專利名稱：：紫草及其有效成分在制備治療腫瘤干細胞的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及紫草及其有效藥理成分在制備治療腫瘤干細胞的藥物中的應用。(二)
背景技術：
：腫瘤中的腫瘤細胞可分為兩類。一類為普通的腫瘤細胞，一類為腫瘤干細胞。普通的腫瘤細胞具有快速分裂，對抗癌藥敏感，沒有自身更新能力等特點。因此，普通的腫瘤細胞在分裂一定代數(shù)后會死亡。腫瘤干細胞則具有如下特點通常情況下處于靜止狀態(tài)，即不分裂狀態(tài)，對抗癌藥不敏感，具有自身更新能力，即具有無限繁殖的能力。在腫瘤化療中，大量的腫瘤細胞被殺死(因為對化療藥敏感)，然而腫瘤干細胞會生存下來(因為對化療藥不敏感)。腫瘤的復發(fā)是由于腫瘤化療藥對腫瘤干細胞無效。換言之，目前的腫瘤化療藥主要是針對腫瘤細胞，而不是腫瘤干細胞(WichaWS,LiuS,DontuG..CancerStemCells:AnOldIdea-AParadigmShift.CancerRes66:1883-1890,2005.DonnenbergVS&DonnerbergAD.MultidrugResistanceInCancerRevisited:TheCancerStemCellHypothesis.JClinParmacol45:872-877,2005.RavandiF&EstrovZ.EradicationofLeukemiaStemCellsAsaNewGoalofTherapyinLeukemia.ClinCancerRes12:340-344,2006.DickJE&LapidotT.BiologyofNormalandAcuteMyeloidLeukemiaStemCells.IntJHematol82:1-8,2005)。事實上，大多數(shù)腫瘤化療藥只對腫瘤細胞有效，而對腫瘤干細胞無效。尋找能有效治療腫瘤干細胞的藥物是當前的一個方向。是否能根除腫瘤的關鍵不在于能殺滅普通的腫瘤細胞，而在于根除腫瘤干細胞。紫草雖然被報道具有抗腫瘤的作用，然而，并沒有報道說明紫草及其有效成分具有抗腫瘤干細胞的作用。本發(fā)明說明紫草及其有效成分具有高效的抗腫瘤干細胞的功能。已有的文獻已經(jīng)說明，具有抗腫瘤作用的藥物大多數(shù)對腫瘤干細胞是無效的，因此，紫草雖然被報道具有殺傷腫瘤細胞的功能，但本領域的技術人員并不能根據(jù)這一點很容易想到紫草及其有效成分具有殺傷腫瘤干細胞的功能，相反，本領域的技術人員會認為紫草及其有效成分很可能對腫瘤干細胞無效，因為大多數(shù)已知的抗腫瘤藥物對腫瘤干細胞治療效果甚微(見以上的參考文獻及其中所應用的文獻)。因此，用紫草及其有效成分來制備治療腫瘤干細胞的藥物是本領域技術人員所未知的。至今并未有紫草及其有效成分在制備腫瘤干細胞治療藥物中的應用報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了紫草及其有效成分在制備治療腫瘤干細胞的藥物中的應用。所述的紫草為紫草的有機溶劑的提取物或用超臨界方法獲得的提取物。所述的有機溶劑為含16個碳原子的醇溶液，優(yōu)選乙醇。所述的治療腫瘤干細胞藥物還含有藥物賦形劑或載體，可制成下列之一的劑型①注射液；②片劑；③膠囊劑；顆粒劑；⑤湯劑。所述治療腫瘤干細胞的藥物中也還可以含有其他的抗癌藥。本發(fā)明所述紫草有效成分包含有紫草素、紫草素的對映體異紫草素以及它們的衍生物，如紫草萘醌類化合物、異紫草萘醌類化合物、紫草屬素、紫草呋喃等物質(zhì)。部分紫草素萘醌類化合物結構式如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>紫草素(Shikonin)R=-OH去氧紫草素(Deoxyshikonin)R=-H乙酰紫草素(Acetylshikonin)R=-OCOCH3異丁酰紫草素(Isobutyrylshikonin)R=-OCOCH(CH3)2e-羥基異戊酰紫草素(p-hydroxyisovalerylshikonin)R=-OCOCH2C(CH3)2OH異戊酰紫草素(Isovalerylshikonin)R=-OCOCH2CH(CH3)2a-甲基-正丁酰紫草素(a-methyl-n-butyrilshikonin)R=-OCOCH(CH3)CH2CH30,e-二甲基丙稀酰紫草素(p,(3-dimethylacrylshikonin)R=-OCOCH=C(CH3)22,3-二甲基戊烯酰紫草素(Teracrylshikonin)R=-OCOCH2C(CH3)=C(CH3)24-羥基-2,5-二甲基戊烯酰紫草素丙酰紫草素(Propionylshikonin)0OCH3<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>1一甲氧基一紫草素1-methoxy-shikonini-甲氧基-e,e-二甲基丙稀酰紫草素(1-methoxy-P,p國dimethylacrylshikonin)1一甲氧基一乙酰紫草素(1-methoxy-acetylshikonin)OH0<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>Shikonine部分異紫草萘醌類化合物結構式如下:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>去氧異紫草素(Deoxyalkannin)異紫草素(Alkannin)去水異紫草素(anhydroakanin)R=陽HR=-OHR=-CH=CHCH=C(CH3)26,P-二甲基丙稀酰異紫草素(卩,p-dimethylacrylalkannin)R=-OCOCH=C(CH3)2乙酰異紫草素(Acetylalkannin)R=-OCOCH3e—羥基異戊酰異紫草素((3-hydroxyisovalerylalkannin)R=-OCOCH2C(CH3)2OHa—乙酰氧基異戊酰異紫草素(a-acetoxyisovalerylalkannin)R=-OCOCH2CCH3OCOCH3a_甲基一正丁酰異紫草素(a-methyl-n-butyrilalkannin)R=-OCOCH(CH3)CH2CH32,3-二甲基戊烯酰異紫草素(Teracrylalkannin)R=-OCOCH2C(CH3)=C(CH3)2紫草屬素結構式如下OH0<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>紫草屬素A(LithospermidinA)紫草屬素B(L他ospermidinB)紫草呋喃結構式如下R=-COCH(CH3)CH2CH3R=-COCH(CH3)CH3紫草呋喃A(ShikonofUranA)R=-CH3紫草呋喃B(ShikonofuranB)R=-CH(CH3)CH2CH3紫草呋喃C(ShikonofliranC)R=-CH2CH(CH3)2紫草呋喃D(ShikonofiiranD)R=-CH(CH3)2紫草呋喃E(ShikonofuranE)R=-CH=C(CH3)2所述的紫草的有效成分為下列之一:(l)紫草素；(2)去氧紫草素；(3)乙酰紫草素；(4)異丁酰紫草素；(5)e—羥基異戊酰紫草素；(6)異戊酰紫草素；(7)a—甲基一正丁酰紫草素；(8)e，e-二甲基丙稀酰紫草素；(9)2,3-二甲基戊烯酰紫草素；(10)4-羥基-2,5-二甲基戊烯酰紫草素；(11)丙酰紫草素(Propionylshikonin);(12)異紫草素；(13)去氧異紫草素；(14)乙酰異紫草素；(15)去水異紫草素(Anhydroalkannin);(16)e,P-二甲基丙稀酰異紫草素；(17)e—羥基異戊酰異紫草素；(18)a—乙酰氧基異戊酰異紫草素；(19)a—甲基一正丁酰異紫草素；(20)a—甲基一正丁酰異紫草素；(21)2,3-二甲基戊烯酰異紫草素；(22)1—甲氧基一紫草素；(23)1_甲氧基一e,P-二甲基丙稀酰紫草素；(24)l—甲氧基一乙酰紫草素；(25)紫草屬素A;(26)紫草屬素B;(27)紫草呋喃A;(28)紫草呋喃B;(29)紫草呋喃C;(30)紫草呋喃D;(31)紫草呋喃E;(32)Shikonine。特別的，所述的紫草的有效成分為下列之一(1)紫￥*1(2)乙酰紫草素;(3>異丁酰紫縣；(4)縣一^#戊酰紫草素;(5)異戊酰紫草素；(6)a-甲基一正丁酰紫草素；(7)P,e-二甲基丙稀酰紫草素。所述的治療腫瘤干細胞藥物還含有藥物賦形劑或載體，可制成下列之一的劑型①針劑；②片劑；③膠囊劑；④顆粒劑；⑤緩釋劑。所述治療腫瘤干細胞的藥物中也還可以含有其他的抗癌藥。本發(fā)明所述的紫草及其有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，有益效果主要體現(xiàn)在提示了紫草及其有效成分的新用途，如紫草素可有效地去除腫瘤干細胞，紫草提取物去除腫瘤干細胞的藥效顯著比阿糖胞苷強，這為新藥篩選提供了基礎，療效好，具有重大開發(fā)前景。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例l:紫草乙醇提取物的制備新疆紫草1000g，用6倍質(zhì)量的75%乙醇滲漉，滲漉速度15ml/min?；厥找掖紴r出液，減壓回收乙醇至無乙醇味，濃縮得比重為L10g/ml的浸膏，添加10倍質(zhì)量的純水，靜置1小時，離心(5000G)5分鐘，取沉淀，即為紫草乙醇提取物，記為乙醇提取物I(下同)，備用。用上述相同方法采用內(nèi)蒙紫草為原料，制得紫草乙醇提取物，記為乙醇提取物II(下同)，備用。以上的乙醇濃度可選7595%之間的任意值，也可用甲醇、丙醇等各種醇代替。實施例2:紫草超臨界提取物制備超臨界提取將紫草1000g粉碎成粗粉(過40目篩)，置1L超臨界C02萃取釜中，調(diào)節(jié)壓力25MPa，溫度45。C，流量30kg/h，提取時間2h。收集得到10g萃取物切o實施例3:紫草對腫瘤干細胞的藥效測定實驗方法急性髓系白血病細胞(acutemyeloidleukemia)和急變期慢性髓系白血病(blastcrisschronicmyeloidkeukemia)病人的外周血或骨髓細胞。外周血細胞用白細胞分離液去除紅細胞，骨髓細胞用150mMNH4C1和10mMNaHC03處理5分鐘去除紅細胞。細胞用無血清培養(yǎng)基洗三遍，加入紫草提取物(終濃度為O、5、lOpg/ml)處理4小時，或加入阿糖胞苷(終濃度為O、5、10pg/ml)。然后用無血清培養(yǎng)基洗三遍去除紫草提取物，用甲基纖維素IMDM培養(yǎng)液(1%甲基纖維素、30%牛血清白蛋白、0.2mM巰基乙醇、2mM谷氨酰酰氨、50ng/ml重組人干細胞因子、10/ml重組人粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子，10ng/ml重組人白介素-3、3單位/ml促紅細胞生成素、50ng/ml粒細胞集落生長因子)配成50000細胞/ml，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10—14天，觀察細胞集落。結果以上的細胞集落方法是觀察腫瘤干細胞或具有自身更新能力腫瘤細胞的一種公認的方法，能生長成集落的細胞被認為是腫瘤干細胞或前體細胞(GuzmanML,RossiRM,KamischkyL,"a/..Thesesquiterpenelactoneparthenolideinducesapoptosisofhumanacutemyelogenousleukemiastemandprogenitorcells.Blood105:4163-4169,2005)。阿糖胞苷是一個廣泛用于治療急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋系白血病和淋巴瘤的一種抗癌藥。從結果來看，阿糖胞苷不能有效去除腫瘤干細胞，而紫草提取物去除腫瘤干細胞的藥效顯著比阿糖胞苷強(表l一2)。表l、紫草提取物和阿糖胞苷抑制急性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%，藥物處理組的細胞集落百分比為-(處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))x100%。表2、紫草提取物和阿糖胞苷抑制急變期慢性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%，藥物處理組的細胞集落百分比為=(處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))x100%。實施例4:紫草有效成分對腫瘤干細胞的藥效測定實驗方法急性髓系白血病細胞(acutemyeloidleukemia)和急變期慢性髓系白血病(blastcrisschronicmyeloidkeukemia)病人的外周血或骨髓細胞。外周血細胞用白細胞分離液去除紅細胞，骨髓細胞用150mMNH4C1和10mMNaHC03處理5分鐘去除紅細胞。細胞用無血清培養(yǎng)基洗三遍，加入紫草素(終濃度為O、5、10pM)處理4小時，或加入阿糖胞苷(終濃度為O、5、10|iM)。然后用無血清培養(yǎng)基洗三遍去除紫草提取物，用甲基纖維素IMDM培養(yǎng)液(1%甲基纖維素、30%牛血清白蛋白、0.2mM巰基乙醇、2mM谷氨酰酰氨、50ng/ml重組人干細胞因子、10/ml重組人粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子，10ng/ml重組人白介素-3、3單位/ml促紅細胞生成素、50ng/ml粒細胞集落生長因子)配成50000細胞/ml，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10—14天，觀察細胞集落。表3、紫草素和阿糖胞苷抑制急性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%，藥物處理組的細胞集落百分比為=(處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))x100%。表4、紫草素和阿糖胞苷抑制急變期慢性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%，藥物處理組的細胞集落百分比為氣處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))xlOOX。表5、紫草其他有效成分(10pM)抑制抑制急性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%,藥物處理組的細胞集落百分比為K處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))xlOOX。表6、紫草其他有效成分(10、M)抑制抑制急變期慢性髓系白血病干細胞的集落生成效率。<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞，表中的數(shù)據(jù)為對照的細胞集落數(shù)為100%，藥物處理組的細胞集落百分比為氣處理細胞組集落數(shù)/對照細胞組集落數(shù))xlOOX。實施例5、紫草素對腫瘤干細胞的藥效測定實驗方法急性髓系白血病細胞(acutemyeloidleukemia)和急變期慢性髓系白血病(blastcrisschronicmyeloidkeukemia)病人的外周血或骨髓細胞。外周血細胞用白細胞分離液去除紅細胞，骨髓細胞用150mMNH4C1和10mMNaHC03處理5分鐘去除紅細胞。細胞用無血清培養(yǎng)基洗三遍，加入紫草素(終濃度為O、5、10pM)處理18小時，或加入阿糖胞苷(終濃度為O、5、10)處理18小時。然后用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)、熒光素FITC標記的抗CD34抗體、熒光素PE_Cy5標記的抗CD38抗體對細胞做染色，染后用流式細胞分析儀分析細胞。結果PI著色的細胞為死細胞，PI非著色的細胞為活細胞。CD34陽性/CD38陰性為月中瘤干細胞(GuzmanML,RossiRM,KamischkyL，Wa/,.Thesesquiterpenelactoneparthenolideinducesapoptosisofhumanacutemyelogenousleukemiastemandprogenitorcells.Blood105:4163-4169,2005)。表3和表4的結果說明，紫草素可有效地去除腫瘤干細胞。表7、紫草素和阿糖胞苷對急性髓系白血病干細胞的生存率影響。<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞。表中的百分比為活的CD34陽性/CD38陰性細胞的百分比，等于PI陰性細胞群中的CD34陽性/CD38陰性細胞除以PI陽性和陰性細胞中的CD34陽性/CD38陰性細胞再乘以100%。表8、紫草素和阿糖胞苷對急性髓系白血病干細胞的生存率影響。<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表注對照為沒有藥物處理的細胞。表中的百分比為活的CD34陽性/CD38陰性細胞的百分比，等于PI陰性細胞群中的CD34陽性/CD38陰性細胞除以PI陽性和陰性細胞中的CD34陽性/CD38陰性細胞再乘以100%。以上實施例說明紫草及其有效成分具有很好的治療腫瘤干細胞藥物中的應用前景。權利要求1.紫草在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用。2.如權利要求l所述的紫草在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于:所述的紫草為紫草的有機溶劑的提取物或用超臨界方法獲得的提取物。3.如權利要求2所述的紫草在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的有機溶劑為含16個碳原子的醇溶液。4.如權利要求3所述的紫草在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的有機溶劑為乙醇。5.如權利要求1所述的紫草在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的藥物中還可以含有其他的抗癌藥。6.紫草的有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的有效成分為下列之一(l)紫草素；(2)去氧紫草素；(3)乙酰紫草素；(4)異丁酰紫草素；(5)e—羥基異戊酰紫草素；(6)異戊酰紫草素；(7)a—甲基一正丁酰紫草素；(8)e,e-二甲基丙稀酰紫草素；(9)2，3-二甲基戊烯酰紫草素；(10)4-羥基-2,5-二甲基戊烯酰紫草素；(11)丙酰紫草素；(12)異紫草素；(13)去氧異紫草素；(14)乙酰異紫草素；(15)去水異紫草素；(16)e，e-二甲基丙稀酰異紫草素；(17)e—羥基異戊酰異紫草素；(18)d—乙酰氧基異戊酰異紫草素；(19)a_甲基一正丁酰異紫草素；(20)a—甲基一正丁酰異紫草素；(21)2,3-二甲基戊烯酰異紫草素；(22)1甲氧基一紫草素；(23)l—甲氧基一e,P-二甲基丙稀酰紫草素；(24)1—甲氧基一乙酰紫草素；(25)紫草屬素A;(26)紫草屬素B;(27)紫草呋喃A;(28)紫草呋喃B;(29)紫草呋喃C;(30)紫草呋喃D;(31)紫草呋喃E;(32)Shikonine。7.如權利要求6所述的紫草的有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的紫草有效成分為下列之一(l)紫草素；(2)乙酰紫草素；(3)異丁酰紫草素；(4)e—羥基異戊酰紫草素；(5)異戊酰紫草素；(6)a—甲基一正丁酰紫草素；(7)0，e-二甲基丙稀酰紫草素。8.如權利要求6所述的紫草的有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的治療腫瘤干細胞藥物還含有藥物賦形劑或載體。9.如權利要求6所述的紫草的有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的治療腫瘤干細胞藥物還含有其它的抗癌藥。10.如權利要求6所述的紫草的有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，其特征在于所述的治療腫瘤干細胞藥物制成下列之一的劑型①針劑；②片劑；③膠囊劑；④顆粒劑；(D緩釋劑。全文摘要本發(fā)明提供了紫草及其有效成分在制備治療腫瘤干細胞的藥物中的應用。所述紫草有效成分包含有紫草素、紫草素的對映體異紫草素以及它們的衍生物，如紫草萘醌類化合物、異紫草萘醌類化合物、紫草屬素、紫草呋喃等物質(zhì)。本發(fā)明所述的紫草及其有效成分在制備治療腫瘤干細胞藥物中的應用，有益效果主要體現(xiàn)在提示了紫草及其有效成分的新用途，如紫草素可有效地去除腫瘤干細胞，紫草提取物去除腫瘤干細胞的藥效顯著比阿糖胞苷強，這為新藥篩選提供了基礎，療效好，具有重大開發(fā)前景。文檔編號A61K36/185GK101194920SQ20071018103公開日2008年6月11日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權日2006年9月29日發(fā)明者汛胡申請人:杭州賀博生物技術有限公司