光基因諸如綠色熒光蛋白等，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，卩-葡糖醛酸糖苷酶等。
15. 按照權(quán)利要求14的方法，其中所述構(gòu)建體示意性地顯示于圖1中。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防/治療尋常魚(yú)鱗病(IV)、特異反應(yīng)性和潛在地其他與聚絲蛋白基因序列中功能失去突變相關(guān)的病癥。該預(yù)防/治療基于試劑的使用，該試劑能使宿主翻譯系統(tǒng)連讀聚絲蛋白基因突變等位基因中存在的無(wú)義突變。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101400697SQ200780008788
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者威廉姆·亨利·歐文·麥克萊恩, 弗朗西斯·簡(jiǎn)·多羅西·史密斯 申請(qǐng)人:敦提大學(xué)校董事會(huì)